Programmed cell Death Protein 1–PDL1 interaction Prevents

heart Damage in chronic Trypanosoma cruzi infection

Raíssa Fonseca1, Rafael Moysés Salgado1, Henrique Borges da Silva2,
Rogério Silva do Nascimento1, Maria Regina D’Império-Lima 1 and José
Maria Alvarez1
1
Laboratory of Immunology of Infectious Diseases, Department of Immunology,
Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazil
2
Center for Immunology, Department of Laboratory Medicine and Pathology,
University of Minnesota, Minneapolis, MN, United States

Nicolás Esteban Arias Rodríguez

Frontiers in Immunology
IMMUNOLOGY AND ALLERGY

Factor de
Ranking Cuartil
Impacto

2017  5.62 20/171 Q1

2018 4.64 - -

Información obtenida de Scopus Journal Metrics

2
 Trypanosoma cruzi

3
Adaptado de ‘Center of Disease and Control of Infections’
 ENFERMEDAD DE CHAGAS

• 6 a 7 millones de personas
infectadas con T. cruzi.
• Principalmente en zonas
endémicas de 21 países
de América Latina.
• El control vectorial es el
método más útil para
prevenir la enfermedad de
Chagas.

World Health Organization. 2018

4
Tomado de ‘MACAULAY Honors College at Cuny. Arianna Injeian. 2016 ’
 ENFERMEDAD DE CHAGAS

Sintomatología no Signos:
específica: - Ligera
- Fiebre hepatomegalia y
- Sarpullido esplenomegalia.
- Dolor de Cabeza - Ganglios
- Fatiga inflamados
Signo de Romaña
- Chagoma

- Cardiopatías
- Persistencia del parásito en el
tejido e infiltración leucocitaria.
- Sintomatología
gastrointestinal.

5
Adaptado de MedScape ‘Chagas Disease (American Trypanosomiasis) Clinical Presentation. 2018
 DURANTE LA INFECCIÓN Andrade D, et al (2014)
Reed SG (1988)
Lima EC et al (1997)

PRIMERA LÍNEA DE DEFENSA

Macrófagos Células Células NK
dendríticas
LT CD4+ LT CD8+

- Control del parásito

- Daño en el tejido

IL-12 Nogueira LG et al (2014)

TNF-α Gomes JAS et al (2005)
IFN-γ

Macrófagos 6
activados
 PROTEÍNA DE MUERTE CELULAR PROGRAMADA PD1
Enfermedad aguda
La elevada expresión de
estas moléculas puede
PDL1 (Ligando 1 de llevar a evasión inmune
programación celular) del patógeno.
Smith P et al (2004)

Fvasconcellos (talk ·
Expresado en células
contribs) [Public domain] mieloides y linfoides. El bloqueo de estas
▰ Proteína 1 de muerte Regulado por IFN-γ interacciones puede
celular programada (PD1) recuperar la respuesta
Gutierrez FRS et al (2011)

o CD279 inmune.
PDL2 (Ligando 2 de
▻ Proteína de superficie. programación celular) Para recuperar la
▻ Regulación del sistema Puede ser expresado por respuesta inmune
Kamphorst et al (2017)
inmune. células dendríticas y puede que se necesite
macrófagos de coestimulación por
▻ Inhibe activación, Liang SC et al (2003)
proliferación yBarber DL et al (2005) Ishida M et al (2002) CD28. 7
producción de citoquinas
CD28

CD80
CD28
CD86

8
VACÍO DEL CONOCIMIENTO

Se desconoce la función de PD1 y PDL1 en

la infección crónica por Trypanosoma cruzi

9
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál es la función de PD1 y PDL1 en la

infección crónica por Trypanosoma cruzi?

10
OBJETIVO GENERAL

Evaluar la función de PD1 y PDL1 en la

infección crónica por Trypanosoma cruzi

11
Evaluar y comparar la mortalidad, histología, frecuencia y actividad cardíaca
entre ratones con infección crónica por T. cruzi y ratones no infectados.

A. Mortalidad asociada con la infección crónica por T. cruzi. Efectivamente hay una
disminución en la
supervivencia de ratones
T. cruzi
Sylvio X10/4
con infección crónica por
Trypanosoma cruzi
Infectados i.p comparado con ratones
con 1x106
tripomastigotes
sanos.

C3H/HePAS

12
Evaluar y comparar la mortalidad, histología, frecuencia y actividad cardíaca
entre ratones con infección crónica por T. cruzi y ratones no infectados.

- Pocas células
B. Análisis histológico de corazones de ratón sano (I) y ratones crónicamente
inflamatorias en pequeñas
infectados con restringidas (II) y extensas (III) áreas de infiltración leucocitaria. Nido
de amastigotes en corazón de ratón infectado (IV). áreas en aproximadamente
el 30% de los ratones.
T. cruzi
Sylvio X10/4 I II
- Extensas áreas con
Infectados i.p infiltración leucocitaria y
con 1x106
tripomastigotes daño muscular con
presencia de nidos de
amastigotes en
C3H/HePAS aproximadamente el 70%
de los ratones.
A los 330 días post infección se
realizaron cortes longitudinales a
corazones los cuales fueron teñidos III 13
con Hematoxilina-Eosina.
IV
 Evaluar y comparar la mortalidad, histología, frecuencia y actividad cardíaca
entre ratones con infección crónica por T. cruzi y ratones no infectados.

C. Electrocardiograma (ECG) de ratón sano (1). ECG de ratón infectado sin anormalidades (2). ECG de
ratón infectado con bradicardia (3). ECG de ratón infectado con arritmia (4). D. Frecuencia cardíaca en
latidos por minuto de ratones sanos y ratones infectados.
T. cruzi
Sylvio X10/4

Infectados i.p
con 1x106
tripomastigotes

C3H/HePAS

Ratones fueron anestesiados i.p con

Ketamina y Xylazina. Se implantaron
transductores durante 2 minutos y se 14
tomaron los datos.
Evaluar y comparar la frecuencia de LT CD4+ y CD8+, monocitos, LB y NK en
corazón, el total de células aisladas de bazo y corazón, y la expresión de PD1 y
PDL1 entre ratones crónicamente infectados y ratones no infectados.

E. Frecuencias de LT CD4+ y CD8+, monocitos (Ly6C), LB (B220) y NK (DX5) en corazones de ratones no

infectados e infectados. F. Células totales aisladas de bazo y corazón de ratones infectados y no infectados.

C3H/HePAS

Pequeñas piezas de corazón fueron

extraídas. Se les aplicó colagenasa tipo
IV, se cultivaron en RPMI por 45
minutos a 37º.
Las suspensiones de células de bazo
fueron tratadas con Buffer de lisis ACK.
PBMCs fueron aisladas con 74% de
gradiente de Percoll.
Las células se marcaron con mAbs Aumento en la frecuencia de LT CD4+ y
CD8+
fluorescentes contra diferentes 15
moléculas para citometría de flujo.
Evaluar y comparar la frecuencia de LT CD4+ y CD8+, monocitos, LB y NK en
corazón, el total de células aisladas de bazo y corazón, y la expresión de PD1 y
PDL1 entre ratones crónicamente infectados y ratones no infectados.

E. Histogramas mostrando la expresión de PDL1 y PD1 en cada población de leucocitos infiltrados en el

corazón de ratones infectados crónicos y no infectados.
Todos las células de los ratones
infectados crónicos expresaron
más PD1 y PDL1 que las células de
ratones no infectados.
C3H/HePAS
Aunque los ratones infectados
presentaron mayor prevalencia de
TC CD4+ y CD8+ en el tejido
Pequeñas piezas de corazón fueron cardiaco, la expresión de PD1 y
extraídas. Se les aplicó colagenasa tipo PDL1 sugiere inhibición de la
IV, se cultivaron en RPMI por 45 respuesta inmune lo cuál puede
minutos a 37º. contribuir a la persistencia del
Las suspensiones de células de bazo parásito y a la cardiopatía crónica.
fueron tratadas con Buffer de lisis ACK.
Argüello RJ et al (2012)
PBMCs fueron aisladas con 74% de
gradiente de Percoll.
Las células se marcaron con mAbs
fluorescentes contra diferentes 16
moléculas para citometría de flujo.
 Evaluar y comparar la parasitemia sistémica
AA
100
100 y el puntaje
BB
15
histopatológico
NS
entre
ratones tratados con a-PD1 y a-PDL1 y ratones tratados con IgG como control.

Total Histopathology Score

A B E
**

u l t u r e s (%)
(% )
15

T o t a l H is to p a t h o lo g y S c o r e
NS
**

o s i t i v e ccultures
PParasitemia
a r a s ite m ia
80
80 10
NS
a PDL1
10
Treatment

PPositive
E. Histogramas mostrando la expresión de606 0PDL1 y PD1 en cada
5 población de leucocitos infiltrados en el
5
corazón de ratones infectados crónicos y no infectados.
aPD L1
Ig G
40
40 0 Todos las células de los ratones
B Before
e fo re A fte r
After
Not IgG a PDL1 0 infectados crónicos expresaron
Infected α P D 1más
/α P D L PD1
B E
C o n tr o l 1 yIg GPDL1
T r e a te que
d las células de
P a r a s ite m ia s u b p a te n te 5 m L
A P a r a s ite m ia s u b p a te n te 1 m L C ** EBD
C B P a r a s ite mA ia1 100 C ratones no infectados.
51 0 0
P a r a s ite m ia s u b p a te n te 54 0 m L s u b p a te n te 1 m NL S D ** 70

T o Pt aal rH aiss t iotpeamt h ioalo g y S c o r e

100 C3H/HePAS
P ré T r a ta m e n to a P D L 1 + a P D 1 ** 15
15 F NS

is t o p a th o lo g y Score
S c o re
NS
**
C u ltu r a s p o s itiv a s (% )

P ó s T r a t a m e n t o a P D L 1 + a4P 0D 1

(% )
P r é T ra ta m e n to a P D L 1 + a P D 1 60

c u l tu r e s(%)
C u ltu r a s p o s itiv a s (% )

C u l tu r a s p o s itiv a s (% )

30
80
10 9 0
P ó s T r a t a m e n t o 90
aPD L1+aPD 1 Aunque los ratones infectados
50

o ta l HHistopathology
P o s i t i v ecultures
Parasitemia
30
10
10 aPD1 + aPDL1 presentaron mayor prevalencia de

% o f F ib r o s is
20
60 40
5 80
80 Treatment TC CD4+ y CD8+ en el tejido
Pequeñas piezas de corazón fueron 10 20 30
cardiaco, la expresión de PD1 y
Positive
40 NS

7
extraídas. 14
Se les
21
aplicó colagenasa 0
7
tipo1 4 2 1
0 70 70
55 20
PDL1 sugiere inhibición de la
10
2 0 IV, se cultivaron en RPMI por 45
D ia d a L e itu r a C o n tr o l αa PP D D1 L/α 1P D L 1 Ig G T r e a te d
D ia d a L e itu r a 10 respuesta inmune lo cuál puede

TTotal
Ig G
minutos
P a r a s 0ite m ia s u b p a te n te 5 m L a 37º.D P a r a s ite m ia s u b p a te 0n te 1 m L F 7 0
6060
N S
contribuir a la persistencia del
00 0
Las suspensiones 7 1 4 de células
D ia d a L e itu r a
2 410 de bazo
P r é T r a t a m e n t o I g G
7 6 01 4 B e f o r e
Before 2 1 After A fte r
C o n tr o l
Not IgG
α P D 1 /α P D L 1
aPD1/aPDL1
Ig G T r e a te d
α P D 1 /α P D L 1 Ig G T re a te d
parásito y a la cardiopatía crónica.
C u ltu r a s p o s itiv a s (% )

fueron tratadas con Buffer de lisis ACK.

P ó s T ra ta m e n to Ig G D ia 5d0 a L e itu r a Infected
% o f F ib r o s is

30
Argüello RJ et al (2012)
C PBMCs P a rfueron
a s ite m iaaisladas
s u b p a te n con
te 5 m 74%
L de D 40
P a r a s ite m ia s u b p a te n te 1 m L F 70 NS
100
gradiente de Percoll. 20
4 0
3 0
6 0
p o s itiv a s (% )

P r é T r a t a m e n t o2 0 I g G
Las8 0 células se marcaron con mAbs
o s itiv a s (% )

10 P ó s T r a ta m e n to Ig G 50
fluorescentes contra diferentes
10
17
o f F ib r o s is

30
0 0 40
60
7 moléculas 14 para
2 1 citometría de 7flujo. 1 4 21 α P D 1 /α P D L 1 Ig G T re a te d
D i a d a L e i tu r a 20 30
Evaluar y comparar el total de células aisladas de bazo y corazón, la frecuencia - Ratones BALB/c
de LT CD4+ y CD8+, monocitos, LB y NK en corazón y la expresión de PD1 y PDL1 desarrollaron 5 veces más
parasitemia que ratones
entre ratones crónicamente infectados y ratones sanos.
C57BL/6

- Los dos modelos controlaron

T. cruzi la parasitemia.
Sylvio X10/4
- Al día 16 post infección
todos los ratones BALB/c
murieron.

- La producción de ON en
células peritoneales es 2
C3H/HePAS veces mayor en C57BL/6 que
en BALB/c

- En células del bazo se

encontró mayor producción
• Conteo de parásitos con 5uL de de ON en BALB/c lo cual
sangre obtenida de venas laterales coincidió con la visualización
de la cola. de parásitos vivos.
• Determinación de nitrito con la
reacción de Griess.
18
19
INTERFERONES TIPO-I

Leucocit
Interferon os
α
Interferon Células
β epiteliales

Interferon
ω
Interferon
Fibroblast
κ os 20
ÓXIDO NÍTRICO

▰ Isoforma inducible de la
óxido nítrico sintetasa
(iNOS) ON

▰ Macrófagos ON
LPS
IL-1 ON
ON
ONSi
IFNy
TNFα
21
Green S et al (1991)
ÓXIDO NÍTRICO Y T. CRUZI

ON
ON

ON
ON

Gazinelli R.T et al (1992) 22

Fernandez M.A et al (1992)
ÓXIDO NÍTRICO Y T. CRUZI

• Óxido Nítrico es muy

Gazinelli R.T et al (1992) importante en la fase
Vespa G et al (1994) aguda pero no en la
Petray P et al (1995) crónica.
Saeftel, M et al (2001)

ON

23
 C57BL/6 BALB/c 129Sv 129Sv
IFNαBR +/+ IFNαBR 0/0
WT KO

Cepa Y
I.P

24
 Comparar los niveles de IFNαB y TNFα en células peritoneales de - Células peritoneales de
ratones C57BL/6
ratones C57BL/6 Y BALB/c infectadas con T. cruzi y comparar la acción produjeron niveles más
de a-IFNαB y a-TNFα en la producción de Óxido Nítrico. altos de IFN-I que células
peritoneales de BALB/c.

Células Células Células - 48 días post-infección los

peritoneales peritoneales peritoneales valores de IFN-I eran
iguales a los de un ratón
sano.
Infección Infección
in vitro in vitro - Después de la infección
in vitro PC de C57BL/6 se
produjeron niveles muy
6-48 post - altos de TNF-α, al
infección o
normales a-IFNα/B a-TNFα
adicionar a-IFN-αB no
hubo cambios.

Re suspendidas - Al adicionar a-IFN-αB en

en RPMI una células y a-TNF-α a
ELISA otras se redujo la
Incubadas en 24 producción de ON.
plaquetas a 37% por
16 horas para
adhesión de células a 25
superficie plástica.
Comparar los niveles de IFNαB, TNFα en células de bazo de ratones
C57BL/6 Y BALB/c infectados con T. cruzi y su acción en la
producción de Óxido Nítrico.
Células - La producción de IFN-I en
de bazo
células de ratones C57BL/6 al
día 8 post infección es más
alta que en células obtenidas
de BALB/c.

- La adición de aTNF-α, aIFN-αB

y aIFN-y demostró reducción
Infectados 5, 8,11 en la producción de ON.
días antes o
normales

IFN-I estimula la producción de ON en

células peritoneales y de bazo de
Re suspendidas en ratones infectados.
RPMI

26
ELISA
Comparar los niveles de IFN-y, IL-10 e IL-4 en células peritoneales de
ratones C57BL/6 y BALB/c infectados con T. cruzi.

- La producción de IFN-y en ratones BALB/c fue detectado desde los 5 días post-infección, sin
embargo a los 8 días post-infección los ratones C57BL/6 demostraron niveles más altos de
IFN-y (22 ng/ml) que los BALB/c (15 ng/ml).

- Al día 12 post-infección los ratones BALB/c se mantenían en los mismos niveles mientras que
los C57BL/6 bajaron sustancialmente los niveles de IFN-y. (22 a 3 ng/ml)

- Desde el día 5 al día 8 post-infección los niveles de IL-10 e IL-4 no estaban en niveles
detectables. Al día 12 post-infección los niveles de IL-10 eran de 12 U/ml en BALB/c y 15 U/ml
en C57BL/6. IL-4 seguía bajo los niveles de detección.

27
 Comparar los niveles de parasitemia entre ratones C57BL/6
infectados con T. cruzi tratados y no tratados con IFNαB.

- Los niveles de parasitemia

en ratones tratados son
menores a los niveles en
ratones no tratados.

- El tratamiento en ratones
Inyección de IFNαB por vía sub
BALB/c no modifico la
cutánea y retados con parasitemia.
tripomastigotes sanguíneos de T.
cruzi.
- No hubo mortalidad en
ningún grupo.
Conteo de
parásitos

28
 Comparar los niveles de parasitemia en ratones WT (con el gen
IFNαBR) y KO (depletados del gen IFNαBR) infectados con T. cruzi.

- 8 días post infección los niveles de

parasitemia en ratones KO son mucho
mayores que en ratones WT.

- A comparación de BALB/c que

presentaba similar parasitemia los KO
no murieron después de la infección.
Infectados con 10.000 formas
sanguíneas de la cepa Y de T. - No hubo mortalidad en ningún grupo.
cruzi.
- Ratones 129Sv son relativamente más
resistentes.
Conteo de
parásitos

29
 Comparar el porcentaje de macrófagos de cavidad peritoneal
infectados por T. cruzi en ratones WT (con el gen IFNαBR) y KO
(depletados del gen IFNαBR).

- A las 12 horas post infección el 46% de

las células de ratones KO estaban
parasitadas mientras que en WT solo el
28% lo estaban.

- A las 72 horas post infección el 56% de

las células de ratones KO estaban
Incubados a 37ºC por 6 horas para
parasitadas, en el WT el 36% tenía
permitir adhesión de células a la infección.
superficie.
- La señalización de IFN-αB favorece el
control del parasitismo en los
Luego de lavados se macrófagos.
realizó la infección

30
 Comparar los niveles de producción de ON en macrófagos de bazo
infectados por T. cruzi y tratados con a-IFNαB, a-IFN-y y a-IL-12 en
ratones WT (con el gen IFNαBR) y KO (depletados del gen IFNαBR).
- Al tratar ratones WT con a-IFN-α/B se
redujo la producción de ON en 40-50%
los días 5 y 8 post infección. En el día
12 la producción de ON no se evidenció.

- Al tratar ratones KO con a-IFN-α/B no

hubo cambios en la producción de ON,
se confirmó que el antisuero no tenía
actividad específica inhibitoria de ON.
Infectados con T. cruzi.

- Tratamiento con a-IFN-y y a IL-12

también redujo producción de NO, lo
Tratados con a-IFN-y, a cual comprueba su acción como
IL-12 y a-IFN-α/B cofactores en la producción de NO.

31
 TNFα e IFN-y estimulan la producción de ON pero la acción de IFN-I
en este mismo proceso no había sido estudiado.
IFN-I tiene un rol secundario en la infección.

Ratones depletados de IFN-αB R aunque tenían niveles mayores de

parasitemia no morían, mientras que ratones sin IFN-y, IL-12 y TNFR el
resultado era alta parasitemia y alta mortalidad.

La ausencia de IFN-I reducía la capacidad de los macrófagos de

destruir parásitos, debido a la ausencia de la producción de ON.

32
CONCLUSIONES

Los IFN-I estimulan la producción de ON en macrófagos como

parte de la respuesta inmune innata frente a T. Cruzi durante la
fase inicial de la infección, asimismo ayuda al control de la carga
parasitaria y parasitemia inicial.

33
¡GRACIAS!

34