Manual Prctico de Microbiologa y Parasitologa Manacorda A. M.; Cuadros D. P.; lvarez A.

Ao: 2007

Captulo 5 COLORACIONES
Objetivos Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica. Ejercitar las tcnicas de coloracin simple y compuesta. Practicar la preparacin de coloraciones de uso a partir de soluciones madre. Introduccin En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exmenes se realizan en fresco. Por esta razn, cuando se quieren conocer los detalles morfolgicos es necesario recurrir a tinciones. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por algn componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los ms usados en microbiologa son: a) Sales colorantes b) Colorantes liposolubles a) Los colorantes ms comnmente usados son sales que pueden ser de tipo cido o bsico, trminos que no indican necesariamente su pH en solucin, sino que una parte significativa de la molcula sea aninica o catinica. Los colorantes bsicos consisten en un catin coloreado unido a un anin incoloro (ej, clorhidrato (-) de azul de metileno (+). Los colorantes cidos tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado (eosinato (-) de Na (+). Los colorantes se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano; si la clula no ha muerto, el proceso de tincin la mata. La clula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos, y ellos son los ms usados en citologa bacteriana. Las bacterias son ricas en cidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de grupos fosfatos. Los colorantes bsicos tien la clula bacteriana uniformemente, a menos que antes sea destruido el ARN del citoplasma. Los colorantes cidos no tien la clula bacteriana, y por lo tanto, pueden usarse para impartir al fondo un color de contraste (coloracin negativa). Desde el punto de vista prctico entonces, los colorantes bsicos tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear de las clulas eucariotas y procariotas; los colorantes cidos reaccionan con sustancias bsicas, como las estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas. b) Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de los depsitos de grasa. Ej. negro Sudn. En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas, con el propsito de hacerlas visibles al microscopio ptico; uno de ellos es el cido tnico que se emplea en la coloracin de flagelos y espiroquetas.

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Tcnica para realizar una preparacin coloreada Una preparacin coloreada exige la sucesin de tres pasos: preparacin del extendido, fijacin y coloracin. 1.- Preparacin del extendido Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Si el cultivo proviene de un medio lquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende hasta formar una fina pelcula que cubra el centro del portaobjetos. Si el cultivo proviene de un medio slido, se procede as de la siguiente manera: Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y luego se extiende la suspensin bacteriana hasta formar una fina pelcula sobre el portaobjetos sin tocar los bordes. Se deja secar al aire, o se seca al aire caliente de la llama, si los microorganismos lo admiten. 2.- Fijacin Este segundo paso se efecta para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente. La fijacin coagula las sustancias proteicas de las clulas, lo cual hace que los microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las bacterias. Existen dos tipos de fijacin: con calor o mtodo de Koch y fijacin qumica. Mtodo Koch El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaucin de llevar el extendido hacia arriba. El inconveniente de este mtodo es que los microorganismos pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta excesivo. Despus del procedimiento, el portaobjetos debe notarse caliente pero no debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano. Fijacin qumica La coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias qumicas es lo ideal pues las clulas no resultan deformadas. Existen varios mtodos: - Se inunda el preparado con alcohol metlico, se deja actuar 3 minutos y se lava con agua. Es el ms usado. - Idem con formalina al 5 % (v/v). - se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter sulfrico) y se deja actuar hasta su evaporacin completa.

3.- Coloracin En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de acuerdo al mtodo de tincin que se realice. Para la observacin microscpica existen diferentes tipos de coloraciones segn las(s) caractersticas morfolgicas que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y compuestas.

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Coloraciones Simples Se entiende por coloracin simple al teido de los microorganismos aplicando slo una solucin colorante. Pueden ser positivas o negativas. 1.a. La coloracin positiva es la tincin de los microorganismos, efectuada con colorantes bsicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan qumicamente con el citoplasma microbiano. Tcnica: Se cubre el frotis, despus de fijado, con la solucin colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar. Con fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos. Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja actuar 30 a 60 segundos. Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. El azul de metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la cual se usa ms concentrado y se deja actuar durante ms tiempo. Tambin a la solucin de azul de metileno de uso se le agrega un lcali (KOH) como intensificante, que acta haciendo ms rpida e intensa la reaccin de coloracin. Generalmente como intensificante se usa un lcali para un colorante bsico y un cido para un colorante cido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una dbil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan ms intensas. 1.b. La coloracin negativa es lo contrario del procedimiento de tincin usual: los microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las clulas. La sustancia usada para la tincin negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las clulas, tal como: tinta china (suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado grandes como para penetrar en la bacteria) colorantes cidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El ms utilizado es la nigrosina dado que es el que ms contraste ofrece por ser negro. La coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los microorganismos en microscopa ptica, pero su mxima utilidad est en revelar estructuras como cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas que, por su pequeo dimetro transversal, resulta difcil ponerlas en evidencia; por medio de la coloracin negativa se observan sin dificultad. Mtodo de Burri (con tinta china o nigrosina): Se coloca en un extremo del portaobjetos una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensin microbiana y se mezclan bien con el ansa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se hace un extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo a medida que se extiende, con lo cual se conseguir una zona donde el contraste sea el adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersin.

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Coloraciones compuestas Aunque existen mltiples tipos de tinciones, vamos a referirnos aqu a los dos mtodos de coloracin especiales ms comunmente empleados en la prctica corriente del laboratorio de microbiologa: la tincin de Gram y la de Ziehl-Neelsen.

Tincin de Gram Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la ms empleada en bacteriologa. Permite diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y tamao, por esta razn es una tincin diferencial. Las etapas a seguir se detallan en la Tabla 1. Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la grampositividad depende de la naturaleza y composicin qumica de la pared o parte de ella. Se han propuesto varias teoras para su explicacin, pero la ms aceptada es la que sostiene que las bacterias gramnegativas son ms permeables al alcohol debido a su alto contenido en lpidos. Cuando la bacteria se tie con el complejo colorante bsico-mordiente, ste queda atrapado en las bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza fsico-qumica de su pared. Por el contrario, en las gramnegativas es arrastrado debido a su alto contenido lipdico. Tabla 1 Etapas en la tincin de Gram Resultados Gram(+) Se tie de violeta Permanece violeta Permanece violeta Permanece violeta

Pasos Colorante bsico Mordiente Decoloracin Contraste

Mtodo Violeta de genciana Lugol Alcohol de 95% o Alcohol-acetona Fucsina o Safranina

Gram (-) Se tie de violeta Permanece violeta Se decolora Se tie de rosa

Tincin de Ziehl-Neelsen El fundamento de esta tcnica diferencial, se basa en la propiedad de la cido-alcohol resistencia de algunas bacterias del orden Actinomycetales, si bien no es privativa de ellas. Estos microorganismos se consideran grampositivos, pero se colorean difcil e irregularmente, de ah que emplee este tipo de tincin (Ziehl- Neelsen) o su variante (Kinyoun). Cualquiera de las dos tcnicas citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto, que la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la accin decolorante de una solucin de cido-alcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre un fondo azul (tabla 2).

Tabla 2 Etapas en la tincin de Ziehl- Neelsen Resultados Acido-alcohol resistente Se tie de rojo Permanece rojo Permanece rojo Permanece rojo

Pasos Mtodo Colorante bsico Fucsina Mordiente Calor Decolorante Alcohol-clorhdrico Contraste Azul de metileno

No cido alcohol resistente Se tie de rojo Permanece rojo Se decolora Se tie de azul

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SOLUCIONES COLORANTES Soluciones madre Son soluciones saturadas de colorante, de conservacin indefinida, a partir de las cuales se preparan las soluciones de uso mediante dilucin en medio acuoso. Las soluciones madres se preparan en alcohol. Preparacin: se pueden seguir dos tcnicas: -Triturar el colorante en el mortero, agregar de a poco el alcohol e ir pasando de a poco a un frasco color caramelo. -Colocar el colorante en un frasco color caramelo que contiene perlas de vidrio hasta 1 cm de altura. Agregar posteriormente la cantidad de alcohol necesaria y agitar vigorosamente varias veces durante 2 das. Esta tcnica es la ms aconsejable por su simplicidad y prolijidad. Antes del uso se deja reposar 24 horas para que el colorante no disuelto sedimente. Para preparar las soluciones de uso se pipetea del sobrenadante. Solucin madre de fucsina bsica: Fucsina bsica................................................ 5g Etanol 96 ...................................................... 100 ml Solucin madre de violeta de genciana: Violeta de genciana.......................................... 5 g Etanol 96 .........................................................100 ml Solucin madre de azul de metileno: Azul de metileno................................................10 g Etanol 96............................................................100 ml Soluciones de uso La solucin de uso se prepara generalmente con 10 ml de la solucin madre y 90 ml de agua. Dado que resulta una solucin hidroalcohlica, su duracin es limitada ya que el colorante precipita al cabo de aproximadamente 2 meses. Por esta razn, los volmenes que se preparan se deben adecuar al consumo del laboratorio. Solucin de uso se prepara generalmente con 10 ml de la solucin madre y 90 ml de agua. Dado que resulta una solucin hidroalcohlica, su duracin es limitada ya que el colorante precipita al cabo de aproximadamente 2 meses, Por esta razn, los volmenes que se preparan se deben adecuar al consumo del laboratorio. Solucin de uso de fucsina bsica: Fucsina fenicada de Ziehl Solucin madre de fucsina bsica....................10 ml Fenol (cristales fundidos)...................................5 g Agua destilada c.s.p.........................................100 ml Solucin de uso de violeta de genciana: Solucin madre de violeta de genciana.............10 ml Agua destilada c.s.p.........................................100 ml Solucin de uso de azul de metileno: Azul de metileno alcalino de Loeffler Solucin madre de azul de metileno..................30 ml Solucin acuosa de KOH 1/10000 c.s.p...........100 ml Una vez preparadas estas soluciones, se deben filtrar y colocar en frascos color caramelo.

Actividades 1. Preparacin de examen en fresco de microorganismos y observacin al microscopio. 2. Preparacin de extendidos, fijacin y tincin con coloraciones de Gram y Ziehl Neelsen. 3. Observacin microscpica.