CROMATOGRAFÍA

ANÁLISIS QUÍMICO
INSTRUMENTAL
 Cromatografía
 Técnica de separación muy potente.

 Los compuestos químicos se separan en

función de su diferente afinidad por una fase
móvil y una fase estacionaria.
 Existen muchas variantes en función de la
naturaleza de dichas fases móvil y
estacionaria.
 Ténicas manuales

 Cromatografía de columna.
 Cromatografía de capa fina TLC.

 Técnicas instrumentales

 Cromatografía de gases GC.

 Cromatografía de líquidos LC.
 Cromatografía de líquidos de alta eficacia HPLC.
La fase estacionaria
Sólidos muy porosos con capacidad adsorbente

Gel de sílice.- La superficie de éste,

interacciona con los compuestos orgánicos
mediante interacciones de carácter polar.
 Puentes de hidrógeno.
 Interacciones electrostáticas.
Los compuestos más polares que interaccionan
más frecuentemente con la sílica.
 La fase móvil
En cromatografía de líquidos (columna, capa fina, HPLC) la fase
móvil es una mezcla de disolventes: ELUYENTE
En cromatografía de gases la fase móvil es el GAS PORTADOR
En el proceso de cromatografía la fase móvil fluye arrastrando los
compuestos que están retenidos en la fase estacionaria.

En cromatografía de líquidos la naturaleza del eluyente tiene una

gran importancia
 Eluyente polares: Rompen
más eficazmente las
uniones de los compuestos
con la fase estacionaria.
Arrastran más rápidamente
a los compuestos.

 Eluyentes no polares: No
rompen las uniones de los
compuestos con la fase
estacionaria.
Arrastran muy lentamente
a los compuestos.
 La serie eluotrópica:
hexano < tolueno < cloroformo < diclorometano <
acetona < acetona de etilo < etanol < metanol < H2O

 Para conseguir el poder de elución deseado se utilizan

mezclas de disolventes
Cromatografía de capa fina (TLC)
Cromatografía de capa fina (TLC)
Cromatografía en papel
Cromatografía plana

 separación de clorofilas
mediante cromatografía en
papel
El índice de retención Rf

 Rf.- es una propiedad que

permite identificar sustancias en
una mezcla.
 El Rf de una sustancia en el
mismo soporte y con el mismo
eluyente siempre es constante:
Rf A (SiO2 Hex: AcOEt, 5:1) = 0.47
Influencia de la estructura en los
compuestos en el Rf
Influencia del eluyente en el Rf
 Cromatografía en columna
 Los elementos básicos de una cromatografía en columna son la
fase estacionaria y la fase móvil.

 La fase estacionaria la forma un sólido poroso, el cual queda

soportado en el interior de una columna generalmente
fabricada en plástico o vidrio.

 La fase móvil se encuentra formada por la solución que

lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución
que sale al final de la columna se reemplaza constantemente
por nueva solución que se suministra desde un contenedor por
la parte superior de la columna.
Cromatografía en columna
 La mezcla proteica que ha de ser
separada se coloca en una capa sobre
la parte superior de la columna y se
permite que lentamente se introduzca
en el interior de la matriz sólida
mientras se añade nueva solución
tampón por la parte superior de la
columna.

 La solución proteica forma una banda

dentro de la fase móvil que
inicialmente corresponde a la anchura
de la banda de proteína aplicada sobre
la columna.

 Conforme las proteínas migran a

través de la columna, su avance se
encuentra retardado en diferente grado
por las interacciones diferenciales que
cada una de ellas pueda ejercer con la
fase estacionaria.
 De esta forma, la banda de
proteínas se ensancha y los
diferentes tipos de proteínas
se separan gradualmente,
formando bandas dentro de la
banda total de proteínas. La
separación, y por tanto la
resolución, aumenta con la
longitud de la columna. Sin
embargo, cada banda
individual de proteína
también se ensancha con el
tiempo debido a procesos
difusionales, disminuyendo
por tanto la resolución.
 Refinamientos más modernos de los métodos cromatográficos
son el HPLC, cromatografía líquida de alta presión, y el FPLC,
cromatografía líquida de media presión.

 Estas técnicas hacen uso de bombas de presión que aceleran el

movimiento de las moléculas proteicas a lo largo de la
columna y de materiales cromatográficos de alta calidad que
pueden actuar bajo el flujo presurizado. Mediante la reducción
del tiempo en que la proteína se encuentra en el interior de la
columna, estas técnicas limitan el ensanchamiento por difusión
de las bandas de proteínas, aumentando por tanto la resolución.
Cromatografía de gases