Técnicas Blot

Alfonso Cohen
Iván Hernández
Eileen Parra

Junio 17, 2019

1. Introducción
Southern Blot es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una
secuencia de ADN concreta en una mezcla compleja de este ácido nucleico.

Digestión Separación Transferencia

Fijación Hibridación Visualización

2. Digestión
3. Separación
La separación se realiza por electroforesis en gel de agarosa. Luego se desnaturaliza en ADN
con álcali seguido de neutralización para la fijación.
4. Transferencia
La transferencia de los fragmentos desde el gel hacia la membrana se da por capilaridad, al
pasar el tampón a través del gel y la membrana.
4. Transferencia
4.1 Membranas

Nailon Nitrocelulosa

Capacidad de unión de 400-600 μg/cm2 Capacidad de unión de 80-125 μg/cm2

El nailon cargado es útil cuando se trabaja Capacidad pobre para unirse a moléculas
con ácido nucleico de bajo peso molecular pequeñas
Recomendable cuando se requiera el uso Requiere altas concentraciones de sal en los
repetitivo de una membrana tampones de transferencia
Recomendable para objetivos con media o
 
baja abundancia
5. Fijación
La fijación es la unión del ácido nucleico objetivo a la membrana Los principales métodos son:
fijación por calor y por luz ultravioleta (UV).
6. Hibridación
La hibridación es la unión de la secuencia fijada en la membrana con otra secuencia marcada, a
la que es complementaria.

(32P)dCTP: desoxicitidina
trifosfato
6. Hibridación
6.1 Tampón de hibridación: ayuda a la hibridación entre las moléculas de sonda marcadas y su
secuencia complementaria inmovilizada en la membrana.
Algunos tampones desarrollados son:
• solución de Denhardt (mezcla de albúmina de suero bovino (BSA),
• Ficoll 400 y polivinilpirrolidona),
• ADN desnaturalizado de esperma de salmón (u otras especies)
• heparina.

6.2 Lavado: Después de la hibridación, la secuencia hibridada se lava para eliminar la sonda no
hibridada.
7. Visualización
la membrana de nailon se
coloca, junto a una
película de rayos X dentro
de una caja que las aísle
de la luz. La película
registra las posiciones
donde hay desintegración
radiactiva.
8. Bibliografia
[1] Walker J. M., Rapley R. (2008), Molecular Biomethods Handbook, segunda edición,
Humana Press.

[2] Southern E. M. (1975), Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments

Separated by Gel Electrophoresis.
Northern
blot
BIOMACROMOLECULAS

Hernández, A. Martin, P. Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. Biología molecular y nefrología.
Laboratorio de medicina interna y biología molecular
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

García, J. Silva, M. Técnicos especialistas de laboratorio del servicio Navarro de salud. Editorial Mas, S.L segunda
edición
FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS DE
HIBRIDACIÓN

Las técnicas de hibridación se

fundamentan en la complementariedad
entre el fragmento de acido nucleico
buscado y una secuencia total o parcial
complementaria llamada sonda
• Fragmentos de ADN
• Oligonucleótidos
• Fragmentos de ADN generados por
PCR

Segura, M. Lopez, G. Jimenez, L. Hibridación in situ ultraestrucutral. Universidad nacional autónoma de México.
EXPRESIÓN GÉNICA

1. Transcripción
2. Transcrito primario
3. Adición extremo
Poly-A
4. Eliminación de
intrones
5. mARN

Hernández, A. Martin, P. Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. Biología molecular y nefrología.
Laboratorio de medicina interna y biología molecular
DETECCIÓN DE SECUENCIAS
ESPECIFICAS DE ARN

1. Aislamiento del ARN

2. Homogenizar y desnaturalizar el
ARN
3. Separación por electroforesis
desnaturalizante
4. Transferir a membrana de
Nitrocelulosa o Nylon
5. Hibridar con sonda especifica
6. Revelar con placa de rayos X

Castillo, F . Biotecnología ambiental, editorial Madrid, 2005

DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPECIFICAS DE ARN

Hernández, A. Martin, P. Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. Biología molecular y nefrología.
Laboratorio de medicina interna y biología molecular
DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPECIFICAS DE ARN

Hernández, A. Martin, P. Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. Biología molecular y nefrología.
Laboratorio de medicina interna y biología molecular
Western
blot
Western Blot
• Introducción
• Protocolo de Western Blot
• Aplicaciones
Western Blot

[1
]
¿En qué casos es útil utilizar Western Blot?
Protocolo de Western Blot
Protocolo de Western Blot
 Preparación de la muestra

Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

• Lisar las células. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que
favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces se añaden inhibidores de
proteasas y fosfatasas que evitan la digestión por las enzimas celulares de las
proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.

• Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Después

se procede a homogeneizarlos. Por último se centrifuga para obtener las proteínas
en el sobrenadante. [2]
 Preparación de la muestra
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalización proteica.
Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas
mecánicas
- como filtraciones
- centrifugaciones [2]
Protocolo de Western Blot
Electroforesis en gel
Geles

[3]
SDS-PAGE

[1,3]
Esquema del procedimiento Electroforesis en gel

Cassette del gel

Buffer Buffer Jeringa

ánodo catodo Hammilton

Cámara del
electrodo
negativo

ANODO CATODO

Fuente de alimentación
Bandas de separación
de proteínas.
Protocolo de Western Blot
Objetivo de la transferencia
¿Cómo funciona la transferencia?
Protocolo de Western Blot
¿Por qué se utilizan anticuerpos?
Inmunodetección
Inmunodetección
Detección quimioluminiscente

[2]
Detección quimioluminiscente
Protocolo de Western Blot
Controles de carga
Protocolo de Western Blot
Adecuado para Western Blot
Protocolo de Western Blot
Ausencia de bandas, o bandas muy débiles
Ruido de fondo
Exceso de proteína y/o anticuerpo
Burbujas de aire, lavados insuficientes, transferencia incompleta
Conocer la proteína de interés
 Aplicaciones
Investigación
• Actualmente, el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la
biología molecular.

Diagnóstico
• Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el
Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado
positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia
del virus es muy baja.

• Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,

comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".

• Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot

• En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la

presencia del FIV en gatos. [3]
 Bibliografía
[1] W. Neal Burnette « 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic
detection with antibody and radioiodinated protein; pp. 195–203; (Abril 1981).

[2] Lefkovits, I. y Pernis, P. Immunological Methods. Academic Press, Ed. Harlow, David
Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 1988

[3] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. « Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications; pp. 4350–
4354; (1979).