Gen mol - Tema 1 - Introducción a la genética

molecular
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Introducción. El método genético para la

caracterización de la función génica
¿Para qué le sirve la Genética a un Biólogo en 2022? Los biólogos genetistas estudian el
.

material hereditario, pero hoy todas las áreas de la Biología lo estudian de una u otra forma →
La diferencia es el método. El método genético es utilizado para la caracterización de la
función génica. Por ejemplo, podemos tener una gran variedad de fenotipos de calabazas, pero
que nos interese uno para una producción agrícola. Aplicando este método y diferentes
métodos de estudio podremos averiguar que genes y alelos son los responsables del fenotipo
observado y tras selección artificial u otras técnicas podremos obtener calabazas con dicho
fenotipo.

Desde Mendel, en Genética estudiamos los procesos biológicos explotando LA VARIACIÓN. →

Todo esto se descubrió con el gen homeótico antenapedia

El esquema racional utilizado por los investigadores que, desde 1900, han desarrollado el
análisis genético ha llegado a ser la base de la aproximación intelectual favorita de aquellos
biólogos que estudian el funcionamiento de los seres vivos, no de las enzimas o de los
ecosistemas, de los seres vivos Pero ¿cuál es la lógica, el método racional, que subyace al
análisis genético formal? La primera ley de Mendel es un buen ejemplo de aplicación de esta
lógica → El monohíbrido.
Hoy, SXXI, mejor que visualizar la primera Ley de Mendel como una demostración de la
naturaleza diploide de los guisantes y particulada de la herencia, debemos centrarnos en una
consecuencia de gran alcance: Los experimentos de Mendel son un ejemplo perfecto de
simplificación conceptual del sistema en estudio (a la manera de la física), para poder estudiarlo
de forma científica. El análisis de variantes para un carácter y del modo en que se heredan nos
permite detectar la existencia de genes controlando caracteres y estudiar estos hasta en sus más
finos detalles.
.

Los experimentos de Mendel hoy en día

. Existe un gen (3/4:1/4) con un papel fundamental en el control del color de la semilla de
guisante.
. Con este esquema, en otros materiales podríamos detectar otros genes de efecto
parecido
. La relación entre este gen y esos otros podría investigarse mediante experimentos como
el de la figura
. En este material vemos dos formas moleculares del gen, dominante y recesiva (?)
. Otras técnicas de análisis genético (violación de la segunda ley de Mendel) nos
permitirían investigar la posición relativa de este gen respecto de otros genes del genoma
→ Fenómeno de ligamiento
. ¿Podríamos investigar la función de otros genes del genoma (ejem: proteína nuclear X) en
la coloración de la semilla? Es decir, podemos averiguar la función de un gen
cualquiera y viendo el fenotipo resultante.

Generación de mutantes
Necesidad de la variación
Desde Mendel, la influencia de los genes en los caracteres y procesos biológicos se estudia a
través del análisis de la variación. Un análisis cuidadoso de una colección de variantes para un
carácter permitirá determinar el número de genes implicados en ese carácter, sus relaciones y su
naturaleza molecular.

Utilizar la Genética Molecular como herramienta de estudio requiere dominar la lógica del
Análisis Genético y saber Biología Molecular.

Pero todo empieza, o termina, en la variación. Las mutaciones aparecen espontáneamente con
una frecuencia muy baja, lo cual lleva a los genetistas a acelerar el proceso de obtención de
mutantes mediante el uso de mutágenos. Según su modo de acción, se han utilizado hasta
tres tipos de mutágenos. Cuando tú tratas a un individuo con un mutágeno, no muta una sola
base, sino que varias (depende de la dosis). Ocurre también al azar. La mutagénesis no genera
mutaciones únicas en el genoma, depende de la dosis (más mutágeno, más mutaciones) → Si
no tienes el control del mutágeno, será algo difícil de utilizar.

Al final, lo que necesitas en genética es la variación la cual esta no es muy grande .A veces hay
que producir nueva variación, por ejemplo en el laboratorio mediante mutágenos.
 Tipos de mutágenos
Básicamente encontramos tres tipos:

Los mutágenos químicos: son los más utilizados, provocan cambios puntuales en la
secuencia. Cuando son usados no sabes que bases mutan ni cuantas bases van a mutar.
Alteran la secuencia de DNA de manera puntual. Cambian una base por otra pudiendo causar
que ese gen deje de funcionar. En la imagen vemos un par GC , que tras una división , la G
pasa a ser G* (pudiendo estar metilada, o otra cosa.)Esto no va a poder subsistir, o es
corregido o la celula se muere. Si ocurre otro sitio de replicación, ambas moléculas se
.

replican, y acabas teniendo AT. Si comparo GC a AT, vemos que ha ocurrido una transición.
Cabe destacar que cuando tu tratas un individuo con un mutágeno químico no se muta una
fase y además no sabes que se va a mutar. Todo depende de la dosis de mutante. Se
generaran varias mutaciones en sitios aleatorios. No se generan mutaciones limpias.

Los mutágenos físicos también pueden provocar cambios puntuales pero su <valor añadido=
respecto a los químicos es la posibilidad de provocar cambios de mayor alcance: deleciones y
reordenaciones cromosómicas. No necesariamente de mayor utilidad en nuestro caso
(Excepto en prácticas). Pueden provocar cambios grandes pudiendo eliminar un brazo
cromosómico. Si yo cojo un mutante basado en que he perdido el brazo corto del cromosoma
3 , no puedo explicar el por qué. Esto no es útil porque en el brazo corto del cromosoma 3
hay miles de genes, siendo una cosa muy burda para hacer genetica. Sin embargo la luz UV,
es mas floja. Cuando hay dos timinas , la luz UV, genera un dimero,la cual se lee mal
generando tras la replicación una secuencia alterada.

Los elementos de inserción basan su capacidad mutagénica en la disrupción causada por su

integración en el gen. En algunas aplicaciones es interesante el hecho de que el elemento
 proporcione una etiqueta molecular al gen mutagenizado. En el caso de los transposones, la
mutagénesis es relativamente simple debido a la actividad biológica del elemento, pero esta
actividad introduce un factor de inestabilidad. Debido a que sigue saltando el transposón
puede ir cambiando su expresión, por lo que generalmente puede no es útil. Los elementos
de inserción son trozos de DNA que se puede insertar en el genoma, y si cae en un gen
generan una mutación. Vemos en la imagen que entre el exón 2 se ha introducido, generando
un mutante. Además ese trozo de DNA puede servirse como una etiqueta ya que cuando yo
me enfrente con el organismo que he mutado, tengo etiquetado el gen que esta causando el
fenotipo.

Resumen de los mutágenos utilizados, siendo los físicos menos útiles, ya que
crean cambios muy grandes. EMS es un mutágeno químico típico; en animales
se utiliza mas ENU. Los elementos transponibles se puede utilizar en cualquier
organismo, y el T-DNA es especifico de Arabidopsis.
.

Creación y seleccción de mutante

Al final lo que a uno le gustaria es tener muchas lienas mutantes (cuantas más mejor)

Líneas mutantes: colección de mutantes donde no están mezclados los fenotipos. Con líneas
organizamos todo mejor → Cuantas más líneas mejor. Una linea mutante donde todo esta
todo mezclado, no es util porque no se sabe que fenotipo estas cogiendo.

Si yo hago un experimento de mutagénesis y acabo con por ejemplo esas 4 lineas de moscas
de Drosophila , no puedo decir que son puras ya que el mutágeno muta todo el gen. En la
botella con moscas white puede ser que una mosca y otra no sean iguales porque la mutación
la tienen en otro lado distinto.
Hay, en todo caso, una gran diferencia entre una colección de individuos tratados con un
mutágeno y una colección de mutantes.

Screening de fenotipos: tu objetivo es librarte de una colección general, te centras en uno a

diferencia de una colección general.

Un ejemplo para obtener una linea mutante puede ser :

Cogen una mosca macho a la cual la meten EMS en la comida. Utilizan macho por una
cuestión de linea germinal, pueden dar millones de espermatozoides.
Lo cruzamos con hembras silvestres. Dando lugar a moscas con mutaciones pero estas son
diferentes mutaciones porque un espermatozoide no lleva 1 mutación si no que lleva cientos
de mutaciones. Esto aun no es una linea mutante . No vas a encontrar un mutante
homocigoto. Todas estan en heterocigosis. Ahora NO cruzamos entre hijas con diferentes
mutaciones, ya que no saldrá homocigosis
Cogen machos F1 y lo cruzan con moscas obtenidas. Aun no obtendremos homocigotos si no
que hasta que no crucemos hermano x hermano no conseguiremos homocigotos.
Se obtendrá según Mendel 1/4- 1/2- 1/4. Cojo machos y hembras que tengan una mutación
igual y consigo hijos con solo esa mutación, porque son homocigotos, y son recesivos.

Problemas clásicos encontrados en los experimentos de

búsqueda de mutantes
Cuando haces la coleccion y haces el screening te encuentras con unas erie de problemas:
Vas a tener un numero enorme de lineas. Si tu solo quieres estudiar la resistencia de la
sequia del trigo tu no tienes que hacer unas lienas enormes. Si no que puedes hacer un
diseño inteligenete. Por ejemplo:
- Estan buscando agentes autótrofos de Levadura que no sean capaces de sintetizar uracilo.
Entonces mutagenizas levadura, la pones en un medio completo, haces una replica en un
medio sin uracilo y ves que no crecen aquellas que son mutantes no capaces de sintetizar
uracilos.

Si tu eres capaz de generar un screening bueno, te ahorras un gran numero de líneas

¿Cómo minimizar el número de individuos que hay que manejar? La respuesta está
condicionada por factores específicos del experimento, como si la colección será dedicada a
un problema concreto o de uso general; en cualquier caso, un diseño inteligente facilitará la
labor.
Dependiendo del proceso biológico en estudio, el número de mutaciones relacionadas con
el proceso que tienen fenotipo letal puede ser excesivo. Si no tengo material donde
estudiar el fenotipo mal trabajo voy a tener.
La utilización de mutantes condicionales → solo es mutante en ciertas condiciones. Un
mutante condicional es un mutante que solo es mutante en ciertas condiciones mientras
que en otras es silvestre.

Debemos estar preparados para manejar mutaciones con penetrancia y expresividad variables.
Puede pasar que no siempre el genotipo mutado se exprese como en la imagen, ya que solo
dos mutantes Blíster tienen las ampollas de la mutación en muchos casos condicionados por
el ambiente. En diferentes contextos, la mutación puede verse mejor o peor y además los
genes no estan solos . Otros genes pueden influenciar
 A veces, y esto es un problema, sobre todo en experimentos de Genética reversa, la alteración
de la función de algunos genes no genera ningún fenotipo observable (o no se encuentran
las condiciones adecuadas para que aparezca ese fenotipo). Un problema con la simplificación
típica del análisis mendeliano es que es excesiva en algunos aspectos. No hay solución ante
eso. Esto es peor aun en Genética Reversa.En Genetica clásica esto no afecta tanto porque si
no hay un fenotipo no empiezas el experimento mientras que en G.reversa te tiene que dar
lugar a uno, y si no te lo da, tenemos ahí el problema(problema de la sobresimplificación)

Genética clásica vs. Genética reversa

Normalmente en el laboratorio hoy en dio se generan las dos para confirmar todo que esta
bien. .

Genética clásica. Uno hace un experimento de mutagénesis ,donde a un ratoncito le

introducen ENU. He decidido previamente lo que quiero estudiar. Hago los cruzamientos para
obtener los mutantes 100%. Entonces miro el fenotipo del mutante. Al final me interesa saber
que gen esta mutado en este ratón especifico con ese fenotipo. Para encontrar ese gen tendré
que hacer la genética clásica de ligamiento.
La aproximación clásica es intelectualmente más abierta y potencialmente más poderosa
en el descubrimiento de nuevas rutas y funciones. La transformación de información
fenotípica en molecular puede ser complicada en ocasiones. El éxito de esta aproximación
depende de una estrategia de fenotipado eficaz.

Genética reversa. Primero elegimos el organismo con el que vamos a trabajar. A continuación
dependiendo del organismo deberás de utilizar técnicas sofisticadas. Luego eliges el gen y lo
mutas. Lo mutarás dependiendo del organismo y del sistema que tengas a mano. Una vez
mutado, miras el fenotipo.
En la G. reversa el investigador tiene mayor control real sobre el experimento y mayor
capacidad predictiva. El éxito del experimento se basa en la aparición de un fenotipo
 informativo

Resumen
La aproximación genética al estudio de procesos biológicos se basa en la utilización
experimental de la variación
En ausencia de variación natural utilizable, podemos crear nueva variación usando mutágenos
Una colección de líneas mutantes consta de miles de líneas en las que es posible encontrar
.

mutaciones dominantes y recesivas

Podemos buscar mutantes con fenotipo informativo y luego buscar los genes (Genética
directa), o bien buscar mutantes en nuestros genes de interés y luego analizar los fenotipos
(Genética reversa)

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Anotaciones
 Gen Mol - Tema 1 - Test
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Recursos

. En el esquema de Mendel para el análisis del color de los guisantes detectamos:

. La presencia de un gen controlando el carácter, ya que observo dos colores en F2
. La presencia dos genes controlando el carácter, ya que observo dos colores en F2
. La presencia de un gen controlando el carácter, ya que observo un solo color en F1
. La presencia de un gen controlando el carácter, ya que observo dos colores en F2 en
proporción 3/4:1/4
. En la PCR cuantitativa
. Se cuantifica la cantidad de nucleótidos consumidos
. Se cuantifica en cada ciclo el RNA producido
. Se cuantifica en cada ciclo el DNA producido
. Se cuantifican las proteínas de la muestra
. Todas las líneas trasngénicas expresan de la misma forma el transgén
. Sí, si tienen el mismo número de copias del transgén
. Sí, aunque tengan distinto número de copias del transgén
. Sí, si el transgén es el mismo
. No
. Los genetistas utilizan mutágenos:
. Para acelerar la evolución natural
. Para aumentar las variantes fenotípicas disponibles para un carácter
. Para aumentar las variantes de secuencia disponibles para un gen
. Para reproducir en el laboratorio variantes encontradas en la naturaleza
. El número de copias de un gen en el genoma se puede investigar mediante análisis:
 . De Southern blot
. De Northern blot
. De Western blot
. De PCR genómico
. En general, la producción de líneas mutantes, a partir de los individuos mutagenizados
requiere:
. Un esquema de cruzamientos controlados
. Clonar cada uno de los individuos mutagenizados
. No requiere nada porque no es necesario derivar líneas
. Cruzamientos entre los distintos individuos mutagenizados
. En la cuantificación relativa de la expresión de un gen en diferentes tejidos, mediante
RT-PCR cuantitativa
. La utilidad de los resultados es relativa
. Cuantificamos la expresión del gen en relación con otro gen, al que asignamos el valor 1
. Cuantificamos la expresión del gen a partir de una recta patrón
. Cuantificamos la expresión del gen en relación a uno de los tejidos, al que asignamos el
valor 1
. En la RT-PCR cuantitativa las variaciones en concentración y pureza del RNA se corrigen:
. Normalizando los datos respecto a una muestra
. Normalizando los datos respecto a un gen control
. Normalizando los datos respecto a la cantidad de DNA genómico
. Midiendo varias veces en el espectrofotómetro
. Una planta transgénica que acaba de producirse se comporta como:
. Homocigota para cada una de las copias del transgén
. Heterocigota para cada una de las copias del transgén
. Dominante
.

. Recesiva
. Hoy, los genetistas utilizan la variación biológica para:
. Catalogar variantes para su clasificación
. Correlacionar variantes genotípicas con variantes fenotípicas
. Estudiar las leyes de la herencia
. Eliminarla y conseguir así líneas puras
. Un experimento de Genética directa:
. No tiene ninguna utilidad si no podemos determinar el gen causal del fenotipo
. Implica examinar el gen mutagenizado para descartar mutaciones pocos interesantes
. Tiene más posibilidades de éxito si previamente seleccionamos un gen importante sobre
él que actuar
. Es un éxito si disponemos de un fenotipo altamente informativo
. En un experimento de Northern blot, en el gel cargamos:
. DNA digerido con enzimas de restricción
 . RNA digerido con enzimas de restricción
. RNA
. Proteinas
. Las secuencias que dirigen la expresión de un gen suelen estar.
.

. En el primer intrón
. En el 3´UTR
. En el 5´ UTR
. En el promotor
. En principio podemos ver fenotipos en la primero generación tras la mutagénesis
. Solo si se han producido mutación en ambas copias del gen correspondiente
. Si, en cualquier caso, basta con realizar un analisis fenotípico cuidadoso
. No, en ningún caso, hay que fijar primero las mutaciones
. Sí , si se han producido mutaciones de efecto dominante
. Los elementos de inserción tienen utilidad como mútagenos en Biología funcional
porque:
. Se pueden integrar en cualquier secuencia genómica
. Su secuencia tiene efectos fenotípicos
. Su integración en un gen puede anular su función, revelando un fenotipo
. El enunciado es falso, no se utilizan como mutágenos
. Un gen delator:
. Es un gen que denuncia a otros genes
. Es un gen fácil de introducir en el genoma
. Es un gen cuya expresión es fácil de analizar
. Es un gen cuya presencia en el genoma es fácil de analizar

Respuestas
1- 4
2- 3
3- 4
4- 2
5- 1
6- 1
7-4
8- 2
9- 2
10- 2
11- 4
12- 3
13- 4
14- 4
15- 3
16- 3

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Anotaciones
 Gen mol - Tema 2 - Técnicas básicas de DNA
recombinante
.

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Clonación
Clon vs librería
Clonación: obtener clones de un organismo procariota con trocitos de DNA del organismo en
cuestión.

En este experimento en la imagen , cogen un DNA genómico, lo hacen cachitos y lo clonan en

un plásmido el cual lo meten en bacterias. Cuando cogemos esos plásmidos con DNA metidos
al azar, y transformo las bacterias, cada bacteria recibe un plásmido diferente. Cuando dejo
replicarse esa bacteria y obtengo una montaña de células, eso ya es un clon y todas esas
bacterias tiene ese mismo plásmido.

Librería o genoteca: colección de clones que contienen todo ese genoma.

¿Cuántos clones necesito para tener el genoma humano? Millones. Necesitamos muchísimos y si
tengo vectores que puedan coger trozos más grande solemos necesitar menos clones. El
Rastreo de genotecas no se hace hoy en día.

Técnicas básicas de caracterización génica

Rastreo de librerías
.

¿Rastreo de librerías genómicas o de cDNA?: en una librería genómica es coger el genoma

cortar en trozos y meterlo en clones. Mientras que la librería de cDNA es coger el RNA de una
celula, convertirlo en DNA copia con transcriptasa reversa y clonarlo. En una librería de cDNA
voy a buscar cosas que se transcriba, es decir, secuencia de RNA mensajero mientras que en
una librería genómica voy a buscar todo.
De un ser humano ¿Cuántas librerías genómicas hay ? 1 ¿Y de cDNA? Infinitas porque una
librería de cDNA de higado, probablemente no tenga genes de cerebros. Tendra genes
compartidos y otros únicos. En la librería de higado no estresado no hay los mismos
genes que la librería de genes de un higado alcoholizado. Las librerías cDNA son más
dinámicas.

Ya no se hacen librerías gracias a la PCR. Si yo quiero encontrar un cacho de ADN genómico,

con primers consigo ese trozo. Para que querer una librería si voy a tener que mirar millones de
clones.

Para generar PCR necesito 2 primers para sacar un trozo de DNA. Los primers lo saco de la
secuencia del genoma. Si el genoma no esta secuenciado, no puedo generar cebadores.

Hibridación de ácidos nucleicos

La hibridación de ácidos nucleicos esta basada en la complementariedad de cadenas de
nucleótido. Lo que ocurre es que si yo, separo las moléculas de una doble hebra , con una
temperatura a 95º. Si yo retorno a 60ºC espontáneamente , la cosa se hibrida. tu puedes utilizar
este proceso para buscar en un sitio secuencias que se parezca a una secuencia en concreto.
Coges la secuencia que quieres utilizar como sonda y la marcas con radioactividad. La utilizas
como anzuelo para pescar secuencias complementarias a ella.
Si uno quiere hacer Southern , tienes DNA genómico el cual se corta con enzimas de restricción
ya que si no, no lo puedes meter en un gel de agarosa por su gran tamaño. Al digerirlo, lo
cargas en un gel de agarosa, consigues una serie de bandas. Eso lo transfieres a una membrana
según una técnica de transferencia por capilaridad. Ahora le pones la sonda radiactiva, lavo el
exceso de hibridación y te quedas con una cosa muy linda, donde ves una serie de bandas que
corresponde a los sitios con DNA que tiene una secuencia complementaria a mi sonda.

Técnicas básicas de caracterización génica

Conceptos básicos de DNA a proteína
En la imagen vemos un gen X. Dará lugar a un RNA que posteriormente dará un polipéptido.
Si yo comparo el RNA con el gen con las dos hebras, ¿Cuál es la misma secuencia cambiando T
y U? No lo sabes porque no sabes en que dirección va la lectura. Se sabrá cuando se sabe
donde esta el promotor. El promotor es la secuencia de DNA genómico que determina que a
partir de ahí empieza la transcripción de un gen.(en la imagen se transcribe de izq a derecha)
La secuencia 5'-3' es la misma que la secuencia 5'-3' del RNA.
La DNA polimerasa leerá la cadena 3'-5' y por tanto produce un RNA complementario a esa
molécula que será 5'-3'

En el RNA mensajero ¿podemos saber la dirección? Sí. Con la poliA y con el CAP.

La cadena de arriba seria la cadena sense (misma que el RNA ) y la de abajo es la antisense
(complementaria a la RNA)

.
 .

¿Toda la secuencia verde está entera en el RNA? No, porque hay secuencias en el genoma que
no acaban en el RNA, como el intrón; debido al splicing.
Un RNA mensajero va a ser más pequeño normalmente que el ADN genómico.

El polipéptido posee un extremo N (amino) que corresponde al 5' mientras que C (carboxilo)
corresponde al 3'

El primer aa que encontraremos será metionina (AUG) . ¿Esto será lo primero en el RNA? ¿
Donde se encuentra posicionado? Nunca será el AUG el primero. Los RNA empiezan con una
secuencia donde se pegará el ribosoma , y posteriormente se encontrará AUG.
¿Cómo se llama el RNA que esta antes del AUG? 5'UTR. (Es un exón)
¿Dónde termina la secuencia de RNA? ¿Termina en el ultimo nucleotido? Termina en un codón
de terminación donde estará el 3'UTR y posteriormente estará la coli poliA. La secuencia que va
desde AUG hasta el codón de paro se llama ORF (open reading frame ) o CDS.

Región 5' no traducida o en ingés 5' UTR (untranslated region), en el extremo 5', al
inicio de la secuencia codificadora de proteínas.
Región codificadora ² Secuencia codificante denominada Open Reading Frame
Fin de la secuencia codificadora.
Región 3' no traducida (3' UTR).

Esquema general

En procariotas encontramos la secuencia de Shine-Dalgarno.

Secuencia consenso AGGAGG.
Complementaria a una zona del 3' del ARNr 16 S (denominada «secuencia anti-
Shine-Dalgarno).
 La interacción de ambas secuencias posibilita la unión del ribosoma al 5' del ARN
mensajero, lo que facilita el reconocimiento del codón de inicio y la subsiguiente
síntesis proteica.
[1]
En procariotas, la transcripción y la traducción están acopladas.
Eucariotas encontramos la secuencia de Kozak en algunos ARNm.
Región 5'
Funciona como el sitio de iniciación de la traducción de proteínas en la mayoría de
las transcripciones de ARNm eucariota.
Se inicia la traducción en el codón AUG, contenido en dicha secuencia.
Facilita el posicionamiento para la traducción pero no implica la unión al ARNr.

. ↩

De un gen , cuando ya se la dirección en la que se transcribe, puedo predecir el mRNA que va a

quedar sin intrones.

Southern, Northern y Western blot

 Southern Blot
Un Southern Blot

Si tú por ejemplo, metes un gen de mosca al genoma del pulpo, si realizamos esta técnica, y
sale unas banditas ² La información que sacamos es que el pulpo tiene un gen parecido al
que hemos utilizado. Nos dice que el genoma que hemos utilizado contiene el gen que nos
interesa debido a que nos ha salido con la sonda que hemos utilizado
Nos indica presencia
Es necesario cortarlo, porque si no, no obtenemos información estructural y además no
correría, no entraría en el gen. Es esencial las encimas de restricción.
No nos indica el tamaño.

Definición
El análisis Southern blot es un método de laboratorio que se utiliza para estudiar el ADN.
Específicamente, el ADN purificado proveniente de una muestra biológica (como sangre o
tejido) se digiere mediante una enzima de restricción, y los fragmentos de ADN resultantes
se separan mediante corriente eléctrica para hacerlos desplazar a través de un gel o matriz
similar a un tamiz, que permite que los fragmentos más pequeños se desplacen más rápido
que los fragmentos más grandes. Los fragmentos de ADN se transfieren fuera del gel o de
la matriz a una membrana sólida, que luego se expone a una sonda de ADN marcada con
.

una sustancia radioactiva, fluorescente o química. La marcación permite que los fragmentos
de ADN que contienen secuencias complementarias a la secuencia de ADN utilizada como
sonda sean visualizados en el Southern blot. El método recibió su nombre debido a su
creador, el biólogo molecular británico Edwin Southern.
 Northern Blot
Un Nothern Blot:

Ponemos RNA, de un tejido específico y lo hibrido con una sonda. No se corta el RNA con
enzimas de restricción porque no existen, pero tampoco nos hace falta porque lo que
queremos obtener de esta técnica es el tamaño del transcrito, no del gen. Se transfiere, lo
hibrido con la sonda y lo que obtenemos es el tamaño del transcrito.
No tiene que ver con las bandas de Southern.
Nos informa el tamaño del RNA mensajero maduro completo. Es una información que
muchas veces no sabes
Otra cosa en la que es útil es en el patrón de expresión. Si ponemos un RNA, si es el total, si
hubiésemos hecho un Northern más complejo con tentáculo, ojo, cerebroide, quizás nos
podemos encontrar que en el tentáculo se expresa de una forma, en el cerebro apenas veo
nada, pero en el ojo puedo encontrar. Nos dice que el gen se expresa moderadamente en el
tentáculo, prácticamente en el SN y mucho en el ojo.
Esto no se puede ver en un Southern
Se usan las mismas técnicas que en un Southern, pero con tampones diferentes, porque el
RNA es simplexo.

Definición
.

La prueba de Northern blot es un método de análisis de laboratorio que se utiliza para

estudiar el ARN. Específicamente, los fragmentos de ARN purificados provenientes de una
muestra biológica (como sangre o tejido) se separan mediante corriente eléctrica para
hacerlos desplazar a través de un gel o matriz similar a un tamiz, que permite que los
fragmentos más pequeños se desplacen más rápido que los fragmentos más grandes. Los
fragmentos de ARN se transfieren fuera del gel o de la matriz a una membrana sólida, que
luego se expone a una sonda de ADN marcada con una sustancia radioactiva, fluorescente o
química. La marcación permite que los fragmentos de ARN que contienen secuencias
complementarias a la secuencia de ADN utilizada como sonda sean visualizados en el
Northern blot.
 Western blot
Un Western blot

Observamos la proteína. Nos da la expresión del gen. Nos da el tamaño de la proteína y las
posibles formas alternativas de la proteína
En el gel se pone proteínas, se transfieren pero no con papel x capilaridad sino por un campo
eléctrico. Se echa anticuerpos, pero no una sonda.
Una cosa adicional , puedes ver la localización de la proteína. Dependiendo del extracto de
tejido que pongas, puedes ver la proteína o no

Definición
Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica
en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para
separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la
superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la
proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o
químico. Un Western Blot se utiliza a veces para diagnosticar enfermedades.

Ejemplo de empleo de las técnicas Blot

.

Vamos a ver un articulo escrito por el profe chulo . El se encuentra con un gen que se
expresaba en ciertas zonas del grano de maíz ,llamado BETL-1. Lo primero que hacen es un
Southern Blot.

Ponen DNA de diferentes variedades de maíz y de un ancestro . Vemos que el

gen esta en el genoma del maíz pero que en diferentes variedades tienen
diferentes estructuras. Puede ser que el gen esta en diferentes números de
copias. Donde en la variedad en la que estaban trabajando hay 3 copias.
Además existe ya en el ancestro del maíz pero solo tiene 1 copia.

¿Qué significa que un gen tiene 2 copias respecto a decir que un gen tiene 2 alelos? No es lo
mismo y las consecuencias son muy distintas. Dos alelos significa que en el 1 tengo la copia A ,
mientras que en 1' tengo la copia a. Son alelos porque ocupan el mismo sitio en el genoma.
Según la primera ley de Mendel, los alelos se segregan alternativamente. No podemos tener un
gameto con dos alelos de un gen.
Mientras que tener 2 copias de un gen significa que el genoma contiene diferentes copias del
gen en el mismo cromosoma o no. Pueden o no controlar el mismo carácter pero no segregan
alternativamente
Esto es muy importante, porque si estoy buscando un mutante, en una situación que tengo un
gen con 2 alelos; mutar ese gen es mutar un gen, pero si tengo 3 copias necesito 3 mutantes.

Western Blot, con RNA muy pequeño. Han puesto RNA de embrión, de hoja, de
raíz y vemos que no hay expresión, por tanto ese gen no se expresa en la parte
vegetativa; pero si ponemos RNA de granos de diferentes días después de
polinizarlo, vemos que se expresa pero en los granos 9-20 días después de
polinizarlo. NO me dice que dice eso el gen, pero me dice que es importante en
el periodo entre los 9-20 días

.
 Pinchamos a un conejo para obtener al anticuerpo con el que realizar el
Western. Ponemos un extracto total de proteínas de maíz, vemos que abajo de
la imagen la proteína que reacciona con el anticuerpo → nos dice que se
expresa en el mismo sitio de RNA y que hay 2 formas alternativas de la proteína
(el resto son falsos positivos.

Western se utiliza para ver la expresión del gen. No se hace por Northern porque es más
complicado hacerlo. El Northern se ha sustituido por una técnica diferente llamado RT-PCR:
Transcripción reversa de PCR. Coger RNA, pasar a DNA y hacer una PCR.

RT-PCR
RT-PCR: Transcripción reversa de PCR. La idea es coger el RNA de un tejido y convertirlo en
cDNA para hacer PCR.

Ventajas:
Puede ser una alternativa al Northern blot, para analizar la expresión de un gen.
Se necesita muy poco RNA. No vale si está degradado.
Es posible analizar la expresión de genes muy relacionados
Desventajas:
Calidad del RNA no lo notas. Pero es verdad que puedes verlo con el nivel de expresión
Es difícil realizarla de forma cuantitativa . Cuantitativo: es que hay una relación numérica
.

medible entre un parámetro y otro. Si en una PCR da igual que ponga 1 nanogramo o 10
nanogramos, y el resultado es el mismo, no sirve.
Es difícil evitar la contaminación con productos derivados de ADN genómico. Cuando
hago la PCR asumo que esta ocurriendo sobre el cDNA que he hecho del RNA; pero si
hay DNA genómico ahí, también va a salir en la PCR. Entonces, por mucho que pongas
DNAasas, siempre va a haber DNA genómico. Si tu estas mirando un gen raro, nunca vas
a estar seguro que lo que aparece sea del DNA o del cDNA a no ser, que hagas un diseño
inteligente de los oligos.
Tenemos que hacer oligos que funcionen en RNA pero no en DNA. Diseñar de tal
forma que no haya intrones. Si yo tengo un gen que tienen 2 exones y un intrón en
medio y diseño oligos con los exones, teniendo en cuenta que el RNA que sale es la
 unión de los dos exones; en el RNA nos saldrá un producto de PCR que es más
pequeño que nos saldría con el ADN genómico.
Una forma mucho mejor, es coger un oligo de la mitad de los exones. No
funcionando así en el DNA

RT-PCR
Qué es
La RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) es una variación de la PCR
que sirve para amplificar RNA. En la RT-PCR se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN
copia (ADNc), que es un ADN retrotranscrito, usando una enzima llamada transcriptasa
inversa (enzima polimerasa capaz de sintetizar ADN a partir de moldes ARN, lleva asociada
la actividad ARNasa H.) y el resultado se amplifica mediante una PCR tradicional. Esto se
hace así porque la PCR no trabaja sobre moldes ARN sino ADN.

Amplificación de secuencias de ARN

La obtención del cDNA se hace en dos pasos:

. Se sintetiza la primera hebra a partir de un cebador. Además de actividad

retrotranscriptasa, la enzima tienen actividad RNAasa H, que degrada la cadena
molde. Entonces tenemos una única cadena complementaria a la cadena de DNA.
. Hacemos una PCR típica con dos cebadores. Uno es el mismo que hemos usado antes
(hibrida con 5’) y el otro hibridará con 3’ y a partir de él se sintetizará una cadena
complementaria. Sigue la PCR normal, y obtenemos una gran cantidad de moléculas de
DNA que serán complementarias al RNA inicial.

Esta polimerasa sintetiza DNA usando como molde RNA. Para la síntesis se necesita dNTP,
un cebador y un molde. Los distintos cebadores utilizados en la reacción de
retrotranscripción son:

. Oligo (dT): capaz de unirse a la cola poli(A) de la mayoría de los ARNm de eucariotas.
Está compuesto únicamente con nucleótidos de timina que hibridan con el
extremo 3’.
. Mezcla de oligómeros (hexámeros). Tienen 6 bases con una secuencia al azar, así que
por probabilidad, alguno de ellos puede hibridar con el RNA y a partir de él la
polimerasa sintetiza el DNA.
. Cebador específico: capaz de unirse a un ARNm particular.

Esquema general
 En el Northern blot veo la expresión del gen en las semillas y cuando hago RT-
PCR de RNA de semillas también lo veo. En el Northern cuando cojo DNA de
hojas o de raíces, no hay absolutamente nada. Nos gusta porque si no vemos
nada, ese gen no se expresa ahí. El problema es la muestra rodeada de rojo. Esa
muestra es embrión y en Northern dice que no se expresa mientras que en la
RT-PCR si que se expresa ¿Por qué? Mas que nada porque cuando coges una
.

muestra de semilla, al sacar los embriones es difícil no contaminarlo. Esa banda

que sale, es falso. Es el resultado de alguna molécula que he contaminado al
coger los embriones. Al ser tan sensible la RT-PCR acabas viendo expresión
donde no debería de verlo.

Si fuese cuantitativo, eso no seria ningún problema porque si yo veo expresión 1000 y en otro
lado expresión 0,1, interpretamos que el 0,1 es no expresión.

Entonces, ¿Cómo convierto una técnica no cuantitativa en cuantitativa?

RT-PCR cuantitativa o en tiempo real

Tras la RT cuantificamos la cantidad de amplicón acumulada tras cada ciclo de PCR. Lo que
hacen es diseñar unos fluorimetros (aparato que tu enfocas con una luz con una det longitud de
onda y vez la luz reflejada/emitida con una longitud de onda determinada) los cuales miden que
hay en cada tubito tras cada ciclo de PCR. Vamos a tener que teñir el DNA.

Métodos:
Tinción : poner en el tubito, algo que tiña el DNA. El bromuro de etidio, es un agente
intercalante que dentro del DNA da fluorescencia. El problema es que envenena la
reacción y no funciona la polimerasa. Entonces, típicamente se utiliza el SYB-green.
Mediremos cuanta luz verde hay en cada tubito.
Sondas : son unos DNAs que se anillar en el producto que pretendemos amplificar, con
fluorofomo y un quencher . A lo largo de los ciclos de la PCR, la polimerasa según va
copiando , al llegar a la sonda, la rompe y la degrada. Al separar el fluorofomo y quencher
, empieza a dar fluorescencia. Cuanto más DNA hay en el tubo, más sonda se degrada,
mas fluorescencia tengo. Es más especifico ya que dependo de 2 oligos y una sonda.
La cuantificación puede ser absoluta o relativa. La absoluta exige hacer una curva patrón. Con la
relativa , relativizamos unas muestras a otras.

PCR CUANTITATIVA
Qué es
La PCR cuantitativa (o en tiempo real) es una variante de la PCR que permite cuantificar,
además de detectar y amplificar secuencias de ADN. Así se puede saber el número de
copias de un fragmento. Para poder cuantificarlo, se va a tener que añadir algo a la
reacción que mida cuanto ADN hay, normalmente son compuestos fluorescentes. Con una
PCR normal se cuantifica al final cuando ya ha acabado la PCR y se pone en un gel.

Sin embargo, en ésta se va a ir midiendo cuando acaba cada ciclo continuamente. En la PCR
normal no se sabe la cantidad exacta. Se puede saber si hay mucho, poco o nada. En
cambio, en la PCR cuantitativa se sabe exactamente la cantidad, en números. Por tanto, esta
técnica es mucho más sensible, y se puede utilizar para tratar enfermedades, ver la cantidad
de bacterias es una infección, si un paciente responde o no a la quimio, etc.

PCR tradicional PCR en tiempo real

Mide la cantidad de producto
Mide el producto amplificado en cada ciclo
.

amplificado al final de la PCR

Medida cuantitativa porque los datos se recogen
Medida cualitativa
durante la fase exponencial de la PCR
Baja sensibilidad Alta sensibilidad

FASES de la PCR
. Exponencial: el doble de producto se acumula en cada ciclo. La reacción es muy
específica y precisa. Todos los componentes están frescos y disponibles.
. Linear: algunos componentes empiezan a gastarse y ya no se duplica el producto en
cada ciclo. Fase altamente variable.
. Plateau: La reacción se ha parado, ya no se produce más producto. Cada tubo o
reacción alcanzará el plateau en puntos distintos.
 VALORES UTILIZADOS para la CUANTIFICACIÓN
Dentro de la fase exponencial el equipo de PCR en tiempo real calcula 2 valores:
La línea Threshold: nivel en el que se detecta la flourescencia mínima de una
reacción de PCR.
El valor Ct (Cycle Threshold): ciclo de la PCR en el que la muestra alcanza el nivel
Threshold.
.

El valor Ct se utiliza para la cuantificación o detección presencia/ausencia. La comparación

de valores Ct de muestras de concentración desconocida con una serie de estándares
permite la estimación precisa de la cantidad de ADN en la reacción.

MÉTODOS de DETECCIÓN

SYBR-green I: tinte fluorescente que se une al ADN de doble cadena recién sintetizado.
Solo emite fluorescencia cuando es atrapado por una molécula de ADN duplexo.
Sondas TaqMan: oligonucleotidos homólogos a parte de la region que se quiere
amplificar, marcados con dos fluorocromos en los extremos. A partir del cebador, la
ADN polimerasa se desplaza sobre la cadena molde sintetizando la complementaria
hasta la región donde ha hibridado la sonda . Con la actividad exo-5’-3’, hidroliza el
extremo 5’ de la sonda, liberándose el fluorocromo. El fluorocromo receptor
(quencher) no puede absorber la fluorescencia por estar alejado del fluorocromo
emisor (reporter) espacialmente. El fluorocromo de la region 5’ emite fluorescencia y el
 de la 3’ absorbe fluorescencia del 5’ cuando estén cerca. Cuando Ia Taq polimerasa llega
y se encuentra con esta sonda, como es exonucleasa, puede eliminar los nucleotidos de
esa sonda, primero el del fluorocromo de 5’ que se sueltan de la cadena y se aleja del
fluorocromo de 3’. Cuando el del 5’ se Iibera comienza a emitir sin ser absorbida, y
entonces Ia podemos captar con el aparato. Ya no le estorba el de 3’, y podemos captar
todo lo que se emite sin que el de 3’ nos lo quite, y ya sabemos que esa cadena se esté
amplificando.

MÉTODOS de CUANTIFICACIÓN de la expresión

Cuantificación absoluta
La cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida con el número de copias o cantidad
de un gen utilizando una curva de calibración. Hay que estar seguro de que la
concentración de la serie de diluciones está en el rango de la concentración del gen cuyo
número de copias se quiere estimar.

Cuantificación relativa
La cuantificación relativa compara los valores Ct de una muestra de interés con el
obtenido con una muestra de referencia utilizada como calibrador. Previamente, los errores
de muestreo o pipeteo se corrigen comparando el valor Ct de la muestra con el de un gen
endógeno (housekeeping).

. Normalizar los errores de pipeteo comparando la amplificación del gen de interés con la
amplificación del gen endógeno en cada una de las muestras:

. Una vez corregido los errores, se puede comparar la amplificación del gen que codifica
el marcador tumoral en las dos muestras:

. Aplicar la fórmula: 2-ΔΔCt

³ valor Ct = ³ ciclos para ver fluorescencia = ± expresión de un gen (en un tejido).

Aplicaciones de la PCR cuantitativa

La PCR en tiempo real tiene muchas aplicaciones en investigación científica y como
herramienta de diagnóstico:

El análisis de los cambios en la expresión génica de células a través de la

cuantificación de su ARNm permite asociar los cambios a estados fisiológicos celulares,
presencia de fármacos, agentes infecciosos , etc…
En investigación forense y bioseguridad para la identificación con una alta
sensibilidad y especificidad de organismos patógenos o saprófitos difundidos en el
[1]
medio ambiente. Ej: sondas Taqman en el Sars-Cov-2
En el campo de la seguridad alimentaria para la identificación de organismos
genéticamente modificados en alimentos o aditivos alimentarios

ᛟ
 ᛟ
Próximo tema: MBM - Tema 6 - Marcadores moleculares

# Métodos en Biología Molecular #

. Ejemplo: PCR para el Sars-Cov-2

Problemas y ejemplo de empleo de la RT-PCR cuantitativa

Han cogido una serie de muestras de hojas de Arabidopsis en las que analizan
el efecto de una mutación en ese gen INV2. Sacan RNA de esa hojas y hacen
RT-PCR con unos oligos de ese gen.

Hay una fase en la cual las moléculas se estan duplicando en cada ciclo de PCR y una fase en la
que ya no. ¿Por que en el ciclo 35 empieza a tumbarse y no sigue subiendo? Porque se acaba la
reacción enzimática; se va agotando.
La cosa es que tu dispones de una fase de la reacción en la que todo parece ir perfectamente y
las muestras van subiendo a la vez, asumiendo que en todos el DNA se va duplicando (tras 40

.
 .

ciclos tienes 2^40 veces DNA) Hay una relación directa en como sube cada curva y en donde ha
salido.
La curva azul y la curva amarilla se diferencian porque en una tenían mas RNA y cDNA que la
otra. Si empiezo desde 3 llegaré más tarde en subir que si empiezo desde 300.
¿En que tubo había mas RNA? En el azul .
CT es el ciclo en el que cada PCR pasa el umbral. En el amarillo seria 37 mientras que en el azul
27. Hay 10 ciclos de diferencias entre ellos. Si hay 10 ciclos de diferencia , en el momento que
pasan el CT , asumiendo que estan en la parte exponencial es 2 elevado a 10 diferencia de RNA.

Imaginemos que al echar cDNA, echamos más de uno que otro. Generamos una diferencia
biológica. ¿Cómo solucionamos esto?

Por errores de procedimiento (problema técnico) :

Primero: hacen replicas técnicas para hacer una media y tener en cuenta que no pipeteas
siempre todo correctamente.
Si el problema esta en la cantidad de cDNA, calidad de RNA...:
Normalizas los resultados con un control para que los datos salgan bien. Lo haces
cogiendo un gen ubicuo en el que no afecta el experimento, como en la actina para
normalizar los datos relativizando uno a otro.

Ahora vendría el asunto de convertirlo en números.

Con los valores ct obtenidos para el gen estudiado del mutante y el silvestre puedes obtener
una cuantificación relativa aplicando el procedimiento visto en RT-PCR Cuantificación relativa
 .

También hay que tener en cuenta las variaciones biológicas donde cada individuo ha crecido en
diferentes ambientes generando RNA de diferente calidad.

Calidad del RNA

 Al cargar el RNAtotal de un tejido obtenemos esta imagen. ¿Qué significa este
patrón? Vemos todo rRNA porque en una muestra de RNA total, el 95% será
RNA ribosomal. Si mi RNA esta bien vemos las tres bandas

El mRNA ¿Dónde está?¿Por qué no lo veo? El mRNA no lo veo porque hay muy poco, solo es
un 5% y además, no es solo uno. NO existe un solo mRNA; hay 10000 especies diferentes.

Eficiencia del ensayo de PCR

¿Cómo puedo saber que un test es eficiente? Se mira los test en diluciones. Realizamos un Ct y
observamos si las diferentes diluciones salen en coherencia a nivel de diluciones.

En la imagen podemos observar 2 curvas por dilución, ya que se realizan 2 muestras para
corregir el error. Vemos que cuanto más diluido este, más diferencias absolutas hay que relativas
y las 2 curvas están más separadas.

.
Observamos si el Ct que sale corresponde a la concentración relativa. Se realiza una gráfica
específica (concentración /Ct) Observamos una recta, y si la comparamos con una recta teórica,
vemos que la eficiencia es 0,98 /1, siendo una eficiencia muy buena porque es casi exacta.

Curvas de melting
¿Cómo sé que lo que se está amplificando es lo que yo quiero amplificar? En un gel de agarosa
queremos ver una banda y no 4 (significa que los oligos capturan algo parecido a lo que
queremos amplificar)

Las curvas de Melting: el aparato analiza la fusión de la PCR. A medida que sube la Tº, se van
fundiendo las moléculas, y cada vez vemos menos fluorescencia. La Tºde fusión es diferente a
cada amplicon. Si mi RT-PCR, ha salido bien, solo saldrá un pico, pero si no ha salido bien,
puede salir más de uno.(El pico es el punto medio donde se funden las moléculas)
 Proteinas recombinantes
El resultado de la expresión del DNA recombinante puede ser la síntesis de proteína sintéticas.
Podemos extraer el gen del cuerpo humano y sintetizar proteína en bacterias y eucariota.
.

Tengo una proteína MRPshot, que quiero meterla a una construcción en E.Coli. ¿Qué necesito
poner para que funcione y se exprese una proteína recombinante en E.Coli?

Promotor: es una secuencia que determina la transcripción de lo que va detrás de él. No vale
cualquier promotor. Se necesita un promotor que funcione en bacterias.
El promotor puede ser inducible, dependiendo de si le pones metabolito o no. Podemos
matar a la bacteria cuando queramos
La secuencia de la proteína. Solo la codificante. Desde el AUG al codón de terminación. (CDs)
Terminador. Fin de transcripción.
 Proteínas recombinantes. Posee la proteína de interés + un trozo de aminoácido que me
interesa.
Tiene que estar en fase. Por ejemplo 6His. Tenemos que empalmar bien y que sean los
tripletes que quiero. Esto lo dicta el codón de inicio.
Si tengo AUG CUU AUU y quiero meter ACC ACC no puedo meter el ACC en mitad
del AUU porque se leería AUA CCC y no AUU ACC
También podemos poner un epitopo.

Para purificar a una proteína, la transformamos en recombinante. Si tenemos una con mucha
Histidina y pasamos por una pared con mucho níquel, esta se queda pegada a las reinas para
poder purificarla.

Las proteínas recombinantes, purificadas, pueden utilizarse para confirmar una actividad
bioquímica atribuida basándose en similitud con proteínas previamente caracterizadas. Se
deberá prestar atención a la solubilidad de la proteína recombinante. Una utilidad primaria de la
producción de proteínas recombinantes es la producción de anticuerpos específicos.

Resumen
La hibridación de ácidos nucleicos y la hibridación antígeno- anticuerpo permiten obtener
información molecular básica sobre los genes (presencia en el genoma, capacidad codificante,
patrón de expresión, procesamiento post- traduccional..)

Diversas formas de PCR permiten sustituir, en muchos casos, las técnicas de hibridación de
ácidos nucleicos La cuantificación de la expresión de un gen se realiza hoy por:

Western-blot
QRT-PCR
.

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 Genética molecular À

Anotaciones
 Gen Mol - Tema 2 - Test
 Genética molecular À

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Recursos

. En la secuenciación masiva los diferentes fragmentos del material a secuenciar:

. Primero se tienen que clonar en plásmidos
. Se individualizan mediante PCR con cebadores específicos
. Primero se individualizan físicamente en micropocillos o clusters
. Se secuencian todos a la vez en una sola reacción
. Para localizar una línea mutante pública en una especie modelo:
. Debemos explorar la secuencia del genoma
. Debemos explorar la página WEB específica de la especie
. Las líneas mutantes no son públicas, hay que producirlas
. En las especies modelo no necesitamos líneas mutantes
. Una de las siguientes no se puede considerar especie modelo
. Arabidopsis thaliana
. Mus musculus
. Sacharomyces cerevisiae
. Solanum tuberosum
. Para realizar una búsqueda de proteínas homólogas utilizando BLASTx, lo mejor es utilizar:
. La secuencia del promotor de nuestro gen
. La secuencia de un intrón
. La secuencia del cDNA
. Ninguna de las anteriores, porque ninguna es de proteínas
. Los programas tipo BLAST permiten:
. Encontrar secuencias similares que inferimos homólogas
 . Encontrar secuencias homólogas que inferimos similares
. Identificar genes que tienen la misma función
. Identificar genes que no tienen la misma función
. La secuencia de aminoácidos de una proteína viene codificada:
. En los exones
. En los intrones
. En el 5 UTR
. En el promotor .

. La secuenciación Sanger:
. Utiliza dideoxi-nucleótidos para determinar la secuencia
. Utiliza luciferasa para determinar la secuencia
. Es adaptable para secuenciar millones de moléculas distintas
. Utiliza ribo-nucleótidos para determinar la secuencia
. Para estudiar el patrón de expresión de un gen determinado en una especie modelo:
. Debemos explorar la secuencia del genoma
. Debemos explorar la página WEB específica de la especie
. La única opción es estudiarlo en el laboratorio
. Necesitamos líneas mutantes para ese gen
. El motivo de secuencia más fácil de identificar en un gen es:
. La caja TATA
. El inicio de transcripción
. El inicio de traducción
. El inicio de un intrón
. Una búsqueda BLAST que identifica una identidad del 60% es más relevante si se trata
. De una comparación cDNA-base de datos genómica
. De una comparación cDNA-base de datos cDNA
. De una comparación proteína-base de datos de cDNA
. De una comparación proteína-base de datos de proteínas
. Un cDNA puede traducirse potencialmente
. En 3 marcos de lectura
. en 6 marcos de lectura
. No puede traducirse debido a los intrones
. no podemos saberlo si no hay polyA
. Para localizar posibles genes en regiones genómicas debemos buscar
. Marcos abiertos de lectura (ORF)
. Secuencias polyA
. Un promotor activo
. Una secuencia 5 UTR
. Dos especies presentan sinténia si tienen:
 . Bloques cromosómicos en los que se conserva el orden génico
. El mismo número de cromosomas
. Los mismos genes en los mismos cromosomas
. Sus genomas duplicados
. Las especies modelo son aquellas:
. Que tienen su genoma secuenciado
. Que tienen pocos cromosomas
. Que tienen un genoma pequeño
. En las que trabaja una gran proporción de científicos
. En la secuenciación masiva cada secuencia es leída mediante:
. La separación de los fragmentos terminados en los 4 dideoxi
. La fluorescencia determinada por cada uno de los 4 dideox
. La detección de la incorporación de cada nucleótido
. La medición precisa de los tamaños de los fragmentos sintetizados
. En una búsqueda utilizando BLAST el criterio fundamental para evaluar un resultado es:
. El alineamiento
. La puntuación score
. La probabilidad E
. El número de alineamientos detectados

Respuestas:

.3
.2
.4
.3
.1
.1
.1
.2
.3
.4
.2
.1
.1
.4
.3
.3

ᛟ
 ᛟ
.

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[[]]

Anotaciones
 Gen mol - Tema 3 - Proyectos genoma. Análisis y
Comparación de Genomas
 Genética molecular À

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Recursos
Gen mol - Tema 3 - apuntes.pdf
Gen Mol - Tema 3 - Presentacion.pdf

Fundamentos de la secuenciación de genomas.

.
Secuenciación masiva.
Secuenciacion Sanger
Sanger invento un método de secuenciación. Hoy en día es lo mejor si queremos secuenciar
solo una cosa.
Se trata de una reacción de replicación de DNA. Dividiendo la reacción en 4 tubitos los cuales
cada uno tendrá un dideoxi (un nucleótido que carece de hidroxilo). Tenemos:

Un tubo con dideoxi de A

Otro con el de T
Otro con el de G
Otro con el de C
Yo se que en un tubo se pararán las moléculas en A, o en C ...
Posteriormente se tiene que realizar una electroforesis en un gel de acrilamida (porque
necesitamos una enorme resolución) Cabe destacar que es el primer quien determina desde
donde secuencio. Cuando veo las bandas resultantes del gen, directamente podemos
secuenciar.
¿Por que secuencio esa cadena y no la contraria? ¿Por que ese trozo y no otro? ¿Qué es lo que
determina eso? El primer determina desde donde secuencio. Vas a poner en la reacción un
primer de secuenciación y a partir de el, voy a leer la secuenciación. En la imagen, si ponemos el
primer donde esta, leeremos la cadena roja, pero la complementaria.

¿Se lee el primer? No. No se puede leer; se lee la base siguiente al primer.
.

¿Por qué no para en la primera base que encuentra y continua? Porque tenemos los dideoxi y
varios fragmentos aparte en el tubo.

Se utiliza fluorescencia para conseguir mayor resolución y automatización de la lectura. Cada

dideoxi da un color diferente dependiendo de la base en la que se este tratando. Se pueden
leer más secuencia (hasta 1000 bases)

El resultado será un cromatograma que representa los nt en diferentes colores.

Además, por la altura de los picos podemos saber la pb de que ese sea el nt
correcto (debido a que la DNA polimerasa tiene un rango de error).

En cualquier caso, el método de Sanger produce rutinariamente 400 pb por lectura usando
radiactividad y hasta 1000 pb usando fluorescencia.

Lógicamente, solo se puede secuenciar un fragmento por reacción, y en principio por una hebra.

El esfuerzo necesario para completar los primeros proyectos genoma fue gigantesco. Para
secuenciar un genoma completo debemos ir de fragmento en fragmento, por lo que el esfuerzo
necesario para completar los primeros proyectos genoma fue gigantesco
 # Métodos en Biología Molecular #

Tema anterior: MBM - Seminario 2 - PCR

Recursos .

Articulo 1
Wooclap

Qué es la secuenciación
La secuenciación de ADN es el proceso de determinar la secuencia de nucleótidos
(As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN o ARN. La técnica más utilizada para este fin
es el método de Sanger de secuenciación, también conocido por el método dideoxi.

Método de Sanger o método dideoxi

Materiales y componentes
Fragmento de ADN que se quiere secuenciar (necesitamos más [ADN] que una PCR
normal) que actuará como molde
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
ddNTPs unidos a un fluorocromo - ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP, cada uno marcado
con pigmentos de color diferente.
1 cebador
Taq polimerasa (enzima ADN polimerasa)
 Técnicas
Esta estrategia se basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra de ADN
complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en presencia de
ADN polimerasa, los 4 deoxinucleótidos que componen la secuencia del ADN (dATP,
dGTP, dCTP y dTTP) y 4 dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP). Estos
últimos nucleótidos nucleótidos de parada están diseñados para que carezcan del grupo 3’-
OH, que permite la adición del nucleótido consecutivo, de forma que cuando uno de ellos
es incorporado por la polimerasa se interrumpe la síntesis de la nueva hebra. Esto lleva a
que se obtengan fragmentos secuenciados de diferente tamaño, según dónde se incorporen
los dideoxinucleótidos.

De este modo, y tras una simple electroforesis, se va a poder dilucidar la secuencia. De

forma resumida, el proceso sería el siguiente. En primer lugar, se llevan a cabo cuatro
reacciones distintas en tubos diferentes. Cada uno de los tubos va a contener una mezcla
que contiene la misma cadena molde (ADN de simple cadena, obtenido o no tras una
desnaturalización, o ADNc procedente de una retrotranscripción de ARN), la ADN
polimerasa, un cebador marcado radiactivamente, los cuatro nucleótidos normales (dNTP) y
uno de los cuatro dideoxinucleótidos (ddNTP). Así, el cebador, por complementariedad, se
une a la hebra molde favoreciendo su reconocimiento por la ADN polimerasa y el inicio de
la síntesis de la nueva hebra. La ADN polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que de forma
aleatoria, incorpora el ddNTP, por ejemplo el ddATP (cada uno de los tubos contiene un
ddNTP distinto) y se interrumpe la síntesis. De esta forma, en el tubo van a aparecer
fragmentos secuenciados de diferentes tamaños e interrumpidos por el ddNTP del mismo
.

tipo (en este caso ddATP). En el segundo tubo, habrá una mezcla de fragmentos
secuenciados interrumpidos por otro ddNTP (por ejemplo, ddGTP), en el tercero por otro
(ddCTP) y en el cuarto por el último (ddTTP). A continuación, el contenido de cada uno de
los tubos se corre en carreras diferentes de un gel de acrilamida. Finalmente, tras separar en
función del tamaño, y gracias al cebador marcado radiactivamente, se van a poder
contemplar diferentes bandas que van a poder ser traducidas en diferentes nucleótidos.
 .

Gracias a la incorporación de las técnicas fluorescentes, el diseño de fluoróforos, el avance

en enzimología y la introducción de la electroforesis capilar, el método de Sanger aumentó
su eficiencia, pasando a ser conocido como el método de Sanger automatizado, y marcando
el inicio de las tecnologías de secuenciación de primera generación. Esta modificación
supuso mejorar la técnica en tres aspectos principalmente. El primero de ellos, fue gracias al
uso de ddNTPs marcados con cuatro fluoróforos distintos, lo que favoreció que todo el
proceso tuviera lugar en una única reacción en un mismo tubo, y no en cuatro distintos
como en el método original. El segundo consiste en la utilización de la técnica PCR para
llevar a cabo la reacción de polimerización. Esto fue posible con el descubrimiento de
polimerasas resistentes a temperaturas más altas y que soportaran los cambios de
temperatura existentes en los ciclos de la PCR. Por último, y no por ello el menos
importante, la incorporación de la electroforesis capilar en un gel de poliacrilamida. Esta
nueva estrategia, permitió que cada fragmento que acababa de ser secuenciado, tras ser
interrumpido por un ddNTP marcado por el correspondiente fluoróforo, avanzara por el gel
a través de un tubo capilar. Cuando dicho fragmento pasaba a través de la cámara
detectora, el fluoróforo era excitado con un láser, emitiendo una fluorescencia de un color
determinado (como cada ddNTP estaba marcado por un fluoróforo distinto, cada vez que
pasaba un tipo de fragmento parado con un ddNTP distinto emitía una fluorescencia
diferente). Con ello, la determinación del color permitía asignar el nombre de la base
correspondiente y el orden de las emisiones revelaba la secuencia del ADN.
 ᛟ

# Métodos en Biología Molecular #

Secuenciacion masiva
En las técnicas de secuenciación masiva, y a diferencia de la secuenciación por Sanger, la
reacción de polimerización no se detiene en los nucleótidos, se lee la incorporación de todos
ellos (sin electroforesis, en un tubo)

Pero, sobre todo, la diferencia es que la secuenciación se realiza sobre miles/millones de moldes
simultáneamente (¿miles de moléculas de millones de secuencias en millones de tubos?)
Poseemos millones de tubos, uno por cada trocito de DNA que quiero secuenciar. Se hace en
.

paralelo y no se utilizan dt.

Esto se consigue mediante estrategias de secuenciación en paralelo, fundamentalmente 2,

representadas por las plataformas 454 e Illumina
No hay primers específicos. Además , se hace con cualquier DNA o pueden secuenciar
amplicones de PCR.

454
Empezamos teniendo unas placas con millones de agujeros en los cuales en cada uno
meteremos una molécula . Hay un problema de sensibilidad, porque como hay solo una
molécula, la señal va a ser muy débil.
Características especiales:

. No tenemos primers específicos de lo que quiero secuenciar, por lo que no necesito una
información previa de lo que hay en mi genoma
. Se hace con cualquier DNA. Pero no solo de DNA, sino de cualquier material que se
transforma en DNA
. ¿Tiene sentido utilizar esto para secuenciar una PCR? No tiene sentido. Pero si es más de
un amplicon sí Los pasos a seguir son:
. Mediante una serie de técnicas mecánicas , se trocea el DNA en fragmentos pequeños.
. Amplificamos cada fragmento.
. Se le pegan unos adaptadores los cuales deben de ser leíbles por el mismo primer
. Esos primers deben de ser ''pescados'' por una esfera/pelota rebozada de oligos
complementarios al adaptador
. Estos fragmentos de DNA tendrán unas colas las cuales serán complementarias a las esferas.
Cada una de las esferas que añadamos se le unirá solo 1 molécula de DNA
. A cada tubo añadiremos aceite para generar una emulsión (burbujas)
 . Dentro de cada burbuja, se producirá una sola reacción de PCR y donde la molécula de DNA
con la cola irá saltando por la esfera obteniendo muchas copias de ese mismo fragmento en
esa esfera. Se forma como un ''erizo''
. Este contenido se vierte en la placa. Cada micropocillo solo tendrá una esfera con muchísimas
moléculas iguales unidas
. Se cubre y en un secuenciador se lee la placa
. Se le meten diferentes reactivos. Acoplan una reacción enzimática a la incorporación de
nucleótidos
. Cada incorporación de un nucleótido sale un 'fogonazo'. Una cámara ultrasensible te dice
si ocurre o no. ¿Cómo distingue la máquina fogonazo A o T? No lo distingue, pero sabe
que reactivo se esta metiendo.

http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc

Tras esto obtenemos una secuencia en paralelo ¿Para que nos sirve esto?

Preparación de ''librerías''(material genético troceado y listo para ser secuenciado),

secuenciación y técnica general

Ilumina
No se requiere tanta preparación como la técnica 454. Posee mayor eficacia y unas lecturas más
cortas

Video .

. Tenemos el DNA fragmentado a los cuales les añadimos colas en los extremos. Se añado todo
en el mismo soporte, ya no hay tanta manipulación manual. Tenemos un soporte con clusters.
En cada uno están unidas las colas, por lo que a cada uno de los clusters se unirá un único
fragmento de DNA
. Colocamos todo en un porta
. Se realiza posteriormente una PCR en puente, es decir, cada una de las hebras funcionará
como molde mejorando la eficacia de la reacción
. En cada uno de los clusters tendremos millones de fragmentos que se han obtenido a mayor
velocidad
. Al igual que antes por cada vez que se une un nt se emite fluorescencia y con el
cromatograma realizamos la secuenciación

Profundidad de secuencia
La secuenciación masiva produce una inmensa cantidad de datos: de transcriptomas, de exomas
o de genomas. ¿Impacto en Biología?

Puedes secuenciar transcriptomas

Hacer un mapa genético más fácilmente
En el caso del ensamblaje <de novo= de genomas complejos el problema informático no es
menor, la re-secuenciación es más simple. Un genoma eucariota es muy grande y te va a costar
analizarla, y ordenarla luego en cromosomas y genes. El problema informático es muy grave.

Profundidad de secuencia:
Mando a secuenciar un genoma a Illumina y consigo muchos cachitos. ¿Cuántos trozos
necesito? Para tener una representación entera necesito mucho más de 10,
aproximadamente 100 o más. Estos trozos sé van a poner al azar y corres el riesgo de que
haya una zona que no ha sido secuenciado. Este hueco es más improbables cuantos más
trozos haya. Esto es la profundidad de secuencia, es decir, la densidad de cada base en
la que se intenta leer.
Tener muchos trozos tiene una ventaja y es que nos aproximamos a un escenario en
el que eso es cuantitativo.
La re-secuenciación . Es más simple porque ya sabes como es el orden. En una primera
secuenciación todo ocurre al azar.

Sea por Sanger sea por secuenciación masiva, hay dos estrategias distintas para abordar la
secuenciación de un genoma completo (a menudo acaban combinándose (caso humano).

Secuenciación <ordenada= (Chromosome walking)

Secuenciación <al azar= (shotgun)

Secuenciación ordenada
Lo que hacemos es convertir el genoma en una librería, en una colección de clones para
simplificar. Entonces, el genoma humano tiene 23 cromosomas + Y (complemento básico que
forma el genoma) Esto, lo tenemos que convertir en cientos paquetitos más pequeños (librerías
de BACs/Cosmids: librerías de vectores que acogen un montón de DNA) de tal manera que
puedo convertir el cromosoma 1 en un montón de paquetitos solapantes. Entonces estos
paquetitos , hace unos años , uno convertía cada uno de estos paquetitos, en un montón de
plásmidos y luego los secuenciabas por Sanger. Hoy en dia cada BACs de estos, los metes en un
Illumina y los secuencia.
Luego como tengo los extremos secuenciados , puedo garantizar que un BAC es solapante con
otro en una zona, encontrándose continuos etc; haciendo asi cromosome walking; andando por
el cromosoma hasta que lo completo.

Se cogen clones bacterianos con cDNA conocido. Los extremos de los BACs están secuenciados,
se sabe su ubicación en el cromosoma

Necesitas más gente para realizar este trabajo que para realizar la secuenciación azar.

Secuenciacion azar
.
Cojo el genoma que no sé cómo es, lo meto en la máquina formándose millones de trozos. Lo
meto en un ordenador y lo intento ordenar. Quiero que esos millones de trozos formen un
continuo y se ordenen.

Es muy difícil conocer en que orden van en la secuenciación al azar; en la ordenada, simplifico el
asunto y es 'más facil'.

Caracteristicas de los genomas eucarióticos

secuenciados
Comparación entre genomas
Cuando el coste de la secuenciación se ha reducido, los criterios para la selección de
organismos que <merecen ser secuenciados= se han relajado.

La lista de organismos que se secuenciaron cuando el coste era prohibitivo es un buen

indicador (humanos excluidos) de los organismos que podemos considerar <modelo=, son estos
los organismos que debemos seleccionar si queremos avanzar con rapidez en nuestros
experimentos de genética molecular

Características que hacen modelo a un organismo

Fácil de mantener en el laboratorio. Un elefante no.
Mutagenizable. Lo es cualquiera
Se pueden generar líneas homocigotos porque las mutaciones solo se ven en líneas
homocigotas.
Gran número de descendientes, corto tiempo de generación .
Transformable. Es una peculiaridad. Un buen modelo debe de ser transformable y cuanto más
fácil mejor.
Ha sido promocionado por <big guys= y atrae <young guys=. El organismo ha sido
promocionado por un Premio Nobel. No importa quien promociona si no cuanta gente acaba
trabajando con ese modelo
 Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
Un eucariota que se maneja <casi= como bacteria. Podemos utilizar placas Petri, conseguir
grandes cantidades...Plaquear cien mil organismos de levadura es muy facil
Históricamente relevante en análisis genético mediante estudios de tétradas.
El organismo puede ser manipulado en fase haploide o diploide. Es una cosa favorable
porque necesitamos derivar líneas homogicotas, pero tiene una peculiaridad y es que todas
las levaduras son hemicigotas (vemos el fenotipo directamente sin hacer cruzamientos)
Fácilmente transformable utilizando vectores intercambiables con E. coli

Vectores extra-cromosómicos construidos con elementos de plásmidos naturales.

Podemos trabajar con plásmidos fuera del genoma porque hay plásmidos naturales/
artificiales donde se ha clonado una secuencia de replicación autónoma.
Lo que tienes que hacer es transformar con un plásmido sin ARS. Metes levaduras en
ese plásmido y obtengo levaduras que crecen en el medio sin uracilo por lo tanto
esas levaduras en el genoma tienen el plásmido

Por ejemplo hay plásmidos que vas a utilizar como Shuttle vector (transbordador) . Tiene
un gen que me permite seleccionar colonias de bacterias que tienen este plásmido y un
gen que me permite seleccionar levaduras que tienen el plásmido.

El elevado nivel de recombinación cromosómica unido a la posibilidad de transformación con

plásmidos incapaces de <sobrevivir= fuera de los cromosomas han permitido el desarrollo de
métodos eficaces de sustitución génica
Se meten por recombinación homologa. SI hay un DNA en el genoma que es homologa
con una región del genoma, ese DNA puede recombinar e introducirse en el genoma.
También es sencillo construir plásmidos centroméricos y cromosomas artificiales

Organismo favorito para estudios de transducción de señales, tráfico intracelular, ciclo

celular…

Caenorhabditis elegans
C.elegans apareció en el mundo del análisis genético en 1974 de la mano de S. Brenne
Nematodo con ciclo de vida simple, fácilmente observable y bien caracterizado. Es
transparente y podemos ver todo perfectamente
Existen dos sexos pero con posibilidad de cruzamiento o autofecundación
Ser hermafrodita tiene la ventaja de: te ahorras mutante. Es como una 'autofecundación'

El desarrollo de cada línea celular es muy preciso y está perfectamente establecido. Muy
apropiado para estudios de desarrollo y diferenciación
Fácilmente transformable mediante microinyección de DNA en la línea germinal
Instrumental en el desarrollo de las bases científicas de la tecnología del RNAi, ampliamente
utilizada en genética reversa en este organismo

Drosophila melanogaster
Organismo favorito en estudios genéticos desde 1900, innumerables herramientas genéticas
disponibles
Ciclo vital rápido, prolífico
Fácil de cruzar y mantener
Incluye metamorfosis, organismo estrella en estudios de desarrollo en eucariotas (genes
KNOX entre otros)
Fácilmente transformable (integración al azar) utilizando un transposón (elemento P)
El transposón se mueve en la línea germinal. Si tú coges una mosca y le inyectas DNA de
transposón, algunas pueden acabar en el núcleo. Si en la misma mosca, inyecto un DNA
que no es el transposón , se puede introducir si lo flanqueo con extremos repetidos del
transposón para que la transposasa lo reconozca.
Desventaja: al ser un transposón activo puede ir saltando causando inestabilidad.
Esto se puede solucionar:
Quitar los extremos repetidos del transposón.

Arabidopsis thaliana
Ciclo vital corto (para una planta) y muy prolífica, las semillas son <plaqueables=
.

Genera 5000 semillas en un mes.

Posibilidad de cruzamiento y autofecundación
Transformación extremadamente simple por <floral dipping= en Agrobacterium
Puedes coger una solución con esa bacteria, meter los botones florales 1 minuto y
sacarlos. Vemos que pasaba a ser transgénico.
Impresionante colección de líneas mutantes, marcadores, ORFs…. Generados en un periodo
de tiempo relativamente corto
 Mus musculus
Mamífero de ciclo rápido y pequeño tamaño
Gran número de marcadores morfológicos (color de capa y ojos) disponibles (de su época de
mascota)
No es especialmente atractivo biotecnológicamente, tampoco su cría es especialmente fácil,
pero puedes provocar al ratón enfermedades humanas debido a su próxima conexión.
Tras un considerable esfuerzo (Premio Nobel-2007) se han desarrollado tecnologías
complejas, pero eficaces que permiten la transformación por recombinación homóloga.
Es parecido a la levadura

Otros modelos sin modelo

El chopo es un modelo de planta leñosa que crece medianamente rápida pudiendo hacer una
serie de mutantes. Se transforma, etc.
También hay hongos, algas , musgos...

Comparación entre genomas

La integración dirigida en gusanos es muy difícil al igual que en Drosophila y imposible en

plantas.
 Detención de sinténias
La sinténia es una consecuencia de la historia común de los organismos.
No solo la secuencia de los genes, también su posición cromosómica, se ha conservado (en
cierto grado) en la evolución Interesante cuando había que comparar especies secuenciadas con
otras que no lo habían sido y para detectar fenómenos citogenéticos

Conceptos
Las técnicas de secuenciación masiva han revolucionado la biología, por ejemplo, aumentando
exponencialmente el número de genomas secuenciados.
No todos los genomas secuenciados son igualmente útiles para un investigador.
Hay pocas especies modelo, porque se requiere más que un genoma secuenciado para ser
especie modelo.

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 Genética molecular À

Anotaciones

.
 Gen Mol - Tema 3 - Test
 Genética molecular À

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Recursos

ᛟ
.

. En los experimentos de transcriptómica los falsos positivos:

. No existen, gracias al análisis estadístico
. No tienen importancia, son genes de bajo nivel de expresión
. Solo se pueden detectar mediante análisis individualizados
. Se equilibran con los falsos negativos, anulándose
. En un experimento de hibridación diferencial los clones que no hibridan con ninguno de los
RNA:
. Son de alta expresión en ambas muestras
. Están sometidos a splicing diferencial
. Son de muy baja expresión en ambas muestras
. Son de otra especie
. En los experimentos de transcriptómica la normalización de los resultados:
. Permite descartar falsos resultados\
. Permite comparar entre si distintos experimentos
. Iguala la expresión de cada gen en ambas muestras
. Refiere la expresión de todos los genes a la de un gen control
. El análisis de clustering en transcriptómica:
. Ordena los genes de menor a mayor nivel de expresión
. Identifica los genes expresados diferencialmente
. Identifica grupos de genes que se expresan concertadamente
. Permite estudiar las relaciones filogenéticas en el array
. En la hibridación in situ , los cortes histológicos se someten a hibridación con:
 . Un anticuerpo
. Una sonda RNA antisense
. Una sonda RNA sense
. La proteína de interés
. Los experimentos de transcriptómica:
. Permiten determinar el orden de genes en los cromosomas
. Permiten identificar que genes sufren modificaciones post-traduccionales
. Ofrecen información valiosa en la caracterización funcional de mutantes
. Solo sirven para identificar genes específicos de una situación específica
. En los experimentos de hibridación a microarrays de dos colores:|
. Las dos muestras de RNA marcadas se utilizan sobre un solo array
. Cada muestra de RNA marcada se utiliza sobre un array
. Cada gen se marca en un color
. Los elementos del cristal van marcados en dos colores
. Un gen presenta un valor RKPM de 50 y 2000 en granos de 10 y 24 días, respectivamente, este
gen
. Se expresa 40 veces más a 10 que a 24 días\
. Se expresa 40 veces más a 24 que a 10 días
. Se expresa en ambas muestras, no sabemos en cuál más
. Se expresa al mismo nivel en ambas muestras
. Los experimentos de transcriptómica con microarrays:
. Permiten detectar genes que sufren splicing alternativo
. Permiten detectar genes que han sufrido mutaciones puntuales
. Permiten detectar genes que se expresan de forma diferencial en dos situaciones
. Todas las respuestas son correctas
. La sensibilidad en un experimento de RNAseq
. Está determinada por la tecnología de secuenciación y es invariable
. Está determinada por la tecnología de hibridación y es invariable
. Está determinada por la profundidad de secuencia y por tanto es variable
. Está determinada por el número de genes en el genoma y por tanto es variable
. Los experimentos de RNAseq
.

. Solo pueden realizarse en especies de genoma secuenciado

. Pueden realizarse en cualquier especie, aunque es más sencillo en especies de genoma
secuenciado
. Pueden realizarse en cualquier especie, disponer del genoma no tiene ninguna relevancia
. Solo tienen interés en especies cuyo genoma aún no se ha secuenciado
. Los datos de expresión génica de experimentos publicados de hibridación a microarrays o
RNAseq:
. Son públicos, se pueden utilizar en nuestra investigación
. No son públicos, solo se liberan parcialmente
 . Son públicos, pero se requieren ordenadores de gran potencia
. Son públicos, pero al no ser de nuestro experimento concreto no son de utilidad
. La sensibilidad en un experimento de microarrays:
. Está determinada por la tecnología de secuenciación y es invariable
. Está determinada por la tecnología de hibridación y es invariable
. Está determinada por la profundidad de secuencia y por tanto es variable
. Está determinada por el número de genes en el genoma y por tanto es variable
. Los experimentos de transcriptómica por RNAseq:
. Permiten detectar genes que sufren splicing alternativo
. Permiten detectar genes que han sufrido mutaciones puntuales
. Permiten detectar genes que se expresan de forma diferencial en dos situaciones
. Todas las respuestas son correctas
. En un experimento de RNAseq, las secuencias que mapean en regiones genómicas no
anotadas se corresponden con:
. DNA genómico que no se transcribe, pero contamina nuestro RNA
. DNA genómico que se transcribe, pero aún no ha sido anotado como tal\
. a y b son posibles
. ni a ni b son ciertas, se trata de secuencias de intrones anotados sin procesar
. En un experimento de hibridación diferencial los clones que hibridan con los dos RNA:
. Se expresan en ambas muestras
. Están sometidos a splicing diferencial
. Son de muy baja expresión en ambas muestras
. Son de otra especie
. Para conocer el destino subcelular de la proteína codificada por un gen tenemos que utilizar:
. Northern blot
. Hibridación in situ
. Inmunolocalización
. RT-PCR cuantitativa
. Una vez identificados genes que comparten patrón de expresión, para descubrir redes
reguladoras de la transcripción debemos comparar en ellos:
. Los intrones
. Los exones
. Las secuencias 3 UTR\
. os promotores
.

Respuestas:

.3
.3
.2
.2
.

.2
.3
.1
.2
.3
.3
.2
.1
.2
.4
.3
.1
.3
.4

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[[]]

Anotaciones
 Gen mol - Tema 4 - Análisis de la expresión .

génica a gran escala

 Genética molecular À

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Recursos
Gen Mol - Tema 4 - Presentación.pdf
4. Análisis a gran escala de la expresion génica.pdf

Genes con patrones de expresión específicos -

Genética Reversa
En la genética reversa se va a seleccionar un gen del cual obtendremos mutantes para sacar
conclusiones sobre su función. La racionalidad de la genética reversa es:

Genes específicos de tejidos o situaciones biológicas deben tener un papel relevante en el

desarrollo/función de las células en las que se expresan. Tener un catálogo de genes que se
expresan en diferentes zonas en un individuo es muy importante.
El análisis del <transcriptoma= de un mutante puede proporcionar datos esenciales sobre
su fenotipo mutante que no se ve a plena vista.

Las estrategias para el estudio de genes con patrones de expresión específicos son:

Sustracción
Hibridación diferencial/ Microarrays
Técnicas de secuenciación masiva

Sustracción
Imaginemos que tenemos dos tejidos distintos con una expresión de mRNA distinto. Queremos
encontrar aquellos mRNA que se expresen en un tejido, pero en el otro no, para así determinar
qué gen es específico en cada tejido.

Por ejemplo, tenemos el hígado y el riñón. Hay que tener en cuenta que en el hígado o en el
riñón hay miles de genes y además cada gen tiene diferente forma y cantidad de expresión.
Debemos de realizar los siguientes pasos:

. En la imagen vemos dos tejidos distintos donde en color verde demuestra un mRNA
[1]
especifico del tejido 1, en azul del tejido 2 y en rojo los mRNA comunes. .
. Ahora se construye un cDNA con un oligo T como cebador (retrotrasncriptor) y mediante
[2]
retrotranscripción se copian todos los mRNA** . Va a ser la secuencia en rosa
complementaria a la secuencia de mRNA.
. lA PELOTA ROSA SERÁ ALGO QUE NOS PERMITIRÁ PESCAR ALGO DE INTERÉS
. Se degrada el mensajero manteniendo el DNA duplexo , el cDNA. Tenemos del tejido 1 el
[3]
mRNA y cDNA del tejido 2.
[4]
. Con ese cDNA resultante , hibridamos el RNA del otro tejido.
[5]
. Aquello que no ha hibridado es específico del tejido.

Cabe destacar que no todos los cDNA encontraran su mRNA.

Hibridación diferencial
La placa que vemos en la imagen es una placa de una librería de cDNA, Landa. En esa librería
no hay clones, hay agujeros. Cada agujerito, es un fago landa que se ha merendado las
bacterias y en su genoma tiene cDNA. Entonces, tu picas un agujerito de esos, lo sacas, lo metes
en un tampón con cloroformo y ese es un clon.
Cogemos el DNA y lo ponemos en un array , es decir una matriz.

Lo que representa la imagen son dos matrices, las cuales van a ser idénticas. Es decir, el cDNA
del fago numero 1 que saca de una placa, lo va a poner en la posición A1 de las dos matrices.
Supongamos que la librería de cDNA , se ha hecho del tejido 2.
Entonces tengo un RNA del tejido 1 , y RNA del tejido 2. Estos RNA se han usado para hacer
esa librería que luego se han colocado en esos dos arrays.
Ahora hibridamos estos arrasys, con el RNA del tejido 1 y el RNA del tejido 2 marcados. Primero
hay que convertir el RNA en cDNA, metemos luego fosforo radioactivo, lo lavas y ves el
resultado.

Resumen:

. Todo empieza con una librería de cDNA obtenido del tejido 2. (derecha). Cada calva posee un
fago con el cDNA clonado. Este cDNA, se extrae y se hace un clon.
. En el array debemos de colocar cada clon en un spot de la membrana, ocupando en dos
membranas una misma posición. .

. En las membranas tenemos cDNA clonado del RNA del tejido 2. Esto se hibrida con el RNA
del tejido 1 y tejido 2 marcados con radioactividad.

El resultado que obtenemos es de:

 Color rojo en una membrana y en otra no significa que ahí hay genes específicos de la librería
usada que no están en el tejido 1.
Color verde en ambas membranas significa que ambas membranas son positivas para ese gen
y ambos tejidos expresan ese gen. Cabe destacar que hay puntos con distinta tonalidad;
marca la intensidad de la señal. Habrá más en un sitio más transcritos y más señal de
hibridación que en otro.
Color blanco significa que la cantidad de cDNA en esos pocillos es tan pequeña que no puede
ser detectado por la sonda.
Color amarillo es un gen que se expresa más en el tejido 1 que en el dos. No significa que es
específico, ya que la hibridación está hecha del tejido 2.

Cabe destacar que para mucho de los genes no hay información de expresión.

Microarrays
Concepto
Es idéntica a la hibridación diferencial pero más evolucionada. Aquí se colocan todos los cDNA
de una especie en membranas de hibridación de vidrio. Tu tienes un porta , muy parecido al del
microscopio, donde alguien ha puesto muchos puntitos donde cada uno de los cuales
representa un gen.
Los cebadores representando cDNA, quiere decir que alguien ha mirado los genes del genoma y
.

ha decidido que si pone un oligo de 60 bases de esa secuencia, eso representa a ese gen.
Entonces en el cristal no hay cDNA completo, hay un pequeño cebador que es especifico de
cada gen.
Todo esto se puede diseñar vía informática.

Esta técnica nos permiten analizar la expresión de todo lo que se puede transcribir en una
especie, obteniendo el transcriptoma global. Si no se encuentra un cDNA, es debido a que está
por debajo del nivel de expresión. Aquí se utiliza fluorescencia que permiten identificar de
forma precisa la señal de cada punto a diferencia de la hibridación diferencial que se utilizaba
marcaje radioactivo.

Entonces la hibridación con sonda en vidrio,permite una cuantificación más precisa. Podremos
saber que en el tejido 1 por ejemplo hay 3 veces más de expresión que en el tejido 2. Vamos a
tener más o menos un numero.

La sonda va a ser el cristal con los clones. Porque el tejido RNAtotal no es la sonda si no que es
la diana. Es menos sensible que el Northern.

Se cogen un montón de clones de cDNA marcados de un color determinado. Un robot coloca

en gotitas sobre un porta donde estaban los cebadores. Las bases de este se eligen
informáticamente; se escogen las más específicas. En cada spot tendremos un montón de
oligonucleotidos pegados al vidrio y simplexos. Esta secuencia es la que va a permitir hibridar
con un cDNA especifico de la muestra.
.

Tras el spotting, se extrae el DNA de dos muestras de distintos tratamientos. Cada uno de los
cDNA se marca con un fluorocromo distinto. Se hace hibridar con el DNA marcado de los oligos
y se lava varias veces. Dejamos secar el cristal y se hace un scanning con un láser. Se genera un
Excel donde se marca la señal recibida por el láser en cada pocillo para poder comparar ambos
tejidos.

Aquellos puntos de color blanco nos indican un exceso de señal. En negro nos indica que no
hay suficiente fluorescencia. Cabe destacar que para en análisis de los datos hay que normalizar
los datos y determinar que genes se expresan de forma diferencial en las muestras. Además de
un tratamiento estadístico. Los puntitos amarillos significa que tengo puntos rojos y verdes a la
vez (expresión de ambos). A parte tendremos puntos rojos o verdes.
Al principio es una parte técnica donde:

. Escanear la imagen con un laser

. Convertir la imagen digital a señales numéricas
. Mirar la calidad de hibridación.
Ahora tenemos que normalizar los datos para comparar los cristales hibridados diferentes
días. Tenemos que normalizar los datos de cada spot respecto al global de los datos
Tenemos que hacer un análisis estadístico para ver como de diferente es el asunto. Cabe
destacar que esto del cristalito no se hace una vez si no que tu tienes que tener 3 cristales
hibridados con 3 RNA diferentes, ya que un puntito puede cambiar.
Al final tendremos una tabla que me dirá que un gen se expresa por ejemplo 10 veces más en
uno que en otro con una p de 0.005.
Luego hay que hacer un análisis funcional, para ver si por ejemplo un gen en levadura tiene
importancia en la glucolisis y entonces es un gen relevante o no .
Posteriormente hay que verificar los resultados usando métodos de genes individuales.

Todo este modulo es exactamente igual con el RNAseq. (secuenciacion masiva de RNA)

Falsos positivos
La imagen que vemos es un experimento donde hicieron un array. En el canal 1 marcaron el
RNA1 con un color. En el canal 2, pusieron el mismo RNA con otro color distinto. Y en uno de
ellos han puesto media docena de RNA que no estan en el RNA 1. (triángulos rojos).
Entonces tenemos RNA 1 + 6 cosas que he echado y RNA 1 sin ninguna de las cosas.
Cada puntito es un gen. La señal de hibridación de cada gen se deberían observar en una
diagonal. La mayoría salen, pero los que se salen de la diagonal son los que se expresan poco.
Los que se expresan poco no tengo información exacta. Cuando hay poca hibridación, la
dispersión de la señal es mayor. .
Como control se pone una serie de RNA en la muestra que ha sido marcada con un color.
Vemos algo preocupante; los cuadrados azules.En el analisis dicen que se expresan diferente en
la muestra 1 que en la 2, cuando no deberia de ser asi porque son la misma muestra. Ese
cambio de expresión lo debemos de considerar falso. Estos falsos positivos son más falsos,
cuanto menos varíe su expresión en las dos condiciones (cuando estén más cerca de la
diagonal). Los genes que varían poco suelen ser fundamentales para la célula, pero demostrarlo
es muy complicado

¿Cómo se validan los datos? Tenemos que validar el número de inducciones que hagamos; es
decir, debemos de verificar que un gen en concreto se ha inducido 21 veces (Mediante PCR
cuantitativa o Northern).

Por ejemplo quiero demostrar que un gen de Arabidopsis se ha inducido 166 veces. Mediante
una PCR cuantitativa en 3 líneas transgénicas obtenemos una gráfica

Línea en negro: muestra no transgénica. Líneas punteadas: antes de inducirse.

Líneas sólidas: después

Lo que vemos es que cuando empieza a inducirse un gen y a expresarse el gen diana a las 6
horas se ha inducido 1000 veces más respecto al control.

¿Existen grupos de genes cuya expresión varía de forma concentrada a base de un sustrato
biológico común? Se puede observar mediante experimentos de Clustering. Este experimento
nos permite encontrar genes y patrones de expresión. Realizar árboles filogenéticos.
 Cada columna representa diferentes condiciones de luz. Mediante un análisis
matemáticos vemos que hay genes que se expresan más de noche que de día;
que hay genes que se inducen y se reprimen. Gracias a esto podemos
simplificar el número de inducciones, ya que agrupamos en varios
experimentos. En las últimas columnas se encuentra las diferencias de expresión
en distintas repeticiones del experimento. Con estas diferencias hacemos un p-
value para poder determinar la significación de la expresión diferencial de los
genes

Fold change es el número de veces que cambia la expresión entre dos condiciones en un solo
gen.

Existen herramientas bioinformáticas para analizar toda esta cantidad de datos. Para estudiar
X cosas debemos de utilizar:

Genes co-regulados
Genevestigator: es un programa de pago que te permite comparar los datos de nuestro
experimento con otros datos publicados sobre la expresión de genes de la especie con la
que estamos trabajando
MapMan: es un programa que nos proporciona información básica sobre los genes que
tu elijas y anotas.
Rutas afectadas
Gene Ontology o GO: nos permite saber qué procesos están variando en nuestro
.

experimento
KEGG: en esta página están anotados los genes de cada ruta metabólica. Podemos buscar
el metabolismo que nos interesa y buscar si los genes que tenemos con expresión
diferencial forman parte de esa ruta

Técnicas de secuenciación masiva. Análisis del

transcriptoma. RNA-seq
Es otra forma de estudiar los patrones de expresión. Su utilidad es casi infinita, pudiendo
secuenciar individuos nuevos o genomas de especies ya secuenciadas.
 Nos permite realizar genética de asociación. Podemos separar individuos según las
respuestas distintas a una situación/enfermedad/ambiente...
Podemos realizar análisis de transcriptomas

Por ejemplo: tenemos células tumorales y células normales. Al extraer su mRNA, hacemos una
librería de secuenciación masiva por Illumina. Tras eso conseguimos millones de fragmentos
pequeños, los cuales pueden ser alineados con el transcriptoma de una especie que estamos
utilizando en el experimento (debe de estar anotada y estudiada). Así podemos ver qué genes
se expresan y cuáles no.

Al ser una secuenciación podemos ver si los intrones están conservados o no. Además, al tener
información sobre la secuencia de nucleótidos puedo ver si se cambian o no. También la
sensibilidad va a depender del dinero, puedo aumentarla, secuenciando más para así obtener
más lecturas y una señal más fuerte.

Existe unos números llamados FPKM (reads per Kb per M) y RPKM (fragmentos per Kb per M)
que nos permité validar el número y referirnos al KB de trasncritos que tengo y a los millones
totales de lectura

Imaginemos un tejido del cual extraemos el RNAtotal por lisado. El pool de RNA va a estar
formado por mRNA del citoplasma, algo de DNA genómico (que puede quedar del proceso de
extracción), RNA inmaduro y rRNA (el más abundante). Si no procesamos la muestra, obtenemos
millones de lecturas donde la mayoría será del rRNA.
 RNA total: al analizar la muestra obtenida como tal tenemos miles de lecturas de rRNA.
Obtenemos menos lecturas de genes trancritos y aún menos de los raros. Lo bueno, es que
encontramos la proporción relativa de cada gen ya que no hemos sesgado la muestra.
Reducción de rRNA: enriquecemos la muestra mediante la introducción en una columna de
oligos que pescaran el rRNA. Así obtenemos menor cantidad de rRNA.
Selección de PoliA: se pescan los mRNA para poder enriquecer los genes comunes y los
menos comunes. Se pasan por una columna con oligos poliU. Perdemos el RNA sin procesar y
el RNA no codificante
Captura de cDNA: para estudiar genes concretos. Se usa para analizar si un gen concreto está
afectado, por ejemplo, de cáncer o no. Se pesca el cDNA específico y en una columna se pone
oligonucleotidos con la secuencia de genes de interés. Con esto enriquecemos la muestra y
perdemos el resto de genes que no están en nuestro panel de interés.
.

Los resultados de experimentos de transcriptomica, obtenida vía microaarays o vía RNAseq, se

almacenan en repositorios de acceso público.

Podemos buscar ''in silico''(en el ordenador) genes con patrones de expresión determinados
Con los programas adecuados podemos comparar nuestros resultados con todos los de la
comunidad científica.

Hibridación in situ
Se trata de analizar la presencia de gen a nivel intracelular. Lo analizamos mediante tinciones
al microscopio. No vamos a empezar con la extracción de DNA, por lo que obtenemos un
resultado más homogéneo.

Esta técnica nos permite estudiar en secciones de tejido. Por ejemplo, con un grano de maiz.
Este está dividió en embrión y endospermo. En el endospermo va a haber regiones celulares
diferentes y queremos saber qué genes son de células de transferencia.

Se obtiene un gen llamado BETL9; mientras que BETL9-like se expresa en una capa de células
que rodea todo el grano. Estos no se expresan a la vez en una célula, donde se expresa uno, no
se expresa el otro. Al grano le pegamos un corte dividiendo la muestra en top y bottom. Al
medir la expresión vemos que en la parte superior no sale BETL9 mientras que en la inferior sí;
mientras que BETL9-like se expresan tanto arriba como abajo. Para saber como es posible esto,
si son prácticamente iguales y para saber donde se expresan exactamente, realizamos
hibridación in situ.

Primero se embebe las muestras en cera mediante procesos de deshidrataciones. Se producen

cortes en el microtomo y se lleva al microscopio. Se elige el RNA del gen de interés, se marca
con un tinte y se le echa al corte. Esto hará que hibriden las zonas del corte en las que se
encuentre el gen que nos interesa y se expresa.

Las sondas son de RNA, pero se producen a partir de cDNA que tienes clonado en un plásmido.
Se puede elegir la dirección sense o antisense de transcripción solo modificando el lugar en el
que se coloca el promotor, según que sonda tengamos que producir. Siempre hay que coger
la de antisense que es la complementaria al RNA. Primero hay que determinar en qué
dirección está el cDNA respecto al promotor de la polimerasa, utilizando la polimerasa para
sintetizar la hebra antisense. En la producción de RNA in vitro (se coloca la polimerasa y todos
los componentes en un sistema acelular) y se produce un RNA marcado por radioactividad u
otro tipo de marcaje

Tras la hibridación, se lavan los portas y vemos la detección. En esas sondas radiactivas se le va
a colocar una emulsión fotográfica para que la radioactividad queme la película. Aquellas
células que se ven en negro son las que la sonda ha hibridado y, por lo tanto, es el gen de
interés.

Aquellas sondas que no sean radiactivas será por anticuerpos y por inmunohistoquímica.

Inmunolocalización
Utilizamos un anticuerpo; esta vez no va a ser capaz de degradar como la sonda. Se realiza el
mismo procedicmiento que en la hibridación in situ.

Se reacciona con un anticuerpo contra una proteína. Observaremos donde se transcribe y donde
acaba la proteína. También podemos estudiar la localización intracelular de las proteínas en el
ME

Cuando no disponemos de un anticuerpo para realizar una inmunolocalización se realiza una

técnica de producción de proteínas recombinantes con una zona detectable. O se pone un
epitopo para el anticuerpo o una proteína con GFP que de lugar a luz.

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 Genética molecular À

Anotaciones

. ↩
 .

. ↩

. ↩
. ↩

. ↩
 Gen Mol - Tema 4 - Test
 Genética molecular À

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.

Recursos

. En los experimentos de transcriptómica los falsos positivos:

. No existen, gracias al análisis estadístico
. No tienen importancia, son genes de bajo nivel de expresión
. Solo se pueden detectar mediante análisis individualizados
. Se equilibran con los falsos negativos, anulándose
. En un experimento de hibridación diferencial los clones que no hibridan con ninguno de los RNA:
. Son de alta expresión en ambas muestras
. Están sometidos a splicing diferencial
. Son de muy baja expresión en ambas muestras
. Son de otra especie
. En los experimentos de transcriptómica la normalización de los resultados:
. Permite descartar falsos resultados\
. Permite comparar entre si distintos experimentos
. Iguala la expresión de cada gen en ambas muestras
. Refiere la expresión de todos los genes a la de un gen control
. El análisis de clustering en transcriptómica:
. Ordena los genes de menor a mayor nivel de expresión
. Identifica los genes expresados diferencialmente
. Identifica grupos de genes que se expresan concertadamente
 . Permite estudiar las relaciones filogenéticas en el array
. En la hibridación in situ , los cortes histológicos se someten a hibridación con:
. Un anticuerpo
. Una sonda RNA antisense
. Una sonda RNA sense
. La proteína de interés .

. Los experimentos de transcriptómica:

. Permiten determinar el orden de genes en los cromosomas
. Permiten identificar que genes sufren modificaciones post-traduccionales
. Ofrecen información valiosa en la caracterización funcional de mutantes
. Solo sirven para identificar genes específicos de una situación específica
. En los experimentos de hibridación a microarrays de dos colores:|
. Las dos muestras de RNA marcadas se utilizan sobre un solo array
. Cada muestra de RNA marcada se utiliza sobre un array
. Cada gen se marca en un color
. Los elementos del cristal van marcados en dos colores
. Un gen presenta un valor RKPM de 50 y 2000 en granos de 10 y 24 días, respectivamente, este
gen
. Se expresa 40 veces más a 10 que a 24 días\
. Se expresa 40 veces más a 24 que a 10 días
. Se expresa en ambas muestras, no sabemos en cuál más
. Se expresa al mismo nivel en ambas muestras
. Los experimentos de transcriptómica con microarrays:
. Permiten detectar genes que sufren splicing alternativo
. Permiten detectar genes que han sufrido mutaciones puntuales
. Permiten detectar genes que se expresan de forma diferencial en dos situaciones
. Todas las respuestas son correctas
. La sensibilidad en un experimento de RNAseq
. Está determinada por la tecnología de secuenciación y es invariable
. Está determinada por la tecnología de hibridación y es invariable
. Está determinada por la profundidad de secuencia y por tanto es variable
. Está determinada por el número de genes en el genoma y por tanto es variable
. Los experimentos de RNAseq
. Solo pueden realizarse en especies de genoma secuenciado
. Pueden realizarse en cualquier especie, aunque es más sencillo en especies de genoma
secuenciado
. Pueden realizarse en cualquier especie, disponer del genoma no tiene ninguna relevancia
 . Solo tienen interés en especies cuyo genoma aún no se ha secuenciado
. Los datos de expresión génica de experimentos publicados de hibridación a microarrays o
RNAseq:
. Son públicos, se pueden utilizar en nuestra investigación
. No son públicos, solo se liberan parcialmente
. Son públicos, pero se requieren ordenadores de gran potencia
.

. Son públicos, pero al no ser de nuestro experimento concreto no son de utilidad

. La sensibilidad en un experimento de microarrays:
. Está determinada por la tecnología de secuenciación y es invariable
. Está determinada por la tecnología de hibridación y es invariable
. Está determinada por la profundidad de secuencia y por tanto es variable
. Está determinada por el número de genes en el genoma y por tanto es variable
. Los experimentos de transcriptómica por RNAseq:
. Permiten detectar genes que sufren splicing alternativo
. Permiten detectar genes que han sufrido mutaciones puntuales
. Permiten detectar genes que se expresan de forma diferencial en dos situaciones
. Todas las respuestas son correctas
. En un experimento de RNAseq, las secuencias que mapean en regiones genómicas no anotadas
se corresponden con:
. DNA genómico que no se transcribe, pero contamina nuestro RNA
. DNA genómico que se transcribe, pero aún no ha sido anotado como tal\
. a y b son posibles
. ni a ni b son ciertas, se trata de secuencias de intrones anotados sin procesar
. En un experimento de hibridación diferencial los clones que hibridan con los dos RNA:
. Se expresan en ambas muestras
. Están sometidos a splicing diferencial
. Son de muy baja expresión en ambas muestras
. Son de otra especie
. Para conocer el destino subcelular de la proteína codificada por un gen tenemos que utilizar:
. Northern blot
. Hibridación in situ
. Inmunolocalización
. RT-PCR cuantitativa
. Una vez identificados genes que comparten patrón de expresión, para descubrir redes
reguladoras de la transcripción debemos comparar en ellos:
. Los intrones
. Los exones
 . Las secuencias 3 UTR\
. os promotores

Respuestas:

.3
.3
.2
.2
.2
.3
.1
.2
.3
.3
.2
.1
.2
.4
.3
.1
.

.3
.4

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[[]]

Anotaciones
 ᛟ

 Genética molecular À

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Recursos
Gen mol -Tema 5 - apuntes.pdf
Gen mol - Tema 5 - Segundos apuntes.pdf
Gen Mol - Tema 5 - Presentación.pdf

Generación de colecciones de individuos mutantes

y su análisis fenotípico
El objetivo de la genética clásica es utilizar los fenotipos para analizar la influencia de los genes en
los seres vivos. Uno empieza con un fenotipo interesante, en el sentido que es relevador en como
funciona un ser vivo. A partir de el, podemos estudiar como funciona ese proceso biológico y
eventualmente llegaremos al gen que causa el fenotipo.
Nos movemos del fenotipo al gen. Tenemos que generar mutaciones mediante mutágenos
aleatoriamente. En este tipo de genética solo hay leyes de Mendel y ligamiento.
Van a tener que generar individuos mutantes a partir de :

Mutágenos Físicos
Mutágenos Químicos: la mayoría viene de aqui.
Inserción

Esto nos servía para generar el material que haremos la genética clásica, es decir, el fenotipo.
Crear una colección de mutantes en la que nos puede salir con cierta probabilidad un fenotipo de
interés en el que luego hacer genética no es trivial. SI lo fuera, seria una cosa eficaz y fácil ,pero no
es asi, el problema es que necesitamos generar una población de miles de líneas.
Por ejemplo: una serie de personas estaban haciendo experimento de mutagénesis en Arabidopsis.
Si el numero genéticamente efectivo de células es 1 para tener una probabilidad del 99% de
encontrar una mutación deseada en el genoma de Arabidopsis necesitan mutagenizar 46049
semillas asumiendo una frecuencia de mutación de 10^-4. Esto nos quiere decir que necesitas
muchos individuos para encontrar mutaciones. Es decir, si tu consigues mutagenizar Arabidopsis de
manera que creas una mutación cada 10000 bases, para tener una probabilidad del 99% de tener
una mutación en cada gen vas a necesitar 46049 semillas.

El GECN o el numero genéticamente efectivo, quiere decir el numero de células que hay en lo que
has mutagenizado que va a pasar a la siguiente generación.
En el experimento dicen que en Arabidopsis el GECN es 2, por lo que en 23025 semillas nos sirve.
Este numero nos dice el numero de células que tu has mutagenizado que son susceptible de
transferir el material mutante a la siguiente generación. En Arabidopsis es 2 por que en el
meristemo apical hay un par de células que dan lugar a finalmente las flores.
Mutagenizan semillas, de las cuales no todas las células de las semillas a las que llega el mutágeno,
y daña el DNA van a dar lugar a descendientes. Crean quimeras.

Vemos un cotiledón. Donde una celula de ahi, ha sido dañada por el mutageno y hace que un gen
mute, pero solo en esa celula, por lo que una flor no va a salir de esa celula. De las semillas que
me salgan de la planta que viene de la semilla que he mutagenizado , no todas las semillas vana
ser iguales porque viene de una quimera.

Creamos quimeras (individuo cuyas células son de diferentes genotipo). No todas las semillas van
a ser iguales de aquellas plantas quiméricas. Esto lo complica porque voy a tener diferentes
mutaciones que no acaban en las semillas correspondientes.

Para obtener mutantes sólidos (un individuo con las células con el mismo genotipo) tenemos que:
mutar gametos directamente.

Por lo tanto, un mutágeno actúa sobre todas las células de un organismo, pero nos interesa saber
realmente cuántas de esas células van a dar lugar a la progenie, transmitiendo la mutación.
Necesitamos miles de individuos para encontrar un individuo mutagenizado de interés,
además este individuo (célula) debe de estar en el órgano que vaya a dar lugar a la progenie (en el
caso de Arabidopsis los meristemos apicales) y dependerá del número de células genéticamente
efectivas. Pero el número de individuos también dependerá de lo difícil que sea obtener el fenotipo
.

de interés.

Screening
Supongamos que mutagenizo y consigo una colección de mutantes. El método de screening
dependerá del problema analizado, un diseño experimental apropiado debería facilitar la búsqueda
de fenotipos interesantes en una población que siempre será de gran tamaño. Se trata de escoger
la línea de mutantes y buscar el fenotipo de interés.
¿En que generación tengo que hacer el screening?

En animales hay que ir a la F3. El screening se realiza en una generación en la que las mutaciones
de cada línea se hayan combinado siendo homocigotas, ya que son en general mutaciones de
pérdida de función que no suelen ser observables en heterocigosis. Cruzaremos los F1 con los
silvestres para generar individuos hermanos que cruzaremos entre si, donde nos saldrán
homocigotos.
Podríamos mirar la F1 si la mutación es dominante, pero es muy raro, de normal es recesiva.

Usamos el esperma del pez mutagenizado con una hembra silvestre. Esto dará
diferentes individuos en la F1, y para dar lugar a homocigotos, lo cruzamos con un
pez silvestre para generar familia. Cuando conseguimos hermanos, los cruzamos y
ahi ya en la F3 obtendremos mutaciones.
 Si mutagénicas semillas, en la M1, obtendremos quimeras. Esto dará un fenotipo
diferente; pero las plantas se puede autofecundar. El resultado dará semillas con
homocigosis para alguna mutación.

Si yo quiero acabar teniendo 25000 tubitos de semillas de Arabidopsis, ¿de cuantos nº tengo que
partir? ¿Tengo que tener 25000 tubos de 25000 plantas de 25000 semillas? Tenemos que empezar
con tubos de plantas M2 individuales que vienen de M1 individuales. No queremos que todo
venga de la M1 porque tendremos todo igual y no conseguiremos obtener todo el genoma.
Necesitamos variación.

Las líneas mutantes que hemos obtenido tienen en común el fenotipo que este buscando en
cada uno en distintos grados. Obtendremos por ejemplo 12 líneas mutantes de los cuales son de
la misma colección de mutantes, con el fenotipo que esté buscando, en distinto grado. Ahora con
los mutantes hay que investigar estas líneas y encontrar los caracteres genéticos que llevan
mediante las Leyes de Mendel, respondiendo a diferentes preguntas:

¿Dominante o recesivo? Si es recesivo voy a seguir los mutantes fácilmente, pero si es

dominante voy a tener cuidado porque trabajare con homocigotos y heterocigotos. Lo
verificamos con cruzamiento prueba entre un mutante con un silvestre. Al cruzar; si es
dominante en la F1 lo veremos pero si es recesivo lo veré en la F2 o F3. Si la mutación resulta ser
recesivo, la línea mutante será homocigota.
¿Gen único o son varios genes? Puede ser que una de las líneas mutantes en vez de tener un
gen que provoque una mutación, sea debido a 2 genes. Esto lo distingo mediante cruzamiento.
Si cruzamos la línea mutante siendo recesivo con el silvestre, obtendremos un silvestre. Para
saber si es de 1 gen o 2 genes, pediremos ayuda a Mendel. Analizaremos los descendientes; lo
autofecundamos o lo cruzamos con hermanos. Si es un gen obtendremos 3:1; si fuesen 2 genes
obtendremos 9:3:3:1. .

En ningún momento podemos hacer un PCR porque no conozco el gen

¿Alelos o genes? Si es el mismo gen el que afecta al fenotipo hablaremos de alelos, por otra
parte si encontramos varios genes implicados hablaremos de genes y no de alelos ¿Qué es
mejor? Si eres vago, prefieres tener alelos, pero lo mejor es tener muchos genes alterados,
obteniendo información de ellos. Pero también es importante tener varios alelos alterados.
 Prueba de alelismo: conocer si esa mutación son dos alelos de un mismo gen o no. La
prueba de complementación es un tipo de prueba de alelismo que SOLO sirve para
mutantes recesivos, consiste en cruces puros y observar la descendencia. Si los genes son
diferentes, se dicen que complementan y pertenecen a diferentes grupos de
complementación, mientras que si pertenece al mismo gen se dice que no complementan y
pertenecen al mimo grupo de complementación.
Al cruzar dos líneas mutantes en las que el fenotipo está afectado por distintas versiones
de un alelo, y por tanto un mismo gen afectado, se obtiene un heterocigoto para ambos
alelos y ambos no funcionales por lo que el fenotipo del cruzamiento será mutante. En
este test de alelismo decimos que no se ha producido complementación, así decimos
que los dos individuos están afectados en un solo gen.
Al cruzar dos líneas mutantes afectadas en distintos genes nos saldrá un fenotipo de F1
wildtype, así podremos suponer que son individuos mutantes con el fenotipo afectados
en distintos genes. En este caso diremos que se ha producido complementación,
produciendo entre las dos un fenotipo silvestre, lo que quiere decir que hay diferentes
genes afectados.

Cuando realizamos los grupos de complementación extraemos aquellas líneas que están afectadas
por mutaciones en un solo gen y aquellas líneas que están afectadas en varios genes. En el caso
anterior L1 y L2 pertenecen al mismo grupo de complementación porque no complementan entre
ellos, por tanto están afectados en el mismo gen; en otro grupo de complementación estaría L3 y
(por ejemplo) L7, que están afectados en un gen distinto del resto del grupo, pero en el mismo
gen entre ellos. Así, cada grupo de complementación representa a un gen con diferentes alelos
(cada línea es un alelo distinto, pero son del mismo gen porque no complementan.

Tener muchos grupos de complementación (muchos genes afectados) implica que has descubierto
varios genes relevantes en el proceso de estudio, de forma que científicamente es mejor tener
varios grupos de complementación. Sin embargo, desde el punto de vista de demostración es
importante tener muchos alelos, ya que hemos introducido un montón de mutaciones en el
genoma de las líneas, de forma que habrá dudas sobre la casualidad del fenotipo.
Entonces imaginemos otro ejemplo que tenemos una linea mutante 1 vs linea mutante 2. Se cruza
la linea mutante 1 x la linea mutante 2. Imaginemos que M1 es mutante en un gen a (a1a1) y la
M2 es mutante en el gen a tambien pero no tienen el mismo alelo (a2a2)(supongamos que es
recesivo) Nos dará a1a2. Esto nos da mutante: estas dos mutantes tienen alteraciones alélicas. Pero
otra situación es M1 x M2 que nos salga silvestre. Lo que pasa es que el M1 es a1a1BB mientras
que M2 si lo que tiene alterado es B sera AAb1b1. Entonces el silvestre en la F1 sería Aa1Bb1 . Este
fenómeno se llama complementación .Un alelo silvestre de un gen complementa la mutación de
otro gen.

Esto me va a producir una tabla donde la diagonal entre LM1 y LM1 será - y así con el resto;
.

mientras que si cruzamos LM1, LM2 dará + siendo esto diferentes genes, se ha producido
complementación. SI cruzo la L1 y la L3, y sale complementación quiere decir que la 1 y 2 ; 1 y 3
son los genes diferentes. Si la 2 contra la 3 me sale negativo, quiere decir que un mismo gen
distinto alelo. por lo tanto en este panel tengo 2 genes, representados por LM1 y LM2,LM3.
Veremos 2 genes de la LM1 con solo un alelo y LM2, LM3 dos alelos diferentes para un gen.

El color normal de la maíz es purpura; pero se encontró el mutante C1 que carece de color.
Cada mazorca es una F2 y en ella se esta segregando una mutación de alelo C1.Es el mismo gen
de 2 alelos ¿Por que son diferentes? Se diferencian en la repartición de colores. En uno el alelo es
dominante, mientras que en el otro es recesivo.

Análisis fenotípico
Esto no es lo mismo que identificar el gen. Si tenemos un ratón que le falla el higado, aunque no
encuentre el fallo molecular puedo ver muchas otras cosas más. No nos hace falta saber el gen
para tratar un fenotipo.

Permite determinar la influencia de un gen en un carácter

En muchos casos es posible diseccionar complejos procesos biológicos mediante el análisis de
fenotipos mutantes y dobles mutantes
.

Veamos a continuación un ejemplo: un mutante de como no, maíz llamado rgf1 (llenado de grano
reducido)
Esta mutación apareció espontáneamente. Vemos granos normales wildtype pero otros que estan
mas o menos raros, y otros que no son nada normales. Esto quiere decir que es una mutación
codominante pudiendo distinguir una clase silvestre, una homocigota y otra heterocigota. Además
es viable, permitiendo mantener la linea de homocigosis (normalmente las lineas homocigosis son
letales) Ademas si los pesamos, encontramos 4 clases; unos gordos, otros muy delgados y otros 2
con 2 esos intermedios diferentes. Esto es asi porque el endospermo viene del cruzamiento de 2
nucleos centrales, tiene 3 copias(ya que este tenía dos dosis maternas y una dosis paterna).
Entonces si en un grano concreto la madre era mutante, tengo 2 mutantes y 1 silvestre, si en otro
grano el padre era mutante , tengo 2 silvestre y 1 mutante; si los dos son mutantes, tengo triple
mutantes. Por lo que no solo es codominante, si no que también es dependiente de la dosis.

Ahora tendríamos que ver si son alélicos. Tambien quieren ver si ya tenian una mutación publicada.
Entonces en esa época existía una mutación llamada miniatura con propiedades diferentes y
además estan en el mismo cromosoma. La solución es cruzar mn1 x rgf. Lo que obtenemos es
complementación; un gen es complementado por el otro, de manera que los granos son silvestres.
Entonces la mutación rfg y la mn1 no son el mismo gen.
¿Cuándo ocurre esto? A los 12 días, cuando el grano ya esta hecho el silvestre se llena a gran
velocidad a diferencia del mutante que no se llenaba.
.

El mutante muestra niveles reducidos de expresión de genes específicos de células de transferencia.

Por lo que 1º hacen un Western con anticuerpos con BETL1 y BETL2 y vieron que los mutantes no
tenían. Posteriormente hicieron una Hibridación in situ donde no se vio casi señal a diferencia del
silvestre
 El mutante muestra niveles reducidos de expresión de genes específicos de células
de transferencia

Pero al mirarlo al microscopio ven que hay mismas células; y el mutante afecta al pedicelo. A raíz
de esto se preguntaron, ¿es un gen de efecto materno? (Son genes que el fenotipo del individuo
no esta determinado por el genotipo del individuo si no de su madre.) Se vió que no porque todos
los granos vienen de la misma madre pero estos son diferentes entre sí; deberían de ser todos
iguales.

En la caracterización bioquímica vieron:

Los granos mutantes transportan azúcares al nivel de los wt, pero no acumulan almidón.
Las enzimas del metabolismo del almidón se expresan normalmente

Este tipo de análisis proporciona datos fisiológicos y bioquímicos sobre cómo se llenan los granos;
viendo que ni el transporte de azúcares ni las enzimas metabólicas del almidón están afectadas,
sino tan solo el proceso de acumulación de este

¿Y ahora? Determinar el gen no es solo importante para saber la causa molecular de lo que está
pasando, si no que nos da pistas de como seguir investigando el mutante.
.

El conocimiento de la naturaleza molecular del gen causal indicaría nuevas vías de investigación. En
este caso la identificación del gen causal pasa por su cartografía genética, integración en un
mapa.

En un experimento de genética directa tenemos identificado el fenotipo, pero para fijar el genotipo
tenemos que hacer un mapa genético por positional cloning al no conocer la naturaleza
molecular del gen → no se pueden hacer PCR ni blots . Este tipo de estrategias de estudio
genotípico se basa en el ligamiento.

Ligamiento
Si tu quieres localizar un gen en un genoma y solo tienes la información del fenotipo tenemos que
hacer un mapa de ligamiento. El ligamiento es la propiedad de que los genes se hereden juntos.
Esto depende de su posición en el genoma el cual es muy próximo.
Imaginemos un organismo muy simple que tiene un par de cromosomas (2n=2) y hay 2 parentales
(uno rojo y uno verde). El parental 1 tiene ciertos alelos de genes mientras que el otro parental
otros; siendo diferentes entre ellos. Hacemos un cruzamiento y obtenemos un individuo con un
cromosoma verde y otro rojo.
El ligamiento se estudia a partir de la meiosis de ese individuo. No lo
estudiamos antes porque no podemos estudiar un ligamiento en la
situación en la que los 2 cromosomas son iguales. Tenemos que
obtener heterocigosis y a partir de ahí estudiar si los genes se
heredan juntos o separados.

Lo que ocurre en la meiosis es que a veces hay sobrecruzamiento.

El efecto de esto es el intercambio de material. Obteniendo 4
cromosomas:

El cromatidio rojo que no participa en el sobrecruzamiento

El rojo que si lo hizo
El verde que si lo hizo
El verde que no lo hizo

Ahora consideramos que no hay un evento meiótico si no que hay n evento meióticos (nxR!)
Normalmente necesitaremos un segundo parental para poder analizarlos.
Obtendremos una gran cantidad de posibilidades. (Faltan cromosomas)Porque si cada vez que
ocurre sobrecruzamiento tenemos la situación de arriba, voy a tener al menos la mitad o rojo o
verde y la otra mitad a medias.

Cuando se hace análisis genético se estudia la meiosis, en las meiosis de los genes
heterocigóticos se produce sobrecruzamiento, generando cuatro cromosomas
distintos (con un brazo recombinante y otro parental) con n meiosis. Para saber
que ocurre con la F1 es necesario cruzarla con un individuo recesivo en
heterocigosis, para que no produzca interferencias con el resultado de la F1. Se
.

pueden obtener dobles sobrecruzamientos

Cuanto mas sobrecruzamiento hay que meter para explicar el cromosoma, más raro es, porque los
sobrecruzamiento no aparecen siempre.

Ahora metemos los genes. Entonces, en cualquier parte de este panel de cromosomas ¿Cuál es la
proporción entre verde y rojo/ cualquier gen que este en este panel, cuantos alelos tengo
mayúsculas o minúsculas?) 50-50%. La clave es , como se relaciona un gen con lo que le pasa al de
al lado.

Imaginemos que uno de los genes que estamos estudiando es la mutacion. El parental verde es M
(silvestre) mientras que el parental rojo es m (mutante). ¿Cuántos cromosomas hay aqui con la
versión m? La mitad.
.

[!imagen]Para estudiarlos lo mejor es trazar una línea imaginaria y agrupar los genes
según los alelos que presenten. Lo predecible es que la mitad sean M y la otra mitad
m según Mendel.

Imaginad que yo me pregunto de los que llevan m ¿Cuántos llevan Z? Z es otro gen , que resulta
que el que lleva m lleva Z . Entonces de los descendientes, ¿Cuántos de los que llevan m llevan Z?
La mayoría, esto es el ligamiento. ¿Cuántos de los M llevan z? La mayoría. Hay muy pocos casos en
los que se me han cambiado el gen Z respecto al M. Esos casos es donde se me han producido
sobrecruzamiento entre M y Z. Cuanto más cerca estén m y z mas improbable es que haya
sobrecruzamiento, mas improbable que se rompa el ligamiento entre m y z

Ahora contamos entre los descendientes cuantos de los que son m son Z y cuantos tienen z. Si
vemos un sesgo, diremos que hay ligamiento porque si analizo otro gen como W que está mas
alejado, que está en el mismo cromosoma, no esta ligado a M porque esta muy alejado. ¿Cuántos
son W? 1/4 porque no están ligados. SI el gen esta muy lejos el evento del cruzamiento es más
probable. Voy a tener 1/4 m W, 1/4 m w, 1/4 M W , 1/4 M w. (No ligamiento.)

Entonces:

Para estudiar el ligamiento separaremos la población de un cromosoma concreto con la

mutación de interés según el alelo que tenga, cualquier otro gen cercano al gen de interés se
hereda a la vez, debido a que la recombinación en un espacio tan pequeño es extraña. De forma
 que si un alelo M está en el mismo cromosoma que el alelo z de otro cromosoma ambos se
heredarán a la vez en casi toda la muestra.
Por otra parte, si estudiamos un gen lejos de la mutación en el mismo grupo de cruzamiento nos
daremos cuenta de que no hay ligamiento, ya que tener uno de estos alelos en dominancia o en
recesividad es igualmente probable sea cual sea el otro gen. Por ejemplo, el alelo M y el alelo W
se encuentran alejados en el mismo cromosoma, de forma que la probabilidad de que estos se
hereden juntos es la misma a que no lo hagan.

Entonces si yo conozco la posición de Z, W, M... puedo localizar la posición de una mutación

aunque no sepa quien es la mutación utilizando este truco dependiendo de como este ligado.El
positional cloning se basa en el uso de marcadores para conocer la posición de la mutación.

Dos genes para estar ligados tienen que estar en el mismo cromosoma, ¿Cómo lo mido?

Mapas genéticos y problemas de 2 y 3 puntos

.

Problemas de los 2 y 3 puntos

El problema de los dos puntos es un caso que se explica para que se vea la violación de la 2º ley
de Mendel (los caracteres se segregan independientemente)
En el problema de 2 puntos se eligen 2 genes que no cumplen , no segregan independientemente.
Imaginemos 2 genes A y B con alelos AaBb. Hacemos un cruzamiento en el cual empezamos con
esos parentales: AABB aabb. Dando lugar a individuos AaBb. Los cruzamos por un aabb porque si
lo cruzamos por otro heterocigoto sería muy difícil ver de donde provienen , de que gameto; y con
aabb no aporta nada al fenotipo. Entonces podemos centrarnos en el estudio de la meiosis del
dihíbrido.
Obtendríamos AB, Ab, aB y ab

Aqui si A y B son 2 genes que cumplen la 2º ley de Mendel, segregan independientemente y

tienen la misma proporción para los 4. Si no cumpliesen la 2º ley de Mendel, su segregación es
dependiente , y obtendríamos <1/4 y >1/4. Sale >1/4 aquellos que sean iguales que los parentales.
Los parentales proporcionan AB y ab. La meiosis produce mas los de tipo parental AB y ab ; y
habrá menos de 1/4 los de Ab y aB.
En el caso extremo que A y B están absolutamente ligados, estan tan cerca que es imposible que
encuentres recombinante: tendrás 50-50%. Siendo entonces ligamiento absoluto
Cuando hay ligamiento hay 1 /2 de recombinantes. Entonces a la hora de buscar recombinantes te
.

puedes mover entre 0 o 0,5. Nunca hay más de 0,5 recombinantes.(1/4+ 1/4) --> 0<p<0,5
recombinantes)

Si yo tengo de los parentales AB 100, ab 23 aB 27 y aa 98 ¿Cuánto vale el ligamiento de los genes

a y b?
p (fracción de recombinación) recombinantes /total= 50/248 = 0,2 centimorgans

Cuanto mas pequeño es p, menos recombinantes hay y mas ligados y cerca están A y B. Si es AaBb
x aabb NO OBTENDRIAMOS el mismo numero obtendríamos que los recombinantes y parentales
estarían al revés.

El problema de 3 puntos: es el mismo problema que el de 2 puntos (anterior) pero añade una
cosita. Tenemos 3 genes A, B, y C. Cruzamos AaBbCc X aabbcc obteniendo 8 gametos posibles.

Caso mendeliano: 1/8 de cada tipo.

Caso no mendeliano: agrupamos los números AB, BC y AC. Cuando yo tengo los 3 , puedo saber
cual esta en el centro. El que esta en el centro es el mas difícil de cambiar.
- Ya no tendremos 1/8 iguales, depende.
 Haces un problema AB, AC y BC. SI B y C sale 0,15 esta ligado pero si A y C sale 0,5 significa que
no estan ligados.

Cuando yo tengo los 3 a la vez puedo saber cual esta en el centro, mientras que en los problemas
de 2 puntos es difícil saber exactamente . Se sabe que un gen esta en el centro porque es el mas
.

difícil de cambiar.
Imaginemos que B esta en el centro. Si no ocurre sobrecruzamiento obtenemos ABC y abc.¿Como
me salen los gametos Ab o aB? De la recombinación. (Tipo I) ¿bc? Entre B y C tipo II. ¿A y c? De
cualquiera de la dos, tanto I como II.
¿Por que hay 8 gametos? Hay una clase que tienen que salir de I + II. (Es el producto de las 2
probabilidades que salgan las 2 recombinaciones, siendo un suceso muy raro) Mirando los
gametos raros, y miramos el gen del centro.

A partir de la estimación de los problemas de dos y tres puntos podemos construir un mapa, de
manera que los genes A y B estarán representados con una separación de p o de cM (p x100). En
el problema de tres puntos la suma de la distancia genética entre los tres genes no es la misma
que en el de dos puntos, esto significa que al hacer un problema de dos puntos infraestimamos
el número de recombinantes (es decir, algunos no se cuentan, que son los dobles
recombinantes, esto se debe a que por este proceso se producen individuos con fenotipos
recombinantes). Cuanto más pequeño sea el intervalo que estamos midiendo más precisa es la
distancia relativa entre dos genes, ya que es más difícil la presencia de dobles cruzamientos

El problema de tres puntos es la manera práctica para explicar que para realizar un buen mapa
genético se necesitan muchos individuos y muchos marcadores estudiados con pequeñas distancias
entre ellos deduciendo el fallo. En un problema de tres puntos el orden de los genes es seguro, no
se puede discutir; mientras que en uno de dos puntos es más difícil saberla, ya que los dobles
cruzamientos van a afectar mucho al estudio, impidiendo identificar que gen se encuentra en el
medio. Es decir, los mapas genéticos son imprecisos, para aumentar su precisión se usan más
marcadores; además, el estudio de tres puntos es más exacto que el de dos puntos. Con las
distancias obtenidas en los problemas hacemos un mapa genético, observando en un solo
cruzamiento todos los genes que van a acabar en el mapa. Para ello intentaremos estudiar
muchos caracteres a la vez, esto implica cruzar dos parentales que han de diferir en la mayor
parte de los caracteres posibles para poder introducirlos en el mapa (se usaran líneas puras
que sean muy distintas)

Construcción de un mapa
.

El problema de 2 puntos te proporciona un mapa pequeño pero, ¿cómo construyo un mapa por
ejemplo de toda la especie humana? Tenemos que hacer muchos problemas de 2-3 puntos
seguidos. El problema es, ¿Cómo los ordeno?

. Establecer líneas puras y producción de una población de mapa (F2)

. ¿Por qué? Porque es imposible hacer un cruzamiento prueba. Empezamos con parentales lo
mas puros posibles para dar lugar a una F2. Autofecundamos la F1 para obtener una F2.
Las líneas puras: cuanto mas distintos sean los individuos que cruzamos mejor y mas
fácil será. Es una propiedad básica de la genética; necesito variación para poder
estudiar las cosas.
. Anotación del genotipo de cada individuo para cada uno de los marcadores que se van a
emplear en el mapa.
. Cada individuo es importante.

Generamos una tabla. En la izquierda vemos los caracteres que quiero tener en el mapa. Cuantos
mas puntos en el mapa , mas preciso es este.

¿Cuál es la diferencia entre A,a y B,b? A es un carácter dominante, y vemos que solo hemos podido
decidir si son A o a mientras que B es un carácter codominante pudiendo saber decir que cada
individuo es BB, Bb... B es el mejor gen ya que la información es mas precisa. El problema de A es
que no sabré si es Aa O AA.
 En la fila de A, hay 750 A y 450 a. Cada punto en el mapa, él solo cumple la ley de Mendel; si no,
metemos en el mapa un carácter no mendeliano. En la fila A, hay 250 BB, 500 Bb y 250 bb.

No hace falta que cumplan la 2º ley de Mendel pero obligatoriamente si que tienen que cumplir la
1ºley de Mendel. Se mira la 2º ley de Mendel por el problema de 2-3 puntos.

Muchos individuos, muchos puntos y marcadores codominantes son las 3 cosas claves para
generar un mapa.

. Análisis del ligamiento de dos en dos y luego de tres en tres (vía ordenador)
. Integración en un mapa.
. La unión secuencial de marcadores al mapa va produciendo grupos de ligamiento. Según van
apareciendo puntos, el mapa se va cerrando y uno mas grupos de ligamientos diferentes. Al final
del mapa, ¿cuantos grupos de ligamiento hay? Uno por cada nº de cromosomas que tenga la
especie. En nuestro caso serian 23 grupos de ligamientos
. En un mapa saturado (un gran número de marcadores separados entre si por pocos cM,
cubriendo todo el genoma) el número de grupos de ligamiento es igual al número de
cromosomas de la especie

El mapa tiene el numero haploide de la especie, no diploide.

Imaginemos:
Nosotros queremos introducir un carácter en un mapa que ya esta hecho. ¿Sobre que material
tenemos que trabajar? En este caso, necesitamos individuos segregando para caracteres.
Necesitamos generar una población de F2.
Los parentales también deben de ser lo mas diferentes entre ellos y uno de ellos tiene que tener la
mutación. El otro parental es silvestre y del cosa mas diferente que me puedo encontrar.

Clonaje posicional
Positional cloning: meter una mutación en el mapa.Clonar un gen de lo unico que conoces es su
fenotipo e intentas clonarlo en un mapa

En nuestro articulo, presentan un protocolo de meter una mutación en el mapa del genoma de
Arabidopsis.

Marcadores moleculares
Nos permitirán hacer mapas precisos con una gran cantidad de genes, ya que un marcador
molecular es capaz de identificar diferencias de un único nucleótido en dos cadenas de
.

nucleótidos. Estos marcadores son perfectamente codominantes, permitiendo distinguir el

homocigoto de un mutante, del otro o de los heterocigotos.
Bastaría con que uno de los parentales en el genoma tuviera una A mientras que otro una G: esto
es un marcador molecular porque podríamos investigar si una F2 lleva AA, AG...
Para saber si es AA, AG, GG debemos de secuenciar. Yo se que los 2 parentales se diferencian en
esa base , con lo cual es fácil, hacer unos primers , hacer PCR de los individuos que quiero
genotipar y secuencio (Es importante tener un proyecto genoma, si no tuviéramos el conocimiento
de genoma, mal nos iría)

En el articulo trabajan con Arabidopsis .

Columbia es el parental estandar

Mientras que Ler es muy diferente a Columbia

Algunos marcadores que se desarollaron.

SSLP: PCR de microsatélites (repeticiones cortas)Se ve que Columbia en cierta zona del genoma
tiene una repeticion (AT)20 mientras que Ler (AT)15.¿Que ventaja tiene este tipo de marcador'
Porque cuando haces el PCR haces directamente el tamaño. Col tiene 150 bp , Ler tiene 10 bases
menos y el heterocigoto tienen las 2 bandas.
.
Este tipo de dianas es muy fácil que sea diversa entre mutantes, principalmente en el
número de repeticiones. Estas pequeñas diferencias nos permiten identificar bandas por
electroforesis de diferentes tamaños, dividiendo así individuos según su clase

CAPS: utilizan en Col un sitio EcoRI mientras que en Ler hay una base cambiada y no es EcoRI.
Utilizan un sitio de restricción (CAPS) Hacen PCR, digiero con EcoRI y se ve las bandas: una banda
de material digerido en el caso del mutante homocigoto, material no digerido en el silvestre
homocigoto y mezcla de digerido y no digerido en el heterocigoto.
En el cebador de PCR se pueden cambiar unas bases en los extremos de los cebadores, así se
pueden convertir primers en sitios de restricción, que nos permiten estudiar diferentes mutaciones

Proceso de realizar un clonaje posicional

En el articulo dicen que se realiza en 9 meses.La población de mapa para hacer positional cloning
no es el mismo que para hacer el mapa genético, ya que debemos contar con nuestro mutante
para poder localizar la mutación

Paso 1: creación de la F2 población de mapa

Tenemos que producir una población de mapa cruzando el parental mutante por una variedad lo
mas distinta posible. Cruzamos Col x Ler.
Dura 4 meses porque cruzamos Col(mut) x Ler(wt) obtenemos una F1 (2 meses) y los F1 lo
cruzamos por otra F1 silvestre para obtener F2 (otros dos meses.)
Tu población de mapa imaginemos que será ciento de individuos F2 procedentes de ese
cruzamiento.

Paso 2: establecer el ligamiento usando el análisis de segregantes

agrupados.
Entonces, queremos hacer un mapa genetico que aparezca mi mutación, en una zona determinada
de mi genoma para saber que es molecularmente la mutacion. El genoma es mucho mas grande
que eso pero yo no quiero hacer el mapa genetico otra vez si no que quiero ir cuanto antes a la
zona donde esta mi mutacion.
¿Cómo llego al punto donde está mi mutación ? Mediante el análisis de segregantes agrupados.
Dura 1 semana
No sabes donde esta exactamente donde esta la mutación pero sabes que esta en el brazo corto
del cromosoma 3

Lo primero que necesitas es una colección de marcadores (pocos) pero robustos distribuidos por el
genoma. Ser robusto es que cada vez que hacemos una PCR salga perfecta.

.
 Se necesita una selección de marcadores robustos, es decir, que sus primers no generen
.

ambigüedad y que estén homogéneamente distribuidos, permitiéndonos asignar posiciones a lo

largo del genoma (aunque con poca precisión, ya que están muy alejados unos de otros).

Es el genoma de Arabidopsis. Son 5 cromosomas donde seleccionan 4 marcadores

en los cromosomas pequeños o 5 en los grandes.

Usamos esos 20 marcadores con la mutación. ¿Cómo hago el analisis de 20 marcadores contra la
mutación? Primero va a ser en la población en mapa.
La selección de marcadores esta facilitada porque está hecho el mapa genético de Arabidopsis.
Ahora, se seleccionan unos pocos individuos segregantes (es decir de la poblacion de mapa F2)
genotipicamente homogeneos para la mutación; es decir homocigotos (si la población es recesiva.)
Si la mutación es recesiva yo me cojo 8 individuos mutante y por tanto es aa.

La gracia es que los 16 cromosomas de esos 8 indiv tienen esa pinta y todos ellos
en la zona de la mutación son homocigotos.

Si fuese dominante ¿Qué pasaría? En la F2 cogemos no mutantes. Los no mutantes son

homocigotos. Lo que nos importa es que son homocigotos.
Ahora hacemos un pool , una mezcla. En ese pool saco el DNA y hago el PCR con los 20
marcadores. .

Si el miro uno de esos marcadores y está muy lejos de la mutación, estando no ligado, en mis 8
individuos mezclados ,nos saldría las 2 bandas. Nos sale heterocigoto. Si el marcador está cerca,
solo saldrá una banda. Saldrá la banda del parental, que en este caso sería Col.
Nuestro objetico es conseguir heterocigosis en todo el genoma menos en la zona de la mutación.

El primer carril de los geles es la F1 y el segundo carril es el pool de mutantes. Se

señala con un asterisco la banda del parental donde se produjo la mutagénesis.
Por ejemplo nga 6 la banda del mutante parental es la del asterisco, vemos tanto
en la F1 como en el pool de mutantes 2 bandas. No sabemos donde está la
mutación. Sabremos donde hay mutación donde solo veamos 1 banda como en
nga168 y ciw 1

Tras esto, identificamos el marcador mas cercano a la mutación. Nos centramos en el cromosoma
1.
Identificación del marcador más cercano a la mutación y, por tanto, de la posición de mapa de ésta
Ahora tenemos una PCR de Col, de Ler, de F1 y de los 8 individuos. Cada gel es un marcador. En
lugar de hacer todos los individuos en una sola PCR para cada marcador, haremos una PCR para
cada individuo para cada marcador. Se obtiene así un resultado claro sobre la homocigosis o
heterocigosis de los marcadores, que se pueden relacionar con la mutación: para ello se colocan
los patrones del marcador y se mira en cada mutante los alelos que presentan.

¿Que marcador está pegado? El 2. Simplemente contando bandas yo sabria ver

quien esta ligado. ¿Cuántos alelos Col y Ler hay en el marcador 1? 8/8 mientras que
en el marcador 2 hay 15/1 (ligamiento). Esta cerca del 2.

El número de alelos de cada marcador que hay en los cromosomas de los F 2 se pueden contar de
forma rápida, si el número de alelos para cada marcador es el mismo o parecido (por ejemplo a 1
y a 2 tienen ambos ocho representantes en nuestra muestra, por lo que este marcador no está
relacionado con la mutación). Mientras, en el marcador en el que haya una diferencia notable entre
la presencia de un alelo u otro significa que la mutación está en la zona del genoma en la que esté
el marcador.
 F1 tiene un cromosoma verde y otra roja porque viene del cruzamiento Ler x Col. El
4º dibujo tenemos que fijarnos en los 2 geles, entonces tenemos que pintar un
cromosoma rojo entero porque en el marcador 2 es homocigoto col rojo , mientras
que en el marcador 1 es heterocigoto. El punto en el que pasa de rojo a verde no
se sabe exactamente el sitio.El 5º individuo es para marcador 2 heterocigoto. Para
la mutación (Col) es rojo. Para el 6º individuo para la mutacion es rojo y para el
marcador 2 es rojo tambien ; para el 1 es verde, esto quiere decir que en ambos
hay rojo y verde, pero no veremos un sobrecruzamiento en el mismo sitio. Es el
mas raro

A la vista de los 8 es fácil ver a que esta ligado . Y es al marcador 2 por la diferencia.

Pasó 3: identificar marcadores de PCR robustos flanqueantes

.

El objetivo ahora es acabar diciendo que la mutación esta en una cromosoma M y está entre el
marcador b y el marcador n. Yo ya se que la mutación esta en el cromosoma 1 , pero ahora quiero
decir que esta en el cromosoma 1 entre dos marcadores.
Tenemos que coger los marcadores que estan en el mapa genético en la zona cuestión y hacer
problema de 3 puntos entre la mutación y los marcadores.
El proceso será coger el mapa de la zona, para ello cogeremos un parental mutante con un
marcador y un parental no mutante sin marcador, buscaremos entonces individuos recombinantes
en la F 2 generada por autocruzamiento, los recombinantes serán los que sean mutantes y con el
alelo a del marcador y los que no tengan mutación y el alelo A del marcador. Se hacen problemas
de tres puntos para determinar el orden de los marcadores y la mutación, ya que necesitamos
saber con seguridad que los marcadores estudiados están flanqueando a la mutación.

¿Cuantos indv? Nuestro objetivo es encontrar el marcador que flanquean la mutación a 5-10
centimorgans. En la distancia, para medirla bien necesito un minimo nº de recombinantes/ total. Si
cojo 100 , nos sive para encontrar 5 centimorgans.Si cojo 100 indv , y esta a 5 centimorgans tengo
5 recombinantes. Pero si un marcador esta a 0,1 centimarges con 100 no podriamos encontrar
.

recombinantes.

Lo normal es que una mutación no sea facil de genotipar. Genotipar para A o Z sea
facil; pero la mutación no va a ser facil.Es dificil saber si un indv es mutante o no, y
ademas al ser recesiva la mutación es dificil determinar si es un heterocigoto
silvestre o homocigotos silvestres.

¿Soluciones? Necesito saber si son mutantes homocigotos, no mutantes... Para ello, es o trabajar
solo con mutantes sabremos que es homocigotos mm. Si necesito información de todos los
individuos, ¿Cómo sabríamos si un individuo no mutante es Mm o MM? Viendo sus descendientes.
Si es una planta, los descendientes de Mm , volverían a mostrar la mutación mientras que los de
MM no

El objetivo es un mapa donde una mutación este encerrada entre dos marcadores. Como la voy
acorralando? Midiendo distancias genéticas mediante la formula p= recombinantes/total. Siendo
muy importante el nº de recombinantes.

El mapa se construye contando recombinantes. Cuanto mas cerca este de la mutación mas
complicado es encontrar recombinantes.

Paso 4: encontrar recombinantes en la población

 Tenemos un cromosoma , y la mutacion esta entre Z y A. Y al final la quiero acabar
localizando entre O y L, dos marcadores muy proximos. Al final voy a acabar
contando recombinantes. ¿Un recombinante entre A y Z es recombinante entre O y
L? No hace falta. Pero un recombinante entre O y L, es recombinante entre A y Z.
Necesito recombinantes entre A y Z.

A si esta a 10 centimorgans y Z a 5. De 1000 plantas reducirnos a 150 plantas. Los

cromosomas azules o rojos az o AZ no sirven porque nunca nos va a dar
información sobre la distancia genético de nadie. Queremos cromosomas Az. Si
AM son 10 de mzA 5 , si miro 1000 habrá 150. Reducimos asi el tamaño de la
población, reduciéndonos el trabajo. Nos quedamos con 150 INDIV recombinantes
A z. Nos sale que entre el marcador Q y m me salen 7 recombinantes. La distancia
Pqm = 7/1000

Hacemos esto porque nos va a permitir ver recombinantes entre A y Z y son los que no sirven para
hacer el mapa. Solo las recombinantes sirven para poder llegar a la mutación. Saber si un individuo
es recombinante es fácil mediante PCR.

El numero de recombinantes te informa de si estas muy lejos o cerca, el mapa se hace contando
.

recombinantes, a mas cerca estas de la mutación mas dificil es contarlos.

Se trata de analizar toda la F 2 con los marcadores A y B para ver si un individuo es recombinante
o no. La idea es que necesitamos muchos individuos F 2 para hacer construir un mapa preciso para
hacer el positional cloning, necesitamos saber el fenotipo de los marcadores a estudiar y el
genotipo para la mutación (si es posible). El problema es que las mutaciones son difíciles de
ensayar, entonces deberíamos disminuir el tamaño de la población, haciendo el fenotipado en una
subpoblación, para ello buscamos los individuos interesantes de una población, que son los
recombinantes, estos nos proporcionarán información sobre la posición genética de los
marcadores.

Un individuo de la F 2 que no lleve una recombinación entre los marcadores A y B no sirve de

nada, ya que no nos permite encontrar nuevos marcadores. Si encontramos los recombinantes el
fenotipado solo se hace sobre estos, ya que pueden tener un fenotipo de interés. Con los datos de
los recombinantes y el genotipado de un nuevo marcador determinamos la distancia entre la
mutación y el nuevo marcador (será el número de recombinantes m y W entre el total de
individuos de la F2 ).

Paso 5: Fine Mapping como desarrollo de nuevos marcadores de

PCR conocidos
Se pueden diseñar nuevos marcadores, ya que contamos con la secuencia genómica de los
parentales usados. Explorando la zona de interés se pueden ver docenas de cambios de
nucleótidos, pudiendo hacer marcadores muy específicos.

Hacer positional cloning nos permite trabajar con un intervalo pequeño de mapa (reduce el
tamaño del mapa genético en el que buscar la mutación), en el que jugaremos con pocos
recombinantes y distancias genéticas mínimas. Estimar la posición de la mutación con dos
individuos no sirve para calcular distancias genéticas.

Cuantos más marcadores tenga más puntos tengo para determinar dónde está la mutación.

Al final cuando tienes solo un recombinante llegas a algo como un puzzle.

Sobrecruzamiento entre a y L
Sobrecruzamiento entre N y b

Esto nos va a informar de donde está la mutación.

Como son esos individuos para la mutación

Tabla resumen de los pasos para el clonaje posicional

 Problemas del clonaje posicional
. Si hay un carácter controlado por varios genes esto supone un problema, ya que alarga el tiempo
de estudio y lo complica. No suele ser un problema ya que se detecta desde el principio, por lo
que no se introduce en un proceso de positional cloning.
. Podemos estudiar un gen causal con bajo nivel de recombinación y/o abundancia de
secuencias repetidas:
Si tenemos una zona con bajo nivel de recombinación nos costará más encontrar
recombinantes, lo que nos informa de la posición relativa de marcadores. Entonces habría
que estudiar más individuos, complicando el estudio. Un bajo nivel de recombinación debido
a este problema supone infraponderar la distancia genética que se corresponde con una
.

distancia física enorme, pero aparentemente estamos muy cerca de la mutación con nuestro
marcador. Esto ocurre en zonas cercanas a los centrómeros.
Las secuencias repetidas son un problema al dificultar el diseño de marcadores, ya que no se
pueden diseñar primers de PCR en una secuencia repetida, ya que los resultados de la PCR
no serían limpios. En este caso no hay mucho que solucionar, solo se puede intentar diseñar
mejores marcadores.
 Determinación del gen causal
Para determinar cuál es el gen causal en una zona entre dos marcadores (que contengan más de
un gen) se secuenciará el intervalo del marcador, debemos determinar cuál de los genes
contenidos es el causal, para ello:

Técnicas de análisis molecular de genes candidatos: Si me encuentro tres mutaciones debemos

determinar cuál de los genes contenidos entre los marcadores es el causal una de ellas se
encuentra entre dos genes, otra en un exón de un gen y otra en la secuencia codificante de otro
gen, podemos decir que el mutante de interés es el que está en la secuencia codificante. Sin
embargo para asegurarnos deberemos realizar análisis moleculares de los genes candidatos,
viendo si la mutación que creemos causal produce cambios en un aminoácido de la proteína de
interés o si deriva en un stop codón que trunque la misma.

Encontrar nuevos alelos mutantes: Si decido que el gen que codifica un codón de paro en la
secuencia codificante es el causal del fenotipo deberíamos encontrar otros alelos de esta
proteína que generen el mismo fenotipo. Si he tenido suerte a la hora de hacer el primer
screening y el test de complementación tendremos varios alelos de un mismo grupo de
complementación, así me iré a esas líneas mutantes del mismo gen y hacer PCR de estas. Si
diferentes líneas de un mismo grupo de complementación generan un mismo fenotipo o muy
similar diremos que este es el gen causal; sin embargo, si varios alelos de diferentes grupos de
complementación generan el mismo fenotipo tendremos que desechar que ese sea el gen causal
del fenotipo, o al menos no el único.
Complementación: Se introduce el gen silvestre en un vector y se introduce en la línea mutante,
si esta pierde el fenotipo mutante podremos decir que este gen es el causal.

Complejidad del clonaje posicional

El positional cloning no siempre es fácil, en el caso del gen rgf del que hablamos antes se usaron
27000 plantas y se encontraron 341 recombinantes entre rgf y el marcador (mn1), como
recombinaban se sabía que estaban en el mismo cromosoma y que no era el mismo gen (que era
la duda que había en un principio). Con este y otros marcadores se realiza el mapa genético,
llegando a una distancia genética de 3’5 cM, sin embargo la distancia física es enorme, de 4’5 Mbp.
El DNA de maíz tiene grandes cantidades de secuencias repetidas y además tiene DNA no
funcional con muchas mutaciones, por lo que decidir qué mutación genera el problema es difícil.

Ejemplo existido de clonaje posicional: Localización

de la mutación MOS2
La primera complicación de este experimento empieza en la mutagénesis. Existía una mutación
llamada npr1 que bloquea la defensa inducida por ácido acetilsalicílico, que genera una respuesta
sistémica en la planta cuando aparece un patógeno, esta mutación impide que las plantas detecten
el ácido acetilsalicílico y es, por tanto, ultrasensible a los patógenos.

Antes de este artículo se realizó otro experimento en el que se encontró snc1, que es un supresor
de npr1, eliminando el fenotipo causado por la otra. El screening de supresores tiene mucho
interés en genética, ya que puede ser muy sencillo al tener un fenotipo muy claro, la idea es coger
un mutante y echarle aún más mutágeno, buscando que desaparezca el fenotipo causado por la
primera mutación. Es muy interesante para encontrar genes de un proceso biológico, ya que son
genes relacionados con la ruta que caracteriza la primera mutación que normalmente son
controlados por el gen definidos por la primera mutación.

Las plantas doble mutantes snc1 y npr1 producen la expresión constitutiva de los genes de
resistencia, además tienen una construcción delatora expresada constitutivamente: pBGL2-GUS. →
promotor de respuesta a patógenos con un gen reporter GUS

MOS2 es un supresor del supresor de npr1, este screening nuevo es coger el doble mutante snc1-
npr1 y someterlo a mutágeno. Derivando entonces nuevos individuos mutantes homocigotos para
MOS2 que suprime el efecto de npr1. El mutante triple de MOS2-snc1-npr1 tiene un tamaño
intermedio y no expresa la construcción pBGL2-GUS, el mutante inicial no expresa genes de
resistencia y es una planta grande y el doble mutante expresa siempre los genes de resistencia y
crece menos.

.
 .

En las plantas que expresan constitutivamente la resistencia es muy fácil ver su fenotipo, ya que si
tiñes la planta para GUS siempre se tiñe, ya que expresa constitutivamente la construcción. La triple
mutante al teñirla no expresa GUS. Que tenga esta construcción es muy importante y disminuye el
trabajo de fenotipado, ya que comprobar el fenotipo tratando de infectar plantas es un proceso
largo; sin embargo, introducir una planta en un sustrato con glucoronidasa y ver si se tiñe es
rápido.

En la caracterización genética se cruza el doble mutante por el triple mutante, con lo cual los
descendientes F 1 son siempre doble mutante (heterocigotos para mos2 y homocigotos para snc1
y npr1), con lo cual la mutación mos2 es recesiva (aabbcc x AAbbcc → Aabbcc no muestra Mos ) .
Entonces se quiso saber qué hacía mos2 en el triple mutante, en el panel A crecido in vitro expresa
un gen de resistencia como PR2, sin embargo el triple mutante no expresa PR2 (por tanto el triple
mutante tiene suprimida la expresión de genes de resistencia). En el triple mutante ni
introduciendo un análogo al ácido acetilsalicílico se produce la expresión de estos genes, es decir,
ni induciendo su expresión. El control de actina sirve como control.

En el panel B vemos que esto afecta a la infección patogénica, en este ensayo se coloca un
patógeno y se observa y califica la enfermedad de la planta. El doble mutante tiene un nivel de
enfermedad muy baja o nula, sin embargo el mutante de npr1 y el triple mutante tienen un nivel
de enfermedad muy alta.
Además, podemos estar interesados en estudiar el gen mos2 solo, para saber que les pasa a las
plantas con esa única mutación. Para ello se usa Mendel, cruzando plantas silvestres con y a partir
del triple heterocigoto derivar plantas que solo muten mos2, esto es difícil porque solo conocemos
el fenotipo. Lo que se hace es seleccionar en negativo, buscando individuos que no lleven las
mutaciones snc1 y npr1; de los restantes 1/4 será homocigotos mos2, la mitad heterocigotos y el
otro cuarto no mutantes.

Mirando el fenotipo de estos individuos se muestra que mos2 mutado muestra mayor
susceptibilidad que el silvestre al ataque de patógenos, de forma que mos2 es necesario para la
respuesta basal de resistencia.

Para el positional cloning se cruzan las plantas de variedad Col mos2 mutada (mos2-1), snc1 y npr1
mutada (npr1-1) con plantas Ler-snc1, dando lugar a una población de mapa. Como conclusión,
todos los individuosde la F 2 son homocigotos de snc1, por lo que veremos el efecto de mos2-1
sobre snc1; es decir, seleccionando que la única mutación que afecta a la resistencia es mos2.

Se analizan las semillas de F3, sembrándolas en una placa con kanamicina, para seleccionar
portadores del reporter pBGL2-GUS, seleccionando así las plantas mos2 (GUS-) de una planta snc1
(GUS+). El reporter entra a la población de mapa por el parental Col, por lo que hay un cuarto
elemento segregando en el mapa, así hay plantas F 2 que tienen el elemento y otras que no. Al
reporter se le añade un gen de resistencia a Kanamicina, por tanto al plantar estas plantas si no se
mueren sabremos si son mos2 o no lo son (ya que qué sean GUS+ es que son homocigóticas para
mos2). Los kanamicina resistente (F3) son los que tienen la construccion del gen y por tanto la
madre tiene el trasngen.
Si encontramos un F3 resistente 3/4 y otro resistente 100% esto se debe a que el del 100% es
homocigoto para el trasngen mientras que 3/4 es heterocigoto. Encontraremos 250 homocigoto
mientras que 5000 heterocigotos.
De 147 líneas seleccionadas, 34 mostraron ausencia de señal GUS (=homocigosis para mos2)
Encontrando 34 plantas con señal y por tanto homocigotas para mos2, con las que se realiza el
experimento de positional cloning.

.
 .

Con estas plantas se localiza la mutación en una zona del cromosoma 1, delimitada por F17F8 y
F28J9, encontrando marcadores flanqueables. Con estos marcadores buscaremos recombinantes en
esta zona, que nos permitirán avanzar en el mapa. Es importante que la planta F 2 sea heterocigota
para mos2-1 y homocigota para pBGL2-GUS, de forma que el gen mos2 siga segregando en
mutantes y no mutantes, permitiendo localizar la mutación en el mapa. Esto tiene de ventaja
porque a partir de ahora solo nos hace falta teñir, no poner kanamicina. ¿Por que tenemos el
heterocigoto? Para poder hacer el mapa y tener recombinacion.
Para continuar con el experimento se fenotipan las plantas mediante tinción GUS y se genotipan,
obteniendo nuevos marcadores que reducen el intervalo, siendo aún grande. Para reducir el
intervalo necesitamos nuevas plantas, cogiendo más plantas de la F 3 anterior, haciendo un
genotipado con los últimos marcadores, encontrando 18 recombinantes (porque los marcadores
estan mas cercas) y se establecen dos nuevos marcadores que generan un intervalo mucho más
pequeño.Con estos recombinantes, y nuevos marcadores, el intervalo en que se encuentra la
mutación se redujo al comprendido entre F6N18 y F14M2

Finalmente, los autores secuencian las 120 kbp que se flanquearon entre los últimos marcadores,
para ello se realiza PCR con cebadores solapantes. Se usa el genoma ya secuenciado de
Arabidopsis, al secuenciar y comparar se dan cuenta de cuál es el gen mos2, ya que la secuencia
de mos2 tiene una mutación que modifica el marco de lectura al inicio de la traducción, generando
una proteína no funcional. El análisis de estos recombinantes con nuevos marcadores situó mos2-1
entre los marcadores T16O9 y T1E4, con 2 recombinantes a cada lado. La región entre T16O9 y
T1E4 tiene unas 120 kb.
Los autores secuenciaron las 120 kbp en la línea mos2-1, mediante fragmentos solapantes de PCR.
(Tienens que secuenciar el mutante que es donde encontraremos alguna alteracion en la
secuencia.)
.

La secuenciación permitió encontrar una inserción de dos T que causa un salto en el marco de
lectura de Mos-2. Aunque la transcripción no se ve afectada, la proteína resultante es muy
probablemente no funcional.
 El análisis genético muestra que un alelo de inserción mos2-2 muestra el mismo fenotipo que
mos2-1, tiene las mismas propiedades en cuanto a la supresión de snc1 y no complementa la
mutación mos2-1.

La transformación de plantas mos2-1 snc1 npr1-1 con una construcción 35S-Mos2 restaura el
fenotipo snc1 npr1-1. Si yo meto mos-2 y la planta se vuelve silvetsre, significa que es
complementario.

Mos-2 es lo que da resistencia

Conceptos
En el método clásico de análisis genético se producen mutantes al azar y se seleccionan
fenotipos relacionados con el problema en estudio
Utilizando técnicas de análisis genético estándar, los mutantes de interés pueden ser clasificados
en clases de acuerdo al gen o genes afectados
El análisis detallado del fenotipo de los mutantes produce grandes cantidades de información
sobre el proceso biológico en estudio
La naturaleza molecular del gen causal de la mutación desvelará nuevas formas de estudio del
.
fenotipo, y puede determinarse (clonaje posicional), utilizando técnicas de análisis genético
estándar, o combinadas con NGS
La identidad del gen causal debe confirmarse: nuevos alelos y/o complementación
 Outline de un experimento de genética clásica
Definición del problema que queremos estudiar: desarrollo del ala
Producción de una colección de mutantes
Búsqueda de fenotipos de interés para el problema seleccionado en 1º
Clasificación de las líneas mutantes: dominantes, recesivas, letales...
Definición de los genes representados en nuestra colección de líneas mutantes de interes: test de
.

alelismo-grupos de complementación
Análisis del fenotipo de las líneas de genes de interés
Clonaje posicional de un representante de cada grupo
Análisis molecular de todos los alelos de todos los genes en nuestra colección de líneas
mutantes de interés
Generación de nuevos alelos / Complementación donde sea necesario
Fenotipo

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 Genética molecular À

Anotaciones
.
.
 Gen Mol - Tema 5 - Test
 Genética molecular À

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Recursos

. Cómo encuentro la línea con inserción en mi gen favorito?

. Por Blast contra una base de datos de FSTs
. Por Blast contra una base de datos de ESTs
. Por Blast contra una base de datos de Proteínas
. Por Blast contra una base de datos del genoma
. Comparada con la utilización de transposones, la utilización de TDNA:
. Da lugar a líneas mutantes con menos esfuerzo técnico
. Da lugar a líneas mutantes no transgénicas
. Da lugar a líneas mutantes más estables
. Da lugar a líneas mutantes más inestables
. La inserción en mi gen diana parece asociada con un fenotipo, ¿confirmación?
. Mapa genético
. Complementación con el gen silvestre
. Eliminación de la inserción mediante recombinación
. Eliminación de la inserción mediante restricción
. Para encontrar nuevos genes asociados con el desarrollo del epitelio podemos:
. Complementar el mutante de inserción
. Mutagenizar el mutante de inserción
. Revertir el mutante de inserción
 . Buscar alelos adicionales del mutante de inserción
. Las colecciones de mutantes por inserción de Arabidopsis:|
. Son solo accesibles para los miembros del consorcio de laboratorios que las creó
. Son accesibles para cualquier investigador que esté dispuesto a realizar el screening por PCR
. Son accesibles para cualquier investigador que esté dispuesto a cubrir los gastos del
screening por PCR
. Son accesibles para cualquier investigador
. La mutagénesis por inserción es genética reversa porque consiste en insertar un DNA exógeno:
. Al azar, buscando luego el fenotipo de interés
. Al azar, buscando luego la línea con inserción en el gen
. Directamente en el gen seleccionado
. En el fenotipo que resulte biológicamente informativo
. Si queremos estudiar la función de un gen que está triplicado en el genoma
. Tenemos que localizar una línea de la colección que lleve una inserción en cada una de las
tres copias del gen
. Basta con encontrar una línea con inserción en una de las copias y autofecundarla para
buscar triples homocigotos
. Basta con encontrar una línea con inserción en una de las copias y luego realizar
experimentos de complementación con las otras
. Tenemos que encontrar una línea de inserción para cada una de las copias y realizar
cruzamientos entre ellas
. El fenotipo de un mutante de inserción consiste en epitelio desorganizado
. El gen diana es responsable de la organización del epitelio
. La función del gen es impedir el desarrollo del epitelio
. El transposón afecta al desarrollo del epitelio
. El gen diana no se expresa en epitelio
.

. Una vez detectada una línea portadora de inserción en nuestro gen de interés:|
. Tenemos que analizar molecularmente el posible efecto de la inserción en la función del gen
. Tenemos que localizar el gen de interés en el mapa genético
. No podemos analizar molecularmente el posible efecto de la inserción en la función del gen,
porque no conocemos su secuencia
. Tenemos que examinar la secuencia del gen de interés para ver si se han producido
mutaciones puntuales
. La utilización de transgénesis para producir colecciones de mutantes de inserción está limitada:
. Por el tamaño de las construcciones transgénicas
. Porque el efecto de posición puede hacer que el transgén funcione de forma variable en
diferentes líneas
 . Por la eficiencia de transgénesis en la mayoría de los sistemas biológicos
. Por la legislación anti-transgénicos
. El genotipado de los individuos descendientes de la línea de inserción:
.

. No se puede realizar porque desconocemos el fenotipo

. Se puede realizar con PCR y cebadores del transposón
. Se puede realizar con PCR y cebadores del gen
. Se puede realizar con PCR y cebadores del gen y transposón
. La mutagénesis por inserción tiende a producir alelos
. De pérdida de función génica
. De reducción de la función génica
. Mutantes puntuales
. Mutantes de deleción cromosómica
. ¿Qué inserción es potencialmente más deletérea?
. En el espacio intergénico
. En intrón\
. En exón
. En promotor
. Las inserciones en promotor pueden causar efectos fenotípicos porque:
. Alteran el marco de lectura de la proteína
. Pueden provocar un procesamiento anormal de los intrones del mRNA
. Pueden provocar una modificación postraduccional anormal de la proteína
. Pueden alterar el patrón de expresión del gen
. ¿Cómo encuentro la línea con inserción en mi gen favorito?
. Por PCR con cebadores del gen
. Por PCR con cebadores del transposón
. Por mapa genético
. Por PCR con cebadores del gen y el transposón
. Una vez detectada una línea portadora de un posible KO en nuestro gen de interés
. Deberíamos observar un fenotipo causado por la pérdida de función del gen, en los
individuos portadores de la inserción
. No deberíamos observar aun ningún fenotipo, antes hay que mutagenizar todos los genes
relacionados con nuestro gen de interés
. No deberíamos observar aun ningún fenotipo, antes hay que determinar la posición del gen
en el mapa genético
. No deberíamos observar aun ningún fenotipo, antes hay que cruzar los individuos
portadores de la inserción hasta conseguir homocigotos para el KO|| |

ᛟ
 ᛟ

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[[]]

Anotaciones

.
Gen mol - Tema 6 - Genética reversa I. Análisis de
la función génica por mutagénesis insercional
 Genética molecular À

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Recursos
Gen mol - Tema 6 - apuntes.pdf
6. Mutagénesis insercional 2.pdf
Gen Mol- Tema 6 - Presentación.pdf

ᛟ .

Producción de organismos transgénicos

El método de transgénesis fundamentalmente depende del organismo. La inserción del vector
de transformación se produce esencialmente al azar, en sitios que han sufrido roturas de
doble cadena. Es un suceso poco probable, el vector de transformación debe portar algún
[1]
elemento para la selección (la eficiencia del proceso es mejor) .

Podemos utilizar transgénesis en complementación. En este tema utilizamos la transgénesis

como mutágeno, por lo tanto, tenemos varias líneas transgénicas, todas diferentes, ya que se
ha producido al azar → en sitios diferentes. Además, será heterocigoto porque el transgen no
está en el cromosoma homólogo.

Generación de mutantes por inserción de

elementos transponibles
El término transposición describe la transferencia o movimiento de un gen, un número
pequeño de genes ligados o un fragmento del tamaño de un gen. Esto lo podemos observar en
todos los genomas. Su función puede ser la reorganización cromosómica para generar variedad
o evolución. Cualquier entidad genética de este tamaño puede denominarse elemento genético
transponible. Los elementos genéticos transponibles pueden moverse a posiciones nuevas
dentro del mismo cromosoma o hacerlo incluso a un cromosoma diferente. Se detectaron
genéticamente gracias a las anomalías que producían en las actividades y estructuras de los
genes cercanos a las posiciones a las que se movían

Podemos ver un elemento de inserción

En general es mala idea hacer un PCR en algo que no salga, la solución es hacer
una PCR desde el elemento de inserción al gen. Si yo cojo los dos oligos y me
sale un producto de PCR , esto me indica que hay un elemento de inserción
metido en el gen. La distancia entre el oligo del gen y del elemento del inserción
debe de esta a una distancia razonable si no no sale el PCR.
Hay una ventaja → puedo mezclar individuos. Puedo poner 100 individuos juntos
y sacar una PCR. Si me sale positivo 1-2/1-3 es que uno de ellos tiene esa
inserción
Te ahorras hacer muchos pcr. Si existiensen 2 saldrian 2 bandas distintas

Mutagénesis insercional
Aplicaciones
La inserción de transposones y T-DNA (Arabidopsis) puede ser utilizada en mutagénesis:

En aplicaciones de <Forward genetics=, el elemento insertado proporciona una etiqueta que

puede facilitar el aislamiento del gen mutado por perdida o ganancia (<activation tagging=)
de función. Vas a etiquetar los genes ya que a los transposones los puedes modificar para que
.

no eliminen genes si no que los active. → Supongamos que Yo hago una colección de
mutación de inserción → puedo UTILIZARLO PARA HACER genética DIRECTA? Si yo tengo una
colección de mutantes, si la puedo utilizar y la única cosa que tengo que hacer para
seleccionarla es buscar el fenotipo. Encima tengo la ventaja en que el gen esta etiquetado. No
se usa mucho porque hay menos individuos que en una colección de mutágenos químicos
que puedo generar miles.
 En <gene trap= el elemento de inserción proporciona un marcador que facilita el análisis del
patrón de expresión del gen. Puedes hacer un transposón que sea un reporte y detectar
donde se expresa el gen donde se inserta el transposón. → También puedes hacer un
transposón en el que lo que hayas metido sea un repórter . Ahora detectas donde se expresa
el gen
El desarrollo de técnicas de <screening= masivo permite utilizar estas colecciones mutagénicas
por inserción en genética reversa para crear mutantes KO → De esto va el tema

Mutagénesis insercional en plantas

.

Mediante transposones
Los transposones tienen una ventaja frente al T-DNA ya que no requieren prácticamente de
trabajo, por el hecho de que este es un elemento móvil autónomo, integrándose al azar con
reacciones catalizadas por su propia maquinaria. Los más utilizados son de maíz, como los
grupos Mu, Ac/Ds o En/Spm que tienen diferencias en el número de copias en el genoma y la
capacidad de saltar.

Se trata de esperar a que estos transposones salten, generando grandes colecciones. Además,
tiene posibilidad de reversión, es decir, ciertos descendientes de un individuo con
transposones pueden no tener este transposón debido a saltos del elemento. Así, si el
transposón se va y recupero el fenotipo silvestre, se puede considerar al gen como el causal del
fenotipo.

El principal problema es la inestabilidad de los elementos, resultando en individuos extraños

con fenotipos nuevos en cada generación debido a que pueden saltar en el genoma generando
fenotipos de no interés. Por ello, si ya tienes tus líneas mutantes, no te interesa que se
produzcan nuevos saltos y se encuentren nuevos fenotipos, ya que se pierde la asignación
fenotipo-genotipo.

T-DNA
El T-DNA es un trozo del dna que va en un plásmido. Dentro puedes cargar de cualquiera, lo
metes en Agrobacterium, de ahí a la planta y lo tendremos → Es un elemento de producción
de elementos transgénicos que se puede utilizar para generar individuos mutantes por
inserción, por ejemplo, mediante Agrobacterium tumefaciens. La desventaja de estos frente a los
transposones es que tendrán menor número de copias en el genoma, así con un menor número
de copias se necesita una colección más grande para tener posibilidades de mutar el gen de
interés.

Sin embargo, menor número de copias también significa un genoma más limpio y estable,
dejando de movilizarse en el genoma. Además, tampoco tiene preferencias por sitios de
inserción, mientras que los transposones suelen preferir los inicios de transcripción de un gen,
generando sesgos en la ubicación de los elementos de inserción. Los trasnposones no hacen
eso. Por ejemplo el elemento Mu se mete en el 5'UTR, siendo un fastidio porque no lo sabes.
No sabes si va a dar fenotipo o no, pero si no ves un fenotipo obvio como sabes si lo estas
mirando o mal o es que no lo hay.
El problema del T-DNA es que se necesita transgénesis, implicando miles de líneas
transgénicas que es imposible en algunas especies, ya que puede llevarte muchos meses e
incluso años. Por ello, esta herramienta se limita tan solo a Arabidopsis.

La mutagénesis insercional en plantas es mediante transposones y mediante T-DNA, que

.

aplicado a Arabidopsis es lo que ha producido un salto en el conocimiento de la biología de

plantas.

Mutagénesis insercional en Drosophila

El elemento P es un eficaz vector de transformación en un sistema de dos componentes.
También es un eficaz elemento de inserción, por desgracia limitado a Drosophila. Como
mutágeno insercional existen sofisticadas versiones para activación tagging, gene disruption y
gene (enhancer) trap.

El objetivo es que se inserte el elemento P en el genoma y se elimine. Es un transposón de

Drosophila. Básicamente coges el dna del elemento P y lo pinchas a una larva en el culo, la cual
al crecer y sea adulto dará mosquitas con el elemento P insertado.

Es un transposón con sus elementos repetidos (flechas negras).

Aprovechando eso meten un montón de elementos para hacer cosas.

El elemento solo knock out es el de abajo (gene disruption) su objetivo es que
aterrice en el genoma y elimine la actividad de un gen.
Enhancer trap: la idea es poner un gen reporter. El lacZ hace que las células
generen el color azul. Si ese transposón cae sobre un gen que esta en ojo coge
las señales reguladores del gen y vea los ojos teñidos. Atrape genes en función su
expresión. Capturo el patrón de expresión del gen y veo el fenotipo resultante.

Mutagénesis insercional en Vertebrados

 Sleeping Beauty: transposón tipo TC1/mariner reconstruido a partir de un elemento
durmiente encontrado en peces que no tiene la transposasa por lo que no puede moverse.
Esto es habitual en el genoma, encontrando muchos restos de transposones inactivados. Se
puede resucitar modificando las transposasa. Se ha utilizado, ya que es capaz de transponerse
en varias especies, como en células embrionarias de ratón y en células somáticas de ratón.
Piggy back: se extrajo de una polilla y se ha modificado para que salte en mamíferos, con
ventajas frente al otro → admitiendo mayor cantidad de DNA, menor tendencia a la
transposición ligada (que es lo que ocurre cuando un transposón salta a un lugar donde
estaba antiguamente, obteniendo un montón de líneas que tienen el transposón cerca de la
línea anterior, esto dificulta el análisis de genes alejados en el genoma). Los transposones son
capaces de saltar del gen en el que están, por lo que si se revierte una mutación sabremos
que la mutación estaba casada por ellos, pero a veces deja una huella de bases (5 bases por
ejemplo) manteniendo el KO. Sin embargo, este transposón no deja huella, por lo que el salto
genera liberación del KO en caso de que el transposón hubiese causado la mutación.

Construcción de una colección de Mu y de una

TDNA
Colección Mu
Para construir una librería de mutantes de maíz se cruza una variedad de maíz silvestre con una
variedad con un elemento Mu activo, con transposasa y capaz de saltar. Esto no es bueno para
las variedades cultivables para la ingesta de maíz, lo normal es que los elementos Mu en estas
variedades sean inactivos (mu off).

Tras el cruzamiento obtienes una F1 muy poco homogénea, ya que contamos con un
transposón que está saltando (tanto los activos como los inactivos, ya que los Mu activos
.

introducen en el genoma transposasa, que cataliza el salto de cualquier región del genoma
que tenga Mu). Así, tendremos diferentes líneas F1 que pueden ir desde la 1.1 hasta la 1.40000
con diferentes mutaciones y lotes de transposones moviéndose.

A continuación se hace screening para saber cuál de las líneas lleva en el gen de interés un
elemento de inserción que elimina la función génica.

Cada F1 se cruza con otra línea de maíz llamada Mu-Killer, que silencia los Mu's de las
colecciones, impidiendo que salten (estabilizando las colecciones y permitir asociar un fenotipo
a un genotipo) y generando colecciones de mejor calidad.

Plantas con T-DNA

En las plantas con T-DNA se introduce en el genoma de una planta wt el T-DNA, que es un
plásmido con una serie de genes de interés como reporters o resistencia. Obteniendo tras la
transformación una serie de muchas plantas (≈100000 plantas) con el transgén integrado en
diferentes puntos del genoma.
Las ventajas de este procedimiento es que el inserto es inmóvil desde el principio, no salta. El
problema es que es un transgénico, que tiene problemas técnicos al ser un trabajo enorme,
pero también legislativos. Hay colecciones de varias plantas construidas mediante este
procedimiento, pero son escasas, en Arabidopsis es fácil debido a la sencillez de la técnica, tan
solo colocando la planta en una solución con Agrobacterium, esperando a que germinen, salgan
.

las flores y luego las semillas, que serán transgénicas

Identificación de mutantes experimentalmente y

en bases de datos.
Una colección son muchas líneas con una gran probabilidad de tener una inserción en el gen.
Los parámetros críticos en la generación de colecciones son:

. El nivel de saturación, una colección muy saturada es una colección que tiene alta
probabilidad de tener insertos por todo el genoma.
. La homogeneidad de distribución de inserción es importante, ya que debemos tener
inserciones en todas las líneas.
. El número medio de inserciones germinales, que tiene que ver con la dosis de mutágeno
utilizado. Cuanto más mutágeno de introduce en el organismo más difícil es hacer el estudio
fenotípico pero más pequeña será la colección. Las inserciones germinales son las que se
transmiten de generación en generación, hablando de inserciones que afecten a todas las
células de la planta, que da lugar a semillas con células mutadas. Las inserciones somáticas se
dan por salto de los transposones a lo largo del desarrollo.

En Arabidopsis para tener una inserción determinada en un gen concreto se necesitan 120000
inserciones independientes, con una probabilidad del 95%.

Distribución de inserciones Mu en 72 genes, en una colección de 43,776 plantas F1. Tan solo en
unos 40 genes habría inserciones, de forma que en unos treinta no se han encontrado
inserciones (partiendo entonces de un 60% de fracaso). Cuando se encuentra un transposón en
un gen esto no quiere decir que tenga un efecto, puede que haya caído fuera de un gen,
aguasabajo de este o en un pseudogen.

Tener varias inserciones en un mismo gen es bueno, ya que encontraremos varios alelos
mutantes en diferentes organismos, encontrando líneas en las que verificar que el fenotipo está
causado por la inserción del transposón.
 Vemos cantidad de inserciones por screening de genes

Se hacen pools de individuos para hacer PCRs, haciendo PCR de varios individuos a la vez.
En estas PCR se usa un primer de transposón y otro del gen, así solo en el individuo en el que
esté el DNA metido en el gen cerca del primer específico va a salir banda. Así nos permite
juntar cientos de individuos basándonos en la sensibilidad de la PCR, reduciendo el número de
PCRs a realizar.

Las bandas obtenidas se hibridan por Southern blot y se aseguran de que la banda tiene lo
que debería de tener. Hibridando con el gen, asegurando que la banda no es un artefacto, ya
que es capaz de hibridar tanto con el T-DNA como con el gen.

Entonces deshacen los pools que han dado positivo, haciendo PCR individual de lo pools y
observando que individuos muestran el inserto; encontrando así la línea mutante.

Entonces tenemos una planta con un gen presuntamente inactivado por el inserto,
tendremos entonces que confirmar que el gen no funciona y estudiar cual es el genotipo
causado.

.
 .

El sceening es coger el DNA y hacer pools y super pools

en estos aplicamos una PCR y buscamos en ella la inserción con diferentes primers
por ejemplo el 1 y el 2. Si usamos por ejemplo el primer de transposón 2 y de la
inserciñon uno por la derecha llegamos antes es mas cerca y la PCR sale, si
usamos 2 y 3 no sale la PCR. En el gel de arriba vemos como en la PCR se ve por
el cebador la banda

Las inserciones somáticas del transposón son un problema para el estudio. Para ello se han
diseñado métodos de screening que les permite en la PCR eliminar el problema de las
inserciones somáticas. Se realiza entonces un screening bidireccional, para ello se organiza un
pool de PCR que no es al azar, partiendo de una parcela de maíz con filas y columnas se coge
DNA de la misma fila de una zona concreta del maíz (por ejemplo, la segunda hoja). Se hace el
mismo proceso en las columnas con otra zona concreta del maíz (por ejemplo, la tercera hoja).
Haciendo PCR con el pool obtenido de una fila y otra PCR con el pool de la columna, si se
obtiene una banda en ambos pools quiere decir que se trata de una inserción probablemente
germinal que va a resultar ser la de la inserción entre fila y columna. Además dice que se
localiza la planta que es responsable del positivo, que será en la que intersecciones la fila y la
columna.

En la imagen B hacen un Shouter de la Hoja

A partir de este tipo de razonamiento aparecieron los pools tridimensionales y
multidimensionales

Supongamos que hemos encontrado nuestro mutante, entonces haremos un análisis de

ligamiento desde el gen seleccionado y un fenotipo. Haremos un análisis de ligamiento entre la
inserción y el fenotipo, es decir, hemos de demostrar que en las plantas con la inserción
obtenemos un fenotipo y en las que no lo tienen obtenemos otro. También hay que hacer
experimentos de complementación (o reversión, buscando recuperar el fenotipo cuando el
transposón salta) + alelos adicionales.
.

Al meter el transposon en un homocigoto da albino, luego ese es el gen que busco, si le quito
el transposon da fenotipo silvestre → reversión.

Complementación metemos el gen silvestre sin transposon en el mutante y debe dar el silvestre

Utilización de inserciones somáticas como

herramientas de investigación
Por ejemplo en usan inserciones somáticas para sacar las mutaciones. así no nos interesa
conseguir miles de líneas del ratón con el transposón en diferentes partes del genoma (no es
posible) y se aprovechan de la movilidad somática del transposón para buscar patologías
somáticas como el cáncer. Si el ratón con Sleeping Beauty sufre de un tumor y accedemos a su
DNA nos encontraremos a Sleeping Beauty interrumpiendo un gen supresor de tumores.

Con este tipo de estrategias se identifican un gran número de genes implicados en patologías.

Identificación de mutantes experimentalmente y

.

en bases de datos
El screening por PCR es algo que ya no se hace desde 2010, cuando empiezan a desarrollarse
bases de datos en las que se colocan tags que dicen en que puntos del genoma están
insertados los transposones o T-DNA, pudiendo buscar un genoma con el transposón insertado
en el lugar de interés y pidiéndolo al laboratorio. Esto ha sido posible gracias a que a principio
de siglo además de realizar los poolings se intentaba encontrar cual era la posición del
transposón o del T-DNA en cada línea de la colección, con el objetivo de ser un recurso
científico, disponiendo de una base de datos para buscar que inserción tiene el genoma.

La idea es que en el genoma hay transposones y con el inversor display se quiere identificar las
secuencias adyacentes a los transposones, ya que a los lados de este tendré unas secuencias
características. Si mediante PCR identifico cuales son las secuencias (etiquetas de secuencias
flanqueantes FST) por lo que buscar una inserción ya no es hacer una PCR sino buscar una FST
en un gen favorito, buscando en BLAST de las líneas de una colección.

Las colecciones de FST han salido de diversas técnicas que nos permite encontrar secuencias de
nuestro mutante favorito.
 Tenemos que cortar el genoma utilizando una enzima. Pero esta enzima cortará
diferentes partes del genoma, no solo el que queremos. Los trozos formados se
pueden amplificar por PCR, pero no de manera directa ya que nos falta una
parte de información de ese trozo. Para eso utilizamos un adaptador. Ahora si
que si realizaríamos una PCR, utilizando uno o varios cebadores anillados del
transposón y un cebador del adaptador. A base de oligos de la zona de azul y
zona verde voy a conseguir hacer PCR que al final nos dará diferentes FST. Al
final si tengo 40.000 indv de la colección puedo obtener 80.000 FST.

Si quieres mirar un mutante de Arabidopsis, seguramente esta en la colección , solo tienes que
buscar colecciones de FST y hacer BLAST???

.
*Por ejemplo: en la página web de la presentación, ponemos y elegimos un gen que queremos
estudiar. En Query ponemos la matricula del gen (buscándola en TAIR; por ejemplo STARCH
SYNTHASE : AT1G11720) Vemos que hay 2, (.1 o .2) eso significa que hay 2 versiones alternativas
porque en una han encontrado un exón más largos. Vemos que ese gen tiene un montón de
inserciones. Cada FST esta en un sitio diferente, y elegir uno bueno es viendo cuál coincide más
en un exón. Cuanto mas arriba este el FST mejor será, si es un FST muy alejado del principio de
la transcripción, puede ocurrir que el genoma este dañado.

Hoy en día hay 342832 secuencias mapeadas.

Las colecciones que se hicieron por inserciones que se generan al azar se utilizaron para obtener
información de secuencias sobre esas inserciones mediante Inverse Display of Insertions,
haciendo PCR para encontrar las secuencias que flanquean los transposones en el genoma de
todas las líneas de la colección (buscando los FSTs en cada línea), por lo que ya no hay que
hacer PCR, basta con ir a la base de datos y buscar la FST, así si encuentras que la secuencia de
gen está reflejada en 100 bases de un FST proveniente de una línea determinada sabes que en
esa línea hay una inserción en el gen de interés en la posición determinada.
.

Una vez obteniendo un mutante hay que caracterizarlo, tenemos una línea con una inserción
por lo que verificaremos si la inserción es potencialmente mutagénica. Si se ha eliminado la
función del gen debería aparecer un fenotipo, que reflejaría la función del gen en la planta. Si
no aparece el fenotipo puede ser que no se esté mirando en las condiciones adecuadas, la
cantidad de variables a estudiar es infinita, ya que los factores ambientales son clave. Si no
aparece fenotipo en las condiciones observadas puede ser que no hayas mirado todas las
funciones o haya funciones génicas duplicadas, en ese caso comienza el proceso de obtención
de dobles o triples mutantes, y puede que aparezca un fenotipo.

En genética reversa los fenotipos pueden llegar a no aparecer debido a que pueden tener
funciones muy sutiles.

Entonces;
. Genotipado del material recibido. ¿Cómo sé que lo que he plantado es lo que he pedido?
Necesitamos genotiparlo si o si para asegurarme. Esto se realiza por PCR porque sabemos
que en el genoma hay un gen el cual tiene una inserción en un exón. Si lo que queremos ver
esta en el PCR, saldrá positivo en esta; si no, es que nos han engañado. Para saber si es
homocigoto o heterocigoto, con otra PCR, con dos oligos (1 y 2) a ambos lados a diferencia
de la otra PCR que fue en solo un lado; si sale positiva, significa que tiene un lado con
inserción y otro lado sin, siendo heterocigoto.
. Obtención de homocigotos para la inserción. Realizamos varias PCR:
1. FSI heterocigoto
2. FS2 Homocigoto silvestre
3. FS3 Homocigoto mutante
2. Si nos sale 2/3 de heterocigoto y 1/2 de homocigosis; significa que la homocigosis mutante
es letal y no nos sale,
. Análisis fenotípico

Conclusión
. En Genética reversa por mutagénesis insercional intentamos producir mutantes, generalmente
de pérdida de función (KO), por inserción de un DNA exógeno en el gen de interés
. El proceso implica producir una colección de mutantes al azar por inserción de un transposón
o, en Arabidopsis, T-DNA
. La búsqueda del mutante en el gen de interés se realiza por PCR o <in silico= si existe una base
de datos de FSTs
. Una vez localizada la línea portadora de inserción:
Verificar el efecto molecular de la inserción---producir individuos homocigotos para la
inserción---análisis fenotípico detallado
. Confirmación mediante alelos adicionales/complementación

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Anotaciones
ᛟ

. ↩

.
 Gen Mol - Tema 6 - Test
 Genética molecular À

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Recursos
.

. Cómo encuentro la línea con inserción en mi gen favorito?

. Por Blast contra una base de datos de FSTs
. Por Blast contra una base de datos de ESTs
. Por Blast contra una base de datos de Proteínas
. Por Blast contra una base de datos del genoma
. Comparada con la utilización de transposones, la utilización de TDNA:
. Da lugar a líneas mutantes con menos esfuerzo técnico
. Da lugar a líneas mutantes no transgénicas
. Da lugar a líneas mutantes más estables
. Da lugar a líneas mutantes más inestables
. La inserción en mi gen diana parece asociada con un fenotipo, ¿confirmación?
. Mapa genético
. Complementación con el gen silvestre
. Eliminación de la inserción mediante recombinación
. Eliminación de la inserción mediante restricción
. Para encontrar nuevos genes asociados con el desarrollo del epitelio podemos:
. Complementar el mutante de inserción
. Mutagenizar el mutante de inserción
. Revertir el mutante de inserción
 . Buscar alelos adicionales del mutante de inserción
. Las colecciones de mutantes por inserción de Arabidopsis:
. Son solo accesibles para los miembros del consorcio de laboratorios que las creó
. Son accesibles para cualquier investigador que esté dispuesto a realizar el screening por PCR
. Son accesibles para cualquier investigador que esté dispuesto a cubrir los gastos del
screening por PCR
. Son accesibles para cualquier investigador
.

. La mutagénesis por inserción es genética reversa porque consiste en insertar un DNA exógeno:
. Al azar, buscando luego el fenotipo de interés
. Al azar, buscando luego la línea con inserción en el gen
. Directamente en el gen seleccionado
. En el fenotipo que resulte biológicamente informativo
. Si queremos estudiar la función de un gen que está triplicado en el genoma
. Tenemos que localizar una línea de la colección que lleve una inserción en cada una de las
tres copias del gen
. Basta con encontrar una línea con inserción en una de las copias y autofecundarla para
buscar triples homocigotos
. Basta con encontrar una línea con inserción en una de las copias y luego realizar
experimentos de complementación con las otras
. Tenemos que encontrar una línea de inserción para cada una de las copias y realizar
cruzamientos entre ellas
. El fenotipo de un mutante de inserción consiste en epitelio desorganizado
. El gen diana es responsable de la organización del epitelio
. La función del gen es impedir el desarrollo del epitelio
. El transposón afecta al desarrollo del epitelio
. El gen diana no se expresa en epitelio
. Una vez detectada una línea portadora de inserción en nuestro gen de interés:
. Tenemos que analizar molecularmente el posible efecto de la inserción en la función
del gen
. Tenemos que localizar el gen de interés en el mapa genético
. No podemos analizar molecularmente el posible efecto de la inserción en la función del gen,
porque no conocemos su secuencia
. Tenemos que examinar la secuencia del gen de interés para ver si se han producido
mutaciones puntuales
. La utilización de transgénesis para producir colecciones de mutantes de inserción está limitada:
. Por el tamaño de las construcciones transgénicas
. Porque el efecto de posición puede hacer que el transgén funcione de forma variable en
diferentes líneas
 . Por la eficiencia de transgénesis en la mayoría de los sistemas biológicos
. Por la legislación anti-transgénicos
. El genotipado de los individuos descendientes de la línea de inserción:
. No se puede realizar porque desconocemos el fenotipo
. Se puede realizar con PCR y cebadores del transposón
. Se puede realizar con PCR y cebadores del gen
. Se puede realizar con PCR y cebadores del gen y transposón
. La mutagénesis por inserción tiende a producir alelos
. De pérdida de función génica
. De reducción de la función génica
. Mutantes puntuales
. Mutantes de deleción cromosómica
. ¿Qué inserción es potencialmente más deletérea?
. En el espacio intergénico
. En intrón
. En exón
. En promotor
. Las inserciones en promotor pueden causar efectos fenotípicos porque:
. Alteran el marco de lectura de la proteína
. Pueden provocar un procesamiento anormal de los intrones del mRNA
. Pueden provocar una modificación postraduccional anormal de la proteína
. Pueden alterar el patrón de expresión del gen
. ¿Cómo encuentro la línea con inserción en mi gen favorito?
. Por PCR con cebadores del gen
.

. Por PCR con cebadores del transposón

. Por mapa genético
. Por PCR con cebadores del gen y el transposón
. Una vez detectada una línea portadora de un posible KO en nuestro gen de interés
. Deberíamos observar un fenotipo causado por la pérdida de función del gen, en los
individuos portadores de la inserción
. No deberíamos observar aun ningún fenotipo, antes hay que mutagenizar todos los genes
relacionados con nuestro gen de interés
. No deberíamos observar aun ningún fenotipo, antes hay que determinar la posición del gen
en el mapa genético
. No deberíamos observar aun ningún fenotipo, antes hay que cruzar los individuos
portadores de la inserción hasta conseguir homocigotos para el KO

ᛟ
 ᛟ
.

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 Genética molecular À

Anotaciones
Gen mol - Tema 7 - Genética reversa II. Análisis de
la función génica por mutagénesis dirigida
.

 Genética molecular À

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Recursos
Gen mol - Tema 7 - Apuntes.pdf
7. Mutagénesis dirigida 1.pdf
Gen Mol - Tema 7- Presentacion.pdf

Base molecular de la recombinación homóloga

El gene targeting mediante recombinación homóloga se realiza construyendo un vector que
contenga al menos parte del gen, que mediante eventos de sobrecruzamiento se incorporará en
el genoma del individuo. Este método tiene una serie de ventajas:

Mutagenización de un solo gen: Seleccionando el gen sobre el que queremos actuar.

Control total sobre la forma en la que queremos modificar el gen: Podemos introducir en la
construcción desde una mutación puntual a cambios en el promotor (alterando la expresión),
pasando por un elemento que cause KO. Entonces, si este método es tan sencillo…

¿Por qué no se utiliza siempre en lugar de los métodos previos? El problema de esta técnica es
que no siempre se puede usar, dependerá del sistema biológico del que se trabaje. Ya que la
eficacia del proceso de mutagénesis dirigida depende de la ratio de recombinación homóloga y
de recombinación ilegítima (HR/HI), estos dos mecanismos son usados por las células para
corregir errores de rotura de doble cadena.

Todo empieza por DNA roto en doble cadena debido a alguna radiación , productos químicos.
Entonces sto es letal si no es corregible de forma inmediata, viendo comprometida su viabilidad.
Aunque no tratemos las células con ninguno de estos mutágenos también se producen las
roturas de doble cadena de forma espontánea, que se corrigen de forma espontánea. Esto se
puede reparar de dos formas:
 Unión de extremos no homólogos (Recombinación ilegítima): Es el mecanismo más
simple y eficaz para arreglar doble cadenas de DNA. Se colocan unas proteínas en los
extremos rotos que reclutan a una ligasa, que sella la doble hebra.
Su principal problema es que es un mecanismo mutagénico, si se pierde un nucleótido
durante la rotura el gen no recupera su función normal (posiblemente cause una
mutación de pérdida de función, ya que la eliminación de uno o dos nucleótidos produce
el cambio del marco de lectura).
Se produce continuamente en cualquier célula y nos permite elaborar individuos
transgénicos, ya que el DNA exógeno puede ser incorporado durante el proceso de
sellado, no solo reparando el DNA, sino también introduciendo un nuevo gen.
Unión de extremos homólogos: Los extremos del DNA roto se une a las proteínas de la
familia Rad, iniciando un proceso diferente, buscando en el núcleo alguna molécula con
secuencias homólogas a la zona que se ha roto. Esto deriva en una invasión de cadena, ya que
la hebra rota hibrida con el DNA integro, que se usa como molde para reparar el DNA roto,
utilizando la cadena molde para copiar los nucleótidos que se hayan podido perder para
después ligarlos.
Este método produce una solución sin mutagénesis para estos cromosomas rotos (para
.

ello posiblemente existan los cromosomas homólogos en eucariotas) y permite, si

introducimos en este proceso un DNA parecido a un elemento del genoma, hacer
recombinación homóloga con ese gen.

Todos los organismos pueden hacer cualquier metodo, el problema es que depende de los
organismos.
Los organismos eucariotas tienen las proteínas implicadas tanto en la recombinación homóloga
como la ilegítima, así que se realice un mecanismo u otro dependerá del propio organismo,
condicionando que se pueda hacer mutagénesis dirigida por recombinación homóloga o no.

La eficacia de la recombinación homóloga varía mucho entre organismos eucariotas, así la ratio
de gene targeting (calculada como HR/HR+IR) más alta es en levaduras (en concreto S.
cerevisae).

Esto quiere decir que si introduces un DNA exógeno en la célula el DNA acabará en el genoma
por recombinación homóloga en S. cerevisae. Así, para los científicos que trabajan con este
organismo tardan cuestión de días o semanas en hacer este proceso, haciendo avanzar el
conocimiento sobre proteínas y procesos celulares eucariotas a pasos agigantados. Finalmente,
la eficacia de gene targeting depende de la utilización de HR en el organismo

Cogemos una levadura, metemos el DNA homologo, para conseguir una serie de colonias. El
95% va a tener recombinación homologa; mientras que un 5% será ilegítima. Por lo cual hacer
gene tagging en levadura es inevitable.

En hongos hay niveles importantes de recombinación homóloga, pero en animales la situación

es mucho más complicada. En las células madre embrionarias de ratón el porcentaje de
recombinación homóloga respecto al total de transgénesis es muy pequeña (entre un 0.1-1%).
Pero aun así han conseguido hacer ratoncitos mutantes por recombinación.

En plantas, es una estrategia con alta tasa de fracaso (más del 99% de eventos ineficaces), esto
quiere decir que se necesitan miles de eventos de targeting para producir una recombinación
homóloga (por tanto no es una herramienta que vaya a usarse). En los últimos años se ha
intentado buscar métodos para mejorar la eficacia:

Sobreexpresión de genes de recombinación homóloga.

Silenciamiento de genes de recombinación ilegítima.
Inducción de daños del genoma en un sitio concreto, aumentando la probabilidad de que en
este sitio se produzca recombinación homóloga. Se trata de inducir la rotura de doble cadena
para introducir el DNA de interés por recombinación homóloga, para ello debemos hacer que
el DNA esté continuamente roto y hemos de introducir un DNA exógeno con extremos que
permitan recombinar con la zona rota. Entonces, la estrategia fue producir daños mediante
enzimas que eran capaces de cortar el DNA en un punto determinado, en lo que se basa la
técnica CRISPR-Cas, aunque se usaban otro tipo de enzimas de restricción con dianas
enormes para seleccionar zonas muy concretas del genoma.

En musgos la recombinación homóloga se realiza casi igual de fácilmente que en las levaduras,
esto abre la puerta al estudio de procesos biológicos de las plantas verdes mediante
recombinación homóloga (como la fotosíntesis)

Tipos de vectores para recombinación

Depende de como orientes la secuencia
 Vector de inserción
Es un vector en el que se favorece la posibilidad de que este se integre en la diana (genoma).
Se trata de un vector circular con una zona homóloga con una región correspondiente del
genoma, produciendo eventos de sobrecruzamientos entre el vector y el genoma (introduciendo
el plásmido dentro del genoma).

Estos vectores no se usan para realizar mutaciones puntuales, sino para hacer mutagénesis
mediante inserción de un elemento extraño en un gen.

Los vectores pueden ser circulares o ends-in (con los extremos partidos), este último tiene una
ventaja: se introduce un DNA que tiene una rotura de doble cadena por tanto se reclutan más
fuertemente las enzimas que ligan el DNA. Es mas estable el otro pero funciona mejor ya que
está roto y puede inducir la reparación directamente.

Al igual que se hace integración se puede producir la escisión, ya que al introducir un vector se
crea una situación en la que sus extremos son homólogos, lo cual puede iniciar un proceso de
recombinación que genera un cromosoma íntegro parecido al inicial y la expulsión del vector de
inserción.
Es decir, cuando integras un vector se duplican los extremos, siendo capaz de hibridar entre
ellos y, si se produce un sobrecruzamiento se generará un cromosoma inicial íntegro y el vector
.

de inserción.

Solo lo hago sobre un organismo y obtengo solo una linea.

Vector de remplazamiento (ends-out).

Ahora necesitamos dos sobrecruzamientos. En esta clase de vectores se cambia una zona del
genoma por lo que va en el vector. Son iguales que los anteriores, con una homología directa
con la diana al principio y al final; tal cual se disponen en el genoma tienen los extremos
homólogos hacia fuera (vectores Ω, ya que al hibridar se produce la hibridación de un extremo
con el principio del gen target y el otro con el final, quedando con forma omega). Estos
vectores eliminan la secuencia sobre los sobrecruzamientos y la reemplazan por la del vector

¿Se podría producir un solo sobrecruzamiento? Sí, pero dependerá de la probabilidad. Es mucho
mas improbable que ocurra 2 , que 1, siendo mejor el otro que este vector. Son menos eficaces
que los anteriores, ya que se necesita de un doble sobrecruzamiento para generar un
remplazamiento viable. Sin embargo, son mucho más versátiles a la hora de alterar un gen,
introduciendo la modificación que nos interese in vitro (promotor sin dominio de expresión,
mutaciones en un aminoácido, etc.) Este nos permite cambia run gen por la versión la que me
de la gana del gen.

Mutagénesis dirigida. Ratón

Un ratón se ha explotado la recombinación homóloga para introducir elementos en el genoma,
para ello se crea un vector Ω (lineal) que lleva una serie de secuencias homólogas antes y
después del gen de resistencia a neomicina (antibiótico). Además, en el extremo fuera de las
secuencias homólogas han colocado un gen de selección negativa (HSV-tk, gen de la timidina
quinasa del herpes virus), que es letal. Así, al introducir estas células en un medio con un
sustrato concreto las que contengan el vector introducido por RI morirán, al sintetizar un
producto letal

En el DNA original el vector trasnformante (lo que hay arriba del todo) .
Tenemos un gen de selección negativa verde y un gen de resistencia neomicina
naranja. Ocurre un evento de recombinación ilegítima. Se mete todo el DNA ,
causando que la célula tenga el gen de resistencia a neomicina pero también de
HSV-tk. Esto genera que sean sensible a FIAU. Se mueren.

Habitualmente se genera una recombinación ilegítima, incorporando el vector mediante el

ligamiento de los extremos de DNA y manteniendo el gen de selección negativa. El resultado es
un genoma con todo el elemento insertado, consiguiendo células resistentes a la neomicina,
pero sensibles al producto metabolizable por la proteína sintetizada por el gen de la timidina
quinasa del herpes simple. Entonces, en un medio adecuado podremos seleccionar en contra de
células que lleven el evento

Esto en plantas es importante, ya que la transformación de un gen para validar unos resultados
por recombinación ilegítima se traduce en que el elemento se inserte de forma aleatoria en el
genoma. Por ello se necesitan miles de transformaciones mediante transgénesis para verificar los
efectos de las construcciones

Lo que los científicos buscaban es que el vector se alinee con la secuencia genómica con la que
tiene homología, lo cual se observa con la presencia de exones.

Gracias a la perfecta homología entre las regiones se van a producir dos eventos de
sobrecruzamiento, que van a integrar de manera precisa el casete dentro del gen diana, que se
encontrará modificado al sustituir uno de sus exones por el gen de la resistencia a la neomicina.

El gen de la timidina quinasa de herpes virus se pierde en el proceso al estar fuera de las
secuencias que recombinan, teniendo un cromosoma modificado de una manera precisa por
recombinación homóloga; las células finales de este proceso tienen resistencia a neomicina pero
también al sustrato de la timidina quinasa. Conseguimos asi un KO.

Este proceso se ha convertido en una herramienta de investigación en los últimos 15 años de

primera magnitud, permitiendo que se seleccionen genes a nivel celular. Por ejemplo, tomando
.

células madre embrionarias que se electroporan y se cultivan en un medio normal; entonces se

plaquean de nuevo en un medio con el análogo de la neomicina y el compuesto tóxico del gen
de selección. Así en estas células solo pueden crecer células en las que se haya producido el
evento de recombinación homóloga, eliminando las células con el gen de selección negativo
mantenido por la recombinación ilegítima. Así, una vez seleccionada las células se pueden
generar ratones modificados de forma concreta. Me da igual que sea un 0,1% ya que me será
fácil encontrar aquel organismo recombinado utilizando un antibiótico adecuado que me lo
enseñará
El método es muy sencillo, consiste en coger el gen celular de células madre transformadas e
introducirlo en un blastocisto que se extrae de otro ratón con otro genotipo, de manera que las
células introducidas van a colonizar el blastocisto, produciendo un blastocisto quimera (con
células originales del blastocisto y con células insertadas).

Este blastocisto se inserta en un útero y se completa en ella el desarrollo embrionario,

generando ratones quimera, ya que parte de su cuerpo viene de células modificadas y células
que no lo están. Para conseguir ratones puros se realizan diferentes cruzamientos, estudiando
en la descendencia el fenotipo de la modificación introducida por recombinación homóloga.
Normalmente se modifican otros genes para poder hacer un seguimiento de la quimera,
sabiendo la transmisión genética de los caracteres.

En este proceso se generan ratones quimera, que son difíciles de monitorizar a lo largo de los
cruzamientos; en esta imagen se genera mutagénesis dirigida en el gen M de un solo
cromosoma, siendo entonces heterocigoto para el gen M (Mm)

Estas células Mm se introducen en el blastocisto de un ratón con pelaje de distinto color (en
este caso negro), así en el blastocisto habrá células capaces de dar pelo de color marrón (con el
elemento insertado) o de color negro. Entonces, la madre adoptiva que da lugar a ratones
quimera, que se podrán ver a través del pelaje (cuanto más pelaje marrón mayor contribución
tienen las células modificadas para dar lugar a la quimera, ya que la parte negra viene del
blastocisto receptor)

Así, la quimera madura estará constituida por células aaMM (cubierta negra y sin modificación) y
células AAMm (cubierta marrón y modificación), esto se cruza con hembras negras sin mutación
(aaMM).
Este cruzamiento genera

ratones aaMM (que viene de la parte negra del parental, por lo que no tienen la modificación)
ratones AaMM (son ratones heterocigotos para el pelo pero sin modificación)
 ratones de interés AaMm (doble heterocigotos, heredando la inserción).

Cuanto mas marrón sea el ratón mas células tienen del organismo manipulado

Despues si cruzamos quimera madura con otro nos saldrá 4 tipos.

El cruzamiento de estos ratones genera individuos que no nos interesan, que vienen de la parte
quimera negra o que tienen pelaje marrón pero no nos interesan por no tener mutación; nos
interesan otra vez los dobles heterocigotos que se vuelven a cruzar obteniendo algunos
homocigotos para el alelo mutante del gen M (nos interesan los individuos A_mm, que
aparecerá en un cuarto de los individuos del cruzamiento).

Para comprobar esto podemos hacer una PCR para ver si el gen tiene el alelo modificado o el
silvestre, ya que estamos hablando de genética reversa con análisis molecular.

La transformación de ES ilustra la necesidad de dominar las leyes de la genética para seguir la

transmisión de estos caracteres. La naturaleza molecular de la mutación puede ser investigada
ya en el proceso de selección del clon ES que se desea transformar.

Verificaciones previas
Para conseguir un mutante por modificación dirigida de un gen concreto mediante
recombinación homóloga requiere de saber si el elemento se integra en el cromosoma que nos
interesa o no (esto puede ocurrir por recombinación ilegítima). Para ello:

Debemos conocer el número de copias de la construcción introducidas en el individuo,

introduciendo un único elemento esto es fácil ya que solo hay un trozo de DNA integrado en
el genoma
-Si hay más copias puede darse un fenotipo que no se genere por la modificación que
estamos monitorizando. Esto no es sencillo de analizar, ya que por PCR solo sabremos si
este elemento se ha integrado, no en qué lugar del genoma; se analiza mediante
Southern blot. Veremos el gen endógeno con la modificación que introduce la
recombinación homologa. Si aparece una banda extra puede ser que se ha organizado de
manera imprevista o se ha introducido en otro sitio.
Hay que verificar también la modificación del gen diana, que debería funcionar de forma
perfecta en recombinación homóloga. Esto requiere secuenciar los extremos de la
recombinación, buscando que no se haya producido alguna pérdida de base.
.
 Hay que estudiar la asociación del fenotipo y el gen diana, hemos de estar seguros de que
los individuos con modificación tienen siempre el gen diana y de que aquellos que no tienen
la inserción no lo tienen.
Hay que generar varias líneas, ya que por el efecto de variabilidad hemos de producir
.

diferentes líneas para verificar el fenotipo que se observe. Al hacerlo en cultivo in vitro, puede
ocurrir alguna mutación espontanea. Ademas diferentes tipos de individuos pueden
reaccionar de diferente forma.

En el caso de la mutagénesis dirigida es también necesario, a pesar de que el elemento de

recombinación se introduzca siempre en el mismo lugar, ya que debemos atravesar una fase de
cultivo in vitro y vamos a generar quimeras en las que pueden ocurrir eventos aleatorios que no
son controlados. Produciremos varias líneas diferentes con varios clones celulares, obteniendo
diferentes quimeras y diferentes ratones; como por ejemplo en varias razas de ratón

Conclusión
La recombinación homóloga permite obtener mutantes en genes específicos de forma
dirigida
Pero solo en organismos donde la HR es eficaz (en la práctica levadura y ratón)
El análisis molecular es necesario para verificar que se ha producido la modificación deseada,
y que no se ha producido ninguna otra modificación
El análisis genético es necesario para establecer el ligamiento modificación–fenotipo en un
sistema complejo (incluye quimeras)
Es posible producir modificaciones inducibles (ver seminario)

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 Genética molecular À

Anotaciones
 Gen Mol - Tema 7 - Test
[[]]

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Recursos

. La recombinación homóloga en ratón

. Permite obtener el fenotipo deseado .

. Facilita la construcción del mapa genético

. Permite solo obtener mutantes KO del gen diana
. Permite modificar el gen diana a voluntad
. Los vectores de inserción
. Contienen una única región homóloga
. No contienen regiones homólogas
. Contienen una región no homóloga y dos regiones homólogas
. Tienen que ser lineales
. En los experimentos de recombinación homóloga, la técnica de southern blot
. Sirve para medir el número de copias del gen diana
. Sirve para medir el nivel de expresión del gen diana
. Sirve para detectar la presencia de la construcción y verificar los extremos del evento de
recombinación
. Sirve para detectar la presencia de la construcción, verificar los extremos del evento de
recombinación y detectar posibles inserciones adicionales\
. |En los experimentos de recombinación homóloga, la técnica de PCR
. Sirve para medir el número de copias del gen diana
 . Sirve para medir el nivel de expresión del gen diana
. Sirve para detectar la presencia de la construcción y verificar los extremos del evento de
.
recombinación
. Sirve para detectar la presencia de la construcción, verificar los extremos del evento de
recombinación y detectar posibles inserciones adicionales
. |Un ratón quimera para un KO
. |Es heterocigoto para el KO
. Es homocigoto para el KO
. Produce descendencia heterocigota para el KO
. Produce descendencia homocigota para el KO
. En un ratón KO condicional
. La inserción del transgén es inducible
. El transgen se ha insertado por recombinación ilegitim
. El transgen se ha insertado como condición
. El KO es inducible
. Para la inducción del KO
. Utilizamos la tecnología CRE/LoxP
. Utilizamos la selección con neomicina
. Utilizamos la selección contra Timidina quinasa
. |Utilizamos PCR
. La recombinación homóloga
. Depende del nivel de transcripción del gen diana
. Es dependiente de los mecanismos de reparación de roturas del DNA
. Depende de la presencia de DNA intacto
. aSolo se produce en meiosis
. Para la obtención de un homocigoto KO, el ratón descendiente del ratón quimera debe:
. Autofecundarse, si él es heterocigoto para el KO
. Retrocruzarse por su parental no quimera, si él es heterocigoto para el KO
. Cruzarse por un hermano no modificado, si él es heterocigoto para el KO
. Cruzarse por un hermano heterocigoto, si él es heterocigoto para el KO
. La recombinación homologa no es una alternativa eficiente para hacer genética reversa en:
. Ratón\
. Levadura
. Physcomitrella
. Plantas superiores
. |El fenotipo de un ratón KO homocigoto|
. Debe ser confirmado en ratones KO heterocigotos
 . Debe ser confirmado en ratones KO derivados de otro clon ESC
. Puede ser confirmado estudiando el ligamiento
. Puede ser confirmado en ratones hermanos del anterior\
. En ratones la reparación del DNA por recombinación homóloga es rara, pero:
. Podemos seleccionar los eventos de interés en fase de blastocisto
. Podemos seleccionar los eventos de interés en fase de quimera
. Podemos seleccionar los eventos de interés en fase de F1\
. Podemos seleccionar los eventos de interés en fase de ESC
. Los vectores de remplazamiento (omega)
. Contienen solo una región homóloga
. Contienen una región no homóloga y dos regiones homólogas
. |Tienen que ser circulares
. No contienen regiones homólogas
. En la producción de ratones KO el marcador de selección negativo
. Sirve para seleccionar en contra de blastocistos
. Sirve para seleccionar en contra de ESCs con recombinación homóloga
. Sirve para seleccionar en contra de ESCs con recombinación ilegítima\
. Sirve para seleccionar en contra de quimeras
. |La activación del KO en un ratón KO condicional
. Implica el cruzamiento del condicional por un ratón que expresa Cre
. Implica el cruzamiento del condicional por una quimera Cre
. Implica el cruzamiento del condicional por una quimera no Cre
. mplica el cruzamiento del condicional por un individuo silvestre
. En la producción de ratones KO el marcador de selección positivo
. Sirve para seleccionar blastocistos
. Sirve para seleccionar madres de alquiler
. Sirve para seleccionar células madre embrionarias transformadas
. Sirve para seleccionar quimeras

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[[]]
Anotaciones

.
 Â Genética molecular À

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Recursos
Gen mol - Tema 8 - apuntes.pdf
8. Edición genómica.pdf
Genética Molecular, Tema 8(5).pdf

Introducción
Si somos capaces de elegir en qué lugar del genoma producimos una rotura de doble cadena se
puede favorecer la recombinación homóloga, de forma que si hay un DNA en la zona con cierta
homología a la zona de rotura podremos realizar recombinación homóloga, modificando los
promotores o incluso el propio gen diana.

Pero tan útil como la recombinación homóloga puede ser la recombinación ilegítima, ya que se
altera la secuencia codificante del gen y se produce un KO, de forma que si se busca la pérdida de
función del gen y no su edición génica es mucho más fácil de realizar que la recombinación
homóloga, ya que en este último caso necesitamos un DNA homólogo. Es mucho más fácil que
usemos la reparación ilegítima para inducir la pérdida de función de un gen.

El genoma es de gran tamaño, así diseñar una herramienta que te permita cortar una única parte
del genoma es complicado, se necesitan enzimas muy precisas.

Las roturas de doble cadena producen incrementos de órdenes de magnitud en la eficacia de gene
targeting. Pudiendo también generar mutaciones del tipo inserción/deleción

.
 Alternativas anteriores para producción de roturas
de doble cadena de forma dirigida
Los dos siguientes mecanismos permitieron realizarlo mediante el reconocimiento DNA-proteína:

Proteínas con dominios Dedos de Zinc y proteínas DNAsas .

(Folk1).
Los TF de un gen se unen al promotor en base a un reconocimiento de secuencia y dirigen la
transcripción. La idea de esta alternativa para cortar un gen en una zona concreta fue construir
una proteína con dominios dedos de Zinc y DNAasas capaces de cortar el DNA por una zona
concreta.

Los dedos de Zinc son estructuras proteicas cuya estructura tridimensional es estabilizada con
átomos de Zn, estos dominios son muy típicos en factores de transcripción (principalmente de
hormonas esteroideas). Cada dedo de zinc interacciona con tres bases del DNA concretas, por lo
que se pueden construir proteínas artificiales que reconozcan el DNA

Para inducir la rotura de doble cadena utilizaremos el dominio DNAasa de una enzima de
restricción (folk1) que solo puede cortar cuando se encuentra formando un dímero. Así, cuando
se reconozcan las bases por cada uno de los monómeros de la enzima se formará un dímero,
reconstruyendo el dominio DNAasa de folk1, que cortará la hebra.

El problema es que la interacción DNA proteína no es tan específica y encima son grandes por lo
que no es del todo eficaz
 Proteínas de dominio TALE
Estas proteínas cuentan con un dominio central capaz de reconocer el DNA siguiendo unas reglas
concretas (es mas específica que los dedos de zinc). El dominio TALE está formado por una serie
de módulos que están compuestos por dos proteínas que reconocen un nucleótido distinto de la
hebra de DNA. Acoplada al dominio TALE tenemos una DNAasa llamada folk1, que cuando
dimeriza corta la doble hebra.

En el sistema TALENs se realizan factores de transcripción diseñados para cortar el DNA, estos
sistemas vienen de patógenos capaces de infectar plantas e inyectar sus factores de transcripción
para obligarlas a expresar genes que faciliten la infección y el desarrollo del patógeno.

Son construcciones con un dominio N-terminal, TALE repeat domain y C-terminal, seguido de una
enzima DNAasa. Combinando diferentes variantes de la repetición de un total de 34 aminoácidos
somos capaces de reconocer un blanco determinado mediante su estructura tridimensional.

Entonces, la idea de ambos mecanismos es inducir la rotura de doble cadena del DNA que tenderá
a ser solucionada por recombinación homóloga o ilegítima. Estos sistemas deben de ser
introducidos en las células como una construcción: un DNA con su promotor, su secuencia
codificante y su terminador, esperando a que este se exprese.

Mecanismo de edición actual: CRISPR-CAS9

 Características
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) es el sistema de
inmunidad adaptativa presente en bacterias y arqueas que les permite responder y eliminar
material genético invasor. Les permite guardar ese genoma que les ha invadido para cuando
les invada otra vez, reconociendo al patógeno para futuras batalllas. La región donde estén
todas estas zonas es la region CRISPR. Además, tienen un operón con Ios genes Cas y un gen
que da Iugar a un ARN muy importante.

Genes Cas: genes asociados a CRISPR con actividad nucleasa.

crRNA: RNA CRISPR.
tracRNA: RNA transactivador implicado en la maduracion de los chNA y necesario para la
activacion de las nucleasas.
PAM: motivo adyacente a la secuencia espaciadora, imprescindible para el corte.

Se transcribe toda esa region con repeticiones y trozos de ese DNA. Se forma un solo ARN de
todo ese trozo, que tiene que ser cortado en trozos crARN que tengan un trozo de ADN
invasor y un trozo de secuencia repetida. Se tiene todo ese ARN largo troceado y unidos a ese
ARN que ha permitido cortarlo.

Por tanto, ahora permite que el fragmento se dirija al ADN complementario que ha entrado
una segunda vez en la célula y recluta a otra endonucleasa, y se unen. La endonucleasa rompe
ese ADN que lo ha invadido por segunda vez, en un sitio muy específico, y eso hace que se
degrade. Lo corta cerca de una secuencia llamada PAM.

.
 .

La transfección de células embrionarias de organismos eucariotas con plásmidos portadores de

la secuencias de gRNA (RNA guía, molécula quimérica procedente de la fusión de los genes
traRNA y crRNA capaz de conducir ella sola a Cas9 hacia el sitio de corte) y la endonucleasa
Cas 9, puede producir dos cambios sobre los genes diana: su disrupción o edición.

La transfección con plásmidos portadores de gRNA y endonucleasa Cas 9 defectiva (mutada)

permite la localización, activación o la expresión de genes particulares.
 Mecanismo de acción
Está basado en las interacciones RNA-DNA de Watson y Crick y nos permite realizar
edición génica en cualquier organismo. Está formado por dos piezas: una proteínas Cas9
(endonucleasa) y el RNA guía (gRNA).

Existen tres mecanismos que podemos ver en la próxima figura, nos centraremos en el
segundo pero en distintos trabajos podemos ver el uso de los otros mas complejos.
.

La respuesta comienza con un reordenamiento de los fragmentos del DNA invasor en el

genoma, en una zona denominada CRIPSR array que contiene fragmentos del genoma de un
gran número de patógenos. Cuando este array se transcribe se genera un RNA
policistrónico que proviene del genoma de varios patógenos y tiene secuencias separadoras
entre las secuencias del patógeno (son secuencias comunes) que hibridan con un RNA de
secuencia complementaria (trans-activating RNA o tracrRNA) que induce el corte con una
RNA polimerasa III que individualiza el corte de cada una de las subunidades del RNA
proveniente de los patógenos.

Entonces, las unidades individualizadas del array hibridado con el tracrRNA formarán la cabeza
proteica (gRNA) de la ribonucleoproteína que se generará al unirse con Cas9, obteniendo una
molécula de Cas9-gRNA. Esta ribonucleoproteína buscará en el citosol una secuencia
complementaria a la que hay en el RNA guía, cuando la encuentre se degradará el ácido
nucleico al que hibride, ya que si hay una zona complementaria al RNA guía será la secuencia
de DNA del propio del invasor.
 .

Para que el sistema Cas9-gRNA no degrade al CRISPR array (ya que tiene la secuencia
bacteriana y sería reconocida por el RNA guía) existe una secuencia, que es verdaderamente la
reconocida y sirve como fuente del RNA guía, pero no se encuentra en el CRIPSR array. Así,
Cas9-gRNA no reconoce el propio genoma y la bacteria es inmune a su propio sistema.

Partimos de una endonucleasa Cas9 dos dominios de corte (con un dominio RuvC y HNH que
cortan cada uno una cadena del duplex de DNA), que es guiada a su diana por una secuencia
guía que sustituye al RNA que proviene del CRIPSR array en bacterias. La diana (secuencia del
genoma que queremos modificar) se conoce como protospacer, que comparte secuencia con
el gDNA, por lo que el gDNA hibridará con la hebra complementaria al protospacer. Después
del RNA guía contamos con un RNA estructural, encargado de interaccionar con Cas9.

El gen diana está seguido por un Protospacer Associated Motif (PAM), que son tres nucleótidos
que siguen al DNA diana pero no están contenidos en el RNA guía y son específicos de la
Cas utilizada. El PAM se encuentra en dirección 3’ del protospacer.
El complejo Cas9-gRNA escanea el genoma en busca de un PAM compatible con la Cas9
usada y que a continuación del PAM venga una secuencia con el mismo DNA del guía. La
identidad de secuencia se analiza mediante la hibridación con las reglas de Watson y Crick. La
hibridación dispara la actividad endonucleasa, cortando el DNA genómico en dos sitios, cuatro
nucleótidos antes del PAM, finalizando el trabajo de CRISPR. Tras este proceso de corte la
secuencia puede ser recombinada mediante recombinación homóloga o ilegítima.

El complejo Cas9-gRNA (o crRNA:tracrRNA) se asocian a las secuencias PAM a lo largo del

genoma y permiten la desnaturalización del DNA. Su unión a PAM dispara la actividad
endonucleasa de Cas9, activando los dominios HNH y RuvC.

La maquinaria puede tener sucesos off-target, al interaccionar con secuencias inesperadas. Los
efectos son mucho menores que en los dos mecanismos anteriores, ya que la especificidad de
la técnica CRISPR-Cas9 es mucho mayor. Es decir, pueden producirse cortes que no afecten
al gen diana sino que sean en otros blancos inesperados, impidiendo el análisis fenotípico
correcto. Esto se puede solucionar si se hacen guías mas concretas y con la generacióin de CAS
que tengas mas o menos longitud de ARNguía.

En un trabajo, estiman que una molecula fluorescente dCAS9-gRNA tarda ¡6 horas! en

encontrar su diana. Unos 30 ms por cada diana potencial (NGG)

En eucariotas, solo la elevada concentración de moléculas CAS9 podría explicar una interacción
eficiente con la diana

Inserto de la construcción
Hay varios métodos para introducir el sistema Cas9 como plataforma de ingeniería genética:

Figura C. Se puede construir un plásmido que contenga el DNA codificante de la

proteína Cas9 y el que transcriba el RNA guía - roja. Estos plásmidos se transfunden a
la célula y un alto porcentaje de las células debería quedar transformado.
Figura D. El propio sistema Cas9-gRNA puede ser inyectado de forma directa en una
célula o cigoto. El uso de el mecanismo anterior o este depende del tiempo que quieras
mantener el sistema en la célula, ya que el sistema de inyección proteica finaliza en la
degradación de los componentes; mientras que la transformación del plásmido no.
Figura E. También se puede transformar mediante la inyección de vectores virales con la
construcción en un organismo, evitando así la generación de transgénicos (problemas
 técnicos y legislativos). Por ejemplo quieres que la maquinaria llegue justo a las células del
hígado para curar una enfermedad y esto se puede hacer de diferentes maneras, depende
de la estrategia utilizada en cada trabajo
Figura F. También se pueden construir librerías de DNA guía, con miles de secuencias
distintas que producen distintas interacciones DNA:gRNA. Se obtienen miles de guías que
se clonan en plásmidos con la proteína Cas9 y son transformadas en células, obteniendo
múltiples fenotipos distintos.

Utilidades de CRISPR-Cas9 alternativas

La actividad nucleasa de CAS9 se puede utilizar para producir roturas de doble cadena,
capaces de generar KO (por NHEJ, con alta eficiencia) o de incrementar las posibilidades de
<gene replacement= (por HR, con baja eficiencia).
.

Pero, además, el sistema se ha modificado para permitir la edición de nucleótidos concretos

(base editors) o de pequeñas secuencias adyacentes (prime editing). Podemos meterle a la
CAS las modificaciones que que quramos.

Base editors
Se puede usar para inducir mutaciones mediante la edición de nucleótidos específicos. Para ello
se modifica la actividad de la proteína Cas9, suprimiendo sus dominios nucleasa e insertando
un dominio de edición nucleotídica (como la citosina deaminasa, que modifica la citosina por
otra base distinta). Mediante este mecanismo se cambia una base del par, de forma que tras la
replicación se produce la hibridación correcta de las bases y se fija la mutación. Este
mecanismo sirvió como base para producir un sistema de edición y reparación génica basado
en la retro-transcripción del RNA-guía, en este se introduce Cas9 asociada a una
retrotranscriptasa y un gRNA especial, la Cas9 modificada reescribe el DNA diana sin tener que
hacer recombinación
 Extra

Se pueden obtener formas modificadas de la proteína Cas9 sin actividad nucleasa, siendo
incapaces de cortar DNA. Sin embargo están asociadas a otras proteínas capaces de
modificar la expresión del gen mediante proteínas metilasas, activadores o represores.
.

Entonces, es capaz de unirse de forma muy específica a un sitio del genoma de forma
temporal y a la proteína Cas9 modificada se le une un activador o un represor de la
transcripción (o un modificador de la cromatina), modificando la expresión del gen. Sin
embargo, sus efectos off-target son grandes y poco previsibles

Prime editing
Los editores de bases solo permiten acceder a un numero limitado de los cambios que podrían
interesarnos en nuestra investigación

El mecanismo de prime editing, sin embargo, permite reescribir por completo una secuencia
genómica de pequeño tamaño

En este caso se plantean modificar el sistema incluyendo: i. una CAS9 con actividad nickasa; ii.
Fusionada a una transcriptasa reversa; iii. Un RNA guía extendido en su extremo 3’ (peg-RNA)
con una secuencia complementaria a la secuencia del protospacer + nucleótidos adicionales
 [1]
Tras un corte se hace una complementariedad con el RNA guía 31 y la transcriptasa reversa
actua generando un ADN copia que se puede editar. Se produce la hibridación del extremo 3’
del peg-RNA y la molécula de DNA de la hebra PAM, copiando la secuencia dirección 3’-5’
(construyendo cDNA)

El resultado es un dúplex con una secuencia simplexa adicional que puede ser corregida de dos
formas. Si fuera eliminada la secuencia 5’ flap (secuencia original), el resultado sería una
.

secuencia editada

Finalmente, los autores consiguieron modificar 12 loci genómicos en ratón y humanos, desde 3
pb antes del PAM hasta 29 pb aguas abajo. Las modificaciones incluían transiciones,
transversiones, deleciones de hasta 80 pb e inserciones de hasta 44 pb, con una eficiencia
media del 30 %

ᛟ
 . ↩

Producción de un KO usando CRISPR: pasos

Necesario y complejo, sea cual sea la alternativa seleccionada para la edición, es necesario verificar
el genotipo de los individuos, comprobar la presencia/ausencia de la maquinaria de edición, etc. En
este caso el maíz.

Preparación de la construcción editora.

.

Un investigador quiere seguir estudiando la función del gen BETL1, para ello decide hacer CRIPSR
sobre este, con la intención de generar un KO por pérdida del marco de lectura. Entonces decide
interaccionar sobre el primer exón, buscando un PAM (NGG) para el sistema Cas9; cuando se
encuentra el primer PAM en el exón 1 se seleccionan las 20 bases que anteceden al PAM y
formarán parte del RNA guía (el PAM no está incluido). Las veinte bases se fusionan a la parte
estructural de la guía y se expresará junto con la proteína Cas9 en el sistema celular en el que se
busque inhibir la expresión del gen BETL1.

Para ello se elabora un vector de transformación que debe tener: un marcador de selección para
distinguir las plantas transgénicas de aquellas que no han expresado la construcción, el gRNA, la
secuencia de Cas9 optimizada para maíz controlada por un promotor ubicuo para que se exprese
en todas las células y finalizado por un terminador.
 Este es un ejemplo que utiliza el profesor para su Maíz: construcción: CAS9-
gRNA1a-gRNA1b-gRNA2a-gRNA2b-herbicidaR:

El diseño del gRNA es algo más complicado, ya que contamos con varios RNAs precedidos de
promotores típicos de RNAs pequeños celulares. Esto forma un casete de expresión de RNA guía
(promotor, RNA guía y el scaffold/parte estructural), cada casete de gRNA se unirá a Cas9. De
forma que en un solo experimento se pueden mutagenizar varios genes o introducir varios gRNA
del mismo gen para asegurar su mutagenización. Existen sitios web para evaluar distintos
gRNAs que pueden ser diseñados para un gen. En estos se compara el gRNA con la totalidad
del genoma, para buscar secuencias parecidas con las que puedan interaccionar las guías
.

propuestas. Básicamente paran tener cuidado con los off-taggets.

Es fundamental, ya que antes de escoger el gRNA debemos saber cómo de eficaz será y cuál será
su funcionamiento en un gen distinto al gen diana. Este programa nos da las posibilidades de que
se produzca una expresión deseada o de que el gRNA se coloque en un lugar indeseado, esto es
fundamental para asegurarnos de que las posibilidades de que edite blancos similares al gRNA son
casi nulas. Entonces se buscarán gRNA que tengan pocas probabilidades de mutagenizar otros
genes. No obstante, en nuestras líneas alteradas por CRISPR habrá que comprobar que no se haya
producido ninguna mutación indeseada en otro gen blanco que haya podido afectar a la expresión
fenotípica

Introducción en las células/organismos diana

Introducir la maquinaria en las células de interés de diferentes maneras, muchas posibilidades que
se te ocurra. Por ejemplo en maíz se hace transgenicos pero en otros organismos haces otra cosa

El proceso de transformación de una especie como maíz es largo y costoso. El resultado son
plantas potencialmente transgénicas, monocopia, heterocigotas

Presencia de la construcción CAS9-gRNA

Como no puede ser de otra manera lo podemos realizar mediante una PCR. Buscar en la
descendencia quienes no tienen la construcción para que dejen de ser quimeras.

Edición del gen/genes diana?

Miramos si ha habido edición o no. Si tenemos la suerte de que en la PCR salga la edición, aveces
incluso es necesaroi es secuenciar paras saber donde hay un alelo mutante. Análisis sencillo
únicamente si los nuevos alelos difieren significativamente del alelo WT
.

Vemos en la secuenciación que hay un mutante mosaico o heterocigosis que solapan. Ese patrón
hay que descomponerlo en las bases que corresponde por ejemplo mediante algún probgrama,
clonado en E.coli, secuenciación masiva.

La secuenciación de amplicones en material heterocigoto requiere: i. un software de interpretación;

ii. clonación + secuenciación o iii. NGS. La interpretación es aún más complicada si la construcción
editora está presente (mosaicismo)

Finalmente, tras los cruzamientos adecuados, es posible obtener plantas no-transgénicas

homocigotas para alelos mutantes.

Es también posible obtener mutantes bi-alelicos en una generación anterior. Pero aun en este
caso, es recomendable no iniciar el análisis fenotípico en presencia de la construcción editora. Es
un mutante homocigoto en los que ambos alelos esta mutados pero no de la misma forma →
realmente ya no es un homocigoto

Como la secuenciación no tiene picos podemos saber que es homocigota y ver ademas que tiene
una A adicional → un alelo homocigoto adicional. Los alelos mutados son resistentes al sistema y
ya no es editable por lo que no es un blanco de la guía.

Podremos seguir los pasos con:

.

. PCR y secuenciación Sanger de posibles dianas off-target

. Cruzamientos y seguimiento de los alelos de interés
. Análisis fenotípico de los homocigotos KO

Resumen
El sistema CRISPR/CAS9 permite producir eficazmente roturas de doble cadena en sitios
seleccionados del genoma La precisión del sistema reside en el mecanismo de guía de la DNAsa,
se trata de un RNA que reconoce su diana por complementariedad W&C Una vez producida la
rotura de doble hebra, la presencia de un vector Ω (similar a los explicados en el Tema 7) permitirá
la edición del gen diana a voluntad. Plantas……………??

Alternativamente, la reparación por IR generará mutantes de inserción y deleción que podemos

detectar mediante análisis molecular del gen diana, en los descendientes del evento de
transformación inicial Un comentario final sobre la utilización de CRISPR-CAS en cultivos celulares

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