CURSO DE PRIMAVERA

PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER

Conceptos básicos sobre ADN y ARN

Técnicas de amplificación (PCR y variantes)
Aplicaciones principales

Dr. Juan C. Cigudosa

Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
 Material hereditario: ADN

• Nuestra información genética está codificada en una

macromolécula: el ADN (ácido dexoxirribonucléico).

• El ADN con proteínas forma los cromosomas. El material

básico de los cromosomas es la cromatina.

• 46 cromosomas que se agrupan en parejas de

cromosomas homólogos (uno heredado del padre y
el otro de la madre)
2 metros de ADN en un núcleo de 0,005 mm diámetro

Nucleosoma: 8 Histonas+147 pb

Cromatina=(ADN+proteinas)
 El ADN como material genético

Características del material genético

•Capacidad de almacenamiento
de la información

•Capacidad de replicación

•Capacidad de expresión de la
información

•Capacidad de variación por

mutación
 El ADN como material genético

Características del material genético

•Capacidad de almacenamiento
de la información

•Capacidad de replicación

•Capacidad de expresión de la
información

•Capacidad de variación por

mutación
 ADN
1. Acido Desoxiribonucleico:
información genética.
2. Polímero formado por
subunidades: nucleótidos.

3. Nucleótido está constituído:

azúcar
pentosa(desoxiribosa)+base
nitrogenada (A,T,C,G)+
grupo fosfato.
4. T y C pirimidinas; A y G
purinas.
5. T es complementaria a A
C es complementaria a G
6. Estructura de doble hebra
 ¿Qué es una secuencia de ADN?
• ADN: 4 caracteres
A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina).

• Las moléculas de ADN están compuestas por una secuencia de

millones de estos caracteres, de la misma manera que si
tuviéramos un collar en los cuales cada perla es de un color de
cuatro posibles.

• El orden de las bases en la secuencia es la manera de almacenar

la información: el ADN es la memoria química de los organismos
vivos.

• La lectura de esta secuencia de bases es lo que denominamos

secuenciación.
 GENOMA/GEN

• GENOMA: todo el ADN contenido en el núcleo (no olvidar

que hay ADN en mitocondrias).

• La unidad de información en el ADN es el GEN (formado por

nucleótidos) que es una secuencia de ADN que contiene la
información para la producción de proteínas, así como las
instrucciones regulatorias para determinar cuándo y en qué
cantidad se producirán esas proteínas.

• 20000 genes aproximadamente

• 20-30 kb tamaño medio de un gen (nº exones muy variable
(media de 7-8)
 Estructura de un GEN

Región codificante Región no codificante

EXOMA
 El ADN como material genético

Características del material genético

•Capacidad de almacenamiento
de la información

•Capacidad de replicación

•Capacidad de expresión de la
información

•Capacidad de variación por

mutación
 Replicación del ADN
DEFINICION: una molécula original de ADN de doble cadena es convertida en
dos moléculas hijas de ADN idénticas.
 El ADN como material genético

Características del material genético

•Capacidad de almacenamiento
de la información

•Capacidad de replicación

•Capacidad de expresión de la
información

•Capacidad de variación por

mutación
 DOGMA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Complementariedad de bases nitrogenadas

 ARN
1. Acido Ribonucleico.
2. Polímero formado por
subunidades: nucleótidos.

3. Nucleótido está constituído:

azúcar (ribosa)+base
nitrogenada (A,U,C,G)+
grupo fosfato.
4. U y C pirimidinas; A y G
purinas.
5. U es complementaria a A
C es complementaria a G
6. Estructura monocatenaria

Severo Ochoa ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cómo se
sintetizaba el ARN
CODIGO GENÉTICO

43 = 64
codones

20 Aa

1er Aa
SIEMPRE
ATG/ Met

Codones
STOP
TAA/TAG/
TGA
Splicing alternativo
Modificaciones post-traduccionales
Los GENES se anotan en mayúscula y cursiva
P53, BCR-ABL, EGFR, etc

Las PROTEINAS se anotan en minúscula

p53, Bcr-Abl, Egfr, etc
 El ADN como material genético

Características del material genético

•Capacidad de almacenamiento
de la información

•Capacidad de replicación

•Capacidad de expresión de la
información

•Capacidad de variación por

mutación
 El ADN como material genético
• El material genético debe ser capaz de proporcionar una
fuente de variabilidad a través del proceso de
mutación.
• Mutación: cambio que afecta
a la composición del ADN que
tendrá su reflejo final en la
proteína resultante.
• Mutación línea germinal: afecta a los gametos, pasará
a la descendencia.

• Mutación somática: Alteración o cambio en la

información genética (ADN) que ocurre después de la
concepción.

• Este cambio podrá ser beneficioso, neutral o perjudicial.

 Tipos de mutaciones

Mutaciones indel: Cambio de la secuencia de codones que debe ser leída durante
la traducción, resultando en una proteína completamente diferente, que no suele
ser funcional.
Tipos de mutaciones
 Tipos de mutaciones

•Mutaciones no sinónimas: sustituciones nucleotídicas que cambian un

aminoácido por otro (MISSENSE).
•Mutación sinónima: mutación que altera la base situada en la tercera
posición del codón pero no causa sustitución aminoacídica (SILENT)
•Mutación sin sentido: mutación por la cual un codón que especifica un
aminoácido es cambiado a un codón de terminación, dando lugar a una proteína
truncada (NONSENSE).
 Polimorfismos
Definición: variación en la secuencia de un lugar determinado del
DNA entre los individuos de una población. Debe aparecer por lo
menos en el 1% de la población.

La mayor contribución a la variación genética son los SNP (85%)

Cada 1000 b un SNP
 SNPs

•Alrededor de 8 millones de SNPs en todo el genoma.

•Algunos pueden producir cambios en proteína:
- susceptibilidad a padecer enfermedades
- resistencia a tratamientos específico
PREPARACION DE MUESTRAS,
EXTRACCION ACIDOS
NUCLEICOS Y CONSERVACION
DE MUESTRAS
 Muestras Biológicas
1.- Tejido
– Biopsa en fresco
- Biopsia enparafina

2.- Fluidos:
Heparina
- Médula ósea
- Sangre Periférica
EDTA
- Saliva
- Líquido Cefalorraquídeo
- Líquido Pleural
- Líquido Pericárdico
Citrato
- Líquido Ascítico
Sódico
- Líquido Sinovial
 Muestras Biológicas

1) Citogenética Convencional
CARIOTIPO 3 ml de MO/SP
2) Citogenética Molecular HEPARINA
FISH
Corte OCT o
Parafina
3) BIOLOGIA MOLECULAR
Mínimo 5 ml MO/SP
Para RQ-PCRm, 10 ml EDTA
de SP
OBTENCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
 METODOS DE EXTRACCION DE ARN

1) Extracción con Tiocianato de Guanidinio-Fenol-Cloroformo

2) Trizol: reactivo comercial
3) Columnas de silicagel (Rneasy Mini Kit-Qiagen)
4) Purificación por afinidad con Oligo-dT (para mRNA)

Métodos Extracción de ADN

1) Extracción con Fenol-Cloroformo-Isoamílico

2) Columnas de silicagel (DNAmp Mini Kit- Qiagen)

Métodos automatizados
AC. [AC. NUCLEICO] PUREZA (Valor
NUCLEICO (g/l) óptimo)

ADN A260 x 50 x dilución A260/A280 (1,80)

ARN A260 x 40 xdilución A260/A280 (2,00)

 Extracción ADN, ARN y proteína

LISAR Y
HOMOGENEIZAR

LAVAR
PRECIPITAR

ELUIR

LAVAR
PRECIPITAR

DISOLVER ELUIR
CURSO DE PRIMAVERA
PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER

Conceptos básicos sobre ADN y ARN

Técnicas de amplificación (PCR y variantes)
Aplicaciones principales

Dr. Juan C. Cigudosa

Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
 Tipos de PCR

 PCR Sencilla: RFLP

 PCR Anidada (Nested): Amplificación de una secuencia dentro de
otra previamente amplificada
 RT-PCR
 PCR Múltiple: Varios targets diferentes en forma simultánea
 Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa
 PCR MSP: metilación
 PCR Digital (2011)
 Variantes de PCR: secuenciación y pirosecuenciación
 Tipos de PCR: PCR sencilla
Primers externos para amplificación de una secuencia

Fragmento de amplificación
 Tipos de PCR: PCR anidada
Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers

Reacción 1
Primers
extern
os para
amplificación
de una
secuencia
Reacción 2
extensa
Primers
internos
para SEGUNDA PCR
amplificaci
ón de una
Aumentar ESPECIFICIDAD
región
especifica
Aumentar SENSIBILIDAD (10-6)
 Tipos de PCR: RT-PCR
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

mRNA

Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa

cDNA

PCR Enzima Taq polimerasa

 Tipos de PCR: PCR Múltiple
• Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en
un único tubo diferentes secuencias diana.

• Aplicación.
1)Multiplex-PCR control calidad de una muestra:
amplificación de 4 genes constitutivos distintos.
2)Multiplex-PCR LAL-B infantil: amplificación de una
de las 4 posibles translocaciones que estudiamos.
3)ARMS-PCR: Amplificación por PCR de Alelos
Específicos.
 Tipos de PCR: PCR Múltiple

Amplificación 4 genes simultáneamente

BCR (377 pb)

2MG (287 pb)

ABL (193 pb)

PBGD (128 pb)
 Tipos de PCR: PCR Múltiple

Amplificación 4 translocaciones simultáneamente LAL-B infantil

t(4;11) MLL-AF4
t(1;19) E2A-PBX1
t(12;21) TEL-AML1
Controles Positivos t(9;22) BCR-ABL

ADNc individuo con la

t(9;22) e1a2

POSITIVO
Tipos de PCR: Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa

-CUANTIFICACIÓN de la expresión de genes o

reordenamientos.
-Más rápida y menos laboriosa.
 Tipos de PCR: RQ-PCR
Medida de señal de fluorescencia en la fase exponencial del
proceso de PCR a tiempo real
Fundamento
1.Detección y cuantificación de la señal, emitida por un
reporter fluorescente, que aumenta en proporción directa a la
cantidad de producto de PCR
2.Termociclador con sistema de detección capaz de c uantificar
la señal emitida por el reporter
 Tipos de PCR: RQ-PCR

CUANTIFICACION RELATIVA

Expresión de un gen en una muestra problema

en relación a la expresión de dicho gen en controles
normales.

CUANTIFICACION ABSOLUTA

Detección del Nº Copias “exacto” de un gen o

de un gen de fusión mediante la comparación con
estándares de concentración conocida.
 Tipos de PCR: RQ-PCR

• Química de la Reacción.
Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde
ADN.

• Ciclos Térmicos.
– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN
molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).
– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-
Polimerasa (60ºC).
 Tipos de PCR: RQ-PCR

• Química de la Reacción.
Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.

• Ciclos Térmicos.
– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN
molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).
– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementariay actividad de la Taq-
Polimerasa (60ºC).
 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Ag. Intercalantes (SYBR Green)

REACTIVOS Sondas de Hidrólisis

FLUORESCENTES (TaqMan)

Sondas de Hibridación

Sondas de Horquilla (Molecular Beacons)

 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
SYBR Green
Fase annealing Fase extensión (I)

Fase extensión (II) Fin del ciclo de PCR

 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
SYBR Green
Ventajas
- simple y económico
- fácil de usar
- sensible (10-6)
- versátil (no se necesitan sondas específicas)
Desventajas
- sobrestimación de la cantidad de molde por la unión del SYBR
Green a dímeros de primer y a otros productos inespecíficos
- necesario hacer una curva de melting
 Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan)
Fase annealing Fase extensión (I)

Fase extensión (II) Fin del ciclo de PCR

 Tipos de PCR: RQ-PCR

Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan)

Ventajas
-especificidad
-librerías de cebadores y sondas en las casas
comerciales
Desventaja
- diseño de cebadores y sonda para genes que
no se han estudiado (Primer Express)
 Tipos de PCR: RQ-PCR

• Química de la Reacci ón.

Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimeras a (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.

• Ciclos Térmicos.
– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN
molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).
– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-
Polimerasa (60ºC).
Tipos de PCR: RQ-PCR
FUNDAMENTO TERMICORQ-PCR
 Tipos de PCR: RQ-PCR

Producto de amplificación

Fase de plateau o saturación

Fase exponencial

Ciclo umbral (CT)

Ruido de fondo

CT (ciclo umbral):ciclo en el que la intensidad de emisión del fluorocromo

aumenta significativamente con respecto al ruido de fondo
 Tipos de PCR: RQ-PCR
INTERPRETACIONRESULTADOSRQ-PCR(I)
PRESENCIA (Nº COPIAS)/AUSENCIA

CT muestra

Log dilución
 Tipos de PCR: RQ-PCR

-Amplificación robusta y fiable

-Alta especificidad y sensibilidad
-Alta precisión y exactitud
-Cuantifica producto de PCR en cada ciclo
-Capacidad de realizar mayor número de reacciones al día
-No requiere análisis posterior a la PCR (electroforesis)
-Mayor control de contaminación
-Amplio rango de aplicación: reordenamientos IgH o TCR
fusión de genes a nivel DNA
fusión de genes a nivel cDNA
genotipado

expresión génica
 Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)

1ª 2ª 3ª

“X” target
copies

Hacer gotas PCR gotas Leer gotas Cuantificación

PCR Real-time PCR Droplet Digital PCR
Cualitativa Cuantificación relativa Cuantificación absoluta

Droplet Digital PCR (ddPCR™) – 3ª

Generación
 Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)
Ventajas
 Aumento de señal / ruido. DNA de alto número de copias y background
se diluyen, enriqueciendo los DNA escasos y permite un ± 10 % de
precisión
 Eliminación de los sesgos de la PCR. Las tasas de error se reducen
mediante la eliminación de la dependencia de amplificación de la
eficiencia, permitiendo detección de pequeñas diferencias (1,2 X)
 Simplificación de la cuantificación. Con ddPCR no necesitamos
estándares para la cuantificación absoluta ó relativa.
 Reducción del coste del reactivo. reacción son picolitros-nanolitros en
volumen, reduciendo muestra reactivo y entrada

Desventajas
 Precio de la plataforma

SENSIBILIDAD 10-7
 Secuenciación (PCR modificada)

• ¿Qué es la secuenciación?

• Metodología

 Terminadores/Sanger

 Pirosecuenciación

 Nueva generación de secuenciadores

• Análisis de secuencias

• Ejemplos de secuenciación
Sanger F et al. J Mol Biol. 1975 (3):441–448
Maxam AM, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 ;74(2):560-4

M Ronaghi et al. Analytical Biochemistry. 1996;242:84-85

Shenduret et al. Nat Biotecnology. 2008: 26

 Secuenciación (PCR modificada)

1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger

(marcaje fluorescente de las moléculas de ADN
amplificadas por PCR)
2) Separación de moléculas marcadas:
- electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante
- electroforesis capilar
 Secuenciación (PCR modificada)

La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN,

corresponde a la emisión de fluorescencia del nucleótido
incorporado en 3´
 Secuenciación (PCR modificada)

1) Reacción de Secuenciación: Método de Sa nger

(marcaje fluorescente de las moléculas de ADN
amplificadas por PC R)
2) Separación de moléculas marcadas:
-electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante
-electroforesis capilar
 Secuenciación (PCR modificada)

Cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una
de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El
ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con
los picos de colores y su correspondiente base.
 Secuenciación (PCR modificada)
Método enzimático/Teminadores/Sanger

Purificación de los productos de secuenciación

Secuencia correcta

CROMATOGRAMA

Terminadores
 Secuenciación (PCR modificada)
Método enzimático/Teminadores/Sanger

 Revisión visual de los electroferogramas.

Longitud de secuencia adecuada Valores
de calidad mínimos

 Uso de programas informáticos para el análisis.

 Comparar secuencias en ambas direcciones.
 Comparar las muestras con una secuencia de
referencia (sin mutaciones)
 Secuenciación (PCR modificada)

Tipos de discrepancias con la secuencia de referencia:

1.Polimorfismos
- Mutaciones Puntuales
- Deleciones
- Inserciones
- Translocaciones
- Inversiones
2. Artefactos de la secuenciación
 Secuenciación (PCR modificada)
Método enzimático/Teminadores/Sanger

Ventajas Desventajas

 Experiencia  Baja capacidad

 Gold estándar  Sensibilidad baja

 “Único Método”??  No es cuantitativo

 Coste por base
Secuenciación Masiva (PCR modificada)
 Tipos de PCR: RT-PCR

• oligo(dT)n Primer (n = 10 – 20)

mRNA poly(A) tail

TTTTTTTTTTTTTTT
cDNA

• Random Primer p(dN)x (x = 6 -9)

mRNA poly(A) tail

cDNA
NNNNNN
NNNNNN NNNNNN

• Gene-specific Primer
– Unión específica a la secuencia homóloga
– for 1-step RT-PCR
 Tipos de PCR: PCR Múltiple
ARMS-PCR (Amplificación por PCR de Alelos Específicos)

C1 C3
G
1849G>T
T

C4 C2
Control 463 pb
Mutante 279 pb
Normal 229 pb

C3+C2: Amplificación del alelo normal

C1+C4: Amplificación del alelo mutado
C1+C2: Amplificación Control Interno
 Tipos de PCR: PCR Múltiple
C1
G
1849G>T
T
JAK2 Mutación V617F
C4 C2
ADN de pacientes con la
Control 463 pb
Mutante 279 pb
mutación
Normal 229 pb

Control Interno
Alelo Mutado
Alelo Normal

ADN pacientes sin la

mutación

Mutación en homocigosis o heterocigosis: no se conoce la implicación clínica

Tipos de PCR: PCR MSP