CULTIVO DE MICROORGANISMOS. MTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS Y SELECCIN DE COLONIAS. TCNICAS DE TRANSFERENCIA DE CULTIVOS.

Un medio de laboratorio en el que crecen bacterias u otros microorganismos, se denomina cultivo y las condiciones que un medio de cultivo debe cumplir parar obtener colonias es que contenga los nutrimentos esenciales para el crecimiento de una determinada especie microbiana y que se proporcionen las condiciones ambientales especficas para favorecer el crecimiento. Las diferentes especies bacterianas, cuando crecen en el mismo medio de cultivo lo hacen en forma distinta. Por esto, es conveniente conocer la apariencia o caracterstica de crecimiento y desarrollo de la especie, para poder reconocer ciertos tipos de bacterias y porque este conocimiento puede servir de ayuda para la identificacin de las especies. Muchas especies microbianas diferentes habitan normalmente diversas partes de nuestro organismo y nuestro ambiente, sin perjudicar (flora normal). Esto a su vez, exige que se disponga de tcnicas adecuadas para desenbrollar la compleja poblacin mixta de microorganismos (cultivo mixto) en sus distintas partes integrantes; esto es, para cultivar cada especie sola (cultivo puro) y determinar las caractersticas del cultivo mismo. As un cultivo puro es una poblacin de clulas, las cuales proceden de una sola. Este estado es un estado artificial, impuesto en el laboratorio y con el objetivo de aislar diferentes especies en cultivos puros de una mezcla de muchas especies. Idealmente, uno debera aislar una sola clula bacteriana y luego transferirla a un medio estril hasta que se divida para generar mas bacterias, todas derivadas de una clula original. Una poblacin de este tipo se denomina clona, y en este caso, uno puede tener la certeza de que la hererncia de cada miembro de la poblacin es idntica, excepto por las imitantes espontneas.

MTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS.

Los mtodos para el aislamiento de cultivos puros son los siguientes: "Tcnica de siembra en placa por estras. Este mtodo consiste en que sobre la superficie de un medio slido se deposita con un asa de inoculacin, una pequea cantidad de la muestra bacteriana que se distribuye en lineas sobre la superficie o extendindola sobre ella. En este proceso, la aguja de siembra se flamea durante cada una de las etapas de la misma, pues se trata de obtener un aislamiento esto es, reducir el nmero de microorganismos iniciales para obtener colonias aisladas, de otra manera, si el asa no se flameara el nmero de microorganismos que se arrastrara durante el procedimiento sera mayor y dificultara la obtencin de colonias aisladas. *Tcnica de siembra en placa por extensin en superficie. Para hacer la extensin en superficie se utiliza una varilla angular de vidrio esterilizada. En esta operacin se van extendiendo las bacterias sobre la superficie del agar; las bacterias individualmente se separan unas de otras. Cuando se lleva a cabo la tcnica adecuadamente, existen zonas de la placa en las que las clulas bacterianas quedan lo bastante separadas para que en la incubacin no se mezcle la colonia procedente de una clula con la procedente de otra. Se supone, razonablemente, que cada colonia aislada est formada por la descendencia de una sola clula y es por consiguiente un cultivo puro. En aquellas especies que forman agrupaciones caractersticas por ejemplo, estafilococos y estreptococos, las colonias se desarrollan de un grupo de clulas idnticas y tambin representan un-cultivo puro. "Tcnica de vertido en placa. En este caso, la adicin de la muestra, con la consiguiente extensin de la poblacin bacteriana, se realiza en tubos de agar fundido. Para obtener colonias bien aisladas, es preciso hacer una serie de diluciones en varios tubos, puesto que no se conoce de antemano la magnitud de la poblacin bacteriana contenida en la muestra original. Si el medio (agar) fue esterilizado en ese momento, debemos considerar que la temperatura de fusin del agar es de 100C , por lo que antes de utilizarlo es preciso enfriarlo hasta una temperatura de 45C debido a que el calor disminuye la humedad que se condensa cuando el agar se solidifica en las cajas, evitando asimismo que la temperatura del agar destruya o disminuya la carga microbiaf, pero este enfriamiento, no debe ser menor que la temperatura de solidifcacin del agar que es de 40C.

As, el medio se debe mantener durante toda la operacin en estado lquido (45C), para conseguir la distribucin uniforme del material de inoculacin. El contenido de cada tubo despus de mezclarlo, se vierte por separado en cajas Petri, y se deja solidificar para posteriomente incubar. Como algunos de los organismos quedan incluidos en el cuerpo del medio nutritivo cuando este se coagula, despus de la incubacin aparecen colonias tanto en la superficie como por debajo de la misma.

En los tres mtodos de aislamiento, una vez realizado el procedimiento, se deben incubar en posicin invertida las cajas Petri a la temperatura ptima de crecimiento de los microorganismos y se observa su crecimiento despus de un perodo de 24-48 hrs. Se acostumbra incubar siempre las cajas en posicin invertida para evitar que el agua que se condensa en el interior de la cubierta gotee sobre la superficie del crecimiento ya que la condensacin puede dispersar y mezclar los microorganismos haciendo imposible el aislamiento de colonias puras. Para el aislamiento de ciertos tipos bacterianos especficos, estos procedimientos pueden hacerse mas eficaces y rpidos utilizando medios selectivos o diferenciales y tambin se puede tratar previamente la muestra, antes de sembrarla en placa, para eliminar las bacterias distintas de las que se pretende aislar.

SELECCIN DE COLONIAS PURAS. La seleccin de colonias debe hacerse seleccionando una colonia bien aislada de cada cepa y con una aguja de inoculacin, se transfiere un poco de material de cada colonia a cajas Petri coh^agar nutritivo, utilizando la tcnica asptica habitualmente, para evitar contaminacin, utilizando la tcnica de siembra por estras para lograr el mximo crecimiento, el cual es el objetivo en esta etapa, ya no el aislamiento, incubando a la temperatura ptima de crecimiento del microorganismo durante 24 hrs. De ordinario, es posrble determinar cuando una colonia aislada se ha originado a partir de una sola clula bacteriana de cualquiera de las cepas de una mezcla; la colonia pura tiende a tener una forma regular (redonda) y nunca est en contacto con otras colonias. Cualquier colonia que est en contacto con otra colonia no es pura y debe descartarse. Una vez que se ha aislado un cultivo puro siguiendo una tcnica aceptable para comprobar que el cultivo es realmente puro se deben de utilizar medios de cultivo selectivos, asi como realizar pruebas bioqumicas confirmativas que permitan la identificacin del microorganismo.

TCNICAS DE TRANSFERENCIA DE CULTIVOS.

La transferencia de microorganismos de un ambiente a otro, se realiza con el propsito de cultivar los microorganismos, y esta puede realizarse en medio slido, en tubos de agar inclinado, para observar el tipo de crecimiento de los microorganismos teniendo una mayor superficie de crecimiento, o en medio lquido, en caldo nutritivo, en donde se pueden observar ciertas caractersticas del cultivo que pueden ser afectadas por las condiciones fsicas (T, Aw, 2, pH). As de acuerdo a sus necesidades de oxgeno, tenemos que los microorganismo aerobios presentan crecimiento en la superficie del tubo, los microorganismos anaerobios presentan crecimiento, como sedimento en el fondo del tubo y los anaerobios facultativos lo presentan uniformemente a lo largo del tubo. Siempre exiten muchos microorganismos en el ambiente, en el aire que nos circunda y en toda superficie. Debido a esto es necesario tomar las precauciones para impedir que estos contaminantes (microorganismos perjudiciales presentes en una poblacin) penetren en los tubos, cajas, etc. Los microorganismos, al igual que las personas, requieren de una provisin de alimentos continua, tanto como de la eliminacin de sus productos de desecho, por lo que despus de que una poblacin ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o caja, debe ser transferida a un medio de cultivo nuevo, de otra manera, la supervivencia y el crecimiento no pueden continuar. El asa de inoculacin se emplea para transferir el cultivo de un tubo a otro, ya que esta puede arrastrar un mayor nmero de microorganismos que la aguja y abarcar una mayor superficie del agar. En un tubo con agar inclinado el crecimiento de los microorganismos se limita a la superficie del medio. Los microorganismos nunca se encuentran enterrados en el agar, por lo que al sacar los microorganismo del tubo, debe tocarse nicamente el material sobre la superficie del agar.
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La creencia de que para que la transferencia sea exitosa el asa debe extraer gran cantidad de material de cultivo es un error. Una colonia bacteriana (poblacin aislada de microorganismos en un medio de cultivo slido, visible macroscpicamente) del tamao de la cabeza de un alfiler puede contener varios millones de microorganismos. Es pues obvio, que una cantidad pequesima que se adhiera al asa es mas que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. El procedimiento de transferencia principia con el flameado del asa, hasta que est al rojo vivo para luego enfriarla por 10-15 seg. Luego, con la otra mano se sostiene el tubo de donde se van a tomar los microorganismos y se le quita la tapa. Se sostiene la tapa con el dedo meique de la mano derecha hasta que sea tiempo de volver a tapar el tubo. Nunca se deja un tapn de algodn o tapa sobre la mesa porgue eso contaminara el cultivo.

La boca del tubo se pasa por la flama del mechero para destruir cualquier microorganismos indeseable que pueda haberse adherido al vidrio. Luego el asa estril, se introduce en el tubo y con ella se extrae un poco de material microbiano. Al sacar el asa, se vuelve a flamear la boca del tubo y luego se vuelve a tapar. Luego se toma el nuevo tubo y se flamea como el primero, se introduce el asa en el tubo y los microorganismos se depositan, ya sea dentro del medio cuando se trata de caldo de cultivo o medio lquido, o bien se raya con suma suavidad sobre la superficie del agar, trazando varias lneas, cuando se trata de un tubo con medio slido. i Se saca el asa, se flamea el tubo y se vuelve a tapar. Finalmente, el asa se flamea para destruir los microorganismos adheridos a ella.