Comparative proteomics of E.

Coli; O157:H7 : two dimensional gel electrophoresis Vs two dimensional liquid chromatography [1]
E. Coli O157:H7 Es una cepa enterohemorragica de la bacteria E.Coli y una causa de intoxicacin alimentaria.
[1] Nereus W. Gunther IV, Hoan-Jen Pang, Alberto Nuez, Gaylen A. Uhlich

Agenda

1. Abstract 2. Introduccin 3. 2-D Gel Electrophoresis 4. 2-D Liquid Chromatography 5. Anlisis de matched protein. 6. Identificacion de proteinas 7. Resultados Conclusiones

1. Abstract

Las tcnicas para separacin de protenas por estos mtodos ( 2-D GE, 2-D LC) difieren de manera significativa, actualmente no es claro hasta que punto difieren los sets de protenas identificados por estos mtodos Se compara el proteoma de E. Coli O157:H7 contra una variante de ocurrencia natural usando ambos mtodos ( 2-D GE, 2-D LC). Una mitad de la muestra fue analizada con 2-D GE y la otra parte con 2-D LC

Abstract

Protenas diferencialmente reguladas fueron observadas en cada uno de los sistemas e identificados por anlisis MALD/I-TOF/TOF . Numero diferente de Matched Protein Pairs durante pruebas comparativas entre mtodos Una falta de redundancia significativa entre los conjuntos de protenas identificados, sugiere que estos mtodos son complementarios y no estrictamente corroborativos.

2. Introduccin

Inicialmente es necesario, Separar, visualizar, y medir las cantidades relativas de varias protenas individuales. 2-D GE : Separa protenas individuales basndose en el punto isoelectrico y la masa de las protenas 2-D LC : Hace uso del punto isoelectrico y la hidrofobicidad de protenas individuales para hacer la separacin

Introduccin

En este estudio ambas tcnicas fueron utilizadas para comparar el perfil de protena de E. Coli O157:H7 cepa 43895 contra el perfil de su fase variante de ocurrencia natural 43895OR. Una comparacin de los perfiles de protenas proporciona las funciones individuales de protenas y las posibles vas fisiolgicas para ser examinadas en experimentos posteriores. Biological Replicates, falta de consistencia de datos.

Cepa Variante 8395OR

Se conoce que tiene punto de mutacin en la regin de promotores del gen csgD. Caracterizada con las siguientes diferencias fenotpicas :

Colony Appereance, rojo,seca y spera Formacin de biopeliculas fuertes Aumento de la invasin de clulas HEP-2 Aumento de virulencia en raton modelo.

3. 2-D Gel Electrophoresys

Las cepas bacterianas fueron cultivadas y mantenidas en placas de levadura con extractos de casamino acidos (YESCA) La concentracin total de protenas presentes en las preparaciones resultantes fue medida por medio de BCA Protein Assay. Personal Densitometer (scanea los Coomassie stained gel resultantes), Imgenes Digitales usadas para alinear y comparar las intensidades de puntos de protena entre los geles de la cepa 43895 y 43895OR Z32-D Gel ImageAnalysis, crea un Master Gel Alignment para cada cepa a partir de geles replicados.

4. 2-D Liquid Chromatography

Cromatografa lquida (LC), es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un lquido. puede ser llevada a cabo en una columna o un plano. 1D, columna de cromatoenfoque que genera un gradiente de pH 8,5 a 4, permitiendo separacin por punto isoelectrico. Monitorizado por absorvencia UV a 280nm 2D, Columna C18 de fase inversa no porosa, utilizando un gradiente de acetonitrilo agua a un caudal de 0,75 ml / min durante 45 min y monitoreado por absorbancia UV a 214 nm,separacin por hidrofobicidad.

5. Anlisis de Matched Proteins

Cada Matched Protein, Protein Expression Ratio :
P.E.R=log (Protein X [43895 ]/ Protein X [43895OR ])

Protein x [43895], Protein x [43895OR] : Concentracin de pxel para un punto de protena de la cepa respectiva. Se obtiene la media de todos los log[ratios], y se determina la desviacin estndar. Protenas expresadas diferencialmente , aquellos Spot Protein que se encuentran fuera de la desviacin estndar, son extradas del gel y almacenados a -20 grados centgrados

6. Identificacin de las Proteinas

MALDI/I-TOF, (Matrix-assited

Laser Desorption Ionization with Automated Time Of Flight ) identificar

los Differentially Expressed Protein Spots.

4700 Proteomics Analyzer mass spectrometer (Applied Biosystems, MA)

http://www.speciation.net/Database/Instruments/Applied-Biosystems/4700-Proteomics-Analyzer-;i589

Principio de MALDI-TOF
Linear Time Of Flight tube
ion source

detector

-Macromolcula implantada en una matriz. (evita ser destruida y facilita ionizacin). -Ioniza molculas mediante lser pulsado -Separacin segn m/z en el analizador de masas.

time of flight

Reflector Time Of Flight tube

ion source

detector reflector

-Finalmente el detector registra las seales de todos los iones.

time of flight

Reported protein(s) from database searches from putative peptide sequences were within a 95% confidence interval.

7. Resultados

Preps #1

43895

43895OR

Replica Biolgica, Preps #2. -101 matched protein. -13 P.S Upregulated (43895->43895OR) -10 P.S Upregulated (43895OR->43895)

First half, 2-D GE 224 Spots, 43895 225 spots, 43895OR 98 matching spots 126 spots, 43895 127 spots, 43895OR

Differentially Regulated - 7 P.S. Upregulated (43895->43895OR) -11 P.s. Upregulated (43895OR->43895)

Log ([ratios]) Media , Standard deviation

Preps #1

43895

43895OR

Replica Biolgica, Preps #2. -205 matched peaks. -19 P.P Upregulated (43895->43895OR) -22 P.S Upregulated (43895OR->43895)

Second half, 2-D LC 321 Matched Protein Peaks

-Log (ratios) -Absorbance Units [UA] -Mean -Standard Deviation

Differentially Regulated - 27 P.P. Upregulated (43895->43895OR) -30 P.P. Upregulated (43895OR->43895)

Resultados

Graphical analysis of protein expression levels as determined by 2-D GE. [1]

Resultados

Graphical analysis of protein expression levels as determined by 2-D LC.

Identities of Differentially Regulated Proteins After Separation by 2-D GE [1]

Identities of Differentially Regulated Proteins After Separation by 2-D LC [1]

Identificacion con 2D GE
Prep #1.

6 protenas fueron identificadas de 7 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 43895 comparado con 43895OR. 8 protenas fueron identificadas de 11 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 43895OR comparado con 43895.

Prep #2.

9 protenas fueron identificadas de 13 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 4385 comparado con 43895OR. 8 protenas fueron identificadas de 10 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 43895OR comparado con 43895. Dos protenas reguladas diferencialmente en ambas preparaciones (#1 y #2)

30S ribosomal Protein 56 Clp peptidase, chain A

Identificacion con 2D LC
Prep #1.

9 protenas fueron identificadas de 27 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 43895 comparado con 43895OR. Sin embargo, ninguna protena fue identificadas de 30 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 43895OR comparado con 43895.

Prep #2.

5 protenas fueron identificadas de 19 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 4385 comparado con 43895OR. 2 protenas fueron identificadas de 22 que se tomaron como sobrereguladas de la cepa 43895OR comparado con 43895. Una nica protena reguladas diferencialmente en ambas preparaciones (#1 y #2):

Hypothetical Protein Ecs5028

Identificacin de Protenas

Overview of the differentially regulated proteins identified [1]

Conclusiones

Las diferencias en las tcnicas de separacin empleadas por los diferentes mtodos hacen poco probable que exista un considerable overlap en las protenas identificadas. Tanto 2-D LC y 2-D GE carecen reproducibilidad en replicas biolgicas de

2-D LC es mas sensible que la 2-D GE commassie blue stained Gel, y presenta mayor facilidad en el alineamiento de protenas entre separaciones comparativas, evidenciando un mayor numero de matched protein.

Fue posible mediante MALDI/I TOF identificar mayor numero de protenas separadas usando 2-D GE, principalmente fue el resultado de que la sensibilidad de la deteccin no se translado a suficiente material para la identificacin basada en MALDI 2-D GE y 2-D LC son mtodos que se sugieren de uso complementarios y no uno en remplazo del otro.