VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Pablo Richter

Introduccin

La validacin de un mtodo analtico tiene como objetivo establecer por medio de estudios cientficos, que un mtodo tiene las caractersticas de desempeo que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analticas pretendidas. Una vez validada una metodologa analtica, el laboratorio de ensayo deber fijar los intervalos de aceptabilidad para el control de calidad de cada una de las propiedades analticas del mtodo. Una metodologa, an cuando tenga el carcter de mtodo estndar u oficial, debera ser validada antes de ser utilizada en forma rutinaria.

Introduccin

Las propiedades analticas que necesariamente debern ser documentadas en un proceso de validacin, son la siguientes: Precisin al nivel de replicabilidad y repetibilidad Exactitud Incertidumbre Intervalo de linealidad Lmite de deteccin del mtodo

Lmite de cuantificacin del mtodo

Campo de Aplicacin

El presente documento corresponde a una gua tcnica que define los trminos y los procedimientos relativos a la validacin de un mtodo de anlisis. En todas las actividades de laboratorio es esencial uniformar las definiciones y los mtodos de clculo para los diferentes trminos. En este documento se establecen las definiciones relativas a propiedades de mtodos analticos que se utilizarn en los laboratorios de rutina del pas.

Definiciones
CURVA DE CALIBRACIN: Representacin grfica bidimensional, que muestra la variacin de la seal analtica con la concentracin del analito. Esta ltima se obtiene al graficar el valor obtenido de la seal analtica (valor absoluto, altura, rea, etc.) versus las concentraciones de los estndares respectivos. SENSIBILIDAD: Propiedad analtica que se define como la capacidad de un mtodo para discriminar entre concentraciones (cantidades) semejantes de analito. La sensibilidad de un mtodo analtico corresponde a la pendiente de la curva de calibracin. Algunas veces se expresa informando la razn entre el valor de seal obtenida a una concentracin dada de estndar.

Definiciones
LIMITE DE DETECCIN: Existen distintas formas de definir los lmites de deteccin de un mtodo de acuerdo a criterios estadsticos, basados en el cuociente entre la magnitud de la seal de la medida y el ruido de fondo producido por el instrumento o por el blanco analtico.

a) Lmite de Deteccin IUPAC: Concentracin de analito que origina una seal que puede diferenciarse estadsticamente de un blanco analtico.

Lmites de deteccin y cuantificacin

Cul es la menor concentracin que podemos detectar o cuantificar con este mtodo de anlisis?

S= Seal

Razn seal ruido S/n

LD => S/n = 3 n = ruido LC => S/n = 10

b)

Lmite de Deteccin Instrumental (LDI): Corresponde a la concentracin mnima de un compuesto analizado que, sin la presencia de la matriz, un instrumento puede detectar con una fiabilidad definida y que es estadsticamente diferente de la respuesta correspondiente al ruido de fondo obtenido por el instrumento. Lmite de Deteccin del Mtodo (LDM): Corresponde a la concentracin mnima de un compuesto que puede ser detectada en una matriz real, la cual es tratada siguiendo todas las etapas del mtodo completo, incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mnima concentracin produce una seal detectable con una fiabilidad definida, estadsticamente diferente a la seal producto del blanco obtenido en las mismas condiciones.

c)

Definiciones
LMITE DE CUANTIFICACIN DEL MTODO (LCM): Corresponde a la concentracin mnima de un analito que puede ser cuantificada en una matriz real, la cual es tratada siguiendo todas las etapas del mtodo empleado, incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mnima concentracin produce una seal cuantificable con una nivel de confianza definido. INTERVALO DE LINEALIDAD O DE DETERMINACIN: Corresponde al intervalo de concentracin ms fiable de medida para la determinacin analtica del analito. Este intervalo esta comprendido entre la concentracin correspondiente al del LCM y la concentracin mxima que entrega el lmite de linealidad.

Definiciones

PRECISIN: Grado de concordancia de un grupo de resultados entre s. Dispersin de estos resultados alrededor de su media. Existen tres formas de plantear un estudio de precisin:

Replicabilidad (Repeatability, within run precision) Repetibilidad (Intermediate precision, within lab reproducibility) Reproducibilidad (Reproducibility conditions, between lab precision)

Niveles de Precisin

Replicabilidad: Forma de plantear el estudio de precisin. Se define como la dispersin de resultados originados por aplicaciones del mismo mtodo a alcuotas de la misma muestra, para determinar el mismo analito, en el mismo laboratorio, por el mismo operador y con las mismas herramientas analticas, en un corto intervalo de tiempo. Repetibilidad: Forma de plantear el estudio de precisin. Se define como la dispersin de resultados originados por aplicaciones del mismo mtodo a alcuotas de la misma muestra, para determinar el mismo analito, en el mismo laboratorio, y al menos una de las siguientes condiciones es diferente: analista, instrumento, da. Reproducibilidad : Forma de plantear el estudio de precisin. Se define como la dispersin de resultados originados por aplicaciones del mismo mtodo a alcuotas de la misma muestra, para determinar el mismo analito, en diferentes laboratorios, y en las siguientes condiciones: diferente analista, diferente instrumento, igual o diferente da.

Esta propiedad analtica no se determina de forma rutinaria en un procedimiento de validacin. Slo es aplicable a ejercicios de intercomparacin.

Definiciones

EXACTITUD: Expresa la cercana entre el valor que es aceptado, como un valor de referencia (material de referencia certificado) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de anlisis un cierto nmero de veces. La exactitud se expresa en trminos de error, generalmente como error relativo (Ver ms adelante SESGO).

RECUPERACIN: Corresponde a la diferencia (en porcentaje) entre la concentracin medida de un analito en una muestra fortificada (a la que se le ha agregado una cantidad conocida de estndar) y la concentracin medida en la misma muestra sin fortificar, dividido por la concentracin de sustancia agregada.

Definiciones

INCERTIDUMBRE: Se puede distinguir entre los siguientes conceptos:

Incertidumbre genrica: Duda acerca de la composicin qumica de un objeto o una muestra. Es lo contrario a informacin. Incertidumbre especfica: Intervalo de valores en que puede encontrarse un resultado, una media de los mismos y el valor considerado verdadero. SELECTIVIDAD: Capacidad de un mtodo analtico para originar resultados que dependan de forma exclusiva del analito, para su identificacin y/o cuantificacin.

a)

b)

Error vs Incertidumbre
Resultado de un anlisis: 2,5 0,8 mg / Kg
Valor certificado: 2,9 0,2 mg / Kg Error: 2,9 2,5 = 0,4 mg / Kg Incertidumbre: 0,8 mg / Kg

PROCEDIMIENTOS

I.

Calibracin del mtodo

1) Procedimiento para construir una Curva de calibracin

Preparar una batera de estndares de concentracin conocida en el solvente apropiado, dentro del intervalo de concentraciones en que se estima que estarn las muestras a analizar. Posteriormente determinar la seal analtica que origina cada una de las soluciones, y

Realizar una inspeccin preliminar, graficando los puntos experimentales disponibles y verificando visualmente si existe alguna desviacin de la linealidad y aproximadamente a partir de qu valor sta se manifiesta. A partir de la curva de calibracin estimar la parte lineal, obtener la recta de calibracin: Y = S C + Yb, donde C es la masa o la concentracin de la sustancia a ser cuantificada y S e Yb la pendiente y ordenada en el origen de la recta, respectivamente. Calcular los coeficientes S, Yb y r (coeficiente de correlacin) para la curva de calibracin, descartando los puntos preliminarmente eliminados en la etapa anterior. Calcular tambin los lmites inferior (LI) y superior (LS) a partir de los cuales los cuocientes (seal / masa) o (seal / concentracin) indiquen que un punto est fuera del intervalo lineal LI = 0,95s y LS= 1,05s, respectivamente.

Verificar si existe algn punto preliminarmente incluido en la curva de calibracin que, por comparacin con los lmites de corte calculados en b) debera de ser excluido (o sea, si el correspondiente cuociente (seal / masa) o (seal / concentracin) es menor que LI o mayor que LS) o si algn punto inicialmente excluido debera de ser considerado para el clculo de la curva de calibracin.

Inclusin o exclusin de nuevos valores en la curva: Si el examen hecho en c) indica que todos los puntos de la curva preliminarmente incluidos (o excluidos) lo han sido correctamente, el procedimiento est terminado. En caso contrario, repetir las etapas de b) a d), incluyendo o excluyendo los puntos necesarios, hasta que ningn valor sea rechazado o considerado para el clculo de la curva de calibracin.

EJEMPLO Curva calibrado

Los siguientes datos son las reas mximas relativas en cromatogramas de disoluciones patrn de metil vinil cetona (MVK): Determine la recta por el mtodo de los mnimos cuadrados Una muestra dio una seal para MVK con un rea relativa de 10,3. Calcule la concentracin de MVK en la muestra. Dos evaluaciones adicionales de la muestra dieron como resultado las siguientes reas; 10,8 y 10,1. Calcule la precisin de esta determinacin.

Conc. MVK, mM 0,5 1,5

rea relativa 3,02 9,00

2,5
3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

15,03
21,42 27,03 32,97 39,00 44,20 47,00 50,20

I.

Calibracin del mtodo

2) Adicin de estndares
Cuando en el proceso de calibracin del mtodo, se determine que hay interferencia de la matriz, utilizar el mtodo de la adicin estndar de acuerdo a los siguientes procedimientos alternativos. a) Con muestra sinttica: Utilizar una mezcla preparada en el laboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestra sin el principio activo a determinar, luego enriquecer con estndar a diferentes niveles de concentracin. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra sinttica y se agregan cantidades variables del estndar. (curva en presencia de matriz)

cido oxolnico

Curva de Calibracin de Estndar de cido Oxolnico

Curva de Calibracin de cido Oxolnico en matriz

Curva Oxolnico
15000000 y = 42084x - 9036,7 R2 = 0,9997
rea

Curva Calibracin c. Oxolnico en Matriz

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0,00 y = 19162x + 4564,4 R2 = 0,9982

rea

10000000 5000000 0 0,00

100,00 200,00 300,00 400,00 Conc: (ng/ml)

50,00 100,00 150,00 200,00 Conc. (ng/g)

I.

Calibracin del mtodo

2) Adicin de estndares
b) Con muestra: Cuando no es posible contar con una muestra sinttica (o matriz blanco), trabajar directamente con una muestra real. Determinar por duplicado la seal promedio del analito en la muestra, con el mtodo a validar; una vez conocida la seal promedio, proceder a enriquecer las muestras con estndar a diferentes niveles de concentracin. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades variables del estndar.
La ICH (International Conference Harmonization), recomienda preparar muestras independientes por triplicado a cada nivel de concentracin.

EJEMPLO Adicin estndar

En una muestra de agua de mar se determina cobre por voltamperometra de redisolucin andica (ASV). Una alcuota de 5 ml de muestra es diluida en un matraz de 10 ml con agua destilada. Enseguida en tres matraces de aforo de 10 ml se agrega una alcuta de 5 ml de muestra y respectivamente se agrega un volumen de 1, 2 y 3 ml de solucin estndar del analito de 10 g/l. Las seales respectivamente obtenidas son: 4,11 A; 6,15 A; 7,99 A y 10,05 A. Determinar la concentracin de cobre en la muestra. Cu, g/l 0 1 2 3 Seal, A 4,1 6,15 7,99 10,05

ejemplo adicion estndar.xls

I.

Calibracin del mtodo

3) Uso de estndar interno

Siempre que sea posible, particularmente en cromatografa, debe emplearse un estndar interno (explicar diferencia con estndar subrrogate), puesto que esto minimiza los errores debidos a la adsorcin en superficies, a la prdida durante la extraccin, a las prdidas durante la evaporacin del solvente, o durante los procedimientos de derivatizacin, y la irreproducibilidad debida a las tcnicas de transferencia y de inyeccin. Los estndares internos deben ser, idealmente, un homlogo del analito. Si esto no es posible, se elegir un compuesto que posea propiedades fsicoqumicas similares a las del analito. Las propiedades cromatogrficas del estndar interno deben ser tales que eluya muy cerca del analito pero an as, completamente resuelto de cualquier otra sustancia presente.

EJEMPLO Estndar Interno

Los siguientes datos de calibracin han sido obtenidos en una determinacin de benzopireno (BP) por GC-MS. Como estndar interno se utiliz pireno (C13). Construya la curva de calibrado correspondiente.
Conc. BP, ppm Area BP Area estndar interno Area relativa

0,1 0,5
1,0 5,0 10,0

1100 5200
18000 59000 95000

8600 8000
12800 9100 7300

0,13 0,65
1,41 6,48 13,01

II.

Procedimiento para determinar la sensibilidad

Una vez establecida la curva de calibracin de acuerdo al procedimiento anterior, determinar la pendiente de la curva (S), lo cual define la sensibilidad del mtodo.

Curva Oxolnico
15000000 y = 42084x - 9036,7 R2 = 0,9997
rea

Curva Calibracin c. Oxolnico en Matriz

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0,00 y = 19162x + 4564,4 R2 = 0,9982

rea

10000000 5000000 0 0,00

100,00 200,00 300,00 400,00 Conc: (ng/ml)

50,00 100,00 150,00 200,00 Conc. (ng/g)

III.

Procedimiento para determinar el lmite de deteccin IUPAC

Medir la respuesta de al menos 10 blancos analticos independientes, de los que se deduce la media YB y la desviacin estndar B. De acuerdo a la IUPAC, el lmite de deteccin es: YLD = YB + 3 B

A una seal YLD le corresponde una concentracin CLD, lo que se consigue por extrapolacin grfica en la curva de calibrado.

YLD

Curva de Calibrado

CLD

El lmite de deteccin debe expresarse en unidades de concentracin

EJEMPLO LD

Para estudiar la sensibilidad de un mtodo de determinacin de qunina en agua tnica se han realizado dos series de experimentos. En la primera, se realizan 11 medidas repetidas del blanco (agua tnica en ausencia de quinina suministrada por el fabricante) y se obtiene los siguientes datos de intensidad de fluorescencia: 0,70; 0,74; 0,72; 0,71; 0,73; 0,71; 0,73; 0,74; 0,70; 0,69 y 0,75. En otra serie de experimentos, al agua tnica sin quinina, se le aaden cantidades crecientes de quinina para preparar 7 muestras artificiales, obtenindose los siguientes resultados:

Quinina, ug/L Intensidad de Fluorescencia

1,0 2,51

2,0 4,60

3,0 6,52

4,0 8,60

6,0 12,71

8,0 16,68

10,0 20,81

Determinar la sensibilidad y lmite de deteccin del mtodo

ejemplo Limite deteccion quinina.xls

IV.

Procedimiento para la determinacin del Lmite de Deteccin Instrumental (LDI)

Agregar una alcuota de solucin estndar de analito en agua pura o en el solvente adecuado, de manera de obtener una concentracin correspondiente a 2-10 veces el LDI estimado (obtener el lmite estimado alternativamente de valores reportados en literatura, catlogo del equipo, razn seal / ruido, etc.). Someter esta solucin a medicin (n replicas independientes de la solucin) en el sistema instrumental. Se determina la seal analtica Yb y su desviacin estndar (B) de acuerdo a la siguiente expresin: B = ( (Xi- promedio)2/n-1)1/2

La expresin para calcular el lmite de deteccin instrumental es la siguiente: YLD = 3 B n 10 Despus utilizando la curva de calibrado se obtiene la concentracin en el lmite de deteccin.

V.

Procedimiento para la determinacin del Lmite de Deteccin del Mtodo (LDM)

Determinar el lmite de deteccin del mtodo en una muestra real, segn el siguiente procedimiento

1) Si la concentracin del compuesto analizado se sita entre 2 y 10 veces la concentracin del lmite de deteccin estimado, pasar a la etapa siguiente. Si por el contrario la concentracin es demasiado elevada, cambiar de muestra. Si la concentracin es demasiado baja, ajustar mediante la adicin de un estndar la concentracin del compuesto de inters, para situarla entre 2 y 10 veces el lmite de deteccin estimado. 2) Separar a lo menos 10 alcuotas de la muestra utilizada para evaluar el LDM y realizar todas las etapas implicadas en el mtodo analtico.

V.

Procedimiento para la determinacin del Lmite de Deteccin del Mtodo (LDM)

A partir de los resultados obtenidos, calcular la media y la desviacin estndar (B) de las replicas:
La expresin para calcular el lmite de deteccin del mtodo es la misma anterior.

3)

VI.

Procedimiento para la determinacin del lmite de deteccin de un mtodo analtico, a travs de la construccin de una curva de calibracin
Construir curva de calibracin, sobre matriz de muestra, en un intervalo de concentraciones cercano al cero (lo ms bajo que pueda ser detectado) (n 4) . A partir de la curva, determinar:
a) b) Ordenada en el origen de la lnea de regresin: YB Desviacin estndar de la regresin (se obtiene con cualquier programa estadstico): y/x
y/x (yi n 2 yi) 2

1)

2)

Donde: yi: Valor observado del punto en la ordenada i: Valor terico del punto obtenido por la prediccin del modelo de regresin n: Nmero de puntos de la curva de calibracin (n 4) c) Pendiente de la curva de calibracin: S

VI.

Procedimiento para la determinacin del lmite de deteccin de un mtodo analtico, a travs de la construccin de una curva de calibracin

3) Calcular Lmite de deteccin:

Seal del Lmite de deteccin: yLD = yB + 3 sy/x Concentracin del Lmite de deteccin se calcula haciendo uso de la ecuacin de la curva de calibracin.

VII.

Procedimiento para la determinacin del Lmite de Cuantificacin del Mtodo (LCM)

El lmite de cuantificacin del mtodo se determina siguiendo el mismo procedimiento que el usado para el LDM pero finalmente en la expresiones respectivas el factor 3 se sustituye por 10.

VIII.

Ej: Procedimiento para la determinacin del lmite de cuantificacin de un mtodo analtico, a travs de la construccin de una curva de calibracin

El lmite de cuantificacin del mtodo, a travs de una curva de calibracin, se determina siguiendo el mismo procedimiento que el usado para el LDM, pero finalmente la expresin que debe considerarse es: Seal del Lmite de cuantificacin:

yLCM = yB + 10 sy/x
Concentracin del lmite de cuantificacin a travs de la curva de calibracin

IX.

Procedimiento para calcular replicabilidad (Precisin)

la

Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el lmite de cuantificacin del mtodo, separar 10 alcuotas de una muestra y aplicarles el mtodo completo, respetando las siguientes condiciones: mismo analista, mismo instrumento y mismo da. Para realizar los clculos que requiere el mtodo e informar los resultados, utilizar las unidades apropiadas y el nmero de cifras significativas necesarias. La replicabilidad se expresa como la desviacin estndar relativa o coeficiente de variacin (CV).

X.

Procedimiento para calcular repetibilidad (Precisin)

la

Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el lmite de cuantificacin del mtodo, separar 10 alcuotas de una muestra y aplicarles el mtodo completo, cambiando al menos una de las siguientes condiciones: el analista, el instrumento o el da. Para realizar los clculos que requiere el mtodo e informar los resultados, utilizar las unidades apropiadas y el nmero de cifras significativas necesarias. Los resultados se expresan como desviacin estndar relativa o coeficiente de variacin (CV).

XI.

Procedimiento para determinar la exactitud

Dentro del intervalo de determinacin, aplicar el mtodo analtico completo n veces (n = 3-10 replicas) a una muestra en la cual el parmetro a medir est certificado por un organismo reconocido (material de referencia certificado). Para determinar el error relativo del mtodo (E, %), aplique la siguiente ecuacin:
E(%) (Vo Vc) 100 Vc

Vc = Valor certificado; Vo = media de los valores obtenidos aplicado el mtodo.

Adems, puede ser necesario hacer el clculo estadstico para la equivalencia con el material de referencia, utilizando el test de varianzas homogneas

XI.

Procedimiento para determinar la exactitud

Si no existe o no est disponible el material de referencia, la determinacin de la exactitud puede llevarse a cabo de acuerdo a una de las siguientes posibilidades, y en siguiente orden de prioridad: 1) Comparacin del mtodo en la misma muestra, con un mtodo absoluto Comparar el mtodo con un mtodo independiente, ya sea ste de referencia o validado previamente. Recuperacin en una matriz real con 2 niveles de concentracin distintos. Los niveles de concentracin deben estar, en un caso entre 2 y 10 veces el LCM y en el otro, entre 20 y 30 veces el LCM. Intercomparacin entre metodologas validadas. a lo menos 2 laboratorios que utilicen

2)

3)

4)

XII. Procedimiento para determinar la recuperacin

Analizar una muestra real y en paralelo analizar la misma muestra a la que se ha agregado una concentracin dada de estndar. La concentracin final debe estar dentro del rango de determinacin del mtodo. Calcular la recuperacin de acuerdo a la siguiente expresin:
(Cs C) 100 Ca

Recuperacin (%)

Cs = concentracin de la muestra fortificada

C = concentracin en la muestra no fortificada

Ca= concentracin agregada.

XIII. Procedimiento para el clculo de la incertidumbre

Cuantificacin de los componentes de incertidumbre.
Una forma comn de presentar las diferentes contribuciones a la incertidumbre de la medicin total es usar los diagramas de causa y efecto. Este enfoque puede resultar muy til cuando se estudia o cuantifica componentes de incertidumbres individuales. Se ha demostrado, sin embargo, que en algunos casos esta metodologa subestima la incertidumbre de las mediciones, dado que es difcil poder incluir todas las posibles contribuciones de incertidumbre en tal enfoque. En este contexto, el grupo de expertos en calidad y metrologa de Nordtest (2004) ha propuesto el modelo para el clculo de la incertidumbre en el que la repetibilidad (P. intermedia) de las mediciones se combina con la estimacin del sesgo del mtodo. As, usando el control de calidad existente y los datos obtenidos en la validacin del mtodo analtico, la probabilidad de incluir todas las contribuciones de incertidumbre se maximiza.
Sesgo: Diferencia entre el valor medio medido a partir de una serie de resultados de ensayo y un valor de referencia aceptado (un valor certificado o nominal).

XIII. Procedimiento para el clculo de la incertidumbre

En este plano, un laboratorio puede combinar dichos componentes individuales en 2 tipos de incertidumbre: incertidumbre derivada de la repetibilidad (P. Intermedia) del mtodo (urep) y la incertidumbre derivada del sesgo (usesgo). La manera ms comn de estimar los componentes del sesgo son: el uso de material de referencia certificado, participacin en rondas interlaboratorios o ensayos de recuperacin.

XIII. Procedimiento para el clculo de la incertidumbre

Clculo de Incertidumbre Expandida (U).
Para realizar el clculo de U, se deben determinar previamente las dos incertidumbres estndares antes expuestas. Clculo de incertidumbre repetibilidad del mtodo (urep):

urep =

*t (0.95, n 1) n

Donde: = Desviacin estndar al nivel de repetibilidad. t = Coeficiente de student para un 95% de nivel de confianza. n = nmero de datos.

XIII. Procedimiento para el clculo de la incertidumbre

Clculo de incertidumbre derivada del sesgo (usesgo):

usesgo =
Donde:

(sesgo) 2

(uCER) 2

sesgo = el valor puede ser determinado alternativamente por medio del anlisis de un material de referencia certificado, participacin en rondas interlaboratorios o ensayos de recuperacin .
u(CER) = Incertidumbre del material de referencia certificado o del patrn de referencia (valor certificado) utilizado en el ensayo de recuperacin

XIII. Procedimiento para el clculo de la incertidumbre

Finalmente la incertidumbre expandida (U) del proceso analtico, se expresa combinando ambas incertidumbres antes mencionadas, considerando un factor de recubrimiento igual a 2:

U=

2 (urep) 2 (usesgo) 2

Incertidumbre Expandida (U): Cantidad que define un intervalo alrededor del resultado de una medicin que se espera que abarque una gran parte de la distribucin de valores que se podran atribuir razonablemente al mensurando, para un cierto nivel de confianza. Una Incertidumbre expandida (U) se calcula de una incertidumbre estndar combinada (u) y un factor de cobertura k usando: U = k x u.

EJEMPLO Calculo incertidumbre

Determinacin de BTEX
Se lleva a cabo una determinacin de benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (m+p, o) en una muestra de agua. El estndar de calibracin corresponde a una solucin en metanol que certifica que las concentraciones de los compuestos son las nominales 0,5%. El sesgo del mtodo fue determinado a travs de un ensayo de recuperacin, con los siguientes datos (O: valor promedio obtenido; R: valor de referencia):

Benceno g/g O
10,2

Tolueno g/g O
9,9

E-Bz g/g O
11,5

(m+p)-XIL g/g O
25,0

o-XIL g/g O
11,1

R
11,0

R
11,0

R
11,0

R
11,0

R
11,0

Determinacin de BTEX
En la validacin del mtodo analizaron separadamente 8 alcuotas de una muestra real obtenindose las siguientes concentraciones:
N g/g BEN g/g TOL g/g ET-BEN g/g (m+p)-XIL g/g o-XIL

1 2 3 4 5 6 7 8

43,42 43,41 43,52 43,60 43,61 43,57 42,17 42,29

48,62 48,44 48,20 48,27 48,41 48,56 47,63 47,70

32,14 32,17 31,36 31,14 31,91 31,80 31,21 31,25

44,15 44,64 44,67 43,68 44,22 44,67 45,33 43,03

14,15 13,07 13,59 13,06 12,91 12,96 13,19 12,80

Ejemplo incertidumbre.xls

1. Para la determinacin analtica de nitrofurantona en formas farmacuticas se aaden cantidades crecientes de la droga de la droga en dimetilformamida (DMF). En seguida se mide la respuesta instrumental (seal analtica) de cada solucin y se obtienen los siguientes datos:
CONCENTRACIN mg/l 0 0,5 Respuesta Instrumental 0,01 0,058

1
2 4 6 8 10

0,11
0,225 0,445 0,67 0,89 1,08

12
15 20

1,1
1,12 1,11

(a)Determine la Sensibilidad del mtodo. Por otra parte, al no disponer de un material de referencia certificado, se prepara una muestra artificial de tableta que contiene 750 mg de excipientes comunes (estereato de magnesio, talco, almidon, colorante, gelatina etc.) y 250 mg de nitrofurantoina pura. Una porcin de 10 mg de muestra artificial se agrega en un matraz de aforo de 1 litro y se afora con DMF. A la solucin resultante se le determina su respuesta instrumental dando un valor de 0,272. (b) Determine la exactitud del mtodo (error relativo) e indique si hay interferencia por parte de los excipientes de la formulacin. 10 muestras que contienen slo la mezcla de excipientes (sin nitrofurantona) son analizadas independientemente por el mtodo. Las respuestas instrumental obtenidas son: 0,015; 0,010; 0,012; 0,015; 0,010; 0,012; 0,009; 0,010; 0,015; 0,008. (c) Determine el lmite de deteccin del mtodo. 10 porciones de una muestra real de tabletas de nitrofurantona se analizan independientemente por el mtodo analtico y se obtienen los siguientes resultados (mg): 250,35; 250,44; 249,36; 248,99; 250,98; 250,00; 249,98; 251,05; 250,39; 248,98. (d) Determine la precisin del mtodo (desviacin estndar relativa).

Rechazo de datos dudosos

Un dato dudoso difiere excesivamente de la media. La prueba estadstica Q se utiliza para decidir si un dato debe retenerse o rechazarse. Primero se calcula un valor de Qexp y se rechaza el dato cuando el valor es mayor que el valor estadstico (Qcrit)

Qexp

xq

xn

xm ax xm in

, xq es el valor dudoso.

xn es el valor ms cercanoal valor dudoso.

Valores de Qcrit
Nmero de Datos 3 4 5 Qcrit a 90% de probabilidad 0.941 0.765 0.642 Qcrit a 95% de probabilidad 0.970 0.829 0.710

0.560

0.625

Ejemplo: Prueba Q
Valor (x)

x2 12.25 9.61 9.61 10.89 6.25

(x2)=48.61

Para las mediciones replicadas que aparecen al lado, aplique la prueba Q para el valor 2.5. Use un Qcrit a 90% de confianza.

3.5 3.1 3.1 3.3 2.5

(x)=15.5

Qcrit Qexp Qexp

0.642 para 5 valores y a 90% de probabilid ad. 2.5 3.1 0.60 3.5 2.5 Qcrit , se retiene el valor.

EJEMPLO Dato dudoso

En el mundial de ftbol de Alemania 2006, al final de cada partido, llevan a un par de jugadores para hacer la prueba del doping. En la orina se determinan si hay substancias prohibidas (en este caso efedrina). Previamente el laboratorio que hizo el anlisis valid su mtodo con muestras certificadas de efedrina en orina. Esta tena un contenido certificado de 2,05 0,08 ng/ml. Al analizar esta muestra diez veces de manera independiente se obtuvieron los siguientes valores en ng/ml: 2,08; 2,14; 2,09; 2,21; 3,91; 2,01; 2,09; 1,99; 1,98; 2,05. Indique: cul es el objeto, el analito y la muestra para el anlisis. cul es la exactitud y precisin del mtodo que utiliza el laboratorio. Qcrit (tabla (n=10) 0,464)

ejemplo prueba Q.xls

Cartas de Control
Una vez que ha sido validada una metodologa y se comienza con su aplicacin en anlisis de rutina, todos los controles de calidad

relacionados con las propiedades analticas deben ser documentadas a

travs de la construccin de Cartas de Control, de forma tal que el comportamiento del mtodo en el tiempo pueda ser trazable.

EJEMPLO

carta control turbiedad.xls

GLOSARIO

Alcuota: porcin bien definida (masa, volumen) de la muestra Muestra: es la parte (alcuota) del objeto que contiene los analitos Anlisis: someter una muestra a un proceso analtico para conocer informacin qumica sobre la misma Blanco analtico: Muestra, generalmente artificial, que no contiene el analito. Tericamente no debera originar seal, si lo hace sta se denomina seal blanco. El blanco analtico es un elemento de control de calidad utilizado en la rutina analtica el que se procesa como una muestra ms en un anlisis Interferente: Todo compuesto, todo elemento, toda partcula o todo factor que afecte el resultado generado por un mtodo analtico Determinacin (cuantificacin): proceso para conocer la cantidad /concentracin de un analito (o familia) de una muestra que es analizada Detectar: Accin de un instrumento para producir una seal y transducirla en una magnitud fsica fcilmente medible. Proceso de medicin con fines cualitativos.

Identificar: proceso analtico cualitativo que implica un reconocimiento del analito, a travs de las caractersticas qumicas o fisicoqumicas del mismo o de su producto de reaccin
Caracterizar: accin de establecer los aspectos diferenciales de un objeto o sistema, a partir de los resultados analticos

Tcnica: principio cientfico que se utiliza para extraer informacin analtica. Implica el empleo de un instrumento Mtodo Analtico: corresponde a la Adaptacin especfica de una tcnica analtica para un propsito de medicin seleccionado. Es un conjunto de operaciones especificas para caracterizar cuali y/o cuantitativamente a un analito (o familia) en una determinada muestra. Implica el empleo de un tcnica (instrumento)

Mtodo absoluto: es aquel mtodo de cuantificacin calculable que no se basa en el empleo de estndares analticos
Procedimiento: descripcin pormenorizada de una metodologa analtica Material de referencia: Material o sustancia, en el cual una o ms de sus propiedades estn suficientemente bien establecidas, homogneas y estables, que se emplean para calibracin, asignacin de valores a materiales o evaluacin de mtodos analticos Material de referencia certificado: son materiales de referencia que tienen certificados uno o varios valores de sus propiedades (con sus incertidumbres especficas) obtenidos por procedimientos especiales (Ejemplo: ejercicio de intercomparacin) bajo la responsabilidad de un organismo competente e independiente Ejercicio de intercomparacin: conjunto de procesos de medida (mtodo) llevados a acabo por diferentes laboratorios, bajo la coordinacin de un ente competente, para analizar alcuotas de la misma muestra para determinar los mismos analitos

Referencias

J.C. Miller and J.N.Miller, Statistic for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limited edition, Chichester, England, 3rd edition, pag. 115-118, 1993. M. Valcarcel, Principios de Qumica Analtica, Springer-Verlag Ibrica, Barcelona, Espaa, 1999. Norma IRAM 301:2000-Norma ISO/IEC 17025: 1999. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington: 1998. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Guide EURACHEM- CITAC Guide: 2000. Nordtest Report 537. 2004. Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental Laboratories.

Norma ISO 9000: 2000.

IUPAC, Limit of Detection, Spectrochim. Acta 33 B, 242, 1978. Centre d'expertise en analyse environnementale du Qubec. Protocole pour la validation d'une mthode d'analyse en chimie DR-12-VMC. Edition 2000-03-01