Two hybrid system.

Gal4 Gal4 Gal4

His

Plsmido con dominio de unin a ADN (Binding Domain) Cdc25 Genoteca

Cdc25

His
Plsmido con dominio de activacin (Activation Domain)

Cepa de levadura
Leu- Trp-

Controles

Control negativo

Sembrar en Medio:

LeuTrpHis-

Genoma: Gal4 UAS HIS+ Gen reportero - trp -leu -his

Los plsmidos vacos no pueden dar positivo!

Controles

Control negativo

Controles

Control positivo (alguna protena que sepamos que interacciona con Cdc25)

- his, -leu,-trp,

- his, -leu,-trp,

Hay que comprobar que Cdc25 no interacciona con el dominio de activacin por s mismo!

Picar las colonias de levaduras PASOS A SEGUIR Medio de levadura leu - his, -trp, -leu
(para conservar solamente el plsmido que lleva leu)

Cotransformar las levaduras con los plsmidos

Miniprep Levaduras
Sembrar Rplicas
(muy baja eficiencia)

Transformacin E. Coli
(para tener ms cantidad de plsmido)

Aislar e identificar los genes con los que interacciona Cdc25. - his, -trp, -leu,

LB + Amp

- trp, - leu

LB + Amp

LB ampicilina

Miniprep E. coli

Anlisis de resticcin

secuenciacin

acctgactgaaattct aggcat.