CROMATOGRAFIA DE

LIQUIDOS
Objetivos
 Entender la importancia de la
estructura y las propiedades de
los compuestos que se
separarán por CLAR para la

AZ
selección de una fase
estacionaria y detector

Flujo
adecuadas.
 Ser capaz de predecir el orden

R
de elución de los compnentes
de una mezcla.
 Comprender los efectos del
tamaño de partícula, longitud

AM
de columna, composición de la
fase móvil y la velocidad de
flujo sobre una separación
determinada.
 Cromatografia de Liquidos de Alta Resolucion

Reserva de
Disolvente

Filtro

Unidad
Presión e de Inyección
Bomba +
indicador de Columna
sistema de
flujo
gradiente
Horno
(opcional)

mV
Detector
Regis- Procesador
Tiempo trador de datos
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Resolucion

Desarrollo de un método para una muestra que contiene

Aspirina Paracetamol Cafeína

Cromatografia de Liquidos de Alta
Resolucion

Fases a investigar
 Naturaleza química de la aspirina,
el paracetamol y la cafeína
 Selección del detector

 Selección de la fase estacionaria

 Optimización de la separación
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Resolucion

El conocimiento de la naturaleza química de cada

componente en una mezcla proporciona información valiosa
sobre el comportamiento de retención y el orden de elución.
Esto es debido a que propiedades del fármaco tales como la
polaridad, la acidez y basicidad, y la capacidad para formar
puentes de hidrógeno, determinan la afinidad relativa del
fármaco hacia las fases móvil y estacionaria y por lo tanto su
tiempo de retención, tr.
 Cromatografia de Liquidos de Alta
Resolucion

La retención puede ser caracterizada por el

factor de capacidad

k’ = (tr – to)/ to
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Resolucion

Aspirina Paracetamol Cafeína

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Resolucion
Naturaleza Química

Aspirina Paracetamol Cafeína

1. Más Polar
Aspirina Paracetamol Cafeína
2. Menos Polar
Aspirina Paracetamol Cafeína
3. Forma más fácilmente
puentes de hidrógeno
Aspirina Paracetamol Cafeína
4. Más ácido
Aspirina Paracetamol Cafeína
5. Más básico
Aspirina Paracetamol Cafeína
6. Débilmente ácido
Aspirina Paracetamol Cafeína
7. Más soluble en metanol
Aspirina Paracetamol Cafeína
8. Fácilmente soluble en CHCl3
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Resolucion
Selección del Detector

Propiedad del soluto Detectores

1. Altera el índice de refracción A. Conductimétrico
de la fase móvil B. Absorbancia UV (longitud de onda
2. Fluorescencia variable)
3. Absorbe radiación UV B. Indice de refracción
4. Está completamente ionizado C. Fluorímetro
5. Presenta fácil oxidación o reducción D. Amperométrico
electroquímica E. Absorbancia de UV (a 254 nm)
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Fases estacionarias

1. Sílica no modificada 6. NH2 – Amino

2. C18 – Octadecil (ODS)
7. CN – Nitrilo
3. C8 – Octil
4. Cadenas alifáticas cortas 8. -CH(OH)-CH(OH) – Diol
(C6, C3, C1) 9. Intercambio
5. Fenilo aniónico/catiónico
10. Exclusión
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Resolucion
Orden de elución

1 Aspirina Paracetamol Cafeína

2 Paracetamol Cafeína Aspirina

3 Aspirina Cafeína Paracetamol

4 Cafeína Aspirina Paracetamol

5 Paracetamol Aspirina Cafeína

6 Cafeína Paracetamol Aspirina

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Resolucion

Factores cromatográficos a estudiar

1. Tamaño de partícula (3, 5 y 10 micras)

2. Longitud de la columna (10 y 20 cm)
3. Composición de la fase móvil,
% de metanol en buffer (20, 40 60 80 y 100)
4. pH del Buffer (3 y 7)
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Resolucion
Diseños Factoriales
Caso 1
Se desean separar y cuantificar los fármacos descritos abajo, mediante
CLAR, los cuales se encuentran en un gel mantenido a 30°C durante
1 año. El tratamiento de la muestra ya ha demostrado que es capaz de
eliminar la mayor parte de componentes presentes en la fórmula. Con
ésta información, proponer:
a) La polaridad de la fase estacionaria de la columna cromatográfica, la
polaridad de la fase móvil y el tipo de detección. En cada caso
justificar la propuesta. Describa el orden de elución.
b) Los factores a estudiar y los valores que tomarían, para obtener Resoluciones (Res) mayores que
1.6 y factores de Coleo (T) menores a 1.4, de acuerdo a los resultados descritos en la tabla de abajo.

Exp A B C Res T
1 -1 -1 -1 0.69,1.17 2.28,2.33
2 1 -1 -1 1.44,1.55 1.65,2.1
3 -1 1 -1 1.58,1.79 1.5,1.78
4 1 1 -1 2.08,2.11 1.5,1.5
5 -1 -1 1 1.02,1.08 3.0,1.81
6 1 -1 1 0.78,1.08 2.0,1.61
7 -1 1 1 1.8,1.62 2.25,1.6
8 1 1 1 1.1,1.25 1.5,1.25
Exp A B C Res T
(MeOH:Agua) (Flujo) (pH)
1 -1 -1 -1 0.69,1.17 2.28,2.33
2 1 -1 -1 1.44,1.55 1.65,2.1
3 -1 1 -1 1.58,1.79 1.5,1.78
4 1 1 -1 2.08,2.11 1.5,1.5
5 -1 -1 1 1.02,1.08 3.0,1.81
6 1 -1 1 0.78,1.08 2.0,1.61
7 -1 1 1 1.8,1.62 2.25,1.6
8 1 1 1 1.1,1.25 1.5,1.25
 Nombre y Niveles de los Factores

Agua:ACN pH Flujo

-1 40:60 3 1

1 60:40 5 1.5

Media 50:50 4 1.25

Int 20 2 0.5
 Análisis de Varianza para Res
ANOVA
F.V. G.L. SC SCM F
A 1 0.03 0.03 0.9
B 1 1.28 1.28 46.9
AB 1 0.08 0.08 3.0
C 1 0.45 0.45 16.5
AC 1 0.66 0.66 24.4
BC 1 0.05 0.05 1.9
ABC 1 0.02 0.02 0.6
RES 8 0.22 0.03
TOTAL 15 2.78 0.19

Análisis de Varianza para T

ANOVA
F.V. G.L. SC SCM F
A 1 0.74 0.74 5.1
B 1 0.95 0.95 6.5
AB 1 0.03 0.03 0.2
C 1 0.01 0.01 0.1
AC 1 0.08 0.08 0.6
BC 1 0.00 0.00 0.0
ABC 1 0.01 0.01 0.1
RES 8 1.17 0.15
TOTAL 15 3.00 0.20
 Modelo para Res
Y = bo + b1 * A + b2 * B + b3 * A * B + b4 * C + b5 * A *
C + b6 * B * C + b7 * A * B * C
bo b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7
1.38 0.04 0.28 -0.07 -0.17 -0.20 -0.06 -0.03

Modelo para T

Y = bo + b1 * A + b2 * B + b3 * A * B + b4 *
C + b5 * A * C + b6 * B * C + b7 * A * B * C
bo b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7
1.85 -0.22 -0.24 0.04 0.02 -0.07 0.02 -0.03
 Efectos principales para Resolución Interacción para Resolución
1.7 1.98
-
1.6 -
1.78
1.5 +
+
1.58
Res

Res
1.4
+
1.38 +
1.3 -
1.18 - -
1.2
+
1.1 0.98 - +
-1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0
Factor_A Factor_B Factor_C AB AC BC

Efectos Principales para T Interacción para T

2.1 2.4
-
2 2.2 +
+-
1.9 2 -
T

1.8 T 1.8 +
-
- +
1.7 1.6 + -

1.6 1.4 +
-1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0
Factor_A Factor_B Factor_C AB AC BC
 Representación gráfica para Resolución
1.71
1.05 1.175
1.0 0.93

Factor_C
1.685 1.0
0.93 2.095
-1.0 1.495
-1.0 -1.0 Factor_B
1.0
Factor_A

Representación gráfica para T

1.895
2.435 1.405
1.0 1.775
Factor_C

1.67 1.0
2.275 1.47
-1.0 1.905
-1.0 -1.0 Factor_B
1.0
Factor_A
 Factor_C=-1.0 Factor_C=-1.0
1.4 Res 1.4 T
1.6 1.3
1 1.7 1 1.4
1.8 1.5
Factor_B

Factor_B
0.6 1.9 0.6 1.6
2.0 1.7
0.2 2.1 0.2 1.8
2.2 1.9
-0.2 -0.2 2.0
2.1
-0.6 -0.6
-0.6 -0.2 0.2 0.6 1 1.4 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1 1.4
Factor_A Factor_A

Contorno de Res y T
Factor_C=-1.0
1.4

1 Res=1.8, T=1.6
Res=2.0, T=1.5
Factor_B

0.6
Res=1.7, T=1.7
0.2

-0.2 Res=1.6, T=1.8

-0.6
-0.6 -0.2 0.2 0.6 1 1.4
Factor_A