TCNICAS DE DIAGNSTICO

MOLECULAR
Dra. Mariana L. Ferramola
Curso de Tcnicas moleculares
aplicadas a bioqumica clnica.
rea de Qca. Biolgica
FQByF, UNSL
2013

REACCIN DE PCR

Esta reaccin permite obtener un gran

nmero de copias de una secuencia de
cido nucleico determinada, ya sea ADN o
ARN.

RT-PCR

Muestra de partida:
ARN.
Pasos de reaccin:
1)Transcripcin
reversa
para
obtencin de ADNc.
2)Amplificacin de la
secuencia deseada
mediante PCR.

RT-PCR: Deteccin de virus de

Influenza A.
Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004,
p. 27962798.
Muestra: Hisopado nasal
y farngeo.

Transcripcin Reversa: RNA total, usando random

primer hexamers.

Identificacin del
virus de Influenza A
mediante
amplificacin por
PCR del gen de
matriz de dicho
virus (212bp).

RFLP-PCR
Esta tcnica aprovecha la aparicin o
eliminacin de un sitio de corte para enzima
de restriccin debido a una mutacin
puntual.
La tcnica consta de dos pasos sucesivos:
1)Amplificacin de la secuencia de inters
mediante PCR.
2)Restriccin de la secuencia amplificada con
una enzima especfica.

RFLP-PCR: Accin de las enzimas

de restriccin.

RFLP-PCR

RFLP-PCR: Deteccin de alelo

Duarte (mutacin N314D).
La variante Duarte, es un alelo polimorfico del
gen GALT, que da como resultado que la enzima
presente actividad disminuda.
La variante se debe a la mutacin N314D, en la
cual hay una
sustitucin (c.940 AG), que
genera un cambio del aminocido asparagina
(Asn, N) por un cido asprtico (Asp, D).
Este polimorfismo genera un cambio de bases
que determina un sitio de corte para la enzima
de restriccin AvaII.

RFLP-PCR: Deteccin de alelo

Duarte (mutacin N314D).

RFLP-PCR: Deteccin de alelo

Duarte (mutacin N314D).

Anlisis de la mutacin N314D en el exn 10 del gen

GALT humano. Lnea 4: homocigota para el alelo
mutado; lneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y lneas 3 y
7 al 10: homocigotas para el alelo normal

RFLP-PCR: Deteccin de virus

de Influenza A resistentes a
Amantadina.
Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004,
p. 27962798.

Primeramente
se
realiza
una
amplificacin del gen
de la protena M2.
Luego
se
detectan
mutaciones puntuales
que dan resistencia a
amantadina, mediante
el uso de enzimas de
restriccin.

GAP-PCR.
Se utiliza para detectar delecciones en
ADN.par de primers que
Puede usarse un elnico
flanqueen la zona deleccionada, de modo tal que
esta sea amplificada en la reaccin de PCR.
Para delecciones pequeas (menores de 1Kb) el
par de primers utilizados generar dos productos
de amplificacin, el fragmento de menor tamao
se producir a partir del alelo que presenta la
deleccin.
Cuando la deleccin es mayor, la distancia entre
los primers en el alelo normal es demasiado
grande como para ser amplificada, y slo se
obtendr producto a partir del alelo que presenta
la deleccin (alelo mutado). En estos casos, el
alelo normal es detectado usando un tercer

GAP-PCR: Deteccin de
delecciones que causan talasemia..

Long range PCR.

Esta tcnica ha sido utilizada para detectar
delecciones e inserciones.
Pueden
obtenerse
amplicones de hasta
30Kb.
El protocolo de PCR
es modificado por la
introduccin de una
polimerasa
con
actividad correctora
de pruebas (3-5exonucleasa)
adems de la Taq
polimerasa.

Long range PCR: Deteccin de

inserciones

MAPH (mltiple hibridizacin

de sondas amplificables) y
MLPA (mltiple amplificacin
de sondas dependiente de
ligacin)
Ambas son tcnicas basadas en una amplificacin
cuantitativa por PCR.
Presentan la ventaja de permitir el anlisis de hasta
40 secuencia blanco simultneamente.
Son tcnicas muy usadas para deteccin de
delecciones y duplicaciones del genoma.
Debido a la rapidez con que estas tcnicas permiten
escanear hasta 40 blancos, es muy probable que
sean ampliamente usadas tanto para investigacin
como para diagnstico. Por ejemplo para la
caracterizacin/diferenciacin de tumores.

MAPH: Sntesis de sondas

Cada secuencia blanco es detectada por una
sonda especfica.
Todas las sondas estn flanqueadas por las
mismas secuencias (en sus extremos 5 y 3), lo
que permite amplificarlas todas con el mismo par
de primers.
Todas las sondas deben tener tamaos diferentes,
para ser diferenciadas por el detector.

MAPH: Protocolo de ensayo..

Uno de los
primers
usados para
la
amplificacin
con PCR est
marcado con
un
fluorocromo.
Los productos
de
amplificacin
son
separados
por
electroforesis

MLPA.
Principales diferencias con el MAPH:
Utiliza dos sondas para reconocer cada secuencia
blanco.
La hibridacin de las sondas con el ADN blanco se
realiza en solucin.
Luego de la hibridacin de las sondas, se lleva a cabo
una reaccin de ligacin.

MLPA: Protocolo de ensayo..

Las sondas
hibridizan
de manera
inmediatam
ente
adyacente,
de
esta
manera solo
aquellos
pares
de
sondas que
encuentran
sus
secuencias
blanco
pueden ser

MLPA: Protocolo de ensayo..

Las
sondas
que
reconocieron
su
secuencia
blanco
y
pudieron ser ligadas son
amplificadas por PCR,
usando un nico par de
primers.
Todos los amplicones
generados deben tener
diferente tamao.
Los productos obtenidos
son
separados
por
electroforesis capilar y
detectados debido a su
marcacin fluorescente
(usualmente en uno de

MAPH-MLPA: Resultados..

MAPH-MLPA: Resmen..

SSCP (Polimorfismos de
conformacin de cadena
nica).
tcnica de SSCP
detecta. variaciones

La
en la
secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros
cambios pequeos) debido a la generacin de
diferencias en la movilidad electrofortica.
Bajo condiciones no desnaturalizantes, las
molculas de ssADN asumen conformaciones
nicas que dependen de su secuencia de
nucletidos.
Los cambios conformacionales producidos por
variaciones en la secuencia de ADN pueden
resultar en diferencia de movilidad detectables.
La mayora de los experimentos de SSCP son
diseados para evaluar polimorfismos en un nico
locus, y comparar los resultados entre individuos

SSCP
1. Un par de primers
especfico es utilizado para
amplificar el AND blanco.
2. La muestra se enriquece en
ssADN por medio de una
PCR asimtrica, debido a la
presencia de uno de los
primers en mayor cantidad
que el otro.
3. Las movilidades de los
fragmentos simple cadena
se comparan mediante
electroforesis en un gel
neutro de poliacrilamida.
4. Las bandas son detectadas.

SSCP: esquema de trabajo.

SSCP: ejemplo.

El anlisis del ADN por SSCP muestra haplotipos

mltiples , o sets de alelos usualmente heredados
como una unidad. Las calles 3 y 4 mostraron
haplotipos idnticos de dos individuos diferentes.
Las diferencias de migracin de bandas en calles
adyacentes est asociada co n la cantidad de
nucletidos diferentes presentes: calles 2-3 (2);
calles 3-4 (0); calles 4-5 (3); calles 5-6 (1); calles 6-7

Transferencia Southern

Se utiliza para
analizar
fragmentos de
DNA generados
por digestin con
enzimas de
restriccin.

Transferencia Southern

Transferencia Southern
Se utilizan sondas de gran tamao, con
grados de actividad variable,
dependiendo del uso.

Principales
usos:

Deteccin de secuencias
relacionadas ( ej. familias
de genes).
Deteccin de deleciones e
inserciones
grandes
causantes
de
enfermedades
(ej.
Distrofia
muscular
de
Duchenne).
Identificacin
de
individuos mediante VNTR.