UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU

FACULTAD DE AGRONOMIA

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES - TECNICAS CLASICAS Y MODERNAS

INFORME DE FITOPATOLOGIA
Presentado por:
Chuhuala Chvez Roxana

El Mantaro, Per

2012

INTRODUCCION

Las enfermedades de las plantas tienen una notable importancia en la Agricultura moderna, no slo porque poseen el potencial de destruir enteramente las cosechas, sino porque an en los casos en que no causan prdidas totales, por lo general reducen, en forma crnica, el rendimiento de la mayora de los cultivos y obligan a tomar medidas de lucha que aumentan los costos de produccin; adems afectan la calidad y durabilidad de los productos cosechados. Es por eso que la fitopatologa va de mano con la ciencia y de esta manera se presentan tanto los mtodos clsicos y modernos en la deteccin de enfermedades El diagnstico incluye la identificacin del problema, el alcance del problema, la importancia y la magnitud del problema, el mtodo de control a costo-beneficio. emplear, y la demanda de investigacin y

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES TECNICAS CLASICAS Y MODERNAS

1. Tipos de diagnsticos
El diagnstico incluye la identificacin del problema, el alcance del problema, la importancia y la magnitud del problema, el mtodo de control a emplear, y la demanda de investigacin y costo-beneficio (Vzquez, 2003). En la prctica se realizan dos tipos de diagnstico.

1.1 Diagnstico presuntivo

Para realizar un diagnstico presuntivo confiable se deben realizar, entre otras, las acciones siguientes: 1. Examinar el campo y los alrededores. 2. Identificacin de la especie o variedad enferma. 3. Patrones de anormalidad, distribucin geogrfica de la enfermedad en el campo y comparacin de plantas. 4. Examinar plantas individuales, posicin de sntomas y signos. 5. Prcticas agrcolas del cultivo: fertilizacin, riego y control qumico. Antes de enviar una muestra para diagnosticar enfermedades o dao por insectos al laboratorio, examine la planta para otros problemas como dao por animales, factores nutricionales o ambientales. Adems, asegrese de que est enviando una muestra que tenga los sntomas ms distintivos del problema que usted est observando (MIP Forestales, 2006).

1.2 Diagnstico de confirmacin. 1.2.1 Diagnstico tradicional

Se pueden considerar dos fases (Flores- Olivas, et al, 1997):

Diagnstico macroscpico el cual se basa en la observacin de sntomas. Es muy importante la experiencia del fitopatlogo y su conocimiento de las variables que inciden en la enfermedad, como el cultivo a investigar, el suelo, clima, patgeno.

Diagnstico microscpico, que consiste en la observacin de la estructuras del microorganismo Fitopatgeno. Esta observacin puede ser directa- mente al microscopio de luz, para el caso de las bacterias, hongos, nematodos o en el uso de microscopa electrnica para identificar a los virus.

Para

el diagnstico de proceso de

los hongos se necesita la formacin de

estructuras pruebas

reproductivas, como esporas o conidios (ver figura 1 y 2) y cuando se trata de las bacterias, el identificacin debe complementarse con bioqumicas (ver figura 3) (Flores- Olivas, et al, 1997). Comnmente es necesario aplicar los postulados de Koch, para determinar con exactitud la naturaleza del problema (FloresPostulados de Koch: El microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos. El microorganismo debe poder aislarse del hospedante y crecer en cultivo puro. La inoculacin del microorganismo crecido en cultivo puro debe provocar la aparicin de sntomas especficos de la enfermedad en cuestin. El microorganismo debe ser re-aislado del hospedante infectado de forma experimental. Estos principios de Patologa Vegetal sobre los que se apoyan gran parte de las investigaciones no pueden ser cumplidos por cierto grupo de patgenos como los virus, ya que su reducido tamao y su condicin de parsitos endocelulares campo y el empleo de formas obligados (no pueden ser cultivados en medios de cultivo artificial). En este tipo de enfermedades, la observacin de sntomas en clara de ciertos patgenos. alternativas de inoculacin en huspedes diferenciales, permite una discriminacin Olivas, et al, 1997., Iaez, 1998).

Tcnicas clsicas para el diagnstico

Un requisito previo para el control de cualquier enfermedad es la deteccin e identificacin apropiada del organismo causal. La deteccin de patgenos en plantas con sntomas puede ser relativamente simple si se Por otro lado tiene extensa experiencia con el diagnstico de la enfermedad y aislamiento del patgeno. la deteccin del patgeno en las semillas y materiales de como: tubrculos de papa, pueden ser detectar un propagacin asintomtica tales propgulos. Debido nmero bajo de a esto se

sumamente difciles cuando la poblacin de los patgenos es muy baja en los necesitan tcnicas capaces de patgenos en los propgulos. Antes del desarrollo de las

tcnicas serolgicas el nico mtodo disponible y fiable para la identificacin de hongos y bacterias fue el aislamiento en medio de cultivo y prueba de patogenicidad. Las pruebas serolgicas permiten el diagnstico presuntivo de enfermedades bacterianas (Hampton, et al, 1990). Sin embargo hasta que no se desarrollaron las tcnicas basadas en ADN, no se pudo detectar los patgenos en plantas asintomticas (Shaad and Frederik, 1992).

2.1 Empleo de medios selectivos

Mediante el empleo de medios selectivos se puede realizar una

determinacin cuantitativa de

la poblacin. Algunos

medios selectivos se

basan en las posibilidades de las bacterias de utilizar sustratos especficos. La presencia o ausencia de crecimiento y el color de las colonias son importantes (Disponi- ble en http://www.apsnet.org/Education/Mlingual/ Spanish/8As.rtf). Ejemplo: Las especies del gnero Erwinia causantes de pudricin producen enzimas peptolticas que sirvieron de base para la confeccin de un medio selectivo que contiene polipectato sdico, las cavidades que se forman en la superficie del medio indican la presencia de microorganismos peptolticos. Estas enzimas degradan las pectinas de la lmina media, causando el colapso del tejido, una pudricin blanda y la muerte de la clula (Disponible en http://www. apsnet.org/Education/Mlingual/Spanish/8As.rtf).

Otros medios se basan en la tolerancia del patgeno a cierto nmero de antibiticos, fungicidas, bactericidas que los microorganismos saprfitos no toleran o no soportan en determinadas concentraciones. Se emplean tambin diferentes colorantes que provocan un crecimiento caracterstico y desarrollo de colonias cuyo aspecto

permite distinguirlas fcilmente de otros que no se corresponde con el patgeno contaminante estudiado (Stefanova, et al,1986). No resulta fcil crear un medio selectivo o semi- selectivo para un determinado patgeno porque hay que tener en cuenta su sensibilidad o sea la capacidad de recobrar la bacteria en concentraciones bajas y suprimir en forma eficiente la flora contaminante (Stefanova, et al, 1986).

2.2 Tcnica de microscopa ptica y electrnica

El empleo de estas tcnicas se limita solamente a la observacin directa de las estructuras del patgeno en cuestin (Pupiro y Malagn, 2003).

2.3 Tcnicas serolgicas

El uso de inmuno ensayos en la deteccin de patgenos de plantas ha sido rutinario en los ltimos aos, especialmente en virus (Clark, 1981 y Millar, 1988). Entre los ms usados estn: Mtodo por aglutinacin: Consiste en hacer reaccionar cantidades los reactantes (Ag y Ac). La formacin de reaccin positiva. grnulos Las reacciones de equivalentes de

aglutinados o agregados indica una

aglutinacin son menos especficas pues tienen la desventaja de depender grande- mente de los factores fsico qumicos, tales como, concentracin de electrolitos, pH, temperatura y el tiempo. Mtodo por precipitacin: Pueden ser en medios lquidos o en geles. Estos mtodos han demostrado tener una notable eficacia para individualizar y purificar los antgenos dotados de diferencias particulares. La unin del Ag y Ac se traduce por la formacin de un precipitado insoluble con la condicin que los reactivos se encuentren a concentracin equivalente. Mtodo del ltex: Est basado en la prueba de aglutinacin. Los Ac son

adheridos a partculas de ltex. Al enfrentarse el ltex sensibilizado con el Ag especfico se produce la agregacin entre estas esferas y los Ag. Esta prueba ha sido usada principalmente en Virologa, en Bacteriologa la tcnica ha sido usada con xito para detectar Clavibacter michiganense subps sepedonicum y Ralstonia solanacearum en papa y Xanthomonas albilineans en caa. El mtodo es de 100 a 1000 veces ms sensible que una aglutinacin normal, la reaccin aparece ms rpida, generalmente no es necesario el microscopio para observar la reaccin, se necesita muy poco inmuno suero, no requiere la clarificacin de la savia.

Tcnica de Inmuno fluorescencia: Esta tcnica se basa en la conjugacin de anticuerpos especficos con molculas teidas con productos, ejemplo, la fluorescena, que produce un color verde amarillento. Es muy sensible para identificar bacterias Fito patgenas y til para analizar un gran nmero de muestras. La tcnica de inmunofluorescencia permite identificar un antgeno con la ayuda de un inmuno suero conocido, e investigar y titular un anticuerpo con la ayuda de un antgeno conocido.

Tcnica inmuno enzimtica ELISA: El ensayo se basa en la interaccin especfica de un antgeno (patgeno) y un anticuerpo (protenas inmunoglobulinas producidas en un vertebrado superior, usualmente conejos). La reaccin se visualiza a travs de la accin de un conjugado enzima-anti- cuerpo sobre un sustrato. Es un mtodo rpido de gran sensibilidad, especificidad y bajo costo, que supera a muchas tcnicas de diagnstico emplea- das con anterioridad. Existen diferentes variantes de la tcnica de ELISA, todas basadas en el mismo principio. El tipo de tcnica y anticuerpo a emplear depender del objetivo de la aplicacin (campo, laboratorio), tipo de muestra (suelo, agua tejido) y nivel de sensibilidad y rapidez requerida. La tcnica ELISA con sandwich de doble anticuerpo es una de las ms empleadas, en este caso el antgeno es ubicado entre dos anticuerpos especficos, el de captura y el de marcaje, este ltimo est con- jugado a una enzima y puede cuantificarse en el espectrofotmetro. Esta tcnica es de gran utilidad en la deteccin de patgenos de mezclas complejas, tales como, suelo, extractos de plantas. Las tcnicas de inmuno deteccin han sido usadas en la deteccin de menor

microorganismos fitopatgenos, principalmente virus y bacterias y en

escala para hongos. Una aplicacin importante se ha encontrado en los estudios de taxonoma de microorganismos, la fisiologa de la enfermedad y la ecologa de los patgenos. Con el empleo de estas tcnicas se pueden establecer estrategias de manejo de patgenos, cuarentenas (Tabla 1). Las tcnicas serolgicas ELISA- Inmunofluorescencia adems de ser mtodos muy confiables y sensibilidad moderada tiene la ventaja de poder como la certificacin de semillas o fijacin de

asimilar gran cantidad de muestras en algunas horas y los resultados positivos y sospechosos se confirman mediante la prueba de patogenicidad (Gonzlez, et al, 1999).

Agente causal

Cultivo

Tcnica de diagnstico

Phytophthora citrophthoraa Verticillium dahliaea Verticillium albo-atrum Pseudomonas syringae pv tomatoa Pseudomonas syringae pv phaseolcolaa VTCb PVYb Fusarium sppc Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciensd Xanthomonas axonopodis pv. citrie Xanthomonas vasculorumf Xanthomonas albilineans Ralstonia solanacearumf Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicumf Erwinia carotovorag

Ctricos Varias especies de Tomate plantas Semillas frijol Ctricos Papa Papa Frijol Ctricos Caa Papa Papa Papa de

Hibridacin dot-blot PCR Hibridacin PCR PCR PCR AFLP PCR PCR IFI IFI IFI PCR IFI ELISA-DAS IFI

a: de b: 2 de c:

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Tcnicas avanzadas para el diagnstico

Biologa Molecular, es la ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensin de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la informa- cin gentica se transmita eficientemente de unos seres a otros y se exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales que existen entre las especies y colocar genes de un organismo a otro llamado hospedero, empleando tcnicas de ingeniera gentica. Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos de cidos nucleicos a gran escala, abriendo as las puertas a la secuenciacin de los cidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el diagnstico molecular, la terapia gnica o la obtencin de Segn Salazar, organismos superiores citado por Pupiro recombinantes 2003 el uso (Disponible en: de marcadores se www.monogra- fas.com). y Malagn, moleculares es importante en la caracterizacin gentica de las plantas, donde no solamente se identifican genotpicamente los mate- riales, sino que establecen relaciones citogenticas entre los mismos, permitiendo el diseo de mejores estrategias de seleccin y mejoramiento gentico. Reaccin en cadena de la mayor polimerasa (PCR): Es uno de los mtodos en el diagnstico de enfermedades

moleculares de

eficiencia

vegetales. Es utilizada en la deteccin de patgenos en semillas, el cultivo de tejidos, deteccin de toxinas y residuos de pesticidas (Flores-Olivas, et al ,1997). La PCR es una tcnica que permite determinar relaciones filogenticos entre especies y constituye una buena herramienta de anlisis de la biologa de las poblaciones (Bar, 1998). Segn Shaadet al, Mutasa .et al, citados por Flores-Olivas, et al ,1997 entre las ventajas de la PCR est la deteccin de molculas simples en mezclas complejas sin usar sondas radioactivas y con alta sensibilidad. Una de las ventajas sobre los mtodos tradicionales es que no se necesita cultivar los organismos antes de la deteccin. La PCR fue ideada por el bioqumico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y se generaliz a fina- les de la dcada de los 80. Es fcil de automatizar y puede copiar una sola molcula de ADN varios millones de veces en unas pocas horas (Biblioteca Premium. Microsoft Encarta 2006). La reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena. 2 Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 espe- cfica de cada una de las hebras.

3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa. Las aplicaciones de la PCR son mltiples y parecen estar slo limitadas por la imaginacin de los cientficos. Entre ellas tenemos: la amplificacin de fragmentos de genes como rpida alternativa de la clonacin, la modificacin de fragmentos de ADN, la deteccin sensible de microorganismos seguido de una segura genotipificacin, si se desea, el anlisis de muestras arqueolgicas y estudios importantes en enfermedades

antropolgicos, la deteccin de mutaciones

hereditarias, transformacin maligna o tipaje de tejidos, el anlisis de marcadores genticos para aplicaciones forenses, pruebas de paternidad y para el mapeo de rasgos hereditarios, el estudio de expresin de genes, entre otras (Herrera & Gamba, 1996, citados por Ruz y Menndez, 2006).

Reaccin de la polimerasa encadena. 1. Disociacin de la doble hebra de ADN. 2. Hibridacin de los partidores 3. Extensin de la hebra de ADN por medio de la incorporacin de nucletidos. 4. Dobles hebras de ADN amplificadas

RFLP: Es el polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccin. Estos se observan por del ADN hibridacin de los fragmentos como resultado de la por una enzima de restriccin, separados digestin

electroforticamente con sondas de copia nica (Bar, 1998). Se trata de una tcnica costosa y laboriosa que precisa de una gran cantidad de ADN y una informacin previa sobre su secuencia, adems que usualmente ha involucra el uso de radioistopos, por lo que est siendo desplazada por los marcadores basados en la reaccin en cadena de la polimerasa que contribuido a la simplificacin de (Chvez y Gonzlez, 2000). la tecnologa y reduccin de los costos

Tcnica RAPD: Polimorfismo del ADN amplificado al azar. Es una PCR que utiliza un solo iniciador, cuyo tamao es en general de 10 bases, e hibrida a secuencias repartidas aleatoriamente sobre el ADN. Provee patrones de bandas cuyo nmero y tamao permiten el anlisis de variaciones mo leculares (Strigmam y Mackay, 1993 citados por Bar, 1998).

La eleccin del mtodo de anlisis depender del organismo estudiado y sobre todo de su variabilidad gentica, para delimitar especies o grupos dentro de especies se han utilizado ampliamente marcadores de tipo protenas o isoenzimas. Las tcnicas basadas en el anlisis comparado del tamao de los fragmentos de ADN permiten distinguir aislamientos especficos (Bar, 1998).

CONCLUSIONES

Las tcnicas de diagnstico de fitopatgenos indispensable para el trabajo de los fitopatlogos.

constituyen una herramienta

La biologa molecular constituye una tcnica de avanzada tanto en el diagnstico de enfermedades como en la determinacin de variabilidad gentica de Fito patgenos.

La determinacin de las variables climticas y dentro de ella el pronstico y sealizacin constituyen una herramienta importante para establecer las medidas de control de los patgenos.

BIBLIOGRAFIA

www.bibliociencias.cu/gsdl/collect/libros/...dir/doc.pdf es.scribd.com/doc/19829825/Fitopatologia-Agrios. www.utm.mx/edi_anteriores/temas035/3%20nota-35.pd