ENZIMAS MICROBIANAS DE USO INDUSTRIAL

n n n
* Se emplean principalmente enzimas hidroliticas (para ruptura de polimeros con diversas estructuras) * Grandes volumenes (ton) * Deben ser de bajo costo * Purificacion sencilla (en general, solo parcial)

ventajas
pueden seleccionarse de alta o baja especificidad, segn el objetivo

desventajas
costo alto en general

pocos o ningun producto secundario

actividad optima en condiciones de reaccion suaves

estabilidad
inhibicion

pueden emplearse en medios no acuosos para reacciones de sintesis

sustratos poco solubles plantean dificultades en la solubilizacion

PRINCIPALES ENZIMAS INDUSTRIALES Enzima

Proteasas alcalinas Proteasas acidas Proteasas neutras Amilasas Isomerasas

Proceso
detergentes elaboracion de quesos varios industria del almidon jarabes de fructosa

Fuente
bacterias hongos Bacterias, plantas y animales bacterias, hongos Bacterias, hongos

celulasas Pectinasas

celulosas vinos, cerveza, condimentos

hongos hongos

Lipasas

varios

bacterias, hongos y levaduras, animales

Caracteristicas de los microorganismos :

GRAS Bacterias : Genero Bacillus Hongos : Generos Aspergillus, Saccharomyces Facilmente cultivables en medios baratos Enzimas exo-celulares

Preferentemente termoestables y resistentes a stress (pH, concentracion salina)

AAPLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS MICROBIANAS

BEBIDAS Y ALIMENTOS FERMENTADOS PANIFICACION QUESERIA PRODUCCION DE ENDULZANTES MODIFICAR AROMAS TEXTURIZAR ASPECTO ORGANOLEPTICO ABLANDAR CARNES CLARIFICACION DE BEBIDAS (VINOS , CERVEZAS Y JUGOS) DETERGENTES OBTENCION DE PUFAS SINTESIS DE ESTERES SINTESIS DE PEPTIDOS Y LIPIDOS

Glycosyl hydrolases
Enzyme Main substrate Amylosucrase Sucrose Sucrose phosphorylase Sucrose Glucan branching enzyme Starch, glycogen Cyclomaltodextrin glycosyltransferase Starch Amylomaltase Starch Maltopentaose-forming alpha-amylase Starch, glycogen Alpha-amylase Starch Oligo-1,6-glucosidase Starch Alpha-glucosidase Starch Amylopullulanase Cyclomaltodextrinase Isopullulanase Isoamylase : 1,6-alpha-D-glucosidic linkages in some oligosaccharides, Starch Pullulan Maltotetraose-forming alpha-amylase linear and cyclomaltodextrin Glucodextranase Amylopectin starch Trehalose-6-phosphate hydrolase Trehalose Maltohexaose-forming alpha-amylase Starch Maltogenic amylase Starch Neopullulanase Pullulan Malto-oligosyl trehalase hydrolase Trehalose Malto-oligosyl trehalose synthase Maltose

CARBOHIDRASAS
POLIMEROS : AMILASAS PECTINASAS CELULASAS GLUCOSA ISOMERASA

ISOMERASA :

INVERTASA (SACAROSA)) BETAGALACTOSIDASA (LACTOSA) Principales productos que se obtienen (segn grado de hidrolisis)
DISACARIDOS
hidrolizados de almidon dextrinas jarabe de maltosa jarabe de glucosa jarabe de fructosa

ALMIDON Y SUS PRODUCTOS DE HIDRLISIS

Composicion: Polisacarido constituido exclusivamente por glucosa. Se almacena en forma granular en plantas tuberosas y en semillas El almidon de las plantas esta constituido en un 70-80% por amilopectina. Para su utilizacion se requiere : 1- Solubilizacion o gelatinizacion: por calentamiento a 100 oC 2- Hidrolisis enzimatica o liquefaccion: ruptura de la molecula por metodos enzimaticos

HIDROLISIS DEL ALMIDON

Composicion amilosa (uniones glu 1-4) amilopectina (uniones glu 1-6) proporcion variable segn tipo de grano

Tipo de hidrolisis

quimica :calentamiento en medio acido enzimatica - amilasa :1-4(endo) glucosidasa glucoamilasa :1-4(exo) glucosidasa y (1-6) en mucha menor proporcion - amilasa : 1-4(exo) glucosidasa pululanasa : 1-6 glucosidasa isoamilasa : 1-6 glucosidasa

Producto
dextrinas glucosa maltosa

Enzimas

ALFA- AMILASAS MICROORGANISMOS PRODUCTORES: Bacillus amiloliquefasciens y Bacillus licheniformis (enzima termoestable, ta optima: 90oC). La secuencia se ha clonado en plantas de tabaco y obtenido semillas transgenicas pero no se emplean industrialmente Aspergillus oryzae y Aspergillus niger ENZIMAS Peso molecular aproximado : 50 Kda pH optimo : neutro ; requieren Ca 2+ Exocelulares. Segn el tipo de enzima y la concentracion del sustrato pueden obtenerse distintos grados de hidrolisis llegando a liquefaccion: oligosacaridos o sacarogenica.

APLICACIN: Primera etapa de la hidrolisis del almidon. Se disminuye su viscosidad.

METODO DE PRODUCCION Cultivo en batch o batch alimentado. Las cepas presentan gran variabilidad, por lo cual no puede emplearse el cultivo continuo .

Tipo de cultivo : sumergido y aireado.

Condiciones : pH : neutro. Temperatura : 40-45 o C (cepas termofilas) La produccion comienza al finalizarse la fase exponencial de crecimiento, previo a la entrada en esporulacion. Requiere inductor (almidon). Hay represion catabolica por glucosa. No se sintetizan bajo limitacion de nitrogeno. Las amilasas fungicas tienen similar modo de produccion pero el proceso es mas lento (3-4 dias)

 - AMILASAS
1- ORIGEN
VEGETAL : CEBADAS . Durante su germinacion actuan las alfa y beta amilasas para producir la malta. MICROBIANAS : Bacillus polymixa y B. circulans.

2- ENZIMAS pH extremos.

Para los productos fermentados naturales se usan en general Por accion de esta enzima sobre el almidon se obtiene una

las vegetales pero las microbianas son mas estables a la temperatura y los mezcla de jarabe de maltosa + dextrinas

GLUCOAMILASAS
1- ORIGEN

Fungico : Aspergillus niger Rhizopus niveus 2- ENZIMA Se producen como ISOENZIMAS cuyo perfil varia con las composicion del medio y el modo de produccion. Las isoenzimas tienen distinta actividad sobre el almidon. Las enzimas son TERMOLABILES. Son EXOCELULARES 3- PRODUCTOS DE REACCION : glucosa, maltosa y dextrinas. Hidroliza uniones 1-4 y 1-6, pero estas ultimas a menor velocidad. 4- METODO DE PRODUCCION Cultivo sumergido aireado batch o continuo. Requiere inductores (almidon o dextrinas). Glucosa, acido glutamico y lactosa producen represion catabolica. Pueden producirse simultaneamente proteasas y glicosidasas que varian el perfil de isoenzimas. Produccion en el comienzo de la fase estacionaria.

PRODUCCION INDUSTRIAL DE JARABES DE GLUCOSA Y FRUCTOSA

(Novo Industries. Desde 1977)

En Argentina: productos de Maiz http://www.pdm.com.ar Almidon de maiz al 40 % P/V Agua desionizada Ca2+ (20 ppm) 5 min a 105 oC (gelatinizacion) Ph= 5.8- 6.5 (ajuste desde 4.5)

alfa- amilasa 0.15 %

Se requiere cambio de pH en las diferentes etapas. 60 min a 95 o C (liquefaccion) pH 4.5, TEMP= 60 o C, filtracion Dilucion (10-20 % peso seco) disminucion de la viscosidad

glucoamilasa (0.15 U/g almidon)

Reaccion reversible 48 horas a 60 C
o

Puede quedar isomaltosa

Sacarosa

invertasa

Jarabe de glucosa (98 % rendimiento) xilosa isomerasa

Jarabe de glucosa/ fructosa (60 : 40)

GLUCOSA- ISOMERASA
1-

MICROORGANISMOS PRODUCTORES Bacillus coagulans ( Novo) Actinoplanes missouriencis (Gist Brocades) Streptomyces spp (Miles) ENZIMA Es una xilosa isomerasa inducible por sustrato. Es intracelular Temperatura optima elevada Requiere Mg o Co. Es inactivada por colorantes, coloides y sales

2-

METODO DE PRODUCCION. Proceso batch o continuo. Se requieren fuentes de carbono de lenta metabolizacion y el sustrato inductor (xilosa). La glucosa ejerce represion catabolica. El exceso de oxigeno no favorece su produccion. La produccion depende de la fuente de nitrogeno y de carbono.
34-

PRODUCTO : Jarabe de fructosa Inmovilizacion de la enzima o las celulas. Materia prima : jarabe de glucosa 93-96 % diluido al 40-45% (peso seco) con agua desionizada Filtrar por C activado . Aadir Mg, llevar a pH = 8.5 y temp= 60-65 o C. Incubar 1 a 4 Hs. Recuperacion : acidificar, filtrar, intercambio ionico.

Procesos de produccin con enzimas microbianas inmovilizadas: http://aklyosov.home.comcast.net/Volume4.htm

MICROBIAL SOURCES OF GLUCOSE ISOMERASE PRESENTLY BEING USED FOR THE COMMERCIAL PREPARATION OF IMMOBILIZED ENZYMES, AND THE COMPANIES PRODUCING THEM

Manufacturer

Enzyme source

Clinton Corn Processing Co. Novo Industry Gist Brocades ICI Americas, Inc. Miles Laboratories, Inc. Mi-Car Int. Corning Glass Works

Streptomyces rubigenosus Streptomyces wedmorensis Bacillus coagulans Streptomyces murinus Actinoplanes missouriensis Arthrobacter Streptomyces olivaceus Flavobacterium arborescens Streptomyces olivaceus Streptomyces olivochromogenes

Nagase
Miles Kali Chemie Sanmatsu Snamprogetti Finnsugar Godo Shusei UOP

Streptomyces phaeochromogenes
Streptomyces rubiginosus Streptomyces Streptomyces Streptomyces rubiginosus Streptomyces griseofuscus Streptomyces olivochromogenes

Source:Adapted from Antrim et al., 1979; Jensen & Rugh, 1987; Houng et al., 1993.

Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase

SNEHALATA H. BHOSALE, MALA B. RAO, AND VASANTI V. DESHPANDE*

http://mmbr.asm.org/cgi/reprint/60/2/280.pdf

ENZIMAS QUE HIDROLIZAN UNIONES 1-6 GLICOSIDICAS 1- MICROORGANISMOS Aerobacter aerogenes bacterias
streptomyces Pseudomonas amyloderanosa Thermoanaerobacterium

pululanasa pululanasa isoamilasa pululanasa termoestable

ENZIMAS PROTEOLITICAS

ORIGEN MICROBIANO EXOCELULARES DISTINTOS PH OPTIMOS ALCALINAS : para productos de lavar y cueros. NEUTRAS : para panificacion, sabor, bebidas, carnes, produccion de gelatinas, condimentos (Japon). ACIDAS : para queseria.

PROTEASAS NEUTRAS
Se emplean tambien para otros fines (medicos, por ej) en cuyo caso se emplean de preferencia las de origen vegetal o animal (pancreas). Son inactivadas por las proteasas alcalinas. Hay muchos microorganismos que producen proteasas neutras pero son poco usadas por su baja estabilidad.

PROTEASAS ALCALINAS
1- MICROORGANISMOS Bacillus licheniformis, B. megaterium, B. amiloliquefaciens Sterptomyces griseus, S. fradie, etc Aspergillus niger, A. oryzae, A. flavus 2- ENZIMAS DE Bacillus : subtilisinas serina -proteasas no inhibidas por EDTA estabilidad a altas temperaturas pH optimo alcalino (9 a 11) estabilidad frente a quelantes poco estables a los surfactantes se comercializan como granulos o particulas (no en polvo) 3- PRODUCCION Cultivo sumergido en batch o batch alimentado. - Amonio y aminoacidos deben mantenerse en baja concentracion

PROTEASAS ACIDAS
Su uso mas importante es como sustitutos de la quimosina bovina en la elaboracion de quesos. Provocan la coagulacion de la caseina por hidrolisis de un enlace peptidico especifico sin hidrolisis generalizada. Previamente deben agregarse cultivos starters que producen la acidificacion por formacion de acido lactico. 1- MICROORGANISMOS Mucor pusillus HONGOS Endothia parasitica Mucor miehei Desde 1990 se emplea tambien la renina (bovina) recombinante clonada en E. coli. Otros la enzima clonada en Levadura (Gist. B) 2- PRODUCCION En sustrato solido o en medio liquido, segn el tipo de organismos

Otra aplicacin importante de las proteasas acidas es en la sintesis del aspartame. Se emplea la termolisina obtenida de Bacillus Thermoproteoliticus. La sintesis se hace en medios no acuosos empleando : 50 o C L-Asp + L- Phe Aspartame Acetato de etilo

REGULACION DE LA EXPRESION Y PRODUCCION DE UNA LIPASA BACTERIANA

Lipases and Esterases Lipases and Esterases hydrolyze fats and oils. Most of the enzymes listed below are designed for use in food systems such as enzyme modified cheese. They are not designed for use in large scale commercial processes. ENZECO ESTERASE / LIPASE Derived from Mucor miehei, primarily esterase activity. Hydrolyzes triglycerides and produces high levels of short chain fatty acids without excessive production of the longer chain fatty acids. ENZECO MICROBIAL LIPASE 50,000 Derived from A. niger. Random cleaving of the 1,3 positions on fats and oils. Commonly used for enzyme modified cheese when a kosher non animal derived lipase is required. ENZECO MICROBIAL LIPASE CONCENTRATE Derived from A. niger. It is a high activity material. The enzyme will hydrolyze fats and oils most commonly at the 1,3 position. It is a powder preparation that is most commonly used as the source of lipase for dietary supplements when a non animal derived lipase is desired. ENZECO MICROBIAL LIPASE RO Derived from Rhizopus oryzae. This enzyme produces high amounts of short chain fatty acids but does not produce as many long chain fatty acids as the A. niger or pancreatic lipase. Very good for enzyme modified cream. ENZECO LIPASE XX From Candida rugosa. An aggressive lipase that can hydrolyze 90%+ triglycerides to fatty acids. Most effective if temperatures do not exceed 35 degrees C. This preparation is commonly used in non food systems. ENZECO LIPASE CONCENTRATE From Candida cylindracea. An aggressive lipase that can hydrolyze 90%+ triglycerides to fatty acids. Most effective if temperatures do not exceed 35 degrees C.