1.

2 A
MUESTREA
YS
EQUIPO Y M ELECCIONA EL
ATERIAL PA
ANALISIS M RA EL
ICROBIOLO
GICO.

*
 LABORATORIO.

0MATERIAL
0Y EQUIPO
DE USO COMÚ N EN
0MICROBIOLOGÍA.
 MATERIAL Y EQUIPO
1.1. Mesas de laboratorio y fregadero
1.2. Vitrinas y armarios                    
 1.3. Mechero Bunsen

Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama

del mechero (zona aséptica).
En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama
Antes de comenzar a trabajar se procurará disponer de todo el material necesario
para el procesamiento de la muestra
Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminació n de las muestras o/ y
cultivo por microorganismos ambientales
1.4. Gradillas
1.5. Estufa de incubación
Es una cá mara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.

Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su

temperatura ó ptima de crecimiento (generalmente 35-37º).
ESTUFA DE CULTIVO.
1.6. Frigorífico o cámaras refrigeradas

Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como

microorganismos.
Generalmente está n a una temperatura fija de 4ºC.
1.7. Congeladores
Se utilizan para la conservació n de reactivos y microorganismos a temperaturas
inferiores a 0ºC, llegando a -80ºC (los más frecuentes son -20º, -40º y -80º).
1.8. Microscopio óptico
1.9. Centrífuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo que permite la
separació n de los distintos componentes de la muestra mediante la precipitació n
en el fondo del tubo de las partículas en suspensió n.
1.10. Cámaras de seguridad biológica
1.11. Desionizador de agua.
La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiología
Clínica necesitan la utilizació n de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de
interferencia. Entre otra características debe: estar exenta de materiales en
suspensió n o  un pH  comprendido entre 5,0 y 7,5. Durante añ os se ha utilizado
agua destilada, en la actualidad los destiladores se han ido abandonando para dar
paso a desionizadores que funcionan con resinas de intercambio ió nico. También
se pueden utilizar otras técnicas como la ósmosis inversa.
1.12. Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminació n de la
placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto
facilita su recuento.
1.13. Balanzas
1.14. Baños termostáticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de
regulació n de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o
incluso para incubar cultivos de microorganismos.
1.15. Agitador/ mezclador
1.16. Jarras de anaerobios:
Recipientes que se usan para conseguir una atmó sfera libre de oxígeno para el
cultivo de microorganismos anaerobios.
1.17. Asas de siembra:
Se utilizan para sembrar. Pueden ser metá licas o de plá stico, curvas o rectas (para
la siembra por picadura).
1.18.  Ph-metros:
1.19. Material fungible.
 
Placas de Petri: recipientes para verter los medios de cultivo só lidos.
Placas de Petri con medio sólido

Tubos con medio líquido

Tubos con medio sólido

Pipetas de vidrio, de plástico y pipeteadores.
Pipetas automáticas (micropipetas) y puntas de pipeta:
Se utilizan para pipetear pequeñ as cantidades de líquidos.
Se utilizan con puntas desechables de distinto tamañ o y color segú n la micropipeta.
Existen cuatro tamañ os: de 0,5-2µm; de 2-20 µm; de 20-200 µm y de 200-1000 µm.
Asas acodadas o Asas de Digralsky:
Se utilizan para la extensió n de microorganismos sobre la superficie de un medio de
cultivo en placa Petri.

Portas y cubres
Para realizar las observaciones al microscopio.
Vasos de precipitados y matraces

Cucharas y espátulas:
Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.
PREPARACION Y DILUCION DE LA MUESTRA
1. Preparación de la dilución primaria:
1.1. Muestras líquidas no viscosas (como agua, leche, refrescos, etc.
en las cuales la distribució n de microorganismos es homogénea o
fá cilmente homogeneizable por medios mecá nicos como agitació n)
0 1. Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm., con 25
movimientos de arriba abajo, efectuados en un tiempo de 7
segundos.
0 2. En condiciones asépticas, tomar 10.0 mL de la muestra y 3. Diluir
con 90.0 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una
temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente.
1.1.1. Alimentos originalmente líquidos o licuables y congelados:
0 1. Fundir por completo en bañ o de agua entre 40 y 45°C en un
tiempo má ximo de 15 minutos y homogenizar agitando
vigorosamente.
0 2. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras líquidas no
viscosas.
1.1.2. Parte líquida de una muestra heterogénea que
sea considerada suficientemente representativa de la
muestra total:
0 1. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras
líquidas no viscosas.

1.2. Muestras sólidas o semisólidas.

1.2.1. Muestras sólidas y semisólidas no congeladas:

0 1. Pesar una cantidad de 10.0 g de la muestra por
analizar en un recipiente o bolsa plá stica esté ril de
tamañ o adecuado.
0 2. Adicionar un volumen de 90.0 mL del diluyente, segú n
sea el caso, llevado a una temperatura similar a la de la
muestra.
0 3. Operar la licuadora o el homogeneizador
peristá ltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una
suspensió n completa y homogénea, segú n se indique
en la técnica correspondiente para cada alimento. Aú n
en los equipos má s lentos, el tiempo de
homogenizació n debe ser < 2.5 minutos.
0 4. Permitir que las partículas grandes se sedimenten,
y transferir la cantidad deseada (alícuota), tomando
é sta de las capas superiores de la suspensió n.

1.3. Muestras sólidas y semisólidas congeladas:

0 1. Descongelar en refrigeració n de 4 a 8ºC durante 18
h. y no má s de 24 h. antes de diluir y analizar.
0 2. Proseguir como se indica en el inciso 1 para
muestras só lidas y semisó lidas no congeladas
2. Preparación de las diluciones decimales
adicionales.
0 1. Transferir 1.0 mL o un mú ltiplo de la dilució n
primaria, a otro recipiente que contenga nueve
volú menes del diluyente esté ril a la temperatura
apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente. Si se toma 1.0 mL de muestra en 9.0 mL de
diluyente, se obtendrá una dilució n 1:10; si se utilizan
10.0 mL de muestra se utilizará n 90.0 mL de diluyente
y así se tendrá la misma dilució n 1:10
0 2. Mezclar cuidadosamente cada nueva dilució n, siempre de la
misma manera que se describe en el punto 1 del inciso A.
0 3. Selecció n de las diluciones a preparar, así como de aquellas
que se van a inocular, depende del nú mero esperado de
microorganismos en la muestra, con base en los resultados de
aná lisis previos y de la informació n que se obtenga del personal
de inspecció n que la haya colectado. En ausencia total de
informació n, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
0 4. Utilizar pipetas diferentes para cada dilució n inoculando
simultá neamente las cajas seleccionadas. El volumen transferido
debe ser > 10% de la capacidad total de la pipeta. Si es terminal y
se transfiere su capacidad total, escurrir aplicando la punta una
sola vez en un á rea de la caja Petri sin líquido.
0 5. Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe
apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en
posició n vertical, para lo cual este ú ltimo debe inclinarse lo
necesario.
 Introducció n.
MUESTREO.
0 El muestreo consiste en separar una serie de
muestras representativas del lote para someterlas al
aná lisis microbioló gico. El estudio de un nú mero
parcial de datos de uno colectivo, ayuda a deducir las
características de la totalidad.
0 UNIDAD ANALÍTICA: es la porció n de la unidad de
muestra realmente utilizada en un aná lisis en el
laboratorio. Unidad analítica es igual a unidad de
muestra.
0 CONCIDERACIONES GENERALES PARA EL MUESTREO:
No todos los productos pueden recibir la misma atenció n, hay
productos que pueden ser má s importantes que otros o que
presenten mayor riesgo, por lo que Los factores que hay que tener
en cuenta para un muestreo má s o menos intenso, son los
siguientes:

0 * Riesgo: es el má s importante, el tipo de riesgo que implica el

producto , en qué medida es peligroso el tipo de microorganismos
que el producto pueda presentar , lo que hará que la probabilidad
de aceptació n del producto rechazable sea lo menor posible .

0 * Uniformidad: si tras el proceso de fabricació n, el producto

obtenido es muy homogé neo, puede usarse un tamañ o o nú mero
de muestras menor.

0 * Estratificació n: si el lote está formado por sublotes, es necesario

muestrear cada sublote, lo que supone un mayor nú mero de
muestras.
0  Instrumentos para la apertura de envases : todos estériles , ejemplo : tijeras
estériles , pinzas estériles , cuchillos estériles , taladros estériles ...

0 * Etiquetas y material para marcar : toda muestra debe ser correctamente

etiquetada e identificada , ejemplos : etiquetas de cartulina , etiquetas
adhesivas , lá piz grueso , rotuladores , bolígrafos .

0 * Equipo de esterilizació n: en el laboratorio los envases para muestras y otro

tipo de material, se esteriliza en el autoclave o se puede usar un horno ,
mediante calor seco, que puede alcanzar los 170ºC (y que el material
aguante), en el trabajo de campo se puede utilizar un mechero de alcohol .

0 * Refrigeració n: casi siempre, las muestras deben , mantenerse en frío para

preservar sus características microbioló gicas , para ello tenemos que llevar
una nevera portá til , una caja de plá stico aislante o un congelador portá til .
0 * Historial: si un producto de un buen fabricante tiene un historial y
es digno de confianza, el muestreo puede reducirse (la confianza
aumenta conforme lo hace el historial, por ejemplo: los de Sanidad
emplean menos tiempo en inspeccionar a estas empresas).

0 * Limitaciones prá cticas: no siempre puede disponerse de todos los

recursos necesarios para poder analizar un gran nú mero de
muestras, muchos aná lisis microbioló gicos son laboriosos y lentos,
lo que puede llevar a reducir el nú mero de muestras, lo que
aumenta el riesgo.
Material utilizado en el muestreo:
El material para la toma de muestras en Microbiología debe de
reunir características que lo hagan adecuado para este tipo de
aná lisis.

0 * Envases para la toma de muestras: los envases deben estar

perfectamente limpios, secos, esté riles y sin fugas, su tamañ o
guardará relació n con la muestra que se vaya a tomar, será n
hermé ticos e inaccesibles a cualquier contaminació n posterior a su
esterilizació n, los envases que vayan a reutilizarse deben ser de una
calidad y material apropiados, para que puedan esterilizarse
repetidas veces.
0 *Líquidos desinfectantes: muchas veces para la toma
de muestras es necesario desinfectar superficies de
contacto , como por ejemplo los grifos , de ahí que sea
necesario usar un líquido desinfectante , como el
alcohol etílico al 70% ( es mejor desinfectante
diluido , porque el agua facilita la acció n penetrante ) ,
una disolució n de hipoclorito só dico ( lejía ) y también
tener algodó n hidró filo .
TÉCNICAS DE MUESTREO
0 Técnicas no destructivas
Los métodos no destructivos se basan en la evaluació n
segú n conceptos físicos. Un ejemplo son los
consistentes en la obtenció n de coeficientes de
absorció n acú stica superficial del fruto, que permita
detectar su estado de madurez o procedimientos de
resonancia no destructiva.
Técnicas destructivas
Son un ejemplo de estos métodos los ensayos de
comprensió n, de tenció n, de flexió n y trituració n. 
0Técnica con esponja 
a) Descripció n:

Consiste en frotar con una esponja estéril, previamente humedecida en una

solució n diluyente, el área determinada en el muestreo.

b) Materiales:

* Esponja estéril de poliuretano o de celulosa, de 5cm x 5 cm.

* Plantilla estéril, con un á rea en el centro de 100 cm2 (10 cm x 10 cm).
* Frascos con tapa rosca de 250 mL de capacidad, con 100 mL de solució n
diluyente
* estéril.
* Pinzas estériles.
* Bolsas de polietileno de primer uso.
* Guantes descartables de primer uso.
* Protector de cabello.
* Mascarillas descartables.
* Plumó n marcador indeleble (para vidrio).
* Caja térmica.
* Refrigerantes.
0 c) Procedimiento:

1. Retirar la esponja de su envoltura con la pinza estéril o con guantes

descartables o bien usar una bolsa de primer uso, invertida a manera de guante.
2. Humedecer la esponja con la solució n diluyente estéril (aproximadamente 10
mL).
3. En condiciones asépticas frotar vigorosamente el á rea a muestrear. En el caso
de superficies regulares, frotar el á rea delimitada por la plantilla y en las
superficies irregulares (cuchillas, equipos, utensilios, etc), frotar abarcando la
mayor cantidad
de superficie.
4. Colocar la esponja en el frasco con el resto de la solució n diluyente o
alternativamente colocar la esponja con la muestra en una bolsa de plá stico de
primer uso.
5. Para el caso específico de utensilios se deberá repetir la operació n con 3
utensilios má s (total 4 como máximo), con la misma esponja, considerando el área
que está en contacto con el alimento o con la boca.
6. Las tazas, copas o vasos se muestreará n 2 a 3 cm alrededor del borde por
dentro y por fuera.
0 d) Conservació n y Transporte de la muestra
Las muestras se colocará n en un contenedor isotérmico con gel
refrigerante, el cual se distribuirá uniformemente en la base y en los
laterales, para asegurar que la temperatura del contenedor no sea
mayor de 10°C, a fin de asegurar la vida ú til de la muestra hasta su
llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de
muestra y la recepció n en el laboratorio estará en funció n estricta de
dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.
Se deberá registrar la temperatura del contenedor al colocar las
muestras y a la llegada al laboratorio con la finalidad de asegurar que
las mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada. Las
temperaturas superiores a 10 °C invalidan la muestra para su aná lisis.
0Técnica del hisopo 
a) Descripció n:
Consiste en frotar con un hisopo estéril previamente humedecido en una
solució n diluyente, el á rea determinada en el muestreo.
0 b) Materiales:
* Hisopos de algodó n u otro material equivalente, de largo aproximado de 12
cm.
* Tubo de ensayo con tapa hermética conteniendo 10 mL de solució n diluyente
estéril. Se agregará una solució n diluyente con neutralizante como alternativa.
(Ver
Anexo 1).
* Plantilla estéril, con un á rea abierta en el centro de 100 cm2 (10cm x 10cm)
o alternativamente, plantilla estéril, con un área abierta en el centro de 25 cm2
(5 cm x 5 cm).
* Guantes descartables de primer uso.
* Protector de cabello.
* Mascarillas descartables.
* Plumó n marcador indeleble (para vidrio).
* Caja térmica.
* Refrigerantes.
0 c) Procedimiento:

1. Colocar la plantilla (10cm x 10cm) sobre la superficie a

muestrear.
2. Humedecer el hisopo en la solució n diluyente y presionar
ligeramente en la pared del tubo con un movimiento de rotació n
para quitar el exceso de solució n.
3. Con el hisopo inclinado en un á ngulo de 30º, frotar 4 veces la
superficie delimitada por la plantilla, cada una en direcció n
opuesta a la anterior. Asegurar el hisopado en toda la superficie.
4. En el caso de utilizar la plantilla de 5cm x 5cm, repetir esta
operació n 3 veces má s, en lugares diferentes de la misma
superficie, para obtener 100 cm2.
5. Colocar el hisopo en el tubo con la solució n diluyente,
quebrando la parte del hisopo que estuvo en contacto con los
dedos del muestreador, la cual debe ser eliminada.
6. Para superficies irregulares, en el caso de utensilios, se repetirá
la operació n con 3 utensilios má s (total 4 como má ximo), con el
mismo hisopo, considerando el á rea que está en contacto con el
alimento o con la boca.
7. Si no se toman las 4 muestras, se debe anotar en la Ficha de
Toma de Muestra.
0 d) Conservació n y Transporte de la muestra

Las muestras se colocará n en un contenedor isotérmico

con gel refrigerante, el cual se distribuirá
uniformemente en la base y en los laterales, para
asegurar que la temperatura del contenedor no sea
mayor de 10°C, a fin de asegurar la vida ú til de la
muestra hasta su llegada al laboratorio. El tiempo de
transporte entre la toma de muestra y la recepció n en
el laboratorio estará en funció n estricta de dicha
temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.

Se deberá registrar la temperatura del contenedor al

colocar las muestras y a la llegada al laboratorio con la
finalidad de asegurar que las mismas hayan sido
transportadas a la temperatura indicada. Las
temperaturas superiores a 10°C invalidan la muestra
para su aná lisis.
 1.2 C

PREPARA
MEDIOS DE CULTIVO.
 Preparació n de
medios de cultivos
0 El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes
indispensables para el crecimiento de los microorganismos.
La composició n precisa dependerá de la especie que se
quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente. Hay microorganismos muy poco
exigentes que crecen bien en medios de laboratorio
normales y microorganismos muy exigentes que necesitan
determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre
para crecer.
Existen medios cuya composició n permite el
crecimiento de:

1. Un gran nú mero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario,

agar de Sabouraud),

2. Determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo

de otros), son los denominados medios selectivos.

3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de

determinadas pruebas fisioló gicas o test bioquímicos
(utilizació n de citratos, acidificació n a partir de azú cares, etc.).
Los medios de cultivo poseen una serie
de componentes:

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua,

nutrientes orgá nicos (hidratos de carbono, aminoá cidos,
vitaminas, etc.) y nutrientes inorgá nicos (P, Fe, N, Mg, S, etc.)

2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente

solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.
 Incubació n:
0 Depende del metabolismo del microorganismo a
cultivar.

0 La atmó sfera empleada.(aerobio, microaerofílico,

anaerobio)
0 Tiempo.
0 Temperatura.
 Medios de cultivos
Clasificació n de medios de cultivo:

1. Segú n su estado físico: líquidos, semisó lidos y só lidos.

2. Segú n su finalidad en microbiología:

No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el

crecimiento de gran variedad de microorganismos.
Selectivos: permiten el crecimiento de só lo un tipo de microorganismo.
Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser
sangre, suero, albú mina, etc... Para microorganismos exigentes.
Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias
entre diferentes tipos microorganismos.
Los requerimientos de los medios de cultivo son específicos de :

0 La muestra que se analiza.

0 De los microorganismos a ser detectados.
0 Los medios de cultivo se preparan:
En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes.
A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o
pueden adquirirse medios listos para su uso.
 Manejo de los medios de
cultivo:
El laboratorio debe registrar la fecha :
0 de recepció n
0 de apertura del envase.
0 de caducidad
El almacenamiento debe realizarse en las condiciones
apropiadas.
Envases: deben estar herméticamente cerrados.
No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.
Control de calidad del agua destilada
Aplicar pruebas y aná lisis
 Realizació n prá ctica
1. Disolver los componentes del medio en agua destilada.
En muchos casos se parte de un preparado comercial con
todos los componentes deshidratados. Añ adir la cantidad
de agua adecuada para conseguir la concentració n deseada
de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante
(agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la
ebullició n del mismo agitando de vez en cuando, para
asegurar una completa disolució n del agar (medios só lidos
y semisó lidos); para medios líquidos no es necesario
calentar, ú nicamente se agita la mezcla hasta la completa
disolució n de la misma.
2. Esterilizar la disolució n.- Una vez disuelto el medio se debe
esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes.
Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el
procedimiento será diferente:
a) Medios só lidos en placa.- Tapar el matraz con tapó n de
algodó n y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar al
autoclave durante 15-20 minutos. Una vez estéril repartir en
placas de Petri estériles y dejar en reposo para que
solidifique.

b) Medios líquidos.- Una vez disueltos los componentes

repartir en tubos a razó n de unos 2-4 ml por tubo, tapar con
tapó n de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.
ESTUFA DE CULTIVO
0MANEJO

0COMPONENTES

0MANTENIMIENTO
ESTUFA DE CULTIVO.
 ¿Qué es estufa de
cultivo/incubadora ?
0 Es una incubadora que tiene que
mantenerse a 37ºC para desarrollo de
los cultivos bacterianos, hay algunas
incubadoras que tienen tensió n
de oxigeno para anaerobios facultativos.
El nombre comú n es incubadora bacterioló gica
USO Y MANEJO DEL EQUIPO.
0 Lo ú nico que se debe hacer, despué s de tener
preparado el cultivo, es verificar que el termó metro
marque 37 grados centígrados, que es
la temperatura a la cual debe estar, y colocar el cultivo,
luego de lo cual, se cierra la incubadora, y se revisa el
cultivo cada 24 horas para verificar si el crecimiento
es positivo o negativo.
 PARTES DEL EQUIPO:.
0 Controlador de temperatura
0 Panel de control
0 Gabinete externo
IDENTIFICACION DE SUS
COMPONENETES.
 MANTENIMIENTO
0 Limpieza Antes limpiar el equipo, desconectarlo
de alimentació n.
0 Para la limpieza no sumerja el equipo en agua.
0 Utilice un pañ o suave seco hú medo (no embebido)
con jabó n neutro. No utilice abrasivos.