High Performance Liquid Chromatography

Es una técnica analítica usada para separar los componentes de

una mezcla e identificar y cuantificar cada componente cada
componente.

HPLC
HPLC
Cromatografía de reparto
• Es la más utilizada, y se puede subdividir
en líquido - líquido y de fase unida según
como se une la fase estacionaria a las
partículas de relleno.
• En la líquido – líquido, la fase estacionaria
es mantenida sobre la superficie de las
partículas del relleno por adsorción física.
• En la fase unida, se une químicamente a las
partículas del soporte.
Cromatografía de reparto

• La desventaja más importante de la líquido

– líquido es la pérdida de fase estacionaria
por disolución en la fase móvil, lo que
requiere recubrimientos periódicos del
soporte
 HPLC
Principios de separación
cromatográfica

Exclusión
Intercambio por Quiralidad Bioafinidad
iónico tamaño

Polímeros,
Compuestos proteínas, Proteínas y
inorgánicos, Enamtíomero enzimas
ácidos s
os

ácidos, bases, nucleicos

ut

iones
l
so

Acuosos,
Soluciones
Acuosos , Acuosos o Buffer y con
s buffer, agua
io ne Buffer o solventes solventes actividad
d i c especial.
n soluciones orgánicos orgánicos
Co iónicas
 Clasificación de la técnica HPLC
De acuerdo al método
• Cromatografia Fase normal (fase estacionatrio hidrófila; fase movil hidrofoba)
• Cromatografia a fasereversa (fase stazionaria hidrofoba ; fase movil hidrófila)
 •Eficiente y
Fase reversa
robusta

Fase normal
•Fácil

• Normal con solventes

Fase acuosa acuosos. No requiere
agentes con alto pH
Fase normal

tipos de fases estacionarias:

Fase Normal: el componente principal de la fase
estacionaria es muy polar(ej. silice) y la fase
móvil es poco o medianamente polar.
• Bajo estas condiciones los compuestos
poco polares eluyen primero, no bstante
pueden cambiarse las condiciones variando la
polaridad del solvente
Fase reversa
La fase estacionaria es poco polar,
normalmente silica tratada (siloxano) con R
de C8H17 (C-8 o n-octil) a C18H37 carbonos (C-
18 o n-octildecil)
Fase reversa

• La fase móvil es polar

• En estas condiciones los compuestos
menos polares son mas retenidos eluyendo
primero los mas polares junto con la fase
móvil
• Son actualmente las mas utilizadas y su vida
media es mayor a las de fase normal.
fase móvil ácida (pH<2)

Fase estacionaria:
Si-O-Si-R  Si-OH + HO-Si-R
RESUMEN
RESUMEN
Como
seleccionar la
Cromatografía
de acuerdo con
los solutos que se
quieren separar
La figura es un ejemplo de las columnas Shodex™ tipo partición / adsorción. Eje X es la
polaridad de gel; la columna en el lado derecho es de polar baja y el lado izquierdo es de polar
alta. Es decir, la columna del lado derecho se utiliza para el modo FREVERSA y el lado izquierdo
es para el modo de fase normal. Eje Y es el tamaño de los poros del gel. Para el análisis de
componentes de gran tamaño, geles con mayor tamaño de los poros debe ser seleccionado y
viceversa.
La fase estacionaria está empacada en columnas

La mayoría de la columnas tiene entre 10 cm y 30 cm.

Normalmente son rectas y pueden tener largos adicionales como acoples de una o más
columnas.
El diámetro interior está comprendido entre 4 mm y 10 mm.
Los tamaños de partícula del relleno más comunes son 3 μm, 5 μm ó 10 μm.
Relleno pelicular

Consiste de bolillas esféricas, no porosas, de

vidrio o polímero, con diámetros típicos de
30 a 40 μm.
Se deposita una delgada capa porosa de
sílice, alúmina, una resina sintética de
poliestireno – divinil benceno o una resina
de intercambio iónico, sobre la superficie
de estas bolillas.
Vista de la fase estacionaria
Tamaño 10 y 1µm
Relleno pelicular

Para algunas aplicaciones, se aplica un

recubrimiento adicional, que consiste de
una fase estacionaria líquida que se
mantiene adsorbida.
Pueden también ser tratadas químicamente
para dar una capa de superficie orgánica.
Se emplean más para las precolumnas y no
tanto para las columnas analíticas.
 Relleno poroso

Se preparan las partículas de sílice aglomerando

sub-micropartículas de sílice bajo condiciones que
conducen a partículas más grandes que tiene
diámetros muy uniformes.
Las partículas resultantes se recubren a menudo con
películas orgánicas delgadas, que son unidas
química o físicamente a la superficie.
 Columnas
empacadas
comunes
Principios de separación
Absorción Partición Fase
Fase Normal reversa
Solutos

Aceites, Grasas,
Sustancias polares
Lípidos
Condiciones de
separación
N hexano, Octano, Mezclas acuosas con
cloroformo y otros metanol, acrilonitrilo y
alcoholes buffer o pares iónicos
Algunos conceptos previos
CROMATOGRAMA

Tiempo de retención= tiempo que transcurre desde la

inyección de la muestra hasta que el soluto alcanza el
detector( a veces esta magnitud se mide en volumen de
elución)

Tiempo muerto= es el tiempo Ancho del pico en la base= es el

necesario para que una especie que no tiempo transcurrido desde que
se retiene en la fase estacionaria el soluto alcanza el detector
alcance el detector hasta que lo abandona
 Elución de la fase móvil

MODO ISOCRÁTICO

Fase móvil A 50% B 50%

Fase móvil A 20% B 80%

Solvente A. Acrilonitrilo
Solvente B. Agua
Elución por gradiente
Elución por gradiente
automuestreador
 Inyección de la muestra
• Antes de inyectar la muestra en el equipo, hay
que tenerla en estado líquido o en solución, y
tener en claro que sea compatible tanto con la
fase móvil como con la fase estacionaria.
• Se pueden inyectar cantidades que varían entre 1
μl a 100 μl; generalmente se inyectan entre 5 μl
y 10 μl.
• Las cantidades inyectadas varían dependiendo de
la sensibilidad y el rango dinámico del detector.
 Detectores

El rol más importante del detector de HPLC es

monitorear los solutos a medida que eluyen.

Genera una señal eléctrica, proporcional al nivel

de alguna propiedad de la fase móvil o de soluto
 Detectores
Las características necesarias de un
buen detector de HPLC son:

 Sensibilidad.
 Linealidad.
 Confiabilidad.
 Fácil de usar.
 Bajo volumen muerto.
Existen dos grandes grupos de detectores:

De propiedades masivas, moduladas por la

presencia de solutos, como por ejemplo, el
índice de refracción o la densidad de la fase
móvil.
De propiedades del soluto, como por ejemplo
absorbancia de radiación UV, fluorescencia o
corriente de difusión. Estos son más sensibles
que los primeros en
el orden de 1000 veces o más.
 Detectores U.V.
 Es utilizado en más del 70 % de los
equipos HPLC.
 La señal es proporcional a la
concentración del soluto.
 Se detectan alquenos, compuestos
aromáticos y aquéllos que tienen
uniones múltiples de C, O, N, y S.
 La fase móvil no debe interferir en la
detección.
U.V.
Se mide la absorbancia de los eluyentes de
una columna y para minimizar el
ensanchamiento de banda, se mantiene el
volumen lo más pequeño posible, entre 1μl y
10μl y largos de celda entre 2 mm y 10 mm.
Están restringidos a presiones debajo de 600
psi, por lo que se requiere un reductor de
presión.
CARACTERISTICAS U.V. DE ALGUNOS SOLVENTES
 OTROS DETECTORES

De conductividad: es un detector universal de

iones, pero no sirve para elución en gradiente.

Electroquímicos: miden la corriente eléctrica

asociada a la oxidación o reducción de los solutos
a la salida de la columna, y son especialmente
sensibles, pero no sirven para elución en gradiente
Factores que controlan la velocidad de elución
Elución de compuestos neutros: el tiempo de elución de un compuesto neutro esta determiando por
la polaridad y la hidrofobicidad; no depende del pH de la fase móvil.
Para la cromatografía de fase reversa cuanto más lipofílico es el compuesto es más lento.
Para la cromatografía de fase normal el compuesto eluye más rápido
Ejemplo propuesto. Dr Shulamit.
HPLC