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214 Estabilizacion Valladolid
214 Estabilizacion Valladolid
ESTABILIZACION DE ENZIMAS
INDUSTRIALES
LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES
EN LA INDUSTRIA QUIMICA
Enzimas para
Industria
Enzimas La industria
Química
Química
CIENCIAS DE
LA BIOTECNOLOGIA E INGENIERIA ENZIMATICA
1
INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Enzima soluble Enzima inmovilizada
S +E S E
Re-uso ó uso continuo
Mejor control de la reacción
Proceso mas sencillo y mas limpio
Enzima-electrodo 2
BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA DE SUPERFICIES
+E E
Soporte
+ Conservar o aumentar
la actividad
Mejorar la estabilidad
Mejorar la selectividad
5
INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS
DE INMOVILIZACIÓN Y POST-INMOVILIZACION
Mejorar notablemente
las propiedades del biocatalizador
3
INGENIERIA DE ENZIMAS INDUSTRIALES
ESTABILIZACION
REACTIVACION
HIPERACTIVACION
ALTERACION DE ESPECIFICIDAD
ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACION
DE ENZIMAS POR INMOVILIZACION
COVALENTE MULTIPUNTUAL
ESTABILIZACION 3D 6
COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES??
LA MORFOLOGIA DEL SOPORTE
7
LOS BRAZOS ESPACIADORES
O
OH + O CH2 CHOH CH2OH
CH2 CH CH2OH
O
IO- + NH2 E N E
4
O CH2 C O CH2 CH
H
9
LOS RESIDUOS Y LA REGION
..
- NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación)
8
+ NH+
INMOVILIZACION DE ENZIMAS NH3
3
H 2N
H 2N R’
+ H 2N R
O
O CH2 C + H 2N R
H
LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS
Y SOPORTES GLIOXIL
NH2 NH2
H2N
H2N
H2N
H2N
pH 8.0 (NO)
pH 10.0 (NO)
NH2
H2N
Regiones muy ricas
H2N en grupos aminos
H2N
H2N
pH 10.0 (SI)
10
Orientacion correcta: regiones muy ricas en aminos
.........
O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H
NaBH4
O CH2 CH N O CH2 CH2 NH
1mg/ml
O CH2 CH N
O CH2 CH2 NH
O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H
12
LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO
O
O
C
C
O H
H
C O O
H
C C
O
H H
C O
H
C
H
>>>
estable
16
UNION MULTIPUNTUAL TRIPSINA (AMIN0)- 6% AGAROSA (GLIOXIL)
RIGIDEZ
HIDRÓLISIS DE BAEE ACTIVIDAD %
ACTIVIDAD, % 200
100
150
100
50
50
0
0 0 20 40 60 80
0 2 4 6 8
ETANOL, %
UREA, M
DERIVADO UNIPUNTUAL
Estabilidad
comparada con el derivado unipuntual
15
INMOVILZIACION DE ENZIMAS SOBRE
GELES GLIOXIL Y SOBRE OTROS SOPORTES CONVENCIONALES
100 100
80 80
60 glioxil 60
40 40 glioxil
20 glutaraldehido 20 bromocianogeno
0 0
0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800
17
ESTABILIZACION DE ENZIMAS
POR INMOVILIZACION COVALENTE MULTIPUNTUAL
SOBRE SOPORTES GLIOXIL
pH 7.0, 25ºC
90% dioxano
agua ??
replegamiento
desplegamiento
Disolventes pH 7.0
Urea
Uso industrial 25ºC
guanidina
agua
64
REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS - ESTABILIZADAS
DESPUES DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTE
QT EN 90 % DIOXANO
100
Actividad residual, (%)
75 Medio acuoso
50
25
8M Guanidina
0
0 10 20 30
Tiempo (dias)
inactivación total reactivación 24 h.
reactivación 30 min. desplegamiento- replegamiento
ESTABILIZACION DE ENZIMAS MULTIMERICAS
IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES
O
C
H
Actividad residual,(%)
100
75
50
25
0
0 10 20 30 40
Tiempo, (horas)
5mM de fosfato sódico pH 6,5; 25ºC
Concentración de proteína 5g / ml
21
REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMERICAS
ESTABILIZADAS EN CONDICIONES DISOCIANTES
36
EFECTO DE LA ESTABILIDAD DEL DERIVADO EN LA REACCION
DE SINTESIS DE AMPICILINA CATALIZADA POR
-aminoacidoester hidrolasa
75
estándar
50
25 “óptima”
0
0 100 200 300 400
37
tiempo, min
NH3+
Enzima mas rígida
Menor concentración de disolvente
SO4=
en el micro-entorno de la enzima
100
Actividad residual, (%)
75
50
25
0
0 200 400 600 800 1000
Tiempo (horas)
95% dixano, pH 7, 25ºC
24
UTILIZACION DE DEXTRANOS COMO BRAZOS ESPACIADORES
OH HO
OH OH
OH
OH
OH
+
+ +
+ +
+
+
25
PURIFICACION DE GUANIDINO BENZOATASA POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD SOBRE
LIGANDOS CON CARGA POSITIVA
+
+
- +
+
- +
+ -
+
+ -
+
+
Cromatografía
de afinidad
selectiva y eficiente
+ Muy baja densidad de ligandos
Brazos espaciadores
Interacción fármacos y
Biomacromoleculas 43
PROCESOS RELACIONADOS:
BIOTECNOLOGIA DE SUPERFICIES
Placas multipocillo
Partículas magnéticas
Porta-muestras para “chips de ADN”
Diagnostico
Análisis alimentos
Análisis de agua
49
INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS
DE INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACION
Resultados espectaculares
(estabilidad, actividad, selectividad)
Ingeniería multidisciplinar:
biotecnología de superficies + polímeros
INGENIERIA DE LA ENZIMA
Solubilidad
pH
Selectividad
biocatalizador
Ingeniería
substratos y
productos temperatura
codisolventes
de la
Rendimientos reacción
síntesis/hidrólisis
Medio
ambiente
enzimática
Estabilidad de
substratos
Química orgánica 53
BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA
Búsquedas de
Mejora de enzimas
Nuevos enzimas
existentes
Ingeniería de la reacción
Biotecnología de Superficies
Química analítica
Bioquímica
Química orgánica
Biofísica
Ingeniería química
Mejora de
Mejora de Enzimas ingeniería
enzimas por de la
por técnicas de reacción
métodos inmovilización y del
biológicos y reactor
post-inmovilización
MEJORA DE LAS PROPIEDADES
DE UNA ENZIMA INDUSTRIAL
NATURALEZA
•Seres vivos extremófilos
•ADN ambiental
Mutagénesis Mutagénesis
al azar dirigida