CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN

POR TAMAÑOS (SEC)

Basada en la utilización de fases estacionarias

constituidas por una material poroso, inerte,
que permite la discriminación de los solutos
según su tamaño y forma molecular.

Modalidades:
1. Cromatografía de filtración por gel: solutos
solubles en agua.
2. Cromatografía de penetración en gel: solutos
solubles en disolventes orgánicos.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
POR TAMAÑOS

Campo de aplicación

Muy amplio ( Pm: 2000 – 107 Da)

Imprescindible para el análisis de polímeros

sintéticos y macromoléculas
(proteínas, polisacáridos, etc…) con el fin de
evaluar la distribución de pesos moleculares.
MECANISMO DE LA SEPARACIÓN
 RANGO DE PERMEACIÓN

El intervalo útil de Pm para un determinado

relleno de exclusión por tamaño se obtiene a
partir de una curva de calibrado.

Lo más habitual es utilizar Log Pm en

función del volumen de retención (VR). La
curva obtenida presenta generalmente una
parte lineal.
RANGO DE PERMEACIÓN
o Límite de exclusión (LE):
Pm de una especie por
encima del cual las
moléculas no penetran en
los poros.

o Límite de penetración
(LP):
Pm por debajo de el cual
las moléculas del soluto
penetran completamente
en los poros.
 RANGO DE PERMEACIÓN

o Región de penetración selectiva:

A media que los Pm disminuyen con respecto al LE, las

moléculas de soluto pasan cada vez más tiempo en los
poros de las partículas moviéndose con más lentitud.

Se obtienen picos para cada Pm.

Válida para compuestos de estructura química similar a

la de los patrones.
 CALIBRACIÓN UNIVERSAL

En ocasiones no se dispone de patrones, por lo que

es necesario recurrir a una calibración universal
que es independiente de la naturaleza química y
forma de las moléculas.

El VR de un polímero está correlacionado con su

volumen hidrodinámico, el cual se evalúa por
medidas de viscosidad () por acoplamiento en
serie de un detector de viscosidad:

Vh = Pm . 
CALIBRACIÓN UNIVERSAL
 ASPECTOS DIFERENCIALES DE
LA SEC
1. Fase estacionaria inerte: porosidad
controlada con retención de FM. No se
desactiva.

2. No existe interacción química ni fisico-

química soluto-fase estacionaria. No se
producen interacciones irreversibles o cuasi
irreversibles.

3. La FM no contribuye decisivamente a la
separación: generalmente no se emplean
gradientes.
 ASPECTOS DIFERENCIALES DE
LA SEC
4. El mecanismo de retención se establece por
contribución entrópica más que entálpica.

∆Go= -RT ln K ; K = coef. distribución

Teoría básica: K ≈ e -∆Ho/RT

SEC: K ≈ e -∆So/R ∆S < 0

K<< 1
 ASPECTOS DIFERENCIALES DE
LA SEC
5. Fuerzas de retención bajas.

6. La selectividad viene dada por la pendiente

de la zona de permeación.

7. La diferencia en el tamaño molecular de las

especies en el límite exclusión-permeación
indica el rango de tamaños moleculares para
los cuales es aplicable la columna. Rango de
permeación.

8. Se puede aumentar el rango de la zona de

permeación acoplando columnas en serie de
diferente porosidad, aumentando así la
eficacia.
 TEORÍA BÁSICA DE LA HPLC

La Teoría básica nos dice que el coeficiente de

partición, K´, varía entre 0 - ∞, es decir, entre la
exclusión total y la retención total.

En HPLC, K´ = (tR-to)/to = (VR – Vo)/Vo

VR = volumen de retención.
Vo = volumen muerto.
MODIFICACIÓN DE LA TEORÍA
BÁSICA
En SEC como los solutos eluyen antes que el
disolvente VR < Vo  K´< 0 (sin sentido)

Vt = V 0 + V i + Vg ≈ V o + V i

Vt = volumen total de la columna.

Vo = volumen vacío o intersticial.
Vi = volumen interno de las partículas. FM
estancada.
Vg = volumen del gel o matriz.
 MODIFICACIÓN DE LA TEORÍA
BÁSICA
Se define:

Ksec = Ci/Co = VR – Vo/Vt – Vo = VR – Vo/Vi

Ci = conc. Soluto en el interior de la matriz.

Co = conc. Soluto en el exterior de la matriz.

Exclusión total: Ksec = 0, VR = Vo

Penetración total: Ksec = 1, VR = Vt
 FASES ESTACIONARIAS
Geles blandos (polímeros naturales)
Se hinchan en contacto con la FM.

Inconveniente: se comprimen fácilmente. No

trabaja a altas presiones.

Muy buenos para la separación de sustancias de

alto Pm (proteínas, polisacáridos, etc...).

Precaución: pueden ser atacados por bacterias y

hongos. Almacenar en frigorífico y proteger con
azida sódica al 0.02%.
 FASES ESTACIONARIAS
Geles blandos

Nombre Tipo Rango Pm Método Casa

Copolímero Estireno-
Bio-Beads S divinilbenceno hasta 1,4x104 GPC Bio-rad

Bio-Gel A Agarosa 2,0x104 - 1,5x108 GFC Bio-rad

Bio-Gel P Poliacrilamida 102 - 4,0x105 GFC Bio-rad

Merckogel OR Acetato de polivinilo hasta 106 GPC Merck

Sephadex G Dextrano entrecruzado hasta 8,0x105 GFC Pharmacia

Sephadex LH-
20 Dextrano derivatizado 102 - 4,0x103 GPC Pharmacia

Sepharose Agarosa 3,0x105 - 2,5x107 GFC Pharmacia

 FASES ESTACIONARIAS
Semi-rígidas
MUY EFICACES

Desarrollados para trabajar a altas presiones

(no superan los 140 bar) y flujos altos.

Diseñados para trabajar con disolventes

orgánicos. La FM debe de mojar la
superficie, de lo contrario la tensión
superficial impide la penetración de las
moléculas en el interior de la matriz porosa
inerte.
 FASES ESTACIONARIAS
Semi-rígidas

Nombre Tipo Límite Método Casa

Styragel Estireno-divinilbenceno 5x108 GPC Waters
Applied
Ar Gel Estireno-divinilbenceno 2,0x10 7
GPC Research

Chromex Estireno-divinilbenceno 2,0x106 GPC Altex

Sheperagel Estireno-divinilbenceno 5x106 GPC Altex

Poragel A Estireno-divinilbenceno 2,0x104 GPC Waters

Finepakgel Estireno-divinilbenceno 3,0x103 GPC Jasco

Biobeads Estireno-divinilbenceno 4,0x102 GPC Bio-Rad

Aquapak Estireno-divinilbenceno   GFC Waters

Ohpak Poliester hidroxilado aprox. 107   Showa Denko

 FASES ESTACIONARIAS
Rígidas

Soportes de sílice de tamaño de poro

controlado.

Alta permeabilidad y resistencia mecánica.

Permite permear un rango más estrecho de

pesos moleculares que los geles  mayor
resolución.

Prácticamente todos los disolventes mojan

su superficie  más versátiles.
 FASES ESTACIONARIAS
Rígidas
Inconvenientes:

La sílice puede ser atacada tanto en medios

muy ácidos como en medios muy básicos.

Posibilidad de mecanismos mixtos.

Adsorciones, en disolventes acuosos, de
algunas sustancias como las proteínas. Esto se
evita mediante la silanización de grupos diol o
amino.

Reducción de la adsorción por adición de

detergentes no iónicos a la fase acuosa.
 FASES ESTACIONARIAS
Rígidas

Nombre Tipo Límite Casa

Synchropak GPC Sílice 10 8

Synchrom

CPG-10 Vidrio 2,0x107 Electro-Nucleotics

Bio-Glas Vidrio 5,0x106 Bio-Rad

Bondagel E Sílice 2,0x106 Waters

Zorbax PSM Sílice 10 6

Du Pont

Protein Column Sílice 5,0x105 Waters

CRITERIOS DE SELECCIÓN DE
LA FM

Buen disolvente de la muestra.

No debe de reaccionar con la FM, debe mojar

su superficie para facilitar la permeación de los
solutos por difusión.

Tener en cuenta la capacidad de solvatación de

los solutos que pueden originar cambios en los
VR.
 CRITERIOS DE SELECCIÓN DE
LA FM
Tener presente los posibles cambios en el tamaño
de poro de los geles blandos y si en un
determinado disolvente las moléculas tienden a
asociarse (p.ej. dimerizarse).

Compatible con el sistema de detección. El más

habitual es el refractómetro diferencial.

Que evite posibles adsorciones:

Regla empírica: seleccionar disolventes

de estructura similar al empaquetamiento.
CRITERIOS DE SELECCIÓN DE
LA FM

Columna Disolvente
Agarosa Agua+reg. pH 4-9

Dextrano derivatizado Agua+dis. Org. pH 2

Dextrano Agua pH 2

Poliacrilamida Agua+reg. pH 1-10

Estireno-DVB Dis. Org. No agua ni alcoholes

Vidrio, Sílice Todos lo dis. Cuidado pH

 VENTAJAS DE LA SEC

 Tiempos de separación cortos y bien definidos.

Todos los solutos salen de la columna entre Vo y
(Vo+Vi).

 Bandas estrechas que conducen a una buena

sensibilidad.

 Los solutos no interaccionan con la FE ni con el

relleno de la columna por lo que no hay pérdidas de
muestra ni se produce la desactivación de la
columna.
 DESVENTAJAS DE LA SEC

 Sólo se pueden acomodar un número limitado de

bandas en el cromatograma debido a que la escala
de tiempos es corta.

 No es aplicable a muestras de componentes de

tamaño semejante (mezclas de isómeros …) para
que la resolución sea aceptable. Se necesita que la
diferencia sea de al menos un 10% del Pm.
 APLICACIONES
1. Determinación de los Pm de
polímeros
Se aplica sobre todo a muestras polidispersas; mezclas
de moléculas de tamaños similares.

Los picos cromatográficos obtenidos son frecuentemente

muy anchos ya que la columna es incapaz de separarlos.

Parámetros a evaluar:

Mw = Pm medio;
Mn = número de Pm;
Mw / Mn = Dispersión.
 APLICACIONES
1. Determinación de los Pm de
polímeros

Polímeros monodispersos: Mw / Mn = 1
Polímeros polidispersos: Mw / Mn = 2 n

Propiedades:
Los polímeros con alto Mw son más
duros, resistentes y aguantan mejor altas
temperaturas. La dispersión polimérica se
traduce en una menor resistencia mecánica y
afecta a la fluidez en el moldeado.
 APLICACIONES
2. Determinación de proteínas.
Separación de las siguientes proteínas
presentes en una muestra:

Triglobulina (Pm = 669000 Da)

Ferritina (Pm = 440000 Da)
Ig G humana (Pm = 150000 Da)
Transferrina humana (Pm = 81000 Da)
Ovoalbúmina (Pm = 43000 Da)
Mioglobulina (Pm = 17600 Da)
Vitamina B12 (Pm = 13550 Da)
 APLICACIONES
2. Determinación de proteínas.
Condiciones de operación:

COLUMNA: Superdex 200 HR (300 x 10 mm) de matriz

esférica mixta de agarosa entrecruzada y dextrano.
LE de 1.3 x 106.

RANGO DE SEPARACIÓN: recomendado de

10000 – 600000 Da

FM: Na2PO3 0.05 M; NaCl 0.15M; pH = 7.0. Se impone un flujo

de 0.25ml/min.

INYECCIÓN: se inyectan 0.38 µg en 25 µL.

 APLICACIONES
2. Determinación de proteínas.

Se ha obtenido un buen cromatograma debido al pretratamiento de

la muestra mediante un proceso de precipitación de las proteínas
para separarlas del resto.
 APLICACIONES
3. Separación de proteínas en el fluido cerebro
espinal
tR (min)
1 . Albúmina (Pm = 66000 Da) 10
2 . Metalotioneina (MT-1 y MT-2) 15
(Pm = 6500 Da)
3 . Lisozima (Pm = 14000 Da) 21 - 25

Condiciones de operación:

COLUMNA: Superdex 75 (10/300GL)

RANGO DE SEPARACIÓN: entre 6 – 66 KDa)
FM: TRIS 0.02 M; pH = 7.4; 65 % de HNO 3
INYECTOR: inyector manual de 100 µL
DETECTOR: UV 254 nm
 APLICACIONES
3. Separación de proteínas en el fluido cerebro
espinal

Las fracciones resultantes se analizan off-line con un

espectrómetro de masas para determinar su concentración.
Preguntar

El pico correspondiente a la Metalotioneina es doble debido al

solapamiento de la MT-1 y la MT- 2. La MT tiene un tR
correspondiente a una molécula de 13 KDa y su peso es de
sólo 6.5 KDa, esto se explica porque ocupa un gran
volumen. El orden de elución en SEC está basado en el
volumen de las proteínas y no estrictamente en el peso
molecular.
Los picos salen entre 10 – 27 min y todos los cromatográmas
realizados tienen un pico negativo entre 22- 23 min. El
tiempo de elución de este pico corresponde al volumen de
elución de la columna y se observa el mismo pico cuando
inyectamos H2O en SEC-HPLC.
 APLICACIONES
4. Determinación de glucosa, fructosa y sacarosa en
zumos.

Columna: poliestireno entrecruzado

(características hidrófilicas) ; 25cm.
Temperatura de trabajo: 80oC
Límite de exclusión: 1000