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Determinación de la Dosis Efectiva Media (DE50) del Suero Antiofídico Antielapídico (Anticoral) de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de cinco especies de corales colombianas - Héctor Charry Restrepo.

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Informe de una importante investigación científica en la que se establece la dosis efectiva media (DE50) del suero Antiofídico Antielapídico (anticoral) de Laboratorios Probiol Ltda frente al veneno de cinco especies de serpientes de coral presentes en Colombia; Probiol es el único laboratorio que en Colombia elabora sueros antiofídicos liofilizados, polivalentes y anticorales. Este estudio fue realizado por el biólogo y herpetólogo Héctor Charry Restrepo, reconocido nacional e internacionalmente como una autoridad en el tema de los ofidios y los accidentes causados por estos animales.
Informe de una importante investigación científica en la que se establece la dosis efectiva media (DE50) del suero Antiofídico Antielapídico (anticoral) de Laboratorios Probiol Ltda frente al veneno de cinco especies de serpientes de coral presentes en Colombia; Probiol es el único laboratorio que en Colombia elabora sueros antiofídicos liofilizados, polivalentes y anticorales. Este estudio fue realizado por el biólogo y herpetólogo Héctor Charry Restrepo, reconocido nacional e internacionalmente como una autoridad en el tema de los ofidios y los accidentes causados por estos animales.

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INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN.

Determinación de la Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Antielapídico (Anticoral) de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de 5 especies de serpientes del género Micrurus sp. y la mezcla de estos.

Héctor Charry Restrepo.
Biólogo – Herpetólogo. Director Científico del Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia” Manizales (Caldas) 21 de agosto de 2006

Determinación de la Dosis Efectiva Media del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia”. Informe final de Investigación.

Contenido.
1. INTRODUCCION. 1.1 Presentación. 5 1.2 Advertencia de confidencialidad y propiedad del informe. 6 1.3 Objetivos generales del estudio. 6 1.4 Justificación. 6 1.5 Definiciones. 7 1.5.1 Dosis Efectiva Media (De50). 7 1.5.1.1 Términos similares. Diferenciación. 7 1.5.1.2 El modelo biológico. 7 1.5.2 Accidente elapídico. 8 1.5.2.1 La subfamilia Elapinae. 8 1.5.3 Accidente micrúrico. 9 1.5.3.1 Definición. 9 1.5.3.2 Incidencia. 9 1.5.3.3 Diversidad de especies. 9 1.5.3.4 Características generales de las serpientes del género Micrurus. 10 1.5.3.5 Los venenos micrúricos. 13 1.5.3.6 Especies de interés médico. 13 1.5.4 Suero Antiofídico Antielapídico Antimicrúrico. 15 1.6 Cantidad de pruebas realizadas. 15

2. MATERIALES Y METODOS. 2.1 Dosis Efectiva media (De50). 17 2.2 Verificación y repetibilidad de las pruebas. 17 2.3 Materiales utilizados para la realización de las pruebas. 17 2.3.1 Venenos de serpientes del género Micrurus. 17 2.3.1.1 Tipos de venenos utilizados. 17 2.3.1.2 Cantidad de veneno utilizada. 18 2.3.1.3 Obtención legal de los venenos. 18 2.3.1.4 Método utilizado para la obtención de los venenos. 18 2.3.1.5 Tratamiento de los venenos. 18 2.3.1.6 Edad de los venenos. 18 2.3.2 Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. 18

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2.3.2.1

Identificación de los Sueros Antiofídicos utilizados para las pruebas. 19

2.3.3 Solución Salina Normal. 19 2.3.4 Jeringas. 19 2.3.5 Ratones blancos de laboratorio. 19 2.3.5.1 Especie. 19 2.3.5.2 Cantidad y procedencia. 19 2.3.5.3 Estado de salud, peso y sexo. 20 2.3.5.4 Condiciones de mantenimiento. 20 2.3.5.5 Disposición final. 20 2.3.5.6 Comité de ética. 20 2.4 Métodos utilizados para la realización de las pruebas (procedimientos). 21 2.4.1 Método general y Protocolo utilizado. 21 2.4.2 Preparación de cada ampolla de Suero Antiofídico Anticoral liofilizado. 22 2.4.2.1 Comentario. 22 2.4.3 Preparación de la Solución madre. 23 2.4.4 Preparación de la Solución madre de las pruebas 11 y 12 (para la determinación de la De50 de la mezcla de los venenos utilizados). 23 2.4.5 Fórmula de cada experimento. 23 2.4.6 Incubación de la fórmula. 24 2.4.7 Inoculación a los animales de experimentación (modelo biológico). 24 2.4.8 Observación y lectura. 24 2.4.9 Disposición final de los materiales y desechos. 24

3. RESULTADOS Y HALLAZGOS. 3.1 Información general. 25 3.2 Tabla de resultados de la De50 del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie Micrurus mipartitus. 25A 3.3 Tabla de resultados de la De50 del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie Micrurus dumerilii. 25B 3.4 Tabla de resultados de la De50 del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie Micrurus surinamensis. 25C 3.5 Tabla de resultados de la De50 del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie Micrurus spixii obscurus. 25D 3.6 Tabla de resultados de la De50 del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie Micrurus spyches medemii. 25E

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3.7 Tabla de resultados de la De50 del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie Micrurus spp. (mezcla de todos los anteriores. 25F 4. CONCLUSIONES. 26 5. BIBLIOGRAFÍA. 28

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INDICE DE TABLAS. Tabla 1: Número de pruebas, venenos probados y experimentos realizados. P 16 Tabla 2: Tiempo de dilución del Suero Antiofídico Anticoral liofilizado. P 22 Tabla 3: Fórmula de la solución madre de las pruebas 11 y 12. P 24 Tabla 4: Dosis Efectiva media de los venenos estudiados. P 26

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INDICE DE FIGURAS. Fig. 1. Detalle de la cabeza de Micrurus sp. P 10 Fig. 2. Detalle de la cabeza de Micrurus sp. P 10 Fig. 3. Craneo de Micrurus mipartitus. Dentición proteroglifa. P 10 Fig. 4. Escutelación cefálica de Micrurus sp. Vista lateral. P 11 Fig. 5. Escutelación cefálica de Micrurus sp. Vista dorsal. P 11 Fig. 6. Escutelación cefálica de Micrurus sp. Vista ventral. P 12 Fig. 7. Región caudal de Micrurus sp. P. 12 Fig. 8. Micrurus mipartitus. P 13 Fig. 9. Micrurus dumerilii. P 14 Fig. 10. Micrurus psyches medemii. P 14 Fig. 11. Micrurus spixii obscurus. P 14 Fig. 12. Micrurus surinamensis. P 15 Fig. 13. Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral. P 16

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1. Introducción.
1.1 Presentación. Los accidentes ofídicos causados por serpientes del género Micrurus constituyen en nuestro país un riesgo potencial para la población rural y urbana de las zonas de clima cálido y medio; si bien no son demasiado numerosos desde el punto de vista estadístico, los accidentes causados por corales tienen la característica de que revisten especial gravedad y en muchas ocasiones resultan mortales, razón por la cual se hace indispensable poder contar con un antídoto adecuado, eficaz y específicamente elaborado para neutralizar el veneno de las especies de serpientes de coral presentes en nuestro territorio; ese antiveneno para poder tratar este tipo de accidentes con seguridad y efectividad existe en Colombia desde hace muchos años, es el Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral elaborado por Laboratorios Probiol Ltda. Desde el año 1988, Laboratorios Probiol Ltda. ha estado fabricando el único suero anticoral disponible en Colombia y hecho específicamente para Colombia, fruto de una paciente, constante y profunda investigación iniciada por el doctor Cesar Gómez Villegas (q.e.p.d.), fundador del Laboratorio, y continuada cuidadosamente por sus sucesores. El Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral (suero Antimicrúrico) elaborado por Laboratorios Probiol ha probado en numerosas ocasiones que es un eficaz antiofídico polivalente anticoral, capaz de neutralizar adecuadamente los venenos de las diversas especies de corales venenosas presentes en el país, prueba de ello son las cientos de vidas que ha salvado, no solamente en Colombia, sino también en los países vecinos. Muchos casos bien documentados lo atestiguan y confirman. A pesar del importante acervo probatorio de la indiscutible eficacia de este producto y de su vital necesidad en un país tropical y especialmente rico en biodiversidad como es Colombia, recientemente las autoridades sanitarias del país, a través de su órgano de vigilancia de medicamentos, han puesto en duda la condición de “Polivalente” del suero antiofídico anticoral, así como su grado o nivel de potencia neutralizante frente a los venenos de las más importantes especies de serpientes de coral colombianas; por esta razón, Laboratorios Probiol Ltda. queriendo tener el concepto científico, riguroso e imparcial de un tercero experto conocedor del tema, ha contratado con el Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia” la elaboración de un estudio que determine la potencia neutralizante de su producto Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral, y que además confirme o niegue la condición de Polivalente del mencionado producto.

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El presente documento es el informe final de dicho estudio y contiene los resultados, conclusiones y hallazgos de la investigación llevada a cabo por el Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia” a pedido de Laboratorios Probiol Ltda. 1.2 Advertencia de Confidencialidad y Propiedad del Informe. El presente documento es de carácter privado y confidencial y pertenece de manera exclusiva a Laboratorios Probiol Ltda. empresa que lo solicitó y contrató, y por lo mismo es su propietario. Este informe solo podrá ser publicado, dado a conocer o utilizado por Laboratorios Probiol Ltda; el Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia” comparte la propiedad intelectual de este informe por ser de su autoría, pero el derecho y la prioridad de liberación y primera publicación es de Probiol. El Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia” se compromete a no publicar ni dar a conocer parte alguna del presente informe sin la expresa autorización de Laboratorios Probiol Ltda. 1.3 Objetivos generales del estudio. a. Determinar la Dosis Efectiva Media (De50), es decir, la capacidad o potencia neutralizante efectiva media del Suero Antiofídico Altielapídico Anticoral fabricado por Laboratorios Probiol Ltda. para neutralizar los venenos de las siguientes 5 especies de serpientes del género Micrurus: Micrurus surinamnesis s. Micrurus spixii obscurus. Micrurus mipartitus m. Micrurus dumerilii t. Micrurus psyches medemi. b. Además, determinar la Dosis Efectiva Media (De50) del mismo antiveneno frente a la mezcla homogénea de todos estos venenos, la que se denominará aquí como Dosis Efectiva Media (De50) de veneno de Micrurus spp. 1.4 Justificación. El presente estudio se adelantó con el fin de establecer, sustentar, verificar o confirmar la condición de dicho producto (Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda.) como antiveneno POLIVALENTE, es decir, que posee una adecuada capacidad de neutralización contra todos y cada uno de los venenos de las especies de serpientes antes mencionadas, así como su mezcla. Todas estas serpientes altamente venenosas forman parte de la herpetofauna colombiana y de gran parte de Sudamérica; pertenecen a la familia Elapidae (elápidos), subfamilia Micrurinae (micrurinos) y son comúnmente llamadas “corales verdaderas”, “corales” o “serpientes de coral”, son conocidas además con los nombres vulgares de “rabo de ají”, coral “mataganado”, y “coral matagatos”, entre muchos otros.

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1.5 Definiciónes. Consideramos muy importante para efectos de la comprensión del presente informe definir algunos términos de especial relevancia dentro del mismo; estos son: 1.5.1 Dosis efectiva media (De50). 1.5.2 Accidente elapídico. 1.5.3 Accidente micrúrico. 1.5.4 Suero Antiofídico Antielapídico Antimicrúrico (Anticoral). 1.5.1 Dosis Efectiva Media (De50). Se denomina así a la dosis mínima de un antiveneno (o de un antídoto) capaz de proteger efectivamente al 50% de los animales expuestos a la acción de una sustancia tóxica, en un lapso de tiempo determinado, que generalmente es de 24 horas. Se deben determinar además el tipo de tóxico y la cantidad suministrada, la vía de administración (oral, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, inhalada, tópica, etc.) y la especie animal usada como modelo biológico. La De50 se expresa usualmente en miligramos de veneno neutralizados por cada ml de antiveneno. Existen varios métodos para determinar la De50 y la elección del mismo depende del tipo de tóxico a usar y del tipo de antídoto que se quiere probar. 1.5.1.1 Términos similares. Diferenciación. No se debe confundir la abreviatura De50, a la que nos hemos referido, con las abreviaturas DL50 y CL50. La abreviatura DL50 (dosis letal media) indica la dosis mínima de un tóxico capaz de causar la muerte del 50% de la población examinada, en un periodo de tiempo determinado, que usualmente es de 24 horas. La abreviación CL50 (concentración letal media) indica la concentración mínima capaz de causar la muerte de la mitad de la población expuesta a la inhalación de una sustancia tóxica gaseosa o volátil, durante un tiempo determinado. La DL50 se expresa en miligramos de sustancia tóxica o de veneno por kilogramo de peso corporal del animal examinado (dato del que debe quedar constancia). La CL50 se expresa en mililitros de sustancia tóxica gaseosa por kilogramo de peso corporal del animal examinado (dato del que debe quedar constancia), expuesto al compuesto por inhalación durante un periodo de tiempo especificado. La gama de valores de los parámetros DL50 y CL50 es muy amplia. 1.5.1.2 El modelo biológico. Es importante señalar claramente la especie animal usada como modelo biológico o el tipo de organismo en el que se realizó el ensayo, ya que los valores de De50, DL50 o CL50 dependen de varios factores entre los que se destacan: el sistema

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biológico o el tipo de animal utilizado, la raza, el peso, el sexo, la edad, la dieta, etc. Así, por ejemplo, en el caso del insecticida DDT, la DL50 es de 87 mg/kg de peso corporal cuando se administra por vía oral en ratas, pero alcanza 150 mg/kg de peso corporal en perros. La DL50 correspondiente a la Dioxina es de 0,02 mg/kg de peso corporal en ratas y de 0,001 mg/kg de peso corporal en perros; es decir, la rata tolera una dosis veinte veces superior a la que toleran los perros. Aunque para valorar cómo respondería un organismo humano no basta una extrapolación directa de los resultados obtenidos con animales, estos sí dan una idea clara y muy aproximada del grado de toxicidad de una sustancia o del poder neutralizante de un antídoto o antiveneno. 1.5.2 Accidente elapídico. Se denomina accidente elapídico al accidente ofídico causado por una serpiente perteneciente a la gran familia Elapidae (elápidos). Los elápidos son serpientes venenosas terrestres y marinas. Poseen el maxilar superior más corto y este presenta en la parte anterior un par de colmillos cortos, rígidos y erectos, conductores de veneno, surcados o perforados, esta condición dentaria se denomina proteroglifa; la cola es generalmente corta, terminada en punta y no comprimida. Habitan en todos los continentes excepto en Europa. Poseen venenos muy poderosos de acción neurotóxica. Hay especies terrestres, hipógeas, arborícolas y otras exclusivamente marinas. Los miembros más representativos y conocidos de esta familia son las llamadas serpientes de coral, las cobras, las mambas, búngaros, kraits y las serpientes marinas. Esta familia se divide en dos grandes subfamilias que agrupan las formas terrestres (Subfamilia Elapinae) y las formas marinas (Subfamilia Hydrophinae). 1.5.2.1 La subfamilia Elapinae. Está constituida por serpientes venenosas terrestres, hipógeas o arborícolas. Todas ellas presentan un tipo de dentición proteroglifa. Pueden ser ovíparas u ovovivíparas. Esta subfamilia la componen aproximadamente 250 especies y 50 géneros. Usualmente son de talla pequeña y media. Los venenos de estas serpientes son muy tóxicos y potentes, las 10 serpientes más venenosas del mundo pertenecen a este grupo. Su coloración suele ser muy vistosa y brillante. Las especies más conocidas de esta subfamilia son las cobras, mambas, búngaros, serpientes de coral, etc. Especialmente numerosas son las especies de esta subfamilia en Australia, en donde comprenden dos terceras partes de los ofidios presentes en dicho continente. Los géneros más representativos de esta subfamilia son: Dendroaspis, Ophiophagus, Boulengerina, Denisonia, Naja, Hemachatus, Acantophis, Maticora, Notechis, Bungarus, Oxyuranus, Pseudechis, Demansia, Calliophis y Hemibungarus. En América están presentes los géneros Micrurus y Micruroides.

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1.5.3 Accidente micrúrico. 1.5.3.1 Definición. Se denomina accidente micrúrico al envenenamiento causado por la mordedura de una serpiente del género Micrurus, que forma parte de la amplia familia de los elápidos (Elapidae) a la que, como se mencionó ya, pertenecen también las famosas cobras, mambas, kraits y las serpientes venosas australianas; por esta razón algunas veces se lo denomina también “accidente elapídico” que es un término mucho más general. En toda América las serpientes del género Micrurus (que significa “cola corta”) son conocidas con el nombre de corales o serpientes coral. En algunas regiones de Colombia, aparte de ser llamadas corales o coralillos, son denominadas también con los nombres de “coral mata ganado”, “cabeza de chocho” y “rabo de ají”. 1.5.3.2 Incidencia. Se ha calculado que tan solo entre el 2 y 3% de todos los accidentes ofídicos en Colombia son ocasionados por corales. Este tipo de accidentes no suelen ser comunes pero generalmente sí son graves; la mayoría de los casos se presentan en niños, que se sienten atraídos por la belleza y los colores de estos animales, o en adultos que imprudentemente juegan con ellos, confiados en su relativa mansedumbre. 1.5.3.3 Diversidad de especies. En Colombia se han descrito hasta la fecha 22 especies diferentes de Micrurus, esta extraordinaria diversidad hace que ocupe el tercer puesto en número de especies, después de México y Brasil. Género Micrurus (Serpientes de coral verdaderas) especies reportadas en Colombia: M. alleni. M. ancoralis. M. clarki. M. dissoleucus. M. dumerilii. M. filiformis. M. hemprichii. M. isozonus. M. karlschmidti. M. langsdorffi. M. lemniscatus. M. mipartitus. M. multiscutatus. M. narduccii. M. nigrocinctus. M. psyches. M. putumayensis. M. sangilensis. M. spixii. M. spurrelli. M. surinamensis. M. stewarti.

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1.5.3.4 Características generales de las serpientes del género Micrurus. En términos generales, las serpientes de coral son de tamaño mediano y pequeño, la mayoría de las especies muestra unas proporciones con tendencia a ser muy delgadas y largas; las escamas son lisas y la mayoría de las especies exhibe una coloración muy viva y vistosa, con anillos completos de color rojo, negro y blanco (o amarillo). La cabeza suele ser pequeña, con el cuello no diferenciado y los ojos muy pequeños y puntiformes. Habitan en zonas de clima medio y cálido, algunas especies viven en estrecha cercanía con los seres humanos, como las que prefieren los jardines o cultivos como el café y cacao. Muchas especies llevan vida semisubterránea y prefieren permanecen ocultas bajo la hojarasca, piedras o troncos. Se reproducen por medio de huevos y la gran mayoría se alimentan de manera exclusiva de otras serpientes, es decir, que son ofidiófagas. Fig. 1

Fig.2

Como todos los miembros de la familia Elapidae, poseen una dentición de tipo proteroglifo, con dos colmillos delanteros, pequeños y fijos, que en las especies más grandes no sobrepasan los 3 mm. En términos generales, son serpientes de carácter manso, pero cuando muerden lo hacen con mucha fuerza y con frecuencia se quedan firmemente aferradas a la piel por un largo periodo de tiempo.

Fig. 3

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Fig. 4

Fig. 5

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Fig. 6

Fig. 7 Región caudal de Micrurus spp.

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1.5.3.5 Los venenos micrúricos. Los venenos de las serpientes de coral son muy potentes, su acción es predominantemente neurotóxica, si bien algunos son también cardiotóxicos. Nunca debe subestimarse el tamaño de la serpiente ni la ausencia inicial de síntomas generales y locales. La mordedura indolora de una pequeña serpiente coral “rabo de ají” de 10 a 15 cm de longitud y tan delgada como un cordón de zapato, es potencialmente mortal para un hombre adulto. Estos venenos poseen neurotoxinas de bajo peso molecular, que se unen fuertemente a los receptores colinérgicos de la placa neuromotora de las fibras musculares, actuando como un “aislante” que bloquea el paso del impulso nervioso al músculo, lo que ocasiona una parálisis flácida que puede conducir a disnea y paro respiratorio. La mayoría de estos venenos tiene una actividad de bloqueo postsináptico, sin embargo, algunos venenos de corales poseen también actividad de bloqueo presináptico, producto de la acción de fosfolipasas A2 que afectan esta terminal. Es importante recordar que los venenos de los Micrurus (serpientes de coral) no producen efectos hemorrágicos, coagulopatías, ni daños locales a piel o a tejidos. 1.5.3.6 Especies de interés médico. Aunque en Colombia se presentan accidentes por todas las especies de Micrurus, las más importantes desde el punto de vista médico, por ser aquellas que habitan en las zonas más pobladas y en estrecha cercanía con los seres humanos, son en primer lugar, Micrurus mipartitus (coral “rabo de ají”, “rabo de candela”, “cabeza de chocho”) y Micrurus dumerilii (coral macho, “mataganado” “coral verdadera”). En segundo lugar se destacan las especies Micrurus surinamensis (“coral de agua”), Micrurus spixii y Micrurus psyches medemi, es decir, todas las especies que son objeto del presente estudio.

Fig. 8. Micrurus mipartitus. (Coral “Rabo de ají”).

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Fig. 9. Micrurus dumerilii.

Fig. 10. Micrurus spyches medemi.

Fig. 11. Micrurus spixii obscurus.

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Fig. 12. Micrurus surinamensis surinamensis.

1.5.4 Suero Antiofídico Antielapídico Antimicrúrico. Se denomina así al antiveneno capaz de neutralizar las toxinas presentes en el veneno de las diversas especies de serpientes pertenecientes a la familia de los elápidos (fam. Elapidae), subfamilia de los micrurinos (subfam. Micrurinae), género Micrurus spp. En términos que son más comprensibles se denomina suero antiofídico “Anticoral”. Este es un suero heterólogo de origen equino, ovino o caprino, que posee comprobada eficacia y características de Polivalente regional. Actualmente es producido por laboratorios de México, Costa Rica, Colombia, Brasil y Argentina.

1.6 Cantidad de pruebas realizadas. Con el fin de obtener los objetivos generales propuestos en este estudio, se llevaron a cabo 12 grandes pruebas, dos por cada uno de los venenos de las especies de Micrurus antes mencionadas; en cada una de las diez (10) primeras pruebas se realizaron 6 experimentos o niveles, y para el análisis de la mezcla de todos los venenos, pruebas 11 y 12, se realizaron, respectivamente, 6 y 10 experimentos o niveles, para un gran total de 76 experimentos realizados.

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Prueba. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total 12

Veneno. M. mipartitus M. mipartitus M. Surinamensis M. surinamensis M. spixii M. spixii M. dumerilii M. dumerilii M. spyches medemi M. spyches medemi M. spp (mezcla) M. spp (mezcla) 6 venenos

Experimentos. 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 10 76

Tabla 1. Número de pruebas, venenos probados y experimentos realizados

Fig. 13. Presentación del producto Suero Antiofídico Antielapídico (Anticoral) de Laboratorios Probiol Ltda.

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2. Materiales y métodos.
2.1 Método general utilizado para determinar la De50. En todas la pruebas efectuadas se utilizó el método denominado “Costa Rica” y que es exactamente el mismo que se emplea de forma regular en los laboratorios del Instituto de investigaciones biológicas Clodomiro Picado de San José de Costa Rica para determinar la Dosis Efectiva media (De50) o potencia neutralizante de los antivenenos. Este método, aceptado mundialmente por la comunidad científica general, está debidamente validado y avalado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), y se considera un método económico y confiable, seguro y de fácil aplicación. Para una descripción del método, véase el punto 2.4 de este mismo documento sobre “métodos utilizados para la realización de las pruebas”. 2.2. Verificación y repetibilidad de las pruebas. En la realización de todas las pruebas se ha aplicado estrictamente el método antes mencionado (el denominado método “Costa Rica”), ciñéndose a su procedimiento, y ha sido aplicado sin adaptaciones ni modificaciones. La lista completa de los materiales y sus características, así como el método y las técnicas de manejo utilizadas se relacionan a continuación, de modo que todas las pruebas descritas en este trabajo puedan ser repetidas y verificadas por quien lo considere necesario. 2.3 Materiales utilizados para la realización de las pruebas. 2.3.1 Venenos de serpientes del género Micrurus. 2.3.2 Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol. 2.3.3 Solución salina normal. 2.3.4 Jeringas de diversos tamaños. 2.3.5 Ratones blancos de laboratorio (como modelo biológico). 2.3.1 Venenos de serpientes del género Micrurus. 2.3.1.1 Tipos de venenos utilizados. 2.3.1.2 Cantidad de veneno utilizada. 2.3.1.3 Obtención legal de los venenos. 2.3.1.4 Método utilizado para la extracción de los venenos. 2.3.1.5 Tratamiento de los venenos. 2.3.1.6 Edad de los venenos. 2.3.1.1 Tipos de venenos utilizados. Para la realización de las pruebas se utilizaron los siguientes tipos de venenos de serpientes del género Micrurus, previa verificación y confirmación de la identificación taxonómica de cada ejemplar:

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Veneno de Micrurus surinamnesis. Veneno de Micrurus spixii. Veneno de Micrurus mipartitus. Veneno de Micrurus dumerilii. Veneno de Micrurus spyches medemi. 2.3.1.2 Cantidad de veneno utilizada. Para la realización de las pruebas se dispuso de una cantidad mínima de 15 a 20 mg de veneno de cada una de las especies mencionadas. En el formato o planilla de las pruebas se especifica la cantidad de veneno utilizada en cada caso para la preparación de la solución madre. 2.3.1.3 Obtención legal de los venenos. Todos los venenos de serpientes del género Micrurus a utilizar en estas pruebas han sido obtenidos de ejemplares cautivos que forman parte del inventario oficial del Serpentario del Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia”. Dicho serpentario se encuentra debidamente autorizado, avalado y vigilado por las autoridades ambientales del Estado. Cada ejemplar de la colección ha sido legalmente obtenido y cuenta con su respectiva identificación y registro. 2.3.1.4 Metodo utilizado para la extracción de los venenos. Para la extracción de los venenos se ha utilizado la técnica denominada “ordeño manual” con el uso de pipetas Pasteur; esta técnica es conocida con el nombre de “método de Barme” y consiste básicamente en sujetar la serpiente por el cuello, abrirle la boca y colocar sobre cada colmillo una micropipeta tipo Pasteur de manera que el colmillo quede dentro de esta; luego se hace un masaje de suave presión sobre las glándulas productoras del veneno, lo que generalmente induce en la serpiente el reflejo de morder e inocular el veneno, el cual queda depositado en las pipetas. 2.3.1.5 Tratamiento de los venenos. Una vez obtenidos, los venenos fueron conservados a baja temperatura y en la oscuridad, en frascos herméticamente cerrados y debidamente roturados. Posteriormente fueron secados por liofilización, cuidadosamente pesados en balanza analítica digital y dispuestos en recipientes plásticos a dosis de 10 mg. Los recipientes son mantenidos a temperatura ambiente en la oscuridad hasta el momento de preparar la solución madre o solución de veneno diluido en solución salina normal. 2.3.1.6 Edad de los venenos. Ninguno de los venenos utilizados para la realización de estas pruebas tenía un tiempo mayor a 3 meses de haber sido extraído. 2.3.2 Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol. Para la realización de todas las pruebas se utilizaron en total 14 ampollas de Suero Antiofídico antimicrúrico - altielapídico (anticoral) de Laboratorios Probiol Ltda. 18

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2.3.2.1 Identificación de los sueros antiofídicos utilizados en las pruebas: Tipo de producto: Cantidad: Presentación: Marca: Fabricante: Lote: Suero antiofídico antielapídico (anticoral). 14 frascos viales. Polvo liofilizado para ser reconstituido con 10 ml de diluente estéril. Probiol. Productos Biológicos Probiol Laboratorios Probiol Ltda. AC004 (Lote piloto Nro. 4)

Estos antivenenos nos fueron facilitados por Laboratorios Probiol Ltda. En la realización de cada una de las 11 primeras prueba de DE50 se utilizaron 6,85 ml de suero antiofídico de cada frasco vial de 10 ml. (véase formato del protocolo para la determinación de potencia). En cada caso los 3,15 ml restantes fueron desechados. En la prueba Nro. 12, con 10 niveles o experimentos, se utilizaron 21,3 ml (de 3 frascos viales) de antiveneno, los restantes 8,7 ml fueron desechados. En total se utilizaron 14 viales de Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. 2.3.3. Solución salina normal. Para la preparación de la solución madre (solución de veneno de serpiente diluido), se utilizó solución salina normal de marca “Baxter”, de uso corriente hospitalario y disponible comercialmente. Se verificó cuidadosamente la vigencia del registro sanitario y la vigencia del producto. 2.3.4 Jeringas. Se utilizaron jeringas desechables de plástico de diferentes marcas disponibles en el comercio (Rimco, Nipro, BD Plastipak, Inject) con capacidades de 10, 5, 3 y 1 ml; se verificó cuidadosamente la vigencia del producto y de las licencias legales. 2.3.5 Ratones blancos de laboratorio (como modelo biológico). 2.3.5.1 Especie. 2.3.5.2 Cantidad y procedencia. 2.3.5.3 Estado de salud, peso y sexo. 2.3.5.4 Condiciones de mantenimiento. 2.3.5.5 Disposición final. 2.3.5.6 Comité de ética. 2.3.5.1 Especie. Como modelo biológico para la realización de las pruebas se utilizaron ratones blancos (suizos) de la especie Mus musculus (llamados comúnmente ratones de laboratorio). 2.3.5.2 Cantidad y procedencia. Se utilizaron un total de 456 ratones, 72 para cada una de las cinco primeras pruebas y 96 para la sexta prueba (véanse los formatos de protocolo para cada 19

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una de las pruebas); todos ellos procedentes del Bioterio del Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia”; Dicho bioterio o criadero técnico de animales para experimentación, se encuentra debidamente autorizado, avalado y vigilado por las autoridades ambientales y sanitarias del Estado. 2.3.5.3 Estado de salud. Peso y sexo. Antes de ser utilizados se verificó por parte del médico veterinario el estado de salud y el peso de los animales. Se utilizaron solamente animales sanos, de 18 a 20 gramos de peso, machos y hembras no preñadas. Los ratones fueron pesados en una balanza tipo gramera, de marca Ohaus Cent-O-gram, referencia 8217, fabricada por Ohaus Scale Corporation y que recientemente fue calibrada. 2.3.5.4 Condiciones de mantenimiento. Durante la realización de las pruebas y en el tiempo de observación posterior a estas, los ratones fueron mantenidos en cajas de acero inoxidable (6 por caja) de las mismas que se utilizan normalmente en el bioterio; fueron mantenidos en condiciones de temperatura y humedad ambiente, con buena ventilación, y con agua y alimento disponibles a voluntad todo el tiempo. 2.3.5.5 Disposición final. Todos los ratones sobrevivientes (150 ejemplares, el 32,89% de los utilizados) ingresaron de nuevo al bioterio pero fueron mantenidos aparte y sometidos a un periodo de cuarentena y observación de 30 días, luego de los cuales fueron examinados para verificar su estado de salud y posteriormente destinados a alimentar las serpientes del Centro de Investigación. Los ratones que resultaron muertos durante las pruebas (306 ejemplares) fueron debidamente empacados en bolsas rojas para desechos biológicos o biomédicos, marcadas con etiquetas reglamentarias de riesgo biológico, selladas y conservadas en refrigerador hasta su recolección por parte del personal especializado en desechos tóxicos y biológicos de la empresa municipal de aseo, entidad que se encarga de la incineración técnica y adecuada de todo tipo de desechos tóxicos, biomédicos y hospitalarios. 2.3.5.6 Comité de ética. Antes de la realización de las pruebas, y conforme a lo establecido en el artículo 23 del capítulo VI la ley 84 de 1989, se reunió el Comité de Etica permanente del Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia” y hecho un concienzudo análisis de la necesidad y utilidad de las pruebas a realizar y de la metodología a emplear, determinó aprobar la realización de los experimentos teniendo en cuenta: a. Que los experimentos que se quieren llevar a cabo con animales vivos se realizarán con la autorización previa de la autoridad competente y que tales pruebas son imprescindibles para el estudio y avance de la ciencia. b. Que los resultados experimentales no puedan obtenerse por otros procedimientos o alternativas. 20

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c. Que las experiencias son necesarias para el control, prevención, el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades que afecten al hombre o a los animales. d. Que los experimentos no puedan ser sustituidos por cultivo de tejidos, medios y modelos computarizados de simulación, dibujos, películas, fotografías, videos u otros procedimientos. Así mismo, la realización de las pruebas estuvo vigilada por delegados de dicho Comité y como consta en el acta correspondiente, se verificó que no se utilizaran más animales de los estrictamente necesarios y de antemano programados para los experimentos, que no se les causara dolor innecesario ni se incurriera en crueldad o maltrato hacia los mismos. 2.4 Métodos utilizados para la realización de las pruebas. 2.4.1 Método general y protocolo utilizado. 2.4.2 Preparación del Suero Antiofídico Anticoral. 2.4.3 Preparación de la solución madre. 2.4.4 Preparación de la Solución madre de las pruebas 11 y 12 (mezcla de venenos) 2.4.5 Incubación de la solución madre. 2.4.6 Formula de cada experimento. 2.4.7 Inoculación. 2.4.8 Observación y lectura. 2.4.9 Disposición final. 2.4.1 Método general y protocolo. Como ya se mencionó, el método utilizado para determinar la Dosis Efectiva Media (De50) fue el llamado “Método Costa Rica”, y que es mismo que se utiliza regularmente en el Instituto de Investigaciones Biológicas Clodomiro Picado de San José de Costa Rica para medir el título de neutralización de los antivenenos que allí se producen. En principio, este método consiste en la mezcla de una cantidad fija de veneno en presencia de cantidades variables del antiveneno, las que se ajustan a un volumen igual, se incuban por 30 minutos a 37°C y se inocu lan por vía intraperitoneal en grupos de seis ratones por mezcla, de forma que cada uno reciba una dosis no inferior a 3 dosis letales medias (Dl50). El título de neutralización, se expresa en microgramos de veneno neutralizados por mililitro de antiveneno, y se calcula con base en la menor cantidad de antiveneno que proteja adecuadamente a tres de los seis animales inoculados (el 50% de la muestra). Para mayor información, véase definición de la De50, numeral 1.5.1 de este mismo documento.

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El tiempo de observación de cada prueba es de 24 horas. La observación detallada del formato de protocolo puede contribuir mucho a la comprensión del método y su aplicación. (Véase el anexo 1). 2.4.2 Preparación de cada ampolleta del Suero Antiofídico Anticoral liofilizado. Las ampollas de suero antiofídico fueron numeradas del 1 al 14 para identificarlas. Al momento de realizar cada prueba se preparó la respectiva ampolla de Suero Antiofídico según las instrucciones del fabricante, esto es, aplicando los 10 ml de diluente estéril en forma lenta y por la pared del frasco y dejándolo luego en reposo, sin agitarlo, para permitir que el producto se hidrate. Con el fin de verificar el tiempo requerido para la dilución del producto, se calculó un tiempo para la aplicación del diluente estéril de 15 segundos, y se permitió enseguida un periodo de hidratación en reposo que varió entre 1 y 14 minutos; concluido este periodo de tiempo se agitó suavemente el frasco por un periodo de 10 segundos y se realizó una observación. Los resultados u observaciones se relacionan en la tabla 2.

Ampolla

Diluente

Reposo Agitar

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15’’ 15” 15” 15” 15”

1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 10’ 11’ 12’ 13’ 14’

10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10’’ 10” 10” 10” 10”

Resultado. Observación. Se observa un grumo sólido muy grande. Muchos grumos grandes sin diluir. Algunos grumos grandes sin diluir. Algunos grumos pequeños sin diluir. Se forma un sedimento en el fondo. Un poco de sedimento en el fondo del frasco. Se observa aún algo de sedimento. El suero está completamente diluido. El suero está completamente diluido. El suero está completamente diluido. El suero está completamente diluido. El suero está completamente diluido. El suero está completamente diluido. El suero está completamente diluido.

Tabla 2. Tiempo de dilución del suero antiofídico Anticoral liofilizado.

2.4.2.1 Comentario. La presentación final (comercial) del producto Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral, es la de Polvo liofilizado para ser reconstituido con 10 ml de diluente estéril. La prueba de preparación del suero anteriormente descrita demuestra que un tiempo de hidratación en reposo entre 5 y 10 minutos facilita mucho la dilución del producto, el cual no requiere ser agitado fuertemente para quedar listo a ser utilizado.

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2.4.3 Preparación de la Solución madre. En la preparación de la Solución Madre (veneno diluido en solución salina), para cada prueba se utilizó la fórmula estándar de 1mg de veneno por 1ml de solución salina. Ante la dificultad de preparar cantidades pequeñas, se preparó siempre una cantidad de 10 ml de solución madre de cada tipo de veneno. 2.4.4 Preparación de la solución madre de las pruebas 11 y 12 (Mezcla de todos los venenos antes probados). Las pruebas 11 y 12, destinadas a determinar la De50 de la mezcla de los cinco venenos antes probados, se programó como prueba para reconfirmar la condición de POLIVALENTE del Suero Antiofídico Anticoral de Probiol, condición ya probada por el hecho de haber neutralizado adecuadamente cada uno de los venenos en las anteriores pruebas individuales. Para la preparación de la solución madre de esta prueba se planteó si podría utilizarse una mezcla de cantidades iguales del sobrante de las soluciones madre individuales preparadas para cada una de las pruebas anteriores o si por el contrario se deberían mezclar cantidades iguales de los diferentes venenos, en estado seco liofilizado y disolver dicha mezcla en solución salina normal. Reunido el equipo de investigadores y asesores, se planteo y discutió el asunto y se concluyó que técnicamente no debe existir ninguna diferencia en la solución madre de venenos mezclados resultante, bien sea que se use un método o el otro; aún así, se decidió utilizar la segunda opción, para garantizar la frescura de la solución y para verificar que las cantidades de veneno a mezclar fueran exactamente iguales. Se conservó la proporción de 1mg de veneno por 1 ml de solución salina, pero ante la dificultad de pesar cantidades muy pequeñas de veneno con una exactitud 100% confiable, se optó por preparar una cantidad grande de solución (25 ml) de modo que se usaran 25 mg de veneno, es decir 5 mg de cada tipo de veneno. La fórmula de la solución madre de venenos mezclados que se utilizó para las pruebas 11 y 12 es la siguiente: Veneno de Micrurus miparitus: Veneno de Micrurus dumerilii: Veneno de Micrurus surinamensis: Veneno de Micrurus spyches medemi: Veneno de Micrurus spixii obscurus: Solución Salina Normal:
Tabla 3. Fórmula de la solución madre pruebas 11 y 12.

5mg 5mg 5mg 5 mg 5 mg 25 ml

2.4.5 Fórmula de cada experimento. La formula para cada experimento se preparó en el momento previo a la inoculación y no antes, y se hizo de acuerdo a las proporciones establecidas y programadas de antemano para cada nivel según el formato de Protocolo diseñado para cada prueba (Ver formato de Protocolo). De cada fórmula se

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preparó un volumen de 4,5 ml, de manera que se pudiera inocular 0,75 ml a cada uno de los seis ratones de cada nivel y no quedaran sobrantes. 2.4.6 Incubación de la fórmula. Una vez preparada cada una de las 12 fórmulas de cada prueba, estás fueron incubadas a 37° durante 30 minutos en una incubado ra estándar para laboratorio C clínico o bacteriología (Marca “Clinic Lab Supplies” modelo “TermoLab 4,5” de fabricación canadiense). 2.4.7 Inoculación. Una vez preparada e incubada la fórmula para cada experimento, se procedió a la inoculación de 0,75 ml de dicha formula a seis ratones por vía intraperitoneal y en cada experimento o nivel se hizo de la misma manera; como se dijo antes, de cada formula se preparó un volumen de 4,5 ml, de manera que se inocularan los seis ratones de cada nivel y no quedaran sobrantes. La inoculación se efectuó con jeringas tipo insulina de 1 ml, jeringas de aguja fija no removible; se utilizó una jeringa por cada ratón y tras la inoculación fueron debidamente desechadas. 2.4.8 Observación y lectura. Una vez inoculados los ratones de cada experimento o nivel, fueron dejados en una caja de acero inoxidable con sustrato de cascarilla de arroz, tal y como se los mantiene normalmente en el bioterio, con alimento y agua disponibles a voluntad. Cada caja fue debidamente marcada e identificada y dejada en reposo a temperatura y humedad ambiente, con luz baja e indirecta y protegida de corrientes de aire, tal y como son normalmente mantenidas. Se anotó cuidadosamente la hora de cada inoculación y se realizó la lectura de la prueba a las 24 horas exactas, haciendo el recuento de ratones vivos y muertos, datos que se consignaron en las planillas correspondientes. 2.4.9 Disposición final. Todos los frascos, pipetas y jeringas que se utilizaron durante las pruebas, así como las bolsas vacías de solución salina, los guantes y tapabocas desechables, fueron empacados en bolsas rojas para desechos biomédicos debidamente etiquetadas y marcadas. Todas las agujas y jeringas de aguja fija no removible fueron depositadas en un recipiente tipo “guardián” diseñado especialmente para la disposición o desecho de elementos cortopunzantes de uso médico; este recipiente, debidamente etiquetado y marcado, fue sellado según las instrucciones del fabricante. Todos estos desechos fueron recogidos por personal especializado en la recolección de desechos tóxicos, biológicos y biomédicos de la empresa municipal de aseo, que se encarga de la incineración y disposición técnica de esta clase de basuras. Con respecto a la disposición final de los ratones utilizados en las pruebas, véase el numeral 2.3.5.5 de este mismo documento.

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3. Resultados y hallazgos.
Los resultados y hallazgos de cada una de las pruebas se consignaron en las respectivas tablas o formatos de Protocolo que se relacionan a continuación.

Información general. Tipo de pruebas realizadas: Dosis Efectiva Media (De50). Número de pruebas realizadas: 12 pruebas, 76 experimentos. Tipo de antiveneno probado: Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. Tipo de toxinas a neutralizar: Venenos de serpientes del género Micrurus spp. Método utilizado: De50 según Método “Costa Rica”, validado por el Instituto de Investigaciones biológicas “Clodomiro Picado” de San José de Costa Rica”. Aprobado OMS (WHO). Modelo biológico utilizado: Ratones de laboratorio de la especie Mus musculus, de raza albina suiza. Responsable y Coordinador general de la realización de las pruebas: Héctor Charry Restrepo. Director Científico del Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica “Ophidia”. Pruebas ejecutadas por: Equipo de Investigadores y colaboradores de “Ophidia”.

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3.2 Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie: Micrurus mipartitus.
Análisis Nro: 1 Experimentos realizados: 12 Realizado por: Ophidia. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. Fecha de realización: 19 y 20 de marzo de 2006 Director y responsable: Héctor Charry Restrepo.

PRUEBA GRUESA Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 1 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 2 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 3 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 4 0,3 ml 3,45 ml 0,75 ml 5 0,3 ml 3,6 ml 0,60 ml 6 0,3 ml 4,2 ml 0 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 300 6 0,75 ml 1 de 6 400 6 0,75 ml 1 de 6 500 6 0,75 ml 0 de 6 Control 6 0,75 ml 0 de 6 % 66,6 33,3 16,6 16,6 0 0 De50 * *

Resultado: la De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus mipartitus se encuentra entre 100 y 200 Ug de veneno neutralizado por cada ml de suero; como el rango es muy grande, se hace necesario realizar una prueba fina en este nivel.

PRUEBA FINA. Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 7 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 8 0,3 ml 1,8 ml 2,4 ml 9 0,3 ml 2,2 ml 2 ml 10 0,3 ml 2,5 ml 1,7 11 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 12 0,3 ml 2,9 ml 1,3 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 125 6 0,75 ml 3 de 6 150 6 0,75 ml 3 de 6 175 6 0,75 ml 2 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 225 6 0,75 ml 1 de 6 % 66,6 50 50 33,3 33,3 16,6 De50

* *

Resultado: la De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus mipartitus se encuentra entre 125 y 150 Ug de veneno neutralizado por cada ml de suero; esto significa que cada vial de 10 ml está en capacidad de neutralizar entre 1,25 y 1,5 mg de veneno (promedio 1,37). 25A

3.3 Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie: Micrurus dumerilii.
Análisis Nro: 2 Experimentos realizados: 12 Realizado por: Ophidia. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. Fecha de realización: 14 y 15 de abril de 2006 Director y responsable: Héctor Charry Restrepo.

PRUEBA GRUESA Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 1 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 2 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 3 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 4 0,3 ml 3,45 ml 0,75 ml 5 0,3 ml 3,6 ml 0,60 ml 6 0,3 ml 4,2 ml 0 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 300 6 0,75 ml 1 de 6 400 6 0,75 ml 1 de 6 500 6 0,75 ml 0 de 6 Control 6 0,75 ml 0 de 6 % 66,6 33,3 16,6 16,6 0 0 De50 * *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus dumerilii se encuentra entre los 100 y 200 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; con el fin de establecer una cifra más precisa se realiza la siguiente prueba fina:

PRUEBA FINA. Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 7 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 8 0,3 ml 1,8 ml 2,4 ml 9 0,3 ml 2,2 ml 2 ml 10 0,3 ml 2,5 ml 1,7 11 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 12 0,3 ml 2,9 ml 1,3 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 125 6 0,75 ml 3 de 6 150 6 0,75 ml 2 de 6 175 6 0,75 ml 2 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 225 6 0,75 ml 2 de 6 % 66,6 50 33,3 33,3 33,3 33,3 De50

*

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus dumerilii se sitúa en 125 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; esto significa que cada vial de 10 ml está en capacidad de neutralizar mínimo 1,25 mg de veneno. 25B

3.4 Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie: Micrurus surinamensis.
Análisis Nro: 3 Experimentos realizados: 12 Realizado por: Ophidia. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. Fecha de realización: 12 y 13 de mayo de 2006 Director y responsable: Héctor Charry Restrepo.

PRUEBA GRUESA Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 1 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 2 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 3 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 4 0,3 ml 3,45 ml 0,75 ml 5 0,3 ml 3,6 ml 0,60 ml 6 0,3 ml 4,2 ml 0 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 3 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 300 6 0,75 ml 1 de 6 400 6 0,75 ml 0 de 6 500 6 0,75 ml 0 de 6 Control 6 0,75 ml 0 de 6 % 50 33,3 16,6 0 0 0 De50 *

Resultado: la De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus surinamensis se encuentra alrededor de los 100 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; con el fin de establecer una cifra más precisa se realiza la siguiente prueba fina:

PRUEBA FINA. Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 7 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 8 0,3 ml 1,8 ml 2,4 ml 9 0,3 ml 2,2 ml 2 ml 10 0,3 ml 2,5 ml 1,7 11 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 12 0,3 ml 2,9 ml 1,3 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 3 de 6 125 6 0,75 ml 3 de 6 150 6 0,75 ml 2 de 6 175 6 0,75 ml 2 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 225 6 0,75 ml 1 de 6 % 50 50 33,3 33,3 33,3 16,6 De50 * *

Resultado: la De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus surinamensis se encuentra entre 100 y 125 Ug de veneno neutralizado por cada ml de suero; esto significa que cada vial de 10 ml está en capacidad de neutralizar entre 1 y 1,25 mg de veneno (promedio 1,12). 25C

3.5 Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie: Micrurus spixii obscurus.
Análisis Nro: 4 Experimentos realizados: 12 Realizado por: Ophidia. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. Fecha de realización: 26 y 27 de mayo de 2006 Director y responsable: Héctor Charry Restrepo.

PRUEBA GRUESA Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 1 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 2 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 3 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 4 0,3 ml 3,45 ml 0,75 ml 5 0,3 ml 3,6 ml 0,60 ml 6 0,3 ml 4,2 ml 0 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 5 de 6 200 6 0,75 ml 4 de 6 300 6 0,75 ml 2 de 6 400 6 0,75 ml 1 de 6 500 6 0,75 ml 0 de 6 Control 6 0,75 ml 0 de 6 % 83,3 66,6 33,3 16,6 0 0 De50

* *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus spixii se encuentra entre los 200 y 300 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; con el fin de establecer una cifra más precisa se realiza la siguiente prueba fina:

PRUEBA FINA. Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 7 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 8 0,3 ml 2,9 ml 1,3 ml 9 0,3 ml 3 ml 1,2 ml 10 0,3 ml 3,1 ml 1,1 ml 11 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 12 0,3 ml 3,27 ml 0,93 ml Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 200 6 0,75 ml 4 de 6 225 6 0,75 ml 3 de 6 250 6 0,75 ml 3 de 6 275 6 0,75 ml 2 de 6 300 6 0,75 ml 2 de 6 325 6 0,75 ml 2 de 6 % 66,6 50 50 33,3 33,3 33,3 De50

* *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus spixii se sitúa entre 225 y 250 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; esto significa que cada vial de 10 ml está en capacidad de neutralizar de 2,25 a 2,5 mg de veneno (promedio 2,37). 25D

3.6 Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie: Micrurus spyches medemi.
Análisis Nro: 5 Experimentos realizados: 12 Realizado por: Ophidia. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. Fecha de realización: 16 y 17 de junio de 2006 Director y responsable: Héctor Charry Restrepo.

PRUEBA GRUESA Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 1 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 2 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 3 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 4 0,3 ml 3,45 ml 0,75 ml 5 0,3 ml 3,6 ml 0,60 ml 6 0,3 ml 4,2 ml 0 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 300 6 0,75 ml 2 de 6 400 6 0,75 ml 1 de 6 500 6 0,75 ml 0 de 6 Control 6 0,75 ml 0 de 6 % 66,6 33,3 33,3 16,6 0 0 De50 * *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus spyches m. se encuentra entre los 100 y 200 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; con el fin de establecer una cifra más precisa se realiza la siguiente prueba fina:

PRUEBA FINA. Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 7 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 8 0,3 ml 1,8 ml 2,4 ml 9 0,3 ml 2,2 ml 2 ml 10 0,3 ml 2,5 ml 1,7 11 0,3 ml 2,7 ml 1,5 12 0,3 ml 2,9 ml 1,3 Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 125 6 0,75 ml 3 de 6 150 6 0,75 ml 3 de 6 175 6 0,75 ml 2 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 225 6 0,75 ml 2 de 6 % 66,6 50 50 33,3 33,3 33,3 De50

* *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus spyches m. se sitúa entre 125 y 150 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; esto significa que cada vial de 10 ml está en capacidad de neutralizar de 1,25 a 1,5 mg de veneno (promedio 1,37). 25E

3.7 Dosis Efectiva Media (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente al veneno de la especie: Micrurus sp. (Mezcla de todos los anteriores)
Análisis Nro: 6 Experimentos realizados: 16 Realizado por: Ophidia. Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. 20 y 21- 7- 06 Prueba gruesa: Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 1 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 2 0,3 ml 2,7 ml 1,5 ml 3 0,3 ml 3,2 ml 1 ml 4 0,3 ml 3,45 ml 0,75 ml 5 0,3 ml 3,6 ml 0,60 ml 6 0,3 ml 4,2 ml 0 Fecha de realización: 20 al 23 de julio de 2006 Director y responsable: Héctor Charry Restrepo.

Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 200 6 0,75 ml 2 de 6 300 6 0,75 ml 1 de 6 400 6 0,75 ml 0 de 6 500 6 0,75 ml 0 de 6 Control 6 0,75 ml 0 de 6

% 66,6 33,3 16,6 0 0 0

De50 * *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus sp. se encuentra entre los 100 y 200 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; con el fin de establecer una cifra más precisa se realiza la siguiente prueba fina:

22 y 23- 7-06 Prueba fina: Experimento Veneno sol. Solución Suero madre salina normal Anticoral 7 0,3 ml 1,2 ml 3 ml 8 0,3 ml 1,5 ml 2,7 ml 9 0,3 ml 1,7 ml 2,5 ml 10 0,3 ml 1,9 ml 2,3 ml 11 0,3 ml 2,1 ml 2,1 ml 12 0,3 ml 2,2 ml 2 ml 13 0,3 ml 2,4 ml 1,8 ml 14 0,3 ml 2,44 ml 1,76 ml 15 0,3 ml 2,54 ml 1,66 ml 16 0,3 ml 2,63 ml 1,57 ml

Relación Ug de Ratones inoculado Ratones vivos veneno/1 mL Suero intraperitoneal 24 horas 100 6 0,75 ml 4 de 6 110 6 0,75 ml 3 de 6 120 6 0,75 ml 3 de 6 130 6 0,75 ml 3 de 6 140 6 0,75 ml 2 de 6 150 6 0,75 ml 2 de 6 160 6 0,75 ml 2 de 6 170 6 0,75 ml 2 de 6 180 6 0,75 ml 2 de 6 190 6 0,75 ml 2 de 6

% 66,6 50 50 50 33,3 33,3 33,3 33,3 33,3 33,3

De50

* * *

Resultado: La De50 del suero antiofídico anticoral de Probiol frente al veneno de Micrurus sp se sitúa entre 110 y 130 Ug de veneno neutralizados por cada ml de suero; esto significa que cada vial de 10 ml está en capacidad de neutralizar de 1,1 a 1,3 mg de veneno (promedio 1,2). Pag. 25F

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4. Conclusiones.
Observando las planillas del capítulo 3 de resultados y hallazgos, las conclusiones de este estudio resultan evidentes; ha quedado claramente demostrado que: a. El Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. posee una adecuada potencia neutralizante contra los venenos de serpientes de las especies Micrurus mipartitus, Micrurus surinamensis, Micrurus dumerilii, Micrurus spyches medemi y Micrurus spixii. La Dosis Efectiva Media (De50) del suero antiofídico Antielapídico Anticoral de Laboratorios Probiol frente al veneno de cada una de las especies de serpientes mencionadas, según las pruebas y experimentos realizados es la siguiente:

Especie. Micrurus mipartitus. Micrurus surinamensis. Micrurus dumerilii. Micrurus spyches medemi. Micrurus spixii. Micrurus spp. Mezcla.

Dosis Efectiva Media (De50)* 1,37* 1,12* 1,25* 1,37* 2,37* 1,20*

Tabla 3. Dosis efectiva media de los venenos estudiados. *De50 expresada en miligramos de veneno neutralizados por cada 10 ml de antiveneno.

De aquí se derivan dos conclusiones muy importantes, a saber: 1. El mencionado suero Antiofídico Antielapídico es efectivamente un antiveneno ANTIMICRÚRICO o ANTICORAL, ya que neutraliza adecuadamente los venenos de las especies más representativas de este género en Colombia. 2. El mencionado Suero Antiofídico Antielapídico es efectivamente un antiveneno POLIVALENTE, ya que neutraliza adecuadamente los venenos de un importante número de especies de serpientes del género Micrurus, incluida la especie Micrurus mipartitus (coral “rabo de ají”), cuyo veneno no es neutralizado por otros antivenenos anticorales extranjeros. b. El Suero Antiofídico Antielapídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. posee una adecuada potencia para neutralizar la mezcla de todos los venenos anteriormente mencionados; según las pruebas y experimentos realizados, la Dosis Efectiva Media (De50) del Suero frente a la mezcla de los venenos es de 1,2

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mg de veneno neutralizados por cada 10 ml de antiveneno, lo que ratifica y confirma la condición de ANTICORAL POLIVALENTE. c. Por ser elaborado a partir del veneno de serpientes de coral colombianas, procedentes de las diversas zonas geográficas del país, no cabe duda que el Suero antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. debe ser el antiveneno de elección para el tratamiento eficaz de los accidentes causados por la mordedura de este tipo de serpientes en Colombia. d. La confirmada condición de POLIVALENTE del Suero Antiofídico Anticoral del Laboratorios Probiol permite que los accidentes causados por este tipo de serpientes puedan ser tratados con eficacia y seguridad sin que sea necesaria una exhaustiva identificación de la especie causante por parte del personal médico o de enfermería que atienda el caso. e. La demostrada capacidad neutralizante (De50) del Suero Antiofídico Anticoral de Laboratorios Probiol Ltda. frente a los venenos micrúricos, guarda una coherente relación de proporción con la cantidad promedio de veneno inoculada en la mordida de la mayoría de las especies de corales estudiadas y que está entre los 5 y 25 mg de veneno, esto significa que una dosis inicial de entre 5 y 10 frascos viales de 10 ml del antiveneno permiten tratar adecuadamente un accidente micrúrico promedio, siempre y cuando su aplicación sea precoz y por la vía de administración más adecuada (intravenosa). f. No dudamos en recomendar este producto como un Suero Antiofídico Anticoral de primera calidad, capaz de neutralizar adecuadamente los venenos de serpientes de coral colombianas y consideramos urgente su fabricación industrial y su posterior distribución a todas las regiones del país.

Autenticación y aval de contenidos, procedimientos, resultados y conclusiones. El Director y Responsable por esta investigación:

_____________________________________ Héctor Charry Restrepo. C.C. 79’387.066 Btá. Biólogo – Herpetólogo. Director científico del Centro de Investigación Y Asesoría Ofidiológica “Ophidia”.

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5. Bibliografía.
En la realización de las diversas etapas que tuvo la elaboración del presente trabajo de investigación se consultaron numerosas fuentes bibliográficas, electrónicas y entrevistas personales con expertos y autoridades en el tema. Las principales fuentes bibliográficas se relacionan a continuación:

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Manizales (Caldas) Colombia. __________________________________________________________________
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