MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA CLÍNICA. LO QUE SE DEBE

SABER SOBRE EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

BIOQUÍMICA Y FARMACIA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

Dra Janneth Gallegos Núñez PhD

CONTENIDO
• Concepto y objetivos de la Microbiología Clínica
• Funciones del laboratorio
• Situaciones críticas
• Ciclo diagnóstico de una enfermedad infecciosa
LA MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
• Es una ciencia de juicio interpretativo que responde a las necesidades
clínicas del médico tratante, con el propósito de identificar el agente
etiológico de una infección y establecer la actividad in vitro de los
antimicrobianos contra el o los microorganismos identificados
Objetivo

El principal objetivo de la Microbiología Clínica es

• Identificar el agente etiológico de una infección y
• Determinar la susceptibilidad a determinados antimicrobianos.
• Contribuir al tratamiento de las enfermedades infecciosas
• La práctica de la Microbiología clínica en el laboratorio de diagnóstico
exige interactuar con el médico tratante propiciando una
comunicación abierta.
FUNCIONES DEL LABORATORIO
• Unas de las principales funciones del laboratorio es
Garantizar un resultado rápido al clínico, de manera que contribuya a la
toma de decisiones en aquellas situaciones que así lo requieran, para
ello los laboratorios actualmente emplean un sistema informático de
fácil acceso al médico infectólogo, en el que pueda hacer un
seguimiento a la muestra.
• El sistema debe documentar :
• ingreso de la muestra al laboratorio, las pruebas aplicadas durante el
proceso, resultados preliminares y el resultado final
Otras funciones del laboratorio
• Coordinar el aviso vía telefónica de un resultado crítico al médico
tratante o al personal de salud que esté a cargo del pacientes en ese
momento.
• Desarrollar guías de reporte de resultados de susceptibilidad
antimicrobiana mediante trabajo conjunto con el personal médico y
• Publicar periódicamente los patrones de susceptibilidad
antimicrobiana, para que puedan usarse como orientación del
tratamiento empírico
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Depende de:

• La calidad de las muestras recibidas, debe aclararse que el manejo

previo a su recepción en el laboratorio es un aspecto crítico para
lograr resultados exactos, esto se debe a que los microorganismos
pueden crecer, multiplicarse o morir rápidamente cuando existe una
recolección, transporte y conservación inadecuada de la muestra.
Manejo de las muestras
Un manejo inadecuado de la muestra conduce a resultados erróneos y
esto a su vez afecta a la salud del paciente e influye en las decisiones
terapéuticas.
En consecuencia, se afecta el tratamiento y control de las infecciones,
las hospitalizaciónes durarán más, se genera un mayor costo y se
reduce el rendimiento del laboratorio.
.
En la selección y recolección de la muestra están implicados los
médicos tratantes que pueden disponer de la consulta del microbiólogo
clínico.
El médico debe entregar información necesaria para llegar a una
correcta interpretación del resultado, en caso de que exista una
cantidad de muestra escasa se priorizará la prueba diagnóstica a
realizarse
MEJORES RESULTADOS

• Los mejores resultados se obtienen de la colaboración entre el

médico tratante y el especialista del laboratorio, sin descartar la
comunicación efectiva entre médicos, enfermeras y personal del
laboratorio.
SITUACIONES CRÍTICAS

• El tiempo de respuesta no contribuye a la toma de decisiones

• Las políticas del laboratorio causan problemas a la salud del paciente
• Los resultados son inconsistentes con el cuadro clínico
• Es necesario incorporar nuevas pruebas al laboratorio

 
El CICLO DIAGNÓSTICO DE UNA
ENFERMEDAD INFECCIOSA
Desde la sospecha clínica hasta la identificación del agente infeccioso
transcurren las siguientes etapas:
• ETAPA PREANALÍTICA, SELECCIÓN, RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE
LA MUESTRA
ETAPA PREANALÍTICA
Una adecuada recolección de las muestras
Para garantizar una adecuada recolección de las muestras se deben tomar en
cuenta los siguientes aspectos:
• El tipo de muestra debe ser apropiado para cada caso
• La forma de recolección de la muestras
• Las condiciones de transporte hacia el laboratorio (tiempo de transporte ideal,
tipo de envase para la recolección de la muestra y temperatura de transporte).
• Conservación de la muestra.
• Políticas del laboratorio (número de muestras, pruebas, tiempo de duración)
Estas observaciones deben estar establecidas en el Manual de Laboratorio
Recolección de las muestras
• Período donde haya mayor excreción del agente infeccioso, Desde un
• Sitio representativo de la infección y
• Cantidad suficiente que garantice su buen procesamiento en el
laboratorio, empleando la técnica aséptica.
Cuándo?
• Se debe procurar obtener la muestra antes de iniciar la terapia
antimicrobiana o antes de introducir cualquier modificación del
tratamiento antimicrobiano, debido a que disminuye el rendimiento
de la prueba
Sistemas de recolección

• Los sistemas de recolección usados deben ser estériles, herméticos y

adecuados al tipo y volumen de muestras.
• Las torundas o hisopos de dacrón, rayón o algodón no son un buen
método para recolectar una muestra, debido a que recolectan
microorganismos contaminantes, mantienen un volumen de muestra
extremandamente pequeño (0,05 mL), sus fibras dificultan la
recolección de bacterias u hongos y el inóculo de la torunda a menudo
no es uniforme cuando se siembra en diferentes placas de agar.
• Por este motivo las torundas solo se usan para recolectar muestras
nasofaríngeas
Las torunda flocadas son más efectivas que las anteriores,
debido a que sus fibras de nylon perpendiculares mantienen un
campo electrostático que crea una delgada capa altamente
absorbente, con una estructura abierta que permite mantener
la muestra cercana a la superficie, para una completa y rápida
elución de las muestra, se emplean cuando la muestra va a
analizarse con metodologías basadas en ácido nucleico.
Transporte de las muestras

• Las muestras deben llegar al laboratorio perfectamente rotuladas y con la información completa.
La etiqueta debe ir adherida al envase conteniendo los mismos datos de la orden del examen.
• Se deben incluir los datos del paciente que permitan elegir el mejor procedimiento para el
aislamiento del patógeno. Entre estos tenemos:

Antecedentes personales del paciente

Diagnóstico presuntivo
Sitio específico de recolección y tipo de muestra
Administración previa de antimicrobianos
Datos del médico tratante
Alerta en caso de sospecha de un microorganismo altamente patogénico por ej: Neisseria
meningitidis.
ETAPA ANALÍTICA: DIAGNÓSTICA

• Después de la llegada de la muestra al laboratorio, se debe verificar su calidad

adecuada, el correcto transporte , la concordancia entre el sistema de recolección
y la orden de examen.
• Cuando una muestra no cumple con los requisitos previamente establecidos en el
manual de laboratorio, esta debe ser rechazada, debiendo notificar al servicio que
la envió o al personal responsable.
• Si cumple con los requisitos, se registra en el sistema informático o libro de
registro, iniciando la etapa analítica.
• La fase analítica puede desarrollarse empleando diversas estrategias tales como el
diagnóstico microbiológico directo o el diagnóstico microbiológico indirecto, en el
cual se detecta la respuesta inmune generada por un microorganismo en el
hospedero.
Diagnóstico microbiológico directo

Este diagnóstico permite evidenciar el microorganismo o parte de su

estructura en una muestra, para ello es necesario recuperar el
patógeno en una muestra mediante su cultivo. A partir del cultivo se
puede caracterizar al microorganismo y conocer su susceptibilidad
antimicrobiana.
A Hongos y Levaduras en secreción vaginal (40X)
B Trichomonas vaginalis (60 X)
Diagnóstico microbiológico indirecto

.
Ocasionalmente los microorganismos no se recuperan desde un cultivo
o en su defecto presentan un crecimiento muy lento; en estos casos se
aplica la metodología no tradicional, tales como pruebas inmunológicas
o pruebas basadas en los ácidos nucleicos.
Procedimientos del examen microbiológico directo
1. Observación directa de la muestra.
• El diagnóstico directo tradicional comprende 3 procedimientos:

Suministra una información rápida a través del examen microscópico que permite
observar bacterias, hongos, estructuras de parásitos e inclusiones virales.
Los procedimientos empleados son: a)observaciones microscópicas en fresco, o sea
preparaciones entre porta y cubreobjetos, b)observación de preparaciones teñidas, en
la cuales una porción de la muestra se extiende en un portaobjetos, se fija y se tiñe por
la adición de un colorante que tiene afinidad por diferentes estructuras microbianas.
La coloración más usada es la de Gram que permite agrupar a los microorganismos en
Gram positivos o Gram negativos en base a su reacción a la coloración compuesta de
Gram, adicionalmente se aprecia la morfología (cocos, bacilos, cocobacilos) y la forma
de agrupación (pares, cadenas, racimo empalizada)
Líquido cefalorraquídeo, coloración Gram
Abundantes leucocitos y Cocos Gram negativos agrupados en pares (100X)
2. Cultivo
• El cultivo de la muestra constituye una técnica básica para aislar
posteriormente identificar a los microorganismos presentes.
• El cultivo requiere el uso de técnicas de siembra en medios de cultivo
artificiales y condiciones apropiadas de incubación (temperatura,
aireación).
Cultivo primario
• Para el efecto, actualmente se dispone de medios
de cultivo líquidos o caldos y medios solidificados
con agar, entre los que se reconocen los medios
enriquecidos (agar sangre, agar chocolate),
medios selectivos (MacConkey), selectivos y
diferenciales (Agar Manitol salado) y medios
especializados (para BAAR).
• Para realizar el cultivo primario, se debe
seleccionar el medio de cultivo en base al
conocimiento del diagnóstico presuntivo del
paciente, sitio de recolección de la muestra y en
la fisiología del microorganismo causante de la
infección.
• El cultivo microbiano debe permitir la
multiplicación suficiente del
microorganismo, en la mayoría de
bacterias esta fase lleva de 18 a 48
horas, sin embargo, puede durar
semanas o meses como en el cultivo
de algunos hongos filamentosos o de
micobacterias.
• Como resultado final del cultivo se Tinea corporis
obtiene un microorganismo aislado
(puro) siendo necesario para ello
realizar subcultivos, situación que
retrasa el tiempo de respuesta.
Aislamiento del microorganismo

Como resultado final del cultivo se obtiene un

microorganismo aislado (puro) siendo
necesario para ello realizar subcultivos,
situación que retrasa el tiempo de respuesta.

La identificación del microorganismo aislado

tiene lugar a partir de cultivos purificados
mediante subcultivos sucesivos y
comprobación mediante tinción Gram, en el
caso de bacterias
• Preparaciones de hongos (microcultivo)

Microsporum canis con lactofenol azul algodón

3.Identificación del organismo aislado

• En el caso de hongos a través de la

observación de las características
macroscópicas y microscópicas de la
colonia.
• En el caso de hongos se requiere
claves taxonómicas

Microsporum canis
• Se requiere también el estudio
del comportamiento metabólico
y bioquímico que se conoce a
través de la aplicación de
pruebas manuales (pruebas
directas, baterías bioquímicas,
galerías bioquímicas y medios de
cultivo cromógenos).
Candida. Agar cromogénico
Galería bioquímica API 20E para
enterobacterias

Clave para identificación

bacteriana de las pruebas API
• Hoy en día, existe en el mercado
equipos que realizan las pruebas
bioquímicas y metabólicas de
manera miniaturizadas.
• Otras pruebas son las de
requerimiento nutricional y pruebas
diagnósticas no tradicionales, tales
como pruebas inmunológicas,
espectrometría de masas y pruebas
basadas en ácidos nucleicos.
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

• La prueba de susceptibilidad
antimicrobiana se realiza después de la
identificación del agente patógeno, el
objetivo es guiar la elección de la terapia
antimicrobiana adecuada.
• Estas pruebas se denominan antibiograma
o antifungigrama según el caso y permiten
determinar in vitro la susceptibilidad de
bacterias u hongos, respectivamente a los
antimicrobianos, se ejecutan bajo
condiciones estandarizadas y específicas
de laboratorio.
Técnicas para determina la susceptibilidad antimicrobiana

1.Difusión con disco, llamado también método de

Kirby-Bauer, es una técnica económica que informa
de manera cualitativa la sensibilidad de un
microorganismo a un determinado antimicrobiano
(sensible, intermedio o resistente). La prueba consiste
en la difusión de un antimicrobiano impregnado en
un disco de papel, sobre la superficie de una placa de
agar sembrada previamente con el microorganismo
en estudio. Cuando el microorganismo es sensible al
antimicrobiano, sufre una inhibición de su
crecimiento alrededor del disco, formando un “halo
de inhibición” que es visible y medible luego de 18
horas de incubación. El diámetro de la zona de
inhibición determina si existe sensibilidad o
resistencia al antimicrobiano
2.Epsilometría o E-test. Es una
técnica cuantitativa de la
sensibilidad del microorganismo,
determina la concentración
inhibitoria mínima (CIM) de un
antimicrobiano, esto es, la
concentración mínima del
antimicrobiano que es capaz de
inhibir el crecimiento de un
microorganismo determinado.
• La epsilometría emplea una tira
plástica impregnada con
concentraciones crecientes del
antimicrobiano, se coloca en una placa
de agar sembrada previamente de
forma masiva con el microorganismo
de interés. El compuesto químico se
difunde en el agar produciendo
inhibición del crecimiento alrededor
de la tira. La CIM es el punto donde el
crecimiento bacteriano alcanza la tira.
• 
3. La Dilución. Es el método gold estándar para obtener la susceptibilidad
antimicrobiana.
• La técnica es cuantitativa y determina la CIM. Una A dilución seriada de un
antimicrobiano en un medio líquido o sólido se pone en contacto con una
concentración estándar del microorganismo de interés y se estable la CIM, la cual
corresponde a la mínima concentración del antimicrobiano donde no se aprecia el
crecimiento del microorganismo. Existen equipos automatizados que efectúan una
dilución en caldo en forma miniaturizada, así se obtienen resultados de CIM de forma
rápida.
 
DIAGNÓSTICO  DIRECTO NO TRADICIONAL
 
 

• Este tipo de diagnóstico permite detectar el agente etiológico

directamente de la muestra o a partir de un microorganismo aislado
previamente desde un cultivo.
• A continuación se revisa los métodos empleados en un diagnóstico
directo no tradicional:
Método inmunológicos.
• Estos métodos detectan antígenos del microorganismo empleando el
anticuerpo específico, el cual está unido a un sistema de detección
Dependiendo de la técnica inmunológica que se utilice, se puede
detectar el antígeno directamente desde la muestra o a partir de un
microorganismo previamente aislado.
Entre los métodos inmunológicos se puede aplicar:
• El Enzimoinmunoensayo (EIA). Este método detecta directamente antígenos
a partir de la muestra. El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima
(ELISA) de captura, usa un anticuerpo específico del antígeno, el cual está
fijo a una fase sólida (placa). El antígeno presente en la muestra se une al
anticuerpo específico. Posteriormente se añade un segundo anticuerpo
específico contra el antígeno, el cual está unido covalentemente a una
enzima. Después de la incubación y varios lavados el complejo anticuerpo-
antígeno-anticuerpo es detectado al adicionar el sustrato de la enzima
ligada al segundo anticuerpo. La enzima actúa sobre el sustrato produciendo
color, que se puede leer a simple vista o mediante un espectrofotómetro.
La Inmunocromatografía
Otra técnica muy utilizada es la inmunocromatografía (por ejemplo el
“test pack” faríngeo Streptococcus pyogenes ), la cual permite detectar
el agente etiológico directamente desde la muestra.
• Consiste en una membrana porosa de nitrocelulosa, teflón o nylon, que por debajo presenta
una almohadilla de material absorbente, la cual contiene un primer anticuerpo específico
contra el antígeno, ligado a partículas de látex o metal coloidal (reactivo detector).
• La membrana en su parte superior contiene inmovilizado un segundo anticuerpo específico
contra el antígeno, que está ligado a un reactivo de captura.
• Generalmente la membrana y la almohadilla están unidas a un envase plástico desechable,
que en su parte inferior presenta un pequeño orificio donde es depositada la muestra.
• Al depositarla en la parte inferior del envase, la muestra toma contacto y se difunde por la
almohadilla absorbente, encontrándose el antígeno de la muestra con el primer anticuerpo.
• Este complejo se difunde por capilaridad a lo largo de la membrana hasta encontrarse y
unirse (en su parte superior) al segundo anticuerpo. Así el reactivo detector y el reactivo de
captura se encuentran, produciéndose una línea de color en la zona superior de la
membrana