MTODO DE BIURET OBJETIVO: Manejar en el laboratorio el mtodo de Biuret para determinar protenas Observar y determinar experimentalmente el efecto de pH sobre

las protenas de la leche. GENERALIDADES: Investigacin bibliogrfica de los estudiantes sobre colorimetra y punto isoelctrico de protenas MATERIAL POR EQUIPO: 1 Probeta de 50 ml 2 gradillas 2 pipetas de 10 ml 3 pipetas de 5 ml 1 pipeta de 1 ml Tubos de 15 x 100 12 piezas 1 vaso de precipitados de 100 ml 12 tubos de 16 x 15 1 balanza granataria Papel parafilm para 10 tubos Si es necesario, 1 embudo y papel filtro REACTIVOS POR EQUIPO: Aguas destilada Solucin de cido actico 0.1 N Solucin de acetato de sodio 0.1 N Solucin de casena (concentracin 4 mg/mL) Reactivo de Biuret 50 mL APARATOS POR EQUIPO: 1 centrfuga clnica 1 balanza granataria 2 espectrofotmetros 4 celdas LOS ALUMNOS DEBERN TRAER POR EQUIPO: 6 gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada 1 plumn indeleble Masking tape

Jabn y franela para limpiar INTRODUCCIN

Colorimetra La colorimetra es la ciencia que estudia la medida de los colores y que desarrolla mtodos para la cuantificacin del color, es decir la obtencin de valores numricos del color.

Espectrofotometra Se denomina espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de la longitud de onda, de la radiacin, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. La principal aplicacin de la espectrofotometra es la determinacin de las concentraciones ya sea de sustancias qumicas o de microrganismos presentes en una solucin.

Como funciona un espectrofotmetro? El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda.

Ley de Beer-Lambert Es una relacin emprica que relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado. La ley de Beer tiene en cuenta el rea y el nmero de partculas qu

atraviesa un haz de luz, deduciendo de esto la energa que queda atrapada. La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente despus de que en dicho medio se produzca absorcin. La relacin entre ambas intensidades puede expresarse a travs de la siguiente relacin:

Donde: I1, I0: Son las intensidades saliente y entrante respectivamente. A=lc: Absorbancia, que puede calcularse tambin como: L: Longitud atravesada por la luz en el medio C: concentracin del absorbente en el medio.

Es el coeficiente de absorcin: : Longitud de onda de la luz absorbida. : Coeficiente de extincin. La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y , la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. Ecuacin de Henderson-Hasselbalch Formula bioqumica que se utiliza para calcular el pH, de una solucin buffer o tampn, a partir de Pka (la constante de disociacin del acido) y de las concentraciones de equilibrio del acido o base, del acido o la base conjugada.

Donde: A-] / [AH])

S es la sal o especie bsica, y A es el cido o especie cida

En la ltima ecuacin x puede ser a o b indistintamente.

Mtodo de Biuret El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta caracterstico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de nitrgeno del pptido. Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco. Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados.
2+ 2+

Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos

1. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO 1.1 Preparacin de una serie de tubos con solucin amortiguadora de acetatos. Coloca en una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con nmeros consecutivos. Adiciona a cada tubo las soluciones cido actico y acetato de sodio que indica la siguiente tabla:

Tubo

1 2 3 4 5 6 E l volumen final de cada tubo deber ser de 5 ml.

Solucin cido actico 0.1 N 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml 1ml

Solucin de sodio 0.1 N 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml

2. PREPARACIN DE LA LECHE 2.1 En un vaso de precipitados de 100 ml disuelve 6 gr. De leche en polvo descremada, con 50 ml de agua destilada.

NOTA: Aade el agua poco a poco para evitar que se formen grumos que podran dificultar la obtencin de una solucin homognea. No debes calentar la leche para disolverla.

2.2 En un tubo de ensayo de 16 x 150 mm mide 2 ml de leche rehidratada preparada como se indico anteriormente y aade 8 ml de agua destilada, agita cuidadosamente por inversin. Esta muestra de leche diluida (1:5) se ocupara para llevar a cabo la determinacin del punto isoelctrico de las protenas.

3. PUNTO ISOELCTRICO 3.1 Aade 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solucin amortiguadora que preparaste en el punto 1.

3.2 Mezcla cuidadosamente por inversin todos los tubos y deja reposar por espacio de 10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes grumos de leche suspendidos en la solucin te indicar que las protenas de la leche se han insolubilizado debido al pH de las solucin este pH es denominado punto isoelctrico.

3.3 Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m durante 10 minutos NO SIN ANTES BALANCEARLOS. Deber pesar lo mismo que aquel tubo que ocupara el lugar opuesto dentro de la centrifuga.

3.4 Separa el sobrenadante (cuidando de no suspender el precipitado acumulado en el fondo del tubo) y transfiere

a tubos limpios de 15 x 100 rotulados con el nmero de tubo que les corresponde.

4. DETERMINACIN DE PROTENAS CON EL MTODO DE BIURET 4.1 Coloca en una gradilla 11 tubos de 16 x 150 mm, rotula uno de ellos como nmero cero, el cual llevara los reactivos para calibrar el espectofotmetro (blanco de reactivos o testigos) los siguientes 4 tubos llevarn nmeros consecutivos del 1.

4.2 Aade a cada tubo los reactivos para determinar protenas en la curva de calibracin (tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIN Tubo Solucin Patrn 4 mg/ml Sobrenadante Sobrenadante Sobrenadante Sobrenadante Sobrenadante Sobrenadante Agua Reactivo de Biuret (ml) 0 0 ml 0 0 0 0 0 0 1 ml I 0.2 ml 0 0 0 0 0 0 0.8 ml II 0.4 ml 0 0 0 0 0 0 0.6 ml II 0.6 ml 0 0 0 0 0 0 0.4 ml IV 0.8 ml V 1 ml 1 0 2 0 TUBOS PROBLEMA 3 0 4 0 5 0 6 0

0 0 0.5 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0 0.5 0.5 ml ml ml ml 4.0 ml a todos los tubos

0 0 0.5 0 0 0 0.5 ml

0 0 0 0.5 0 0 0.5 ml

0 0 0 0 0.5 0 0.5 ml

0 0 0 0 0 0.5 0.5 ml

Nota:

Mezcla cuidadosamente cada reactivo y deja en reposo 30 minutos para favorecer el desarrollo de color. Antes de iniciar tus lecturas en el espectofotmetro, previo calentamiento de 15, es necesario calibrarlo con el blanco de reactivos a una absorbancia de cero, con una longuitud de onda de 570 mm. Si observas alguna turbidez en alguno de los tubos, es conveniente que filtres antes de hacer la lectura.

5. RESULTADOS

Tubo D.O Mg. De protena

I 0.082 0.8

II 0.121 1.6

III 0.163 2.4

IV 0.202 3.2

1 0.048 0.024

2 0.046 0.023

3 0.048 0.024

4 0.050 0.025

5 0.059 0.02

6 0.048 0.024

Protena Sobrenadante 1 Sobrenadante 2 Sobrenadante 3 Sobrenadante 4 Sobrenadante 5 Sobrenadante 6

mg/ml 0.025 0.024 0.049 0.024 0.04 0.236

Mg/100ml 2.5 2.4 4.9 2.4 4 2.36

Curva de calibracin.
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 O.D

Bibliografa Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ley de Beer- Lambert. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert Scrib (sitio en internet). Colorimetra. http://es.scribd.com/doc/43700968/Colorimetria-copia-3 Disponible en:

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