TECNICAS DE OBSERVACIÓN

MICROSCOPICA
 Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:

• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.

• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la
división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observación con tinciones

• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).
 Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación en fresco
•preparación en fresco simple
•preparación en gota pendiente
2. Observación con tinciones
•Tinción simple: un solo colorante.
•Tinción diferencial: más de un colorante
•Tinción especial
Tinción negativa: colorea el medio que rodea a la
bacteria permaneciendo ésta sin teñir. 
Procedimiento para un preparado en fresco
("entre porta y cubre")

1. Colocar una gota de SSF o 2.- Tomar la muestra con el

agua en un porta asa de siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto
 Observación microscópica
1. Observación en fresco
 Bacterias: Leptospiras, treponemas (M.
campo oscuro)
 Observación microscópica
1. Observación en fresco : (SSF)
 Parásitos : Trofozoitos, larvas.
 Observación microscópica
1. Observación en fresco
 Hongos: Levaduras
 Observación microscópica
1. Observación en fresco con modificaciones
 Hongos
 NaOH 10% (hifas)
Procedimiento para un preparado en fresco
en gota pendiente
2. TINCIONES O COLORACIONES
 COLORANTE: DEFINICIÓN

• Son compuestos orgánicos que tienen alguna

afinidad específica por algún componente.

• Los colorantes son compuestos químicos

utilizados para aumentar el contraste
 COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: más comúnmente usados
 básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión
incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos )
 (cromatina nuclear de pro y eucariotas)
 (más usados en citología bacteriana).
• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica,
el cristal violeta
 ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No
tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste
(coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las
células eucariotas(Rx básicas)
 Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.
 COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
• Se combinan con los componentes lipídicos de
la célula, usados para revelar la localización de
los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.
 COLORACIONES : Tipos
• Vitales
– Son aquellas que se practican sobre células que están vivas,
mediante la introducción de un colorante en la circulación
de un organismo vivo.
– Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
– son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos,
pero que están aislados del organismo del que proceden.
• No vitales
– se realizan sobre células muertas.
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)

b) La fijación

c) Coloración.
Tinción de células para la observación
microscópica

Extensión de una fina capa

de células sobre el porta

Adición del colorante

lavado y secado
Secado al aire

Se coloca una gota de aceite

de inmersión sobre el porta y
se observa con el objetivo de
Fijación por flameado del porta 100X
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
b) La fijación:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y éter)

Metanol
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
c) Coloración. SIMPLE : Positiva o negativa
 Lunes
Tinción simple de azul de metileno.

Frotis y fijación

1.- Poner una gota de agua en 2.- Tomar la muestra con el asa 3.-Extender sobre el agua y
un porta de siembra fijar a la llama del mechero

Tinción

1.- Cubrir la preparación 2.- Lavar con agua, dejar

con Azul de Metileno 5’ secar y observar al
microscopio

Micrococcus luteus
 Lunes
Tinción negativa.

1.- Colocar una gota de

Nigrosina en un porta
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender por
2.- Tomar muestra del todo el porta. Secar al aire
microorganismo con el asa, y observar
flamear el tubo y tapar

cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas
 Hongos
 Tinción negativa
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
c) Coloración. Diferencial o compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos

Etapas :
1. tinción primaria
2. Tinción de contraste o secundaria
- Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHL-
NEELSEN, ESPORAS
 TERMINOS
• Los mordientes, aunque no son
colorantes, intensifican la tinción
porque aumentan la afinidad de la
célula por el colorante. También se
pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras
celulares externas, como los flagelos,
que debido a su delgadez no podrían
ser visualizados de otra forma.
Diferencias en la pared celular
 Lunes

Tinción
L-3.2.3.- Tinción de Gram
Frotis y fijación

1.- Poner una gota de 2.- Tomar la muestra con 3.- Extender sobre el
agua en un porta el asa de siembra agua y fijar a la llama 1.- Cubrir la 2.- Añadir Lugol
del mechero preparación con (mordiente) durante 1’
Cristal Violeta 2’

3.- Decolorar con Alcohol

4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua, dejar
96º hasta que no suelte
colorante secar y observar al
microscopio
 Tinción de Gram
Tinción del frotis
Previamente fijado al calor,
Paso 1 con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las células se tiñen
de color azul-violeta.

Añadir Lugol,
Paso 2 dejar actuar 2 minutos

Todas las células siguen

de color azul-violeta.
Gram +

Decolorar con alcohol

Las células Gram +
Paso 3 siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.

Tinción de contraste
Con safranina 2 minutos.

Las células G+
se ven azul-violeta.
Paso 4
Las G- rosas o rojas.

Gram -
PROCEDIMIENTO COLORACION
GRAM
 Lunes

Tinción de Gram

Cocos Gram - Bacilos Gram -

 COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN

fundamento de esta técnica diferencial se basa en la propiedad

de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos micólicos)
• Resiste la decoloración con alcohol y un ácido fuerte cuando
• VARIANTES
• Caliente : Mycobacterium
• En frío (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E
 Miercoles
Tinción de ácido-alcohol-resistente.
Frotis y fijación Tinción

1.-Poner una gota de agua en un 2.- Tomar la muestra de un 3.-Extender sobre el agua y
porta cultivo de Mycobacterium fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparación con

Fuchina fenicada

2.-Calentar con un hisopo de

algodón empapado en alcohol y 4.-Teñir con Azul de
3.-Lavar con agua y Metileno 1’
prendido con la llama del mechero
decolorar con alcohol
hasta la emisión de vapores.
ácido
Mantener durante 5 minutos.

5.-Lavar con agua, dejar

secar y observar al
microscopio
Tinción de esporas. Miercoles

Tinción
Frotis y fijación

1.-Poner una gota de 2.-Tomar la muestra de un 3.-Extender sobre el 1.-Cubrir la

agua en un porta cultivo de Bacillus agua y fijar a la llama preparación con Verde
del mechero Malaquita

5.-Lavar con agua, dejar

2.-Calentar, con un 3.-Lavar con agua 4.-Teñir con Safranina 1’
secar y observar al
hisopo de algodón
microscopio
empapado en alcohol y
prendido con la llama
Esporas
del mechero, hasta la
emisión de vapores.
Mantener caliente
durante 5 minutos.
Bacterias
 La tinción de flagelos de Leifson
• 1.Se fija químicamente la suspensión bacteriana,
mediante formol, y se hace la extensión en un
portaobjetos.
• 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
• 3.Se cubre la preparación con una mezcla de ácido
tánico y el colorante rosanilina, de preparación
extemporánea. El ácido tánico engruesa los flagelos y
la rosanilina los tiñe.
• 4.Se retira el exceso de colorante con agua.
5. Por último, se deja secar al aire, antes de su
observación al microscopio. 
• Figura 3.11Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar
endosporas. Bacilius cereus (b) La tinción de Leifson revela que este microorganismo posee
flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa
con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su
identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.
 Técnicas de tinción para bacterias
Tinción Uso Técnicas
Tinciones Un colorante; proporciona contraste para Se tine con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina
simples observar mejor un organismo completo básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi
todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.
Tínciones    
diferenciales
Tinción de Gram Dos o más colorantes; distingue entre Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con
bacterias Gram positivas y Gram negativas una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color
violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.
Tinción de Dos colorantes; distingue entre las Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores
ácido-alcohol micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora
resistencia resto de las bacterias brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes
(Ziehl-Neelsen) permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el
colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes
continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.
Tinciones    
especificas
Tinción de Tiñe selectivamente las endosporas Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de
esporas de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe
Wirtz-Cortitlin con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula
toma el color rosa.
Tinción de Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico
flagelos de (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el
Leifson colorante los fine.
Tinción negativa Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparación en fresco del
espécimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que
se observa como una región clara alrededor de la célula.
 Imágenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos
microscopios. (a) La microscopía de campo claro permite observar la forma y las
estructuras internas de mayor tamaño, como el núcleo. (b) La imagen de
contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el característico halo. (c) La
microscopía de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de
Nomarsky es casi tridimensional.
 PARASITOS: Plasmodium
• GIEMSA O WRIGHT
COLORACION LEISHMAN
 HONGOS
• AZUL DE LACTOFENOL
• T. MENTAGROPHYTES
COLORACION DE TEJIDOS
HEMTOXILINA /EOSINA
Hay alguna pregunta…?
o de lo contrario…

…seguimos en la
próxima clase !!!