INHIBICIÓN DE LA

HEMAGLUTINACIÓN

1. Rotular las placas con el número de los sueros a 2. Añadir 0.025 ml de Albúmina bovina (fracción
probar y el antígeno a utilizar. Los sueros son probados V) al 0.4 % en buffer borato salina (BABS) a cada
utilizando diluciones desde 1/10 hasta 20480. pozo.

4. Realizar las diluciones de los sueros con pipeta 3. Adicionar 0.025 ml del suero a titular en el
multicanal. primer pozo de cada columna.

5. Añadir a cada pozo 0.025ml de la dilución de antígeno 6. Agitar y mantener en reposo a temperatura
que contiene 8 unidades hemaglutinantes. ambiente durante 45 minutos.

8. Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente 7. Añadir 0,05 ml de glóbulos rojos diluidos en el
durante 30 minutos. pH óptimo para el virus.
AISLAMIENTO VIRAL

1. Para el aislamiento viral, las muestras

clínicas se deben inocular en células vivas.

2. Para esto se le ofrece un sustrato adecuado

para su replicación como: Cultivos celulares,
Cultivos primarios, Líneas celulares diploides,
Líneas celulares continuas, Huevos
embrionados, Animales de laboratorio.

3. Luego de inocular la muestra, el cultivo

celular se incuba a 37º C y se observa
diariamente para determinar la aparición de
efecto citopático (ECP).

4. Si no se observa ECP se realizarán 3 o 4

pasajes ciegos cada 72 hs.
 PRUEBA DE ANILLO EN LECHE

1. Mezclar bien cada frasco que contenga la muestra de leche .

2. en una gradilla con tubos debidamente rotulados y

considerando los controles respectivos, colocar 1 ml de muestra
en cada tubo ( de diámetro suficiente que permita la formulación
de una columna de 25 mm).

3. añadir 30 ul de antígeno para la prueba del anillo en leche a

cada tubo y mezclar invirtiendo suavemente el tubo varias veces
logrando una distribución uniforme antígeno-leche.

4. luego colocar a gradilla en la incubadora a 37c por una hora y

realizar la primera lectura a los 30 minutos y a lectura final a los
60 minutos.
 AISLAMIENTO BACTERIOLOGICO

1. obtención de
2. inoculación 3. incubación 4. Aislamiento de colonia
muestras.

7. prueba de
6. Tinción de Gram 5. cultivo puro
sensibilidad
 CULTIVO CELULAR

1. Una vez en el laboratorio hay que agitar 2. Seguidamente se centrifuga el medio

fuertemente la muestra contenida en líquido de forma que, en pellet que se
medio específico y descartar el tejido. forme contendrá los hongos, células,
bacterias y sangre y será descartado.

4. Para la inoculación se incuba el cultivo 3. Mientras que el sobrenadante,

celular con unos 200 microlitros del conteniendo los virus, será inoculado
medio líquido unos 90 min. sobre los diferentes cultivos celulares.

5. Posteriormente se retira el medio de 6. Los virus comienzan entonces a crecer,

inoculación y se añade medio fresco. Este proceso puede tardar desde un día a
varias semanas en función del tipo de
virus.

7. Diariamente se encaminará el cultivo celular inoculado bajo

el microscopio y se comparará con un medio sin inocular para
detectar las posibles alteraciones del cultivo celular producidas
por los virus.
SERONEUTRALIZACION

1. Las microplacas con el cultivo celular se enjuagan dos veces

por Medio de Lavado, dejando en cada pocillo algunas gotas del
mismo. que se descartarán en el momento de la inoculación:

2. El virus conocido se diluye en MEM-G o BME con 3% de suero

normal bovino a fin de obtener 10 3,3 DICT50/ml (100 dosis
infecciosas en la mezcla suero-virus e inocular: 0,1 ml).

3. El suero se diluye en el mismo medio, en diluciones dobles a

partir de 1/2 hasta la dilución final elegida (considerar que el factor
de dilución será el doble al agregar igual volumen de dilución viral).
Se mezclan iguales volúmenes de cada dilución sérica con la
dilución viral (por ejemplo, 0,3 ml. dilución sérica y o,3 ml. dilución
de virus).

4. Los controles positivo y negativo se preparan de la misma

manera, el titulo del control positivo debe estar entre 1/8 y 1/64,
y el negativo no debe inhibir el efecto citopatico viral a una
dilucion se incluye un control de la dilución viral (0,3 ml. de la
dilución viral más 0,3 ml. de medio con suero).
5. Se agita suavemente y se lleva a 37ºC durante 60 minutos.
La reacción se detiene a 4ºC durante 30 minutos.

6. Se descarta con cuidado al Medio de Lavado de la

microplaca, se seca con papel absorbente y se inoculan 4
pocillos por cada dilución suero-virus, con un inoculo de 0,1
ml. El control de dilución viral se titula a fin de determinar la
exacta concentración viral: tres tubos con 1,8 ml. de medio
con suero, colocando en el primero 0,2 ml. de la dilución de
virus utilizada (dilución 1/10), se mezcla, se traspasan 0,2 ml.
al siguiente (dilución 1/100) y, finalmente 0,2 ml. al tercero
(dilución 1/1000).

7. En cada microplaca que se utiliza se deben dejar pocillos

de control celular que sólo se completan con medio.
AISLAMIENTO DE EMBRIÓN DE POLLO
1. Primero coja uno de los huevos de la incubadora, que se habrán incubado 1, 2 3 o 4 días y colóquelo
1.- EXTRACCIÓN en un soporte adecuado (la mitad de un cartón de embalaje de huevos). Asegúrese de que el extremo
romo de su huevo está todavía hacia arriba (se puede comprobar utilizando una fuente luminosa para
detectar donde está realmente el embrión).

2. A continuación se abrirá el huevo simplemente como haría con un huevo pasado por agua para el
desayuno. Con la parte de atrás de las pinzas se golpea el extremo romo del huevo, cinco o seis veces, y
una vez quebrada la cáscara en pequeños pedazos, quite los con unas pinzas. Finalmente se quitará con
cuidado la membrana interna que cubre el espacio donde se localiza el embrión. El embrión queda
ahora expuesto.

3. Observar el embrión de pollo bajo la lupa. Si es suficientemente desarrollado debe de verse el

bombeo del corazón así como el movimiento de la sangre en venas y arterias. Utilizar los esquemas del
guión de prácticas para identificar el estadio y las distintas estructuras.

4. A continuación retiraremos el embrión de la yema. Este punto requiere a menudo dos manos.
Necesitará separar el embrión de las membranas extraembrionarias, cortándolas alrededor del mismo,
mientras que lo sostenemos bien para que no se hunda en las profundidades de la yema, una vez que
se libra.