Curso de capacitacin para tecnolgos mdicos ESSALUD

Normalizacin y validacin

MSc. Ivn Lozada Requena Seccin Inmunologa Universidad Peruana Cayetano Heredia

Qu es una norma??
Documento normativo Standard (palabra inglesa) En ciencia y tecnologa

Patrn de medida

2
ILR

Qu es una norma??
Un documento, establecido por consenso y aprobado por un organismo reconocido, que establece, para uso comn y repetido, reglas, directrices o caractersticas para ciertas actividades o sus resultados, con el fin de conseguir un grado ptimo de orden en un contexto dado.

EN 45020:1993 Glosario de trminos sobre Normalizacin ..

3
ILR

Trminos equivalentes
Norma
Un modelo aceptado o aprobado de alguna cosa frente a la cual otros son juzgados Un nivel de excelencia o calidad

Gua
Un principio propuesto para asignar estndares o determinar una lnea de accin

Criterio
Un estndar por el que alguna cosa puede ser juzgada o decidida

Principio
Un estndar o regla de conducta
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ILR

Normalizacin
La normalizacin o estandarizacin es la redaccin y aprobacin de normas que se establecen para garantizar el acoplamiento de elementos construidos independientemente, as como garantizar el repuesto en caso de ser necesario, garantizar la calidad de los elementos fabricados y la seguridad de funcionamiento

5
ILR

Normalizacin
Es la actividad que tiene por objeto establecer, ante problemas reales o potenciales, disposiciones destinadas a usos comunes y repetidos, con el fin de obtener un nivel de ordenamiento ptimo en un contexto dado, que puede ser tecnolgico, poltico o econmico.

ISO (International Organization for Standarization)

6
ILR

Normalizacin
Objetivos
Simplificacin: Se trata de reducir los modelos quedndose nicamente con los ms necesarios.

Unificacin: Para permitir la intercambiabilidad a nivel internacional.

Especificacin: Se persigue evitar errores de identificacin creando un lenguaje claro y preciso
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ILR

Clasificacin de las normas

1. Por el mbito de aplicacin
1. Nacional 1. Normas para el sector industrial. 2. Normas para la empresa. 3. Normas para organismos nacionales. Internacional Cientfico 1. Definiciones de magnitudes, unidades y smbolos. 2. Designaciones de la simbologa matemtica. 3. Designaciones de notaciones cientficas. Industrial 1. Normas de calidad: Definen las caractersticas de un producto o proceso. 2. Normas dimensionales: Definen las dimensiones, tolerancias, formas, etc. de un producto. 3. Normas orgnicas: Aspectos generales (color de las pinturas, dibujos, etc.). 4. Normas de trabajo: Ordenan los procesos productivos.
1. 2. Obligatorias Voluntarias 8
ILR

2.

2.

Por el contenido
1.

2.

3.

Por la forma de aplicacin

Origen de las normas

Internacional
WHO ISO IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) OCDE (Organisation of Economic Co-operation & Development The joint European Standards Organisation (CEN/CENLAC)

Nacional

Local

National Council for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (USA) Programas nacionales de acreditacin Sociedades profesionales Grupos de pacientes

Grupos locales de organizaciones profesionales y hospitales locales, particularmente en auditoras clnicas Contratos proveedor /comprador
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ILR

Normas de inters para laboratorios

Organizacin
ISO
ISO

Ttulo
Sistemas de Gestin de la Calidad: Requisitos
Laboratorios clnicos Requisitos particulares para la calidad y la competencia Principios de Buenas Prcticas de Laboratorio

Abreviacin
ISO 9001:2001
ISO 15189

OECD CAP (College American Pathologists) CPA (Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd

OECD-GLP

Estandares para la acreditacin de CAP-LAP laboratorios Manual de normas y guas para la acreditacin CPA(UK)Ltd

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ILR

Estandarizacin
Observar la situacin inicial es el punto de partida de cualquier iniciativa de mejora.

La mejora del trabajo estandarizado es un proceso interminable.

11
ILR

Qu es un proceso??
(Forma especificada de llevar a cabo una actividad o proceso - Puede ser documentado o no )

Procedimiento

Eficiencia del Proceso

Capacidad de alcanzar los resultados deseados

Entradas
(Incluidos los recursos)

(Conjunto de actividades interrelacionadas o interactuantes)

PROCESO

Salidas

(Resultado de un proceso)

PRODUCTO

Eficacia del Proceso

(Antes, durante y despus del proceso)

Monitoreo y Oportunidades de Medicin

Resultados alcanzados vs Recursos usados

Uso del Ciclo Deming en el proceso de estandarizacin

Actuar
Edwards Deming

Planificar

Verificar
ILR

Hacer
13

Los 6 Pasos del ciclo PHVA segn Ishikawa Definir objetivos y metas Definir los mtodos para lograr los objetivos Llevar a cabo la capacitacin y el entrenamiento Realizar el trabajo
ILR

Actuar

Tomar acciones correctivas

Planificar

Verificar los resultados del trabajo

Verificar
Qu es el control total de la calidad? La modalidad japonesa

Hacer

14

Mapa de procesos en el laboratorio

C l i e n t e E x t e r n o

A C V
Input A A Entrada
PROCESS A PROCESO A

P D H
Input E E Entrada
PROCESS E PROCESO E

Ouput E E Resultado

Output A A Resultado

A A P P C V D D C H

A A P P C V H D C D

Input C C Entrada
PROCESS C PROCESO C

Input D D Entrada Output C C Resultado

PROCESS D PROCESO D

Ouput D D Resultado

C l i e n t e E x t e r n o

A A P P C V H D C D
Input B B Entrada Output B B Resultado
PROCESS B PROCESO B

A A P P C V H D C D

A A P P C V H D C D

Input F F Entrada Cliente Internal Customer Interno

Resultado Output F

PROCESS F PROCESO F

Cliente Internal Customer Interno Feedback Retroalimentacin

A A P P C V H D C D

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ILR

Estandarizacin
El proceso de estandarizacin se basa en cuatro elementos bsicos:
Deteccin de los desperdicios a partir de la observacin de los procesos, para su posterior eliminacin. Identificacin de los elementos de trabajo, obtenidos del proceso de observacin. Anlisis del Takt Time o ritmo al que se deben hacer los distintos productos o servicios en un proceso para satisfacer la demanda del cliente. Las herramientas de trabajo estandarizado para cada proceso, operario y situacin del Takt Time.

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ILR

En la estandarizacin de los procesos del laboratorio se deben tener en cuenta las siguientes fases
Fases en actividades Actividades del proceso operativo Pasos en las actividades del proceso operativo

Pre-analtica

1. 2. 3.

Consulta Seleccin de pruebas Peticin

4. 5. 6.
7. Analtica 7. 8. Post-analtica

Identificacin Obtencin Transporte

Preparacin Preparacin Anlisis

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Consulta Doctor/paciente Rellenado de formulario de peticin Obtencin de especmenes Transporte del especmen y la peticin Recepcin Adquisin Preparacin de la muestra Anlisis de la muestra

9. Informe 10. Interpretacin

Informar de los resultados incluyendo interpretacin y recomendaciones 11. Conclusin del mdico 10. Emisin del informe 11. Recepcin del informe por el mdico, y 12. Accin consulta si es necesario

Pre-analtica: Consulta, seleccin y peticin

Asesor especialista como parte del servicio Manual de los usuarios Establecer sistemas de comunicacin entre clnicos y el laboratorio
Formularios de peticin Informes emitidos por el laboratorio Sesiones clnico patolgicas Reuniones de auditoras Estndar D1 del CPA (UK) Ltd Revisin anual por lo menos

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ILR

Contenido de un manual del usuario

1. Contenido 2. Informacin General 3. Utilizacin del laboratorio 4. Informacin de las reas
1. 2. 3. 4. 5.

1. Peticiones y recogida de especmenes 2. Transporte al laboratorio Bioqumica Hematologa y transfusin de sangre Histopatologa Citopatologa Microbiologa, etc

5. Tablas alfabticas de pruebas/procedimientos

1. 2. 3. 4. 5. Nombre de la prueba Especmen y recipiente necesario Intervalos de referencia (cuando sea necesario) Comentarios especiales Plazos de entrega
ILR

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Ejemplo de petitorio
St Elsewheres Hospital Trust - Laboratorio Clnico Telfono (0800) 100200

Nmero de Historia del paciente Apellidos Nombre Direccin Fecha de nacimiento Sexo (M/F)
Especialista (nombre y apellido)

Nmero del laboratorio

Medico solicitante Firma:

Hospital Sala/Clnica
Fecha y hora de la toma de muestra Detalles clnicos/diagnstico/tratamiento

Bioqumica
Perfil renal Perfil lipdico Perfil heptico Perfil diabtico Perfil seo Glucosa en ayunas Perfil cardaco Glucosa aleatoria Perfil tiroideo Test de embarazo Por favor, especifique otros:

Hematologa
Recuento sangre total RA latex VSG factor antinuclear Folato y B12 Control de warfarina Ferritina Estudio de coagulacin IM estudio ILR

Microbiologa
Orina
Heces MSU CSU Cultivo Parsitos Rutina AFB Torunda Cervical HVS Uretral Otras determinaciones en sangre para .................................................... Otros especmenes para .....................................................

Esputo

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Pre-analtica: Identificacin, obtencin y transporte Identificacin

Mnimo de informacin: Nombre, fecha de nacimiento, fecha de recogida y cdigo relacionado con la admisin hospitalaria

Obtencin y transporte
Genera fuentes de interferencia en el anlisis Estandarizar la preparacin del paciente Aprobacin de comit de tica para procedimientos nuevos o experimentales

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ILR

Analtica: Preparacin del espcimen

En cada laboratorio hay diferencias en los procedimientos de preparacin de especmenes. Es importante implementar un sistema que relacione cualquier determinacin posterior con el especimen original, es decir, debe haber trazabilidad. Es sistema debe estar documentado y seguir la normativa para la elaboracin de los documentos del sistema de calidad
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ILR

Analtica: Preparacin del espcimen

Paso
1

Actividades
Formulario de peticin recibido con dos especmenes para biopsia Espcimen 1 Especmen 2 Dos bloques de tejido preparado del espcimen 1 se colocan en cestillas separadas para su inclusin: Bloque de parafina A Bloque de parafina B Secciones del corte del nivel 1 en el bloque de parafina A y montadas en corte Secciones de corte del nivel 2 en el bloque de parafina A y montadas en corte

Etiquetado
# de acceso para el formulario El nombre del paciente, etc, debera constar en la etiqueta del contenedor del espcimen, pero se pueden adjuntar # de acceso

Numeracin
07-03066

07-03066-1 07-03066-2

Etiqueta del bloque de parafina Etiqueta del bloque de parafina Nmero de corte Nmero de corte

07-03066-1-A 07-03066-1-B 07-03066-1-A-1 mas el nombre del paciente 07-03066-1-B-1 mas el nombre del paciente

ndice al nmero de cdigo, por ejemplo 07-03066-2-A-1 07 = Ao 03066 = nmero de acceso 2 = nmero del espcimen A = letra del bloque de inclusin 1 = Posicin del nivel en el bloque

Analtica: Anlisis
En esta fase los procedimientos cumplen una amplia variedad de funciones que van desde la identificacin hasta la medicin de los analitos. Por tanto, tras la estandarizacin de los pasos de una tcnica o anlisis se deber crear un procedimiento con una estructura preestablecida por el sistema de documentacin de la calidad del usuario

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ILR

Estructura de un procedimiento estandarizado

1. 2. 3. 4. 5. 6. Objetivo Alcance Referencias Definiciones Documentacin Actividades y mtodos

6.1 Fundamentos del mtodo 6.2 Requisitos del especmen 6.3 Obtencin de los datos 6.4 Reactivos, patrones para el control de calidad, accesorios y equipos 6.5 Calibracin 6.6 Descripcin detallada del procedimiento 6.7 Control y evaluacin de la calidad 6.8 Limitaciones del procedimiento 6.9 Informe de resultados e interpretacin clnica 6.10 Anotaciones del procedimiento y otra informacin pertinente
ILR

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Actividades relacionadas a un procedimiento analtico que pueden ser sometidas a estandarizacin

Instrucciones de trabajo para el analizador BHM Manual para los usuarios Del laboratorio 4.1 Bioqumica Prueba funcional 5.0 Tablas de determinacin Por orden alfabtico Manual de utilizacin del instrumento

Manual de mantenimiento del instrumento

Acciones del usuario diarias Calibraciones del instrumento Mantenimiento programado (externo) Mantenimiento no programado (externo)

Procedimiento para la determinacin de TSH en suero

Procedimiento para la obtencin del Espcimen Procedimiento para la prueba de Supresin de TRH Procedimiento para la recepcin del Espcimen Procedimiento para la obtencin de datos Y preparacin del espcimen en bioqumica

Post-analtica: Elaboracin e interpretacin de informes Incluye el contenido y la validacin de los datos El valor de la informacin producida depende de la forma en que est presentado el informe. La validacin de los datos y de la informacin es una parte importante y signica la comprobacin de la correccin de los datos:
Validacin tcnica: uso de correctores de texto, sealar valores crticos, uso de computadoras, etc Validacin clnica, realizado por el facultativo experimentado

Algunas normas de los sistemas de calidad y de acreditacin dan gran importancia a la calidad del informe y a la interpretacin de resultados
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ILR

Post-analtica: Estandarizacin del contenido del informe 1. Nombre y direccin del laboratorio de ensayo y el lugar de realizacin del ensayo cuando sea diferente de la direccin del laboratorio Identificacin nica del informe (# serie) y de cada una de sus pginas y el nmero total Nombre y direccin del cliente Descripcin e identificacin del objeto ensayado Fecha de recepcin del objeto a ensayar y fecha de realizacin del ensayo Identificacin de la especificacin del ensayo o descripcin del mtodo o procedimiento Descripcin del procedimiento de muestreo (opcional) Cualquier desviacin, adicin o exclusin de la especificacin del ensayo, y cualquier otra informacin relativa a un ensayo especfico.
ILR

2.
3. 4. 5. 6. 7. 8.

28

Post-analtica: Estandarizacin del contenido del informe 9. Identificacin de cualquier mtodo o procedimiento de ensayo no normalizado que se haya utilizado 10. Medidas, examenes y resultados derivados, apoyados, cuando proceda por tablas, grficos, dibujos, fotografias, asi como los posibles fallos detectados 11. Indicacin de la incertidumbre de las mediciones 12. Firma y cargo o marca equivalente , de o las persona(s) que aceptan la responsabilidad tcnica del informe y la fecha de emisin 13. Declaracin de que el informe de ensayo solo afecta a los objetos sometidos al ensayo 14. Indicacin de que el informeno deber reproducirse parcialmente sin la aprobacin por escrito del laboratorio.
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ILR

Validacin
Comprende la comparacin sistemtica de todas las operaciones importantes y del equipo para un proceso o procedimiento Objetivo: Garantizar la calidad del proceso cuando se siguen procedimientos y controles establecidos. Es la demostracin documentada de que un proceso, procedimiento o mtodo es apropiado con alta seguridad para desempear una labor especfica
30
ILR

Validacin de mtodos
Demostrar que un mtodo analtico es adecuado para la aplicacin prevista. Se demuestra que los resultados de una aplicacin especial caen dentro de una desviacin de medida definida La validacin de un procedimiento incluye el mtodo utilizado y la manipulacin de las sustancias utilizadas. Es necesario incluir cada operacin y comprobarla por separado.
31
ILR

Validacin: ISO 15189

Item 5.5.2 El laboratorio slo debe utilizar procedimientos validados para confirmar que los procedimientos de anlisis son adecuados para el uso previsto. Las validaciones deben ser tan amplias como sea necesario para satisfacer las necesidades en una determinada aplicacin o campo de aplicacin. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos y el procedimiento utilizado para la validacin. Los mtodos y procedimientos seleccionados para uso deben ser evaluados y se debe demostrar que dan resultados satisfactorios antes de ser utilizados para anlisis mdicos. Una revisin de procedimientos por el gerente del laboratorio o la persona designada debe llevarse a cabo inicialmente y a intervalos definidos. Por lo general, dicha revisin se realiza anualmente. Estas revisiones deben ser documentadas. 32
ILR

Parmetros para la validacin de procedimientos analticos

Precisin Exactitud Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Especificidad Linearidad Dureza o resistencia Robustez
33
ILR

Diferenciacin entre exactitud y precisin

Bien Exactitud x x x x Mal

Precisin

x x x x

x x

x x

x
x

Mal

Precisin: Grado de coincidencia mutua de varios valores medidos; Es independiente del valor convencionalmente verdadero. 34 Exactitud: Grado de desviacin del valor convencionalmente verdadero
ILR

Precisin

Es el grado de repetibilidad de un grupo de resultados. Usualmente se expresa como D.S. o D.S. relativa (coeficiente de variacin) de una serie de mediciones. Las medidas de precisin son calificadas o explicadas en trminos de : replicabilidad, repetibilidad o precisin intermedia y reproducibilidad.

35
ILR

Replicabilidad
Es la precisin en condiciones de Repetibilidad e involucra: Mismo laboratorio Mismo equipamiento Un nico analista Mismo mtodo Misma muestra Intervalos cortos de tiempo

36
ILR

Replicabilidad
Realizar un mnimo de 10 mediciones independientes de un material de referencia a varias concentraciones dentro del rango de trabajo. Repetir tres veces (como mnimo) en un intervalo de tiempo corto. Determinar la desviacin estndar de los resultados. Informar la repetibilidad (como DS) para cada concentracin.
37
ILR

Precisin intermedia
Expresa la variacin intra-laboratorio: Mismo laboratorio El equipamiento puede ser el mismo o pueden emplearse otros equipos. Distintos analistas Mismo mtodo Misma muestra Das distintos

38
ILR

Ejemplo:

Se analiz con cinco sueros de altos, medios y bajos niveles de antitoxina tetnica. El (CV) se us para expresar las variaciones.

39
ILR

Reproducibilidad
Es la precisin en condiciones de reproducibilidad e involucra: Distinto laboratorio Diferente equipamiento Distintos analistas Mismo mtodo Misma muestra Intervalos en tiempos largos

Reproducibilidad

Ensayos interlaboratorios

40
ILR

Ejemplo

Se analiz con cinco sueros de altos, medios y bajos niveles de antitoxina tetnica. El (CV) se us para expresar las variaciones.

41
ILR

Exactitud
La exactitud de un procedimiento analtico es la cercana de sus resultados al valor verdadero. Debe ser establecida a lo largo de un rango.

USP 30-NF25 - 2007

42
ILR

Exactitud
Emplea materiales de referencia Detecta errores sistemticos Hay dos formas de determinarla:
Realizar el procedimiento a un material de referencia conteniendo un analito de pureza conocida Comparar los resultados con los de otro procedimiento de exactitud conocida

43
ILR

Exactitud
Se calcula como el porcentaje de recobramiento del analito en el material de referencia o como la diferencia entre el promedio y el valor convencionalmente verdadero, junto con intervalos de confianza

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ILR

Lmite de deteccin
Es la cantidad ms baja del analito en una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada. Expresada como concentracin del analito en la muestra, ej porcentaje, partes por millon, etc. Especfica si un analito esta o no por debajo de un cierto valor

45
ILR

Lmite de deteccin
Puede determinarse por una relacin visual para mtodos no instrumentales (Formacin de la banda de precipitacin). Se puede definir mtodos cualitativos, como la concentracin por debajo de la cual la identificacin positiva se torna poco confiable.

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ILR

Lmite de deteccin
El limite de deteccin se puede estimar a partir de: La desviacin estndar del blanco. La desviacin estndar de una solucin de concentracin cercana al LD (informado por el fabricante, blanco fortificado). LD = Xb + 3 s LD = 3 s Usando blanco Usando blanco fortificado

S: desviacin estndar de los resultados obtenidos.

47
ILR

Lmite de deteccin
Realizar un mnimo de 10 mediciones independientes del blanco (matriz sin agregado de analito) Realizar como mnimo 10 lecturas independientes del blanco fortificado a baja concentracin (2.5 a 5 veces el LD informado por el fabricante, para espectroscopia). Determinar finalmente la desviacin estndar de los resultados. Para mtodos cualitativos se analizan 10 replicados independientes del blanco y varios niveles de concentracin.
48
ILR

Lmite de Cuantificacin
Se refiere a la concentracin mas baja de un analito en una muestra, que puede ser determinada con aceptable precisin y exactitud bajo las condiciones de operacin Es expresado como la concentracin del analito en la muestra.

49
ILR

Lmite de Cuantificacion
Limite de cuantificacin es la menor concentracin de una muestra que puede ser cuantificada con un nivel de incertidumbre aceptable. LQ = Xb + 10 s Usando blanco LQ = 10 s Usando blanco fortificado
Xb = Valor del blanco

Comparar las seales medidas en muestras con concentraciones bajas del analito con la muestra blanco. La mnima concentracin a la cual el analito pueda ser confiablemente medido se establece como lmite de cuantificacin.
50
ILR

Especificidad Es la capacidad de medir inequivocamente el analito en presencia de otros componentes como impurezas, productos de degradacin, etc.

51
ILR

Especificidad
En el caso de anlisis cualitativos (Pruebas de identificacin), se debe demostrar la capacidad para seleccionar entre compuestos de estructura similar. Se debe confirmar por comparacin con material de referencia conocido y con muestras que no contengan el analito.

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ILR

Sensibilidad
Junto con la especificidad son dos parmetros que se utilizan a menudo para validar las pruebas usadas en el laboratorio. Sensibilidad: Capacidad de una prueba para detectar casos positivos (ausencia de falsos negativos) Especificidad: Capacidad de una prueba para identificar correctamente a todos los casos negativos (ausencia de falsos positivos). S y E tienen la ventaja adicional de que son propiedades intrnsecas a la prueba diagnstica, y definen su validez independientemente de cul sea la prevalencia de la enfermedad en la poblacin a la cual se aplica.
53
ILR

Clculo de Sensibilidad y especificidad

Prueba de referencia o Gold Estndar Positivo Prueba a Positivo evaluar Negativo Total Sensibilidad = Especificidad = VP x 100 VP + FN VN x 100 VN + FP
ILR

Total

Negativo FP VN

VP FN

54

Clculo de Sensibilidad y especificidad

Prueba de referencia o Gold Total Estndar Positivo Prueba a Positivo evaluar Negativo Total Sensibilidad = Especificidad = 50 0 50 Negativo 2 48 50 52 48 100

50 x 100 = 100% 50 + 0 48 x 100 = 96% 48 + 2

ILR

55

Otro ejemplo
Exploracin y biopsia prosttica de una muestra de pacientes con sospecha de cncer de prstata.

Resultado de la biopsia prosttica Resultado del tacto rectal Cncer Patologa benigna

Total 903 1738 2641

Anormal Normal Total

634 487 1121

269 1251 1520

100-56,56=43,44% de los pacientes que efectivamente tenan cncer presentaban tactos normales. Claramente ello indica la necesidad de utilizar otros marcadores ms sensibles, como el PSA o sus derivados, para poder establecer el diagnstico de forma 56 ms precisa.
ILR

La seguridad de una prueba diagnstica. Valores predictivos

Cuando a un paciente se le realiza alguna prueba, el mdico carece de informacin a priori acerca de su verdadero diagnstico Ms bien la pregunta se plantea en sentido contrario: ante un resultado positivo (negativo) en la prueba, cul es la probabilidad de que el paciente est realmente enfermo (sano)?. Los valores predictivos darn mayor informacin5
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ILR

Valor predictivo positivo: Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en la prueba. El valor predictivo positivo puede estimarse, por tanto, a partir de la proporcin de pacientes con un resultado positivo en la prueba que finalmente resultaron estar enfermos:

Valor predictivo negativo: Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba est realmente sano. Se estima dividiendo el nmero de verdaderos negativos entre el total de pacientes con un resultado negativo en la prueba:

Valores predictivos - interpretacin

El valor predictivo positivo en el ejemplo es del 70,21% (634/903) y el valor predictivo negativo del 71,98% (1251/1738). Ello significa que en un 70,21% de los pacientes con un tacto anormal finalmente se confirm la presencia de cncer, mientras que de los que no se detectaron anomalas en el tacto un 71,98% estaban efectivamente sanos.

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ILR

Influencia de la prevalencia
Para el diagnstico del VIH se emplean tests que han confirmado tener una alta validez, con valores aproximados de sensibilidad y especificidad de un 99,5%. Supongamos que se aplicase esta prueba a la totalidad de la poblacin Arequipea, que se cifra en 2.800.000 habitantes. Si asumimos que en Arequipa existen 6.000 pacientes VIH positivos (lo cual implicara una prevalencia de 6000/ 2.800.000 =0,21%), el test resultara positivo en un total de 19.940 sujetos, obtenindose un valor predictivo positivo del 29,9% (ver tabla). As pues, slo un 29,9% de los sujetos con un resultado positivo en el test resultaran estar realmente afectados, mientras que un 70,1% de los mismos no presentaran la enfermedad. Resulta obvio que en una comunidad como la arequipea la utilizacin de esta prueba no resultara til, debido a la alta proporcin de falsos positivos que conllevara.
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ILR

Influencia de la prevalencia
Resultados de la aplicacin del test de VIH en una poblacin de baja prevalencia. Verdadero diagnstico

Resultado del test

VIH+ Positivo Negativo Total 5.970 30 6.000 VIH13.970 2.780.030 2.794.000 Total 19.940 2.780.060 2.800.000

0,995 = 2 780 030

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ILR

Influencia de la prevalencia
Resultados de la aplicacin del test de VIH en una poblacin de alta prevalencia.

Resultado del test Positivo Negativo Total

Verdadero diagnstico VIH+ 796.000 4.000 800.000 VIH10.000 1.990.000 2.000.000 Total 806.000 1.994.000 2.800.000

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ILR

Influencia de la prevalencia
Por lo tanto, si la prevalencia es alta, un resultado positivo tiende a confirmar la presencia de la enfermedad, mientras que si la prevalencia es baja, un resultado positivo no permitir afirmar su existencia.

63
ILR

Linearidad y Rango
Capacidad de producir resultados que sean directamente o por una transformacin matemtica proporcionales a la concentracin del analito en la muestra en un rango determinado. Se refiere a la linearidad de la relacin de concentracin y medicin del ensayo. En algunos, para obtener una linearidad la concentracin y/o la medicin pueden ser transformadas. Las transformaciones pueden ser a logaritmos, raz cuadrada. Si no se obtiene linearidad se puede usar un modelo no linear. El objetivo es tener un modelo que describa la relacin concentracin-respuesta.
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ILR

Linearidad y Rango
Rango es el intervalo ente los niveles superior e inferior de un analito que han demostrado ser determinados con un nivel confiable de precisin, exactitud y linearidad. El rango normalmente se expresa en las mismas unidades del resultado del ensato (ej., porcentaje, partes por millon, etc).

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ILR

Linearidad y Rango
La linearidad se debe establecer a lo largo del rango del procedimiento analtico Inicialmente se debe establecer por examen visual de la grfica de la seal como una funcin de la concentracin del contenido del analito. Se recomienda como mnimo unas 5 concentraciones. Si hubiera una relacin linear se debe establecer apropiados mtodos estadsticos como la regresin linear. El coeficiente de correlacin, el intercepto-y, la pendiente de la regresin linear deben ser calculados y evaluados.
66
ILR

67
ILR

Linearidad y Rango
El rango es validado verificando que el procedimeinto otorge una precisin, exactitud y linearidad aceptables cuando se aplique a muestras que contiene analitos en los extremos del rango asi como tambin dentro.

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ILR

Robustez
Es la capacidad de un mtodo para permanecer inafecto por pequeas pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo y provee una indicacin de su confiabilidad durante el uso normal. Puede ser determinada durante el desarrollo del mtodo.

69
ILR

Pasos para la Validacin

Seleccin de una tcnica Evaluar la factibilidad de la tcnica Optimizacin de la tcnica Evaluar los parmetros de validacin Comparar con otras tcnicas

70
ILR

Categorias de procedimientos analticos segn USP 30 Category I Para cuantificacin de componentes principales. Category II Para determinacin de impuresas o compuestos degradados. Incluyen pruebas cuantitativas y ensayos de lmites. Category III Para la determinacin de caractersticas de performance. Category IVEnsayos de identificacin

71
ILR

Parmetros requeridos para la validacin

Categora II Parmetros Exactitud Precisin Especificidad Lmite deteccin Categora I Cuantitativo SI SI SI No SI SI SI No
Ensayo de lmite

Categora III * SI * *

Categora IV No No SI No

* No SI SI

Lmite Cuantificacin
Linearidad

No
SI

SI
SI

No
No

*
*

No
No

* * Rango No SI SI * Podra requerirse dependiendo de la naturaleza del ensayo especfico.

72
ILR

Estandarizacin de la tcnica de inmunofluorescencia indirecta aplicada a la Enfermedad de Chagas

Curva de crecimiento para obtencin de antgeno de T. cruzi

Analista 1 Da 0 2 4 6 8 10 12 14 # celx106 0,5 2,48 2,87 2,94 3,428 2,57 0,565 0,29

Analista 2 # celx106 0,5 3,06 3,295 3,375 3,25 2,75 0,455 0,01

Analista 3 # celx106 0,5 1,61 3,75 6,05 3,3 2,7 1,47 1,08 Prom 0,500 2,383 3,305 4,122 3,326 2,673 0,830 0,460 DS 0,000 0,730 0,440 1,684 0,092 0,093 0,557 0,555 N 3 3 3 3 3 3 3 3 SEM 0,00 0,28 0,22 0,43 0,10 0,10 0,25 0,25

Obtencin de mayor volumen de parsitos en cultivo

Curva de crecimiento de T. cruzi cepa Tulahuen en tubos de polipropileno - grfica promedio

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 2 4 6

Das

# epi x 10e6 /mL

10

12

14

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ILR

Fijacin del antgeno

Preparacin antgeno a Temperatura ambiente

Preparacin antgeno a Temperatura de 4C

PBS formolado al 2%

Al 1%

Al 0.25%

Al 0.25% PBS formolado al 0.1%

Formalizar toda la noche a T Ambiente

Formalizar a 4C por 1 hora

5 20 parsitos x campo

20 40 parsitos x campo

40 50 parsitos x campo

Secar lminas por toda la noche a TAmb

Guardar a 20C

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ILR

Objetivo de la estandarizacin
Preparar antgeno a temperatura ambiente. Probar diversas concentraciones de PBS formolado necesario para la muerte del parsito con la conservacin de su estructura. Evaluar la proporcin adecuada de parsitos fijados por campo.

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ILR

Fijacin del antgeno

78
ILR

Conclusiones
El mejor procedimiento para la fijacin de antgeno epimastigote de Trypanosoma cruzi para la tcnica de inmunofluorescencia indirecta, es aquel que procesa el antgeno de la siguiente manera: Usar lminas para inmunofluorescencia, lavadas con Alconox (detergente para laboratorio) durante 24 horas, enjuagadas con agua destilada Limpiar antes de usar con alcohol al 96% y papel tissue, evitando dejar pelusas Todo el procedimiento de preparacin de antgeno debe ser realizado a temperatura refrigerada (4C). PBS pH 7.2 a 4C para los lavados PBS formolado al 2% a 4C Proporcin de parsitos fijados: de 40 a 50 por campo, observados a 40X, vistos con forma definida, sin restos de basura y en una adecuada reparticin en el campo observado. La concentracin de parsitos necesaria para la proporcin anteriormente descrita es: 3 x 106 parsitos/ml.
79
ILR

Sueros Controles de Prueba / No inactivados

Diluir sueros en PBS pH 7.2

Agregar 15ul suero diluido a cada pocito

Temperatura incubacin: 37C

30 minutos

45 minutos

1 hora

Ver archivo word

Lavado con PBS (2 veces) y Agua destilada (1 vez ) Tiempos de lavado

5 minutos

10 minutos

15 minutos

Dejar secar completamente a Temperatura ambiente Ttulos a probar del conjugado

Usar Conjugado diluido en PBS pH 7.2 y azul de evans

1/50

1/100

1/200

1/400

1/800

80
Concentraciones a probar del azul

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Estandarizacin del conjugado para IFI

Titulacin del conjugado Anti-inmunoglobulina Isotiocianato de Fluorescena: CONJUGADO USADO.Fluorescein-conjugated rabbit IgG fraction to human IgG (Whole molecule) 2mL. Marca: Cappel. ICN Pharmaceuticals, Inc. Catlogo: 55145 Lote: 02923 Diluciones sugeridas: 1:100 1:800 para IFI humana asociada a

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ILR

Se evaluaron hasta 27 posibles combinaciones de las condiciones indicadas en la tabla

Lminas + / - Prueba 01 Condiciones

Suero

No inactivado

Dilucin Suero

PBS pH 7.2

Temperatura de Incubacin

37C

Tiempo de incubacin

30 minutos

Lavados

Agitacin 5 min con AD

Azul de Evans

0.01%

Glicerina

Preparada con PBS.

Lectura

20X

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ILR

Esquema representativo de la dilucin del conjugado vs diluciones de sueros referenciales

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ILR

Conclusiones
a. El conjugado a la dilucin 1/50 permite diferenciar perfectamente un resultado positivo de un negativo b. El Suero Referencial Positivo se visualiza mejor a la diluacin 1/16, 1/32 y 1/64 con el lavado de 10 minutos. c. El Suero Referencial Negativo se visualiza mejor a 1/16, para las tres condiciones probadas. d. El mejor tiempo de lavado es el de 10 minutos. e. El lavado de 15 minutos lisa la mayora de parsitos y se observa baja fluorescencia y bajo contraste.
ILR

84

Estandarizacin del conjugado

Dilucin del suero referencial 1/16

Dilucin 1/50

Dilucin 1/100

Dilucin 1/200

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ILR

Validacin de la prueba de HAI para el inmunodiagnstico de Chagas

Evaluacin de la sensibilidad y especificidad

Gold Estndar HAI Polichaco Positivo HAI UPCH Total Sensibilidad = Especificidad = Positivo Negativo 51 1 56 Negativo 3 49 52 54 50 104 Total

51 x 100 = 94,4 % 51 + 3 49 49 + 1
ILR

x 100 = 98%
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