Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa

Captulo 8 Txicos Metlicos

Autores:
Bioq. Fernando Rainoldi. Docente de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP. Dra. Leda Giannuzzi. Profesora Adjunta de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP. Bioq. Cristian Oliver. Perito de la Seccin de Toxicologa del Laboratorio Qumico Pericial de la Direccin General de Polica Cinetfica de la Polica de la Provincia de Buenos Aires. Docente de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP.

Introduccin
Resulta bien conocido que los metales cumplen un doble papel en los seres vivos: son varios de ellos nutrientes esenciales mientras que en funcin de su dosis pueden resultar extremadamente txicos. La lista de los metales toxicolgicamente importantes se va ampliando al descubrirse nuevas funciones bioqumicas, dado que algunos de ellos son considerados esenciales tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, molibdeno, manganeso, hierro, cobalto, nquel, cobre, zinc, selenio y flor. A esta lista podran incorporarse el estao y el silicio. Si bien se suele unir en un solo grupo a los as llamados metales txicos esta distincin no hace referencia a las propiedades metlicas de hecho incluye metaloides como el selenio y el arsnico ni a la forma de metal elemental como la especie txica, ya que usualmente las formas inicas solubles son las ms activas. Los metales, especialmente los denominados metales pesados, constituyen una importante fuente de riesgo para la salud y el medio ambiente tanto bajo la forma de intoxicaciones agudas o crnicas. La actividad antropognica es la principal fuente de riesgo, pues acta concentrando los metales y produciendo mltiples ocasiones de exposicin en la vida diaria a travs de los alimentos, aire, agua e incluso en nuestros hogares. En este captulo veremos los distintos metales de mayor importancia en nuestro medio y los distintos mtodos de anlisis.

8.1 Toxicocintica
A los efectos de realizar los monitoreos correspondientes y seleccionar las muestras, resulta til realizar una sntesis de las vas de entrada, depsito y eliminacin de los metales.

8.1.1 Vas de absorcin

Se conocen como vas de entrada posibles a la inhalatoria, drmica, oral, mediada por prtesis metlicas y la transferencia madre-hijo por la placenta o la leche materna. De estas, especialmente en personal expuesto en industrias, la va inhalatoria se considera una de la ms importantes y habituales, observndose en la mayora de las legislaciones laborales una especial preocupacin por la proteccin de los empleados y la medicin en el aire. En los ambientes fabriles o talleres metalrgicos la forma de exposicin ms habitual es a travs de material particulado, vapores o gases, siendo estos ltimos generalmente compuestos organometlicos (carbonilos de nquel, cobalto). Estas combinaciones son mucho ms txicas que las formas elementales. La va drmica, ya sea para la forma elemental o en forma de polvos o gases, resulta otra ruta de exposicin importante en ambientes industriales, provocando dermatitis, alergias y distintos tipos de cncer. La toxicidad de un metal se halla estrechamente relacionada con la va de entrada y su especie qumica. Uno de los mejores ejemplos lo constituye el mercurio, el cual al ser ingerido en su forma elemental resulta prcticamente atxica, mientras que una sal de mercurio soluble
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa o el metil mercurio son absorbidos casi en su totalidad. El mismo metal muestra las mismas diferencia en la va inhalatoria, donde tanto el metil mercurio como el vapor de mercurio atmico se absorben un 80 %.

8.1.2 Biotransformacin
La mayora de los metales circula unidos a la fraccin proteica del plasma, mediante la unin a grupos funcionales como sulfihidrilos, amino, fosfato, imidazol e hidroxilo. La distribucin refleja la diferente capacidad para atravesar membranas y para permanecer unidos a los diferentes componentes de los tejidos u rganos. Debido a que los organismos no pueden destruir a los metales a diferencia de lo que ocurre con las molculas orgnicas existe una larga permanencia en el organismo. A pesar de esto se conocen mecanismos especializados de quelacin y oxidorreduccin, que pueden modificar su excrecin y toxicidad.

8.1.3 Eliminacin
Debido a sus caractersticas qumicas, la va principale de eliminacin es a travs de quelatos hidrosolubles por va renal y gastrointestinal. La va renal requiere previamente que los metales circulen en forma soluble unidos a protenas como la albmina o las metalotionenas, siendo estas ltimas las preferidas por su pequeo tamao (5-6 kDa), lo que permite atravesar libremente por los glomrulos y llegar de esta forma a la orina. Si bien son rutas de poca importancia desde el punto de vista de la detoxificacin, el sudor, el aliento y las faneras constituyen rutas conocidas desde hace tiempo (ej. Talio en pelo y uas). Resulta importante hacer una breve referencia a un tema de por s de inmensa complejidad, el de las especies qumicas. El contenido total de un elemento presente en una muestra no es el factor principal para determinar su toxicidad sino la proporcin de las distintas especies qumicas presentes una matriz determinada. Existen dos ejemplos clsicos que ilustran este concepto: el As(III) resulta mucho ms txicos que el As(V), pues slo el arsnico trivalente puede unirse a los tioles; el Cr (VI) resulta ms txico que el Cr(III) pues es mas soluble en agua que el trivalente, una vez en el interior de la clula pasa a varios estadios intermedios de reduccin Cr(V), Cr (IV) todos ellos capaces de unirse al ADN y provocar mutagnesis. En lo que respecta a los metales de transicin, basta recordar la especiacin qumica del Fe en solucin acuosa para tener una idea de las complejidades posibles. A la fecha, si bien los modelos de prediccin incorporan la especiacin dentro de sus parmetros la medicin de esta resulta an extremadamente compleja.

8.2 Tipos de muestras

A efectos de establecer una relacin dosis-respuesta es necesario conocer tanto la concentracin del metal como el tiempo de exposicin. La definicin ms precisa de dosis es la cantidad de metal dentro de las clulas del rgano que manifiesta efectos txicos. Sin embargo la cuantificacin de metales dentro de los rganos no es posible en sujetos vivos. Se pueden hacer estimaciones indirectas a partir de modelos metablicos derivados de las autopsias. La sangre, orina y pelos son los tejidos ms accesibles para realizar las medidas. Los resultados de dichas determinaciones reflejan exposicin reciente, pasada de larga data, dependiendo del tiempo de retencin y del tejido en particular. La muestra de sangre y orina refleja exposiciones recientes y se correlacionan muy bien con los efectos agudos. Una excepcin es el cadmio en orina: su presencia en alta concentracin en orina implica un dao renal relacionado con la acumulacin del metal en el rin. Las muestras pilosas pueden usarse en asociacin a variaciones en la exposicin a los metales durante largo tiempo. Los anlisis pueden realizarse sobre distintos segmentos del cabello de modo tal que el contenido del metal del nuevo crecimiento puede compararse con exposiciones pasadas. Se debe tener la precaucin de lavar el pelo previamente al anlisis para remover el depsito de metal por la contaminacin externa. Otro tipo importante de muestras es el agua. Las aguas de bebidas libres de materia en suspensin pueden ser analizadas directamente, mientras que las que presentan materia
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa orgnica requieren un procedimiento para solubilizar el material suspendido. Los barros, sedimentos y otros tipos de muestras slidas pueden ser analizadas despus de un tratamiento adecuado. Tambin muchas veces se presentan muestras ambientales o alimentos en los que resulta de inters conocer el contenido de metales. Desde el punto de vista cuantitativo, las intoxicaciones por metales ms frecuentes provienen de la ingestin de agua o alimentos contaminados, ya sea su contenido o continente (latas con plomo).

8.3 Tratamiento de las muestras

Previo a la cuantificacin de metales presentes en medios biolgicos, es necesario efectuar un tratamiento de la muestra, dependiendo el mismo de varios factores: 1- Material biolgico (orina, suero, sangre, vsceras) 2- Metal en cuestin (volatilidad y formas no disociables del metal en el organismo) 3- Procedimiento utilizado para la determinacin final (colorimtrico, absorcin atmica, activacin neutrnica). Los metales pesados se encuentran frecuentemente en el material a analizar formando complejos con molculas orgnicas y deben ser liberados de los mismos para poder determinarlos. Entre los mtodos ms utilizados para el tratamiento previo de las muestras, pueden mencionarse: a) Destruccin oxidativa por va hmeda de la materia orgnica (DMO) empleando cido ntrico, ntrico-agua oxigenada, ntrico-sulfrico, ntrico-sulfrico-perclrico, o bien permanganato de potasio-clorhdrico. b) Destruccin de materia orgnica por va seca. c) Formacin de quelatos y extraccin con solventes. d) Precipitacin de las protenas y determinacin de los metales en el sobrenadante. e) Tcnicas de volatilizacin (arsnico como AsH3, antimonio como SbH3 y mercurio como vapor del elemento). A veces pueden efectuarse combinaciones entre los distintos mtodos, de manera de obtener una muestra apropiada para las posteriores determinaciones. El mtodo de destruccin de materia orgnica (DMO) sulfo-nitro-perclrico (SNP), puede ser aplicado para la determinacin de arsnico, talio, plomo y otros metales de inters toxicolgico en medios biolgicos. Para la determinacin de mercurio se efectuar en un dispositivo especial que incluye un refrigerante a reflujo con dedo fro para evitar prdidas del elemento por volatilizacin del mismo. Existen tambin otros mtodos denominados secos dado que realizan la Destruccin de Materia Orgnica (DMO) por calcinacin. A continuacin se detalla el fundamento del mtodo de DMO por Va Hmeda SulfoNitro -Perclrica

8.3.1 Destruccin de materia Orgnica (DMO) por va hmeda sulfonitro-perclrica

Se basa en la accin de una mezcla fuertemente oxidante sobre la muestra en cuestin a fin de romper la unin entre los metales y la materia orgnica llevndolos a su mximo estado de oxidacin. El HNO3 es un agente oxidante (punto de ebullicin: 56C). 2HNO3 2HNO3 H2O + NO + 3 O*__ en fro. H2O + 2 NO2 +1O* en caliente. H2O

Luego O* + H (de la materia orgnica)

El H2SO4 permite trabajar a mayor temperatura (270 C) siendo adems un indicador de la destruccin de la materia orgnica: cuando cido ntrico se consume comienza a actuar el cido sulfrico que ataca la materia orgnica dando carbono de color negro. En ese momento es necesario detener el calentamiento porque falta medio oxidante, entonces se agregar cido
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa ntrico y se contina el calentamiento. (El C es reductor y podr reducir el As a AsH3 perdindose por volatilizacin). Adems el H2SO4 rompe cadenas de glcidos, protenas y grasas, dando molculas ms pequeas que sern fcilmente atacadas por el cido ntrico. El cido sulfrico es tambin un deshidratante fuerte. Es indicador de que la materia orgnica ha sido totalmente destruida, cuando no aparece color negro y se observan humos blancos de SO3 . El HClO4 posee un poder oxidante muy fuerte. Explota en presencia de materia orgnica, por eso nunca se lo usa slo sino como mezcla cido ntrico-cido perclrico. Adems de ser oxidante produce el clivaje de cadenas. 4 HClO4 4 HClO4 2H2O 4 ClO2 + 2Cl2 + 3O2 + 7 O2 +2H2O 4 CO2 + Cl2 (4 HClO4 :14 O*)

4ClO2 + C (de la materia orgnica)

La principal desventaja de la mezcla SNP es que resulta peligrosa debido a que los cidos oxidantes empleados generan vapores txicos e irritantes as como pueden producir explosiones. Entre las ventajas se menciona la rapidez y utilidad si se manipula con cuidado, permitiendo trabajar en presencia de materia grasa en la muestra permite romper cadenas carbonadas mientras que la calcinacin por va seca no resulta suficiente.

8.3.2 Muestras biolgicas

Se describe a continuacin la metodologa empleada para el caso de sangre, orina o vsceras. Para sangre, se emplean 5 a 10 ml de sangre entera; para orina se usan 50 ml y para vsceras se emplean 25 g vsceras desmenuzadas Reactivos Acido ntrico (p.a.) Acido sulfrico concentrado exento de Arsnico, Talio y Plomo. Mezcla en la proporcin 1: 2 de cido perclrico y ntrico Oxalato de amonio, solucin saturada a temperatura ambiente. Equipos Baln de Kjeldahl de 100ml. Procedimiento Todo el procedimiento debe realizarse bajo campana de extraccin de gases. Si se trata de vsceras se coloca 25 g de vsceras desmenuzadas en un baln Kjeldahl de 250 ml de vidrio Pyrex tratando de no tocar las paredes. Se agregan 30 ml de cido ntrico concentrado y se calienta sobre tela metlica hasta disgregar todo el material. Se contina calentando directamente sobre llama pequea hasta disolver el material. Se retira y se deja enfriar. Si se trata de orina, se miden 50 ml de orina y se calienta sobre tela metlica en un vaso de precipitados hasta reducir a un quinto del original. Se pasa el lquido remanente a un baln Kjeldhal de 100 ml y se incorpora 10 ml de cido ntrico concentrado. De all en adelante se procede de la misma manera en ambos casos. Se agrega al contenido del Kjeldhal 4-5 ml de cido sulfrico concentrado. Se calienta el contenido hasta llegar a carbonizar la materia orgnica. En ese momento debe suspenderse el calentamiento dado que se genera ambiente reductor y se perdern metales como el arsnico o el antimonio por volatilizacin. Se deja enfriar y se agrega lentamente por el cuello del baln 4 ml de cido ntrico y se vuelve a calentar. El agregado de cido ntrico se repite cuando se observe oscurecimiento del material. Se contina calentando y si se produce carbonizacin se agrega 4 ml la mezcla nitrico-perclrico. Se calienta nuevamente y si se observa nuevamente oscurecimiento se agrega 4 ml de la mezcla ntrico-perclrico. Se contina calentando hasta la aparicin humos densos y pesados de trixido de azufre. Llegado este punto, se retira el baln del fuego quedando un lquido incoloro o con un ligero precipitado blanco o amarillento de sulfato de calcio o de hierro respectivamente.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa Dejar enfriar y luego agregar 3 a 4 ml de oxalato de amonio y se vuelve a calentar para eliminar los restos de sustancias oxidantes hasta nuevamente humos blancos de trixido de azufre. Se deja enfriar y se agrega 1 o 2 ml de agua destilada y se calienta para desprender vapores de agua. Se repite el agregado de agua y se calienta hasta humos blancos de trixido de azufre. Se contina calentando hasta obtener un lquido residual de 2ml, se deja enfriar y se trata el lquido y el residuo slido si lo hubiera con agua destilada transvasndolo a un matraz de 25 ml. En estos 25 ml de investigar los metales como Talio, Arsnico, Plomo y otros metales de inters toxicolgico.

8.3.3 Muestras de aguas

Para el caso de muestras de agua, antes de la recoleccin de la muestra debe tomarse la decisin de que tipo de dato se desea obtener como ser: metales disueltos, suspendidos, totales o recuperables totales. Los llamados metales disueltos que son aquellos constituyentes metlicos que atraviesan una membrana filtrante de 0,45 m. Los metales suspendidos que son los que quedan retenidos por la membrana de 0,45 m, los metales totales corresponden a la concentracin determinada sobre una muestra sin filtrar seguida por una vigorosa digestin y los metales recuperables totales corresponden a la concentracin de metales en una muestra sin filtrar seguida de un tratamiento con cido mineral diluido caliente. Para la recoleccin de las muestras de agua el recipiente debe ser de vidrio al borosilicato, polietileno lineal, polipropileno o tefln que deben ser muy bien lavados con detergente y agua corriente, enjuagado con cido ntrico 1:1, agua corriente, cido clorhdrico 1:1 y finalmente con agua destilada desionzada.

Procedimiento
Para la determinacin de metales disueltos las muestras de agua deben estar libres de turbiedad o filtradas a travs de membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con cido ntrico diluido). La muestra debe ser filtrada en el momento de la recoleccin y luego se acidifica con 2 ml de ntrico concentrado por litro de muestra. Para la determinacin de metales suspendidos la muestra se filtra a travs de una membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con cido ntrico diluido) y el anlisis se realiza sobre la porcin de muestra retenida en la membrana. Se transfiere la membrana a un vaso de precipitado de 250 ml y se agregan 3ml de ntrico concentrado. Cubrir el vaso con un vidrio reloj y calentar. Cuando se ha disuelto la membrana incrementar el calentamiento y evaporar a sequedad. Enfriar y agregar 3 ml de cido ntrico continuar calentando hasta que se complete la digestin dado por un residuo de color claro. Agregar residuo seco 2 ml de cido clorhdrico (1+1) y calentar muy bien hasta disolver el material. Lavar las paredes de vaso de precipitados con agua desionizada y filtrar si es necesario para eliminar los silicatos u otros materiales insolubles que pueden obturar el atomizador. Llevar al volumen original de la muestra con agua desionizada. La concentracin de metales totales resulta ser la suma de las concentraciones de las fracciones disueltas y suspendidas. La determinacin de metales extrables se realiza despus del agregado de cido mineral (2 ml/L) y del agitado vigoroso permitiendo que repose durante una noche. En muchos casos esto representa el contenido metlico total si han sido disueltos todos los sedimentos. La muestra est lista para el anlisis cuantitativo mediante Espectroscopia de Absorcin Atmica.

8.3.4 Destruccin de Materia Orgnica (DMO) por va seca

Este tipo de destruccin de materia orgnica resulta de eleccin en el caso de muestras de alimentos que presenten una proporcin de hidratos de carbono elevada. Esta tcnica no es adecuada en el caso de matrices que presenten elevado contenido de protenas o lpidos. Se realiza la DMO por calcinacin de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y xido de magnesio que transforma el a los metales cuantitativamente en compuestos derivados de
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa magnesio. En estas condiciones los metales no son voltiles. En el item denominado determinacin de arsnico se describe el procedimiento y el fundamento de las reacciones. Luego, la muestra est lista para el anlisis cuantitativo mediante Espectroscopia de Absorcin Atmica

8.4 Determinacin de metales de inters toxicolgico por absorcin atmica

Los metales en solucin pueden ser muy bien determinados por espectroscopa de absorcin atmica. El mtodo es simple, rpido y aplicable a un gran nmero de metales en agua de bebida, desechos domiciliarios, barros, fluidos biolgicos como las muestras de sangre, orina o vsceras luego de una adecuada DMO. Algunos metales como el antimonio, arsnico, oro, iridio, mercurio, osmio, paladio, platino, rhodio, ruthemio, selenio, plata, talio, estao y titanio requieren modificaciones en el proceso de digestin. Equipos Espectrofotmetro de absorcin atmica: debe poseer uno o dos canales haz de luz simple o doble monocromador a red de difraccin, detector fotomultiplicador, ranuras ajustables, rango variable de 190 a 800 nm e interconeccin a un registrador. Lmparas de ctodo hueco pueden utilizarse las del elemento simple o las multictodo. Reactivos. Agua destilada desionizada Acido ntrico concentrado grado espectroscpico. Acido ntrico (1:1) Acido clorhdrico (1:1) Combustible y oxidante se usa generalmente acetileno comercial y aire proveniente de un cilindro con aire comprimido. Soluciones stock standard del metal Preparacin del estndar y la calibracin. Se preparan a partir de metales de alta pureza, sales de calidad analtica no higroscpicas usando agua desionizada y cido ntrico. Las soluciones stock se preparan en concentraciones de 1000 mg de metal por litro. Los standards de calibracin se preparan por dilucin de la solucin stock del metal en el momento del anlisis y se descartan luego del uso. Se deber preparar un blanco y como mnimo cuatro estndares de calibracin en intervalos de acuerdo al rango total esperado. Se preparan empleando el mismo tipo y concentracin de cido usado en la preparacin de las muestras (cido ntrico 1:1). Aspirar el blanco y las soluciones registrando las lecturas. La curva de calibracin debe cubrir un rango apropiado de concentracin que produce una absorcin de 0 a 80 %. Debido a que las concentraciones detectadas por este equipamiento son muy bajas (ppm o ppb), debe evitarse interferencias de todo tipo. Una de ellas puede provenir del material de vidrio utilizado. Por ello, debe mantenerse todo el material de vidrio en cido ntrico 1:1 durante 24 hs, para luego realizar los lavados y enjuagues del material con agua bidestilada.

8.5 Mtodos de Anlisis para la determinacin de metales 8.5.1 Investigacin y determinacin de Arsnico.
Generalidades de la intoxicacin Ell Arsnico se halla presente en las aguas subterrneas utilizadas como agua de consumo. Por eso se lo halla tambin en los vegetales que lo absorben en la raz o son regados con dichas aguas. Los mariscos filtran grandes cantidades de agua y concentran el As. El As forma parte tambin de algunos medicamentos orgnicos e inorgnicos usados antiguamente. El arseniato de sodio se us como colorante y el arseniato de cobre en vidrio, papel y pinturas. En pirotecnia se usan compuestos de As para las llamas verdes. En algunos casos el As se us desde el punto de vista criminal.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa La sintomatologa observada en casos de intoxicacin pude distinguirse segn sea de tipo aguda o crnica. Aguda: - Vaso dilatacin de los capilares sanguneos con alteracin de la permeabilidad de los mismos. - Vmitos, diarrea (prdida de agua y sales), irritacin de garganta, dolores faringes. - Edemas subcutneos. Hipertensin. - Colapso, shock, coma. Muerte. Crnica: El As se une a albmina, se absorbe fcilmente a las mucosas y se deposita en hgado, rin, huesos, pelos y uas. Se elimina por orina y heces, pero se reabsorbe en el tabulo contorneado proximal. Por lo tanto, debido a que la absorcin es mayor que la eliminacin, se acumula. Los sntomas ms caractersticos son: - cada del cabello. - mano en forma de garra y pie colgante - en piel: - erupciones - * hiperqueratosis (engrosamiento de la piel de la palma de las manos y pies) * hiperpigmentacin (manchas oscuras) -degeneracin grasa del hgado que puede dar cirrosis. -temblores por alteracin del SNC con desequilibrio de Na y K -fase final: cncer de piel Investigacin toxicolgica de arsnico Para la determinacin de arsnico en materiales biolgicos, alimentos, etc, es necesario destruir previamente la materia orgnica. El mtodo empleado depende del material biolgico de que se trate. Pelos y uas Se utiliza una mezcla de cidos oxigenados concentrados que deshidratan, oxidan y saponifican la materia orgnica. Procedimiento: En una cpsula de porcelana colocar 1 a 2 g de material. Si se trata de pelos es conveniente humedecerlos con unas gotas de agua destilada. Agregar 1 ml de cido sulfrico concentrado y 5 ml de cido ntrico concentrado. Si es posible dejar en contacto varias horas. Calentar progresivamente sobre tela metlica y luego en bao de arena. Cuando aparecen humos blancos, retirar del bao de arena y agregar 2 ml de la mezcla constituida por dos partes de cido ntrico concentrado y una parte de cido perclrico concentrado (70%). Desde este punto en adelante, cuando se produzca oscurecimiento del lquido por carbonizacin debe suspenderse el calentamiento del mismo pues en dicho medio reductor se perder As por volatilizacin. Calentar hasta humos blancos y repetir este tratamiento hasta que el residuo sea incoloro o blanquecino. Retirar del bao y agregar 10 ml de agua destilada. Calentar nuevamente hasta residuo siruposo. Enfriar y tomar con 10 ml de agua destilada. El material est listo para la determinacin cualitativa y luego cuantitativa empleando Absorcin Atmica. Alimentos Nos referiremos en particular al caso de alimentos en base a hidratos de carbono. Se realiza la DMO por calcinacin de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y xido de magnesio que transforma el As cuantitativamente en piroarseniato de magnesio. En estas condiciones el As no es voltil. En este caso es adecuada una DMO por va seca porque la proporcin de hidratos de carbono es elevada, ya que con la presencia de protenas o lpidos, se dificulta la ruptura de las grandes molculas. Procedimiento: Colocar 10 g de muestra en cpsula de porcelana y agregar 3.5 ml de solucin de nitrato de magnesio al 20% y 0.1 g. de xido de magnesio. Mezclar bien formando una papilla y calentar primero a bao mara hasta sequedad, luego en bao de arena y por ltimo en tringulo de pipas hasta cenizas blancas. Enfriar y tomar el residuo con 10 ml de cido sulfrico al 10%. Filtrar si es necesario a fin de obtener una muestra de aspecto lmpido.
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MgO

+ 2 Mg(NO3 )2

+As2O3 CALOR

Mg3(AsO4)2 As2O7Mg2 (piroarseniato) + AsO4H3 + MgSO4 (c. arsnico)

+ 4 NO2 MgO

Mg3(AsO4 )2 As2O7Mg2 +H2SO4

Determinacin cualitativa.

Reacciones de identificacin
Se realizan luego de la destruccin de la materia orgnica (DMO). Las mismas se basan en las propiedades reductoras de la AsH3 o de ciertos reactivos. Reacccin de Bougault: En un tubo de ensayo colocar un volumen de lquido a ensayar con un volumen de reactivo (cido fosfrico) a bao mara durante 10 minutos. En presencia de compuestos arsenicales aparece un color pardo oscuro a marrn cuya intensidad vara con la concentracin. 2 AsO3-3 + 3 H3PO2 3 H3PO4 + 2 As 0 (marrn)

La reaccin tiene una sensibilidad de 100 ppm aumentada a 10 ppm si se agrega I 2. El selenito acta como interferencia pues da la misma reaccin. Se requiere ausencia absoluta de materia orgnica. Reaccin de Bettendorf: En un tubo de ensayo poner un volumen de lquido ms un volumen de reactivo . Calentar a ebullicin y dejar reposar. Si hay As aparece coloracin parda oscura o marrn. AsO3 -3 + 3 HCl 2 Cl3As + 3 SnCl2 (2%) Cl3As 2 As0 (marrn) + 3 SnCl4

Reaccin de Gutzeit: En un tubo de hemlisis colocar 1 ml de c. sulfrico al 25% Agregar 1 ml del lquido problema y una granalla de Zn activado. En la parte media del tubo colocar un trozo de algodn embebido en solucin de acetato de plomo al 1% y en la boca del tubo un papel de filtro sobre al que se coloca una pequea gota de una solucin de nitrato de plata cuya concentracin no sea menor del 50% Colocar el tubo en bao de agua fra. En presencia de As se obtiene una coloracin amarilla caracterstica. El papel colocado en la boca del tubo puede pasar a color negro correspondiente a Ag debido a la humedad del ambiente. AsO4-3 + Zn + 11 H+ AsH3 + 6 NO3Ag As.Ag3.3 NO3Ag + 3 H2O AsH3 + Zn+2 + 4 H2O As.Ag3.3 NO3Ag (amarillo) + 3 HNO3 AsO3-3 + 6 Ag0 (negro) + 3 NO3- + 6 H+

La reaccin tiene una sensibilidad de 10 ppm.

Determinacin cuantitativa de arsnico

a) Mtodo de Gutzeit: Se basa en la formacin de arsina por accin del hidrgeno naciente sobre compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel embebido en Cl2Hg formando complejos
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa coloreados. La longitud e intensidad de la mancha es proporcional a la concentracin de As la cual se compara con manchas estndar. El aparato consiste en un frasco cuyo volumen vara segn la cantidad de As a determinar (Fig. 1). Para cantidades de As entre 50 y 300 ppm se utiliza un frasco cuyo volumen de 250 ml. Para cantidades de As entre 0,1 y 20 ppm el volumen del frasco es de 60 ml. Lleva un tapn de goma con un orificio al que se ajusta un tubo de vidrio con un estrechamiento; a ste se adosa otro tubo similar pero de menor dimetro en cuya parte superior se coloca una banda de papel embebida con una solucin de Cl2Hg y luego secado. Reactivos. Solucin de acetato de plomo al 1% Papel embebido en solucin acuosa de cloruro de mercurio al 5% Mezcla cida Alumbre frrico Cloruro estannoso al 40% P/Ven cido clorhdrico 60% V/V Granallas de Zinc Procedimiento Colocar en la parte inferior del tubo de desprendimiento un papel de filtro plegado y embebido en solucin de acetato de plomo seco. Por el estrechamiento de este tubo introducir lana de vidrio embebida en acetato de plomo. Finalmente, en la parte superior del tubo colocar una tira embebida en Cl2Hg seco. El Ac2Pb retiene el SH2 (como SPb) que interfiere con el color. En el frasco colocar 20 ml de mezcla cida, 2 ml de solucin de alumbre frrico, 0,5 ml de Cl2Sn. Agregar la capacidad de un crisol de 30 ml de granallas de Zn activado y llevar a volumen de 200 ml con agua destilada y colocar por ltimo una cantidad exactamente medida de solucin a ensayar. El agregado de ClNa y H2O a la mezcla cida produce un desprendimiento regular de Arsina (AsH3). El alumbre frrico compleja el Sb que pudiera estar presente. El Cl2Sn disminuye el sobrepotencial del Hidrgeno permitiendo la reduccin. Tapar perfectamente y colocar en bao de agua fra durante 45 minutos. Sacar la banda de papel reactivo y sumergirla en una solucin de KI al 10% que permite estabilizar el color. Secar entre papel de filtro y comparar con bandas standard obtenidas operando de la misma manera. En el caso de utilizar el frasco de 60 ml, las cantidades de reactivos varan. AsO4-3 + 4 Zn0 + H+ <==========> AsH3 (arsina) + 4 Zn+2 + 4 H2O 2 AsH3 + 3 Cl2Hg <=========> As2Hg3 (amarillo pardo) + HCl As2Hg3 + I-1 <===========> (I4Hg)3As3 La sensibilidad del mtodo es de 50 ppm a 300 ppm

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Fig. 1: Equipo para determinacin de arsnico por el mtodo de Gutzeit cuali y cuantitativo.

Expresin de resultados: se indicar la cantidad de As sobre la masa de muestra pesada. Lo habitual es expresar el resultado en mg/Kg de muestra. b) Mtodo de Vasac y Sedivec: El mtodo es similar al anterior con el fundamento de reducir cuantitavamente el arsnico en la muestra con granallas de zinc y luego la arsina reacciona con una solucin de dietilditiocarbamato de plata en piridina formando un complejo color rojo que es medido espectrofomtricamente. Reactivos: Solucin Estndar de Arsnico: disolver 0.1734 g de arsenito de sodio en 1000 ml de agua bidestilada (solucin A). Tomar 10 ml de esta solucin (A) y llevar a 100 ml con agua bidestilada (solucin B). Tomar 10 ml de la solucin B y llevar a 100 ml con agua bidestilada (solucin C)= 1 /ml. Se preparan Estndar de 0, 1, 2, 5 10 y 20 g de As tomando 0,1, 2,5, 10 y 20 ml de la solucin patrn C. loduro de potasio 15% Acetato de plomo 10% P/V. Acido clorhdrico concentrado Solucin piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg) 0.5% Granallas de zinc Ioduro de potasio 15% P/V. Cloruro estannoso al 40% P/Ven cido clorhdrico 60% V/V Procedimiento: Una vez finalizada la mineralizacin se trasvasa cuantitativamente el contenido del baln al erlenmeyer A del dispositivo de Vasac y Sedivec lavando el baln con cantidad suficiente de agua destilada hasta un volumen de 25 ml. Paralelamente procesar un blanco de reactivos sin mineralizacin previa. Agregar a continuacin en 1 ml de ioduro de potasio 15% ms 10 ml de cido clorhdrico concentrado. Dejar reposar 2 minutos y agregar 0,5 ml de solucin de cloruro estanoso y dejar 15 minutos en reposo. La solucin debe permanecer incolora o ligeramente turbia. Si en la etapa final de la mineralizacin no se elimin todo el oxidante, el cloruro se convierte en Cl2 y aparece color amarillo en la solucin). Adaptar inmediatamente el tubo B que contiene algodn impregnado en acetato de plomo y el tubo acodado C que contiene la solucin piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg). Finalmente se agregan tres granallas de zinc y rpidamente se cierra el equipo asegurando que no existan prdidas en las juntas. Trabajar en campana de extraccin de gases. Se deja burbujear (desprender hidrgeno) durante 30 a 45 minutos.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa En presencia de arsenamina el reactivo argntico adquiere color rojo. Se realiza una curva de calibracin con 5 patrones. Realizar la curva de calibracin representando Absorbancia vs. g de As. Leer la absorbancia del complejo formado a 540 nm y se calcula la concentracin de As en la muestra interpolando el valor de la absorbancia obtenida en una curva de calibracin. Interpretacin qumica de la reaccin: En el mineralizado el As se encuentra como AsO4H2. El agregado de ioduro de potasio tiene por objeto transformar el AsO4H2- en AsO3H2- de acuerdo a la siguiente reaccin: AsO4H2- + 2 H+ + 3I- AsO3H2- + H20 + I3EI C12Sn adems de actuar como despolarizante reduce el I3- formado: I3- + 6Cl- + Sn2+ 3I- + (Cl6Sn)2-

El Zn libera H naciente el cual reduce el AsO4H2- a arsenamina (AsH3) La AsH3, al incidir sobre la solucin piridnica de dietilditiocarbamato de plata que es de color amarillo, forma con ste un complejo de color rojo. La reaccin qumica es la siguiente:

N(Et)2 S SAg
+

AH3

N(Et)2 C S + SH

N(Et)2 C S S As/3 + H2O + Ag

color rojo El acetato de plomo se utiliza para eliminar la interferencia del SH2 que en este caso estara presente por las condiciones reductoras de estos ensayos lo que favorecera la transformacin del SO42- en SH2 . Lmite de cuantificacin: En las condiciones de trabajo precedentes el lmite de cuantificacin es de 0,5 g%. Esta tcnica permite determinar As total y es til para la investigacin en intoxicaciones agudas y crnicas, pero no sirve para el seguimiento biolgico de trabajadores expuestos al As inorgnico.

8.5.2 Intoxicacin por Plomo

Generalidades de la intoxicacin El origen de la intoxicacin con Plomo puede ser: Profesional: En la industria se usan compuestos organometlicos de Plomo como antidetonantes. Revestimiento de cables, anticorrosivos, en pinturas y esmaltes (xidos de Plomo), imprentas de tipografa. En fundiciones e industrias de recuperacin del metal. Ambiental: El agua potable puede contaminarse a partir del polvo atmosfrico. Las tuberas de Plomo vuelcan el metal soluble al agua en condiciones cidas. En una intoxicacin con Plomo, generalmente crnica, se vern afectadas fundamentalmente dos enzimas de la va de sntesis del Hem: (a) Delta-ALA dehidratasa, que cataliza la conversin de cido delta-amino levulnico (delta-ALA) a porfobilingeno en el inicio de la va
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa (b) ferroquelatasa que cataliza la introduccin del Fe+3 en el anillo de la protoporfirina IX para dar lugar a la formacin del Hemo. Esto va a derivar en una porfiria secundaria o adquirida, que, en forma crnica, se manifiesta en el conjunto de sntomas caractersticos que constituyen el saturnismo. En laboratorio se determina el Perfil Plmbico, que consiste en la cuantificacin de delta-ALA (aumentada) y coproporfirinas (aumentadas) en orina y delta-ALA dehidratasa (disminuda) y Plomo en sangre (aumentado). Por otro lado se buscar tambin el punteado basfilo caracterstico. Investigacin de intoxicacin plmbica Determinacin de Plomo en sangre (Plumbemia) El mtodo clsico para la determinacin de Plomo en sangre es el mtodo de Jacobs modificado, que se basa en la formacin del ditizonato de Plomo, una vez eliminados por complejacin y extraccin los metales interferentes, y su lectura espectrofotomtrica a 510 nm. Las tcnicas de absorcin atmica son ms rpidas y precisas. Tienen adems muy alta especificidad de manera que las interferencias son pocas. Por esto los pretratamientos utilizados en las tcnicas colorimtricas se simplifican enormemente. Raramente se usan para el anlisis cualitativo. Los lmites de deteccin para las tcnicas de atomizacin en llama se encuentran en el orden de los g/ml y los volmenes de muestra requeridos son de alrededor de 2 ml. Los coeficientes de variacin son de 2 a 0,1%. En tcnicas en donde se realiza una atomizacin en horno de grafito se requieren volmenes de muestra de alrededor de 50 L, con lmites de deteccin 10 a 100 veces menores que en la atomizacin en llama. Los coeficientes de variacin son de 10 a 1%. Se describe a continuacin la determinacin de plomo mediante espectrofotometra de absorcin atmica en sangre por dos mtodos: 1. Mtodo del sobreagregado 2. Curva de calibracin En el mtodo del sobreagregado, cantidades conocidas del analito es sobreagregado a la muestra de sangre realizndose luego la hemlisis de la muestra. Se forma luego un complejo metlico para realizar entonces una extraccin en fase orgnica del mismo y la posterior medida mediante atomizacin en llama. La muestra de sangre se toma por puncin venosa una vez desinfectada la zona con alcohol, mediante jeringa descartable de plstico, previamente heparinizada. Se necesita del paciente un ayuno de por lo menos 10 horas. Todo el material a usar debe ser tratado previamente con cido ntrico 1:1 durante 24 horas. Se enjuaga luego tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada. Reactivos: Pirrolidn ditio carbamato de amonio (APDC) 4%: Se pesan 4 gr de APDC y se llevan a 100 ml con agua bidestilada caliente. Luego se filtra en papel Whatman No4. Tritn X-100 10%: Tomar 10 ml de Tritn X-100 y llevar a 100 ml con agua bidestilada tibia. APDC 2%-Tritn 5%: Se mezclan volmenes iguales de las soluciones anteriores que deben ser preparadas en el momento de usar. Metil isobutil cetona (MIBK): Por lo menos 24 horas antes, saturar en agua destilada MIBK, dejando en contacto permanente ambos lquidos. Solucin madre de Plomo: Se pesan 1.5985 gr de (NO3 )2Plomo p.a. llevando a un litro con cido ntrico 1/1000. Se tendr una solucin de 1 mg/ml. Solucin testigo: 12,5 ml de la solucin madre se llevan a 100 ml con cido ntrico 1/1000. Se tendr una solucin de 125 g/ml.(125 ppm). Equipos. Espectrofotometro de absorcin Atmica. Procedimiento: 1. Colocar 2,5 ml de sangre entera de la misma muestra en cada uno de dos tubos, provistos de tapa y cierre esmerilado.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 2. A uno de los tubos agregar una cantidad conocida, por ejemplo 0,1 ml, de la solucin testigo de Plomo. 3. Paralelamente se preparan un blanco con 2,5 ml de agua bidestilada y un tubo testigo con 2,5 ml de agua bidestilada y 0,1 ml de la solucin testigo. 4. A cada uno de los tubos que contienen sangre se les adicionan 1 ml de la solucin APDC-Tritn. Se agitan los tubos en Vrtex, hasta hemlisis completa, durante aproximadamente 15 segundos. 5. A los tubos blanco y testigo se les agregar 1 ml de la solucin APDC 4%, pues la solucin APDC-Tritn con el agua forma emulsiones muy difciles de separar. 6. Se agrega luego a cada uno de los tubos 2,5 ml de MIBK, agitando en Vrtex durante aproximadamente 30 segundos. Se debe verificar que la mezcla sea adecuada. Se centrifugarn luego durante 10 minutos a 3000 rpm. 7. Finalmente se separarn las fases superiores de MIBK. La fase orgnica debe tomar un leve color amarillo y de no ser as se debe sospechar una agitacin insuficiente y se recomienda repetir la operacin. 8. Los extractos de MIBK se nebulizan en el atomizador de llama y se leen contra MIBK, controlando el cero del aparato despus de cada medida. Expresin de los resultados, para los siguientes valores: Abs muestra = M Abs muestra ms testigo = M T Cantidad de Plomo en muestra = P Cantidad de Plomo sobreagregada = Pa Absortividad = a Longitud de la ranura del quemador = b Volumen de la muestra = Vm Volumen agregado de la solucin testigo = Vt Concentracin del testigo en g / ml = Ct Se tienen las relaciones M= a M
.

b . Pa Vm
.

T=a

Vm

(Pa Vt

P)

Despejando el valor de se llega a una relacin, independiente de los valores de a y b, del siguiente tipo M Pa P= M T . Vm Vt - M____ Vm M T Multiplicando este valor por el factor Ct xVt/Vm se obtendr la concentracin de Plomo en g / ml. b) Mtodo empleando curva de calibracin: Este mtodo es similar al anterior con las siguientes modificaciones: se construye una curva de calibracin con sobreagregado de plomo concentracin conocida a 5 tubos de muestra entera de sangre. La curva se construye de la siguiente manera: De la solucin madre de Plomo (1000ppm), tomar 12.5 ml y llevar a 100 ml con cido ntrico 1/1000.De esta manera se obtiene una solucin de Plomo de 125ppm. Realizar una curva de calibracin con sangre de la siguiente manera En 5 tubos se colocan 2.5ml de sangre en cada uno y agregar 0, 5, 10, 15, 20 microlitros de la solucin de Plomo de 125 ppm. Tubo Microlitros de plomo de Concentracin de plomo
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa solucin 125 ppm 0 5 10 15 20

1 2 3 4 5

X X+25 g/ 100 ml Plomo X+50 g/ 100 ml Plomo X+75 g/ 100 ml Plomo X+100 g/ 100 ml Plomo

1. Agregar 2 ml de APDC y tritn y luego agitar en vrtex durante 60 segundos. Luego agregar 2 ml de MIBK durante 30 segundos. 2. Todos los dems pasos se conservan tal cual, incluido el tratamiento de la muestra problema (cantidades, concentraciones, etc.) 3. La sangre empleada para realizar la curva debe ser de banco asegurando que no contiene plomo mas all de los valores normales. Es conveniente siempre contar con un vial con sangre y cantidad conocida de plomo sobreagregada (standard interno) a modo de verificar los resultados obtenidos. 4. Debe recordarse que el material de vidrio debe estar escrupulosamente mantenindolo en cido ntrico 1:1 durante 24 hs para luego lavarlo con agua bidestilada. Valores de referencia para la poblacin de Capital Federal y alrededores Nios no expuestos: 17 8 g % Adultos no expuestos: 19 7 g % Adultos expuestos: 57 21 g % Valor lmite para el sujeto expuesto: 70 g % (segn Working Conference, Amsterdam 1968). Determinacin de Porfobirinogeno (PBG) orina. Ensayo rpido 1. Se utiliza como muestra la orina recolectada en las condiciones correspondientes a la determinacin de coproporfirinas totales (pH = 7.8) ver item 5.3.2.4. ya que el plomo se polimeriza en medio cido dando uroporfirina. 2. En un tubo pequeo a 2 ml del reactivo de Erlich (2 g de p-dimetil aminobenzaldehdo en 50 ml de HCl y 50 ml de agua destilada) se agregan 1 - 2 gotas de orina. Al cabo de 2 segundos un desarrollo de color rosado a rojo al tope de la solucin indica un test positivo para PBG. 3. El color amarillo que se observa a veces, se debe a compuestos tales como urea y urobilingeno que no desarrollan color en esas condiciones hasta una concentracin de 200 mg/g. 4. En una intoxicacin con Plomo se encontrarn valores de PBG en orina normales o disminuidos. Si se hallaran valores aumentados, sera indicio que la porfiria manifestada es de otra naturaleza, por ejemplo de tipo congnito. Determinacin de Acido Delta Aminolevulnico (delta ALA) en orina. Mtodo de BerkDurk modificado, Clinical Chem. Lab., 1973. La reaccin se fundamenta en la reaccin del delta ALA con acetilacetona dando un compuesto pirrolico (2 metil, 3 acetil 4 (3 propion) pirrol) que condensa luego con el reactivo de Erhlich originado un compuesto rojo que se determina por espectrofotometra a 553 nm. Muestra: Orina correspondiente a 24 horas recolectada en frasco oscuro conteniendo solucin saturada de cido tartrico aprox. 1 ml/ 100 ml de orina. Reactivos. 1. Reactivo de Erlich modificado = 1 gr de p-dimetilaminobenzaldehdo se disuelve en 35 ml de cido actico glacial, se agregan 8 ml de cido perclrico 70% y se lleva a 50 ml con cido actico glacial.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 2. Solucin acetato de sodio 0.5 M: 41 gr de AcNa se disuelven en 1 litro de agua destilada. 3. Solucin AcH 0.5 M: 28.7 ml AcH glacial se llevan a 1000 ml con agua destilada. 4. Buffer acetato: 93.2 ml AcH 0.5 M ms 6.8 ml AcNa 0.5 M (pH=3.5). 5. Solucin diluyente: 0.25 gr de carbn medicinal se agregan a 100 ml de solucin buffer acetato 0.5 M. 6. Estndar de delta-ALA 400 g/ml: se disolvern 4 mg de delta-ALA p.a. en buffer acetato, llevando a 10 ml totales. Equipos. Espectrofotmetro UV-visible Bao termosttico Centrfuga hasta 500 rpm Procedimiento: 1. Transferir 1 ml de orina (pH 6 6.5) a un tubo de centrfuga y agregar 9 ml de solucin diluyente. Mezclar durante unos minutos y centrifugar. 2. Filtrar por papel de filtro y transferir 2 alcuotas de 2 ml c/u del filtrado a sendos tubos de ensayo B y D (Blanco y Desconocido, respectivamente). Al tubo D se le agrega 0.1 ml de acetilacetona y ambos tubos se llevan a bao Mara (BM) hirviente durante 20 minutos. 3. Se enfran entonces los tubos en bao de agua y se le agrega 2 ml de Reactivo de Erlich a cada una. Luego de 15 minutos se lee la absorbancia del tubo D a 553 nm contra el tubo blanco. 4. La cantidad de delta ALA se obtiene a partir de una curva de calibracin expresada en g/ml. Se tomarn soluciones de 50, 30, 10, 5 y 1 g/ml, diluyendo la solucin standard original de 400 g/ml. sobre ellas se realiza la reaccin de Erlich en forma anloga a la realizada sobre las muestras. Observacin: La reaccin del delta ALA con el reactivo de Erlich es muy sensible aunque no especfica pues tambin la dan las aminocetonas y las glucosaminas. Desde el punto de vista de la determinacin del perfil plmbico, estas interferencias no tienen relevancia en los rangos de concentracin de -ALA halladas en el saturnismo. Valores normales 0.1 a 0.5 mg% para menores de 15 aos 0.1 a 0.6 mg% para adultos excrecin urinaria 1.3 a 7 mg/24 hs.

Ensayo para porfirinas en orina Se trata de un test rpido cuyo resultado es positivo desde valores de concentracin de 70 g% (1 mol/L). Reactivos Acido actico Alcohol amlico Eter etlico Procedimiento En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de una mezcla de igual volumen (1:1:1) de cido actico, alcohol amlico y ter dejando caer sobre ella 15 ml de orina. Luego de 2 minutos el reactivo habr extrado la mayor parte de las porfirinas presentes por lo que se separara una capa superior en el tubo. Si esta capa superior muestra fluorescencia roja, el test es positivo. El ensayo se puede hacer ms sensible transfiriendo la fase orgnica superior con una pipeta Pasteur a otro tubo conteniendo 1 - 2 gotas de HCl. Se agita fuertemente (10 - 20 seg) y se observa la capa clorhdrica inferior a la luz UV. Tambin puede hacerse una prueba mediante 10 ml de orina, 0.5 ml de AcH glacial y talco, agitando vigorosamente, para observar la fluorescencia en el tubo. Determinacin de coproporfirinas totales en orina. A.A.Fernndez; R.J. Henry, H.Goldenberg Clin. Chem. 12, 463 - 474, (1966).
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa El mtodo se fundamenta en la extraccin de coproporfirinas a pH adecuado con acetato de etilo para la posterior oxidacin del coproporfiringeno remanente a coproporfinas que luego se extraen con cido clorhdrico y posterior lectura en espectrofotmetro a tres longitudes de onda a efectos de corregir las interferencias Muestra: Orina correspondiente a 24 horas recolectada en un frasco oscuro conteniendo CO3Na2 como conservador en cantidad suficiente para una concentracin final de 0.1 - 0.5%. El CO3Na2 tiene como finalidad de evitar las prdidas de coproporfirinas fundamentalmente, conservando a pH 5 - 9.5. En estas condiciones, la mayor parte de los coproporfiringenos pasarn a coproporfirinas. Reactivos 1. Acetato de sodio 1%: 10 g de sal anhidra o 16,6 g de acetato de sodio trihidratado se disuelven en agua y se llevan a 1000 ml. La solucin es estable varias semanas a temperatura ambiente. 2. Buffer acetato de sodio (pH = 4,8): se mezclan 1 vol. de actico glacial con 4 vol. de solucin saturada de acetato de sodio y 3 vol. de agua. 3. Solucin saturada de acetato de sodio: la saturacin se facilita mucho disolviendo el acetato de sodio a 70 - 80o C. Si el acetato de sodio no cristaliza al enfriarse el agua, se calienta de nuevo la solucin y se aade ms sal. Se puede usar sal anhidra o trihidratada. 4. Solucin alcohlica de iodo al 1% (de reserva): Se disuelve 1 g de iodo en alcohol y se diluye hasta 100 ml. Conservar en heladera en frasco oscuro con tapn de vidrio. 5. Solucin de iodo al 0,005%: se diluyen 0,1 ml de la solucin de reserva en agua destilada hasta 20 ml. Se debe preparar en el momento de usar. 6. Acido clorhdrico 1,5N se aaden 12,5 ml de HCl a 50 ml de agua destilada aproximadamente y se diluye hasta 100 ml. Equipos: Espectrofotmetro UV visible.

Procedimiento:
1. Se debe controlar el pH de la orina con papel indicador de manera que se encuentre en el rango de 5 a 9.5; no se debe trabajar con muestras cuyo pH sea inferior a 5. 2. Posteriormente, se debe examinar la muestra de orina a la luz UV y si tuviera fluorescencia roja se debe diluir la misma con agua en una relacin 1:10. 3. A 20 ml de orina se le agregan 10 ml de buffer acetato (pH = 4.8) y se transfiere a una ampolla de decantacin. Se le agregan 30 ml de acetato de etilo y se agita suavemente durante 3 a 5 minutos. Se deja reposar y se descarta la fase acuosa. 4. La fase orgnica se lava 3 veces con 5 ml de acetato de sodio 1% cada vez. Se colectan los extractos orgnicos, descartndose la fase acuosa y se agregan 2 ml de solucin de iodo al 0.005% preparada en el momento, no dejando ms de 5 minutos en contacto ya que el tiempo es crtico. Se desecha la solucin de iodo y finalmente se efectan tres extracciones o hasta que la capa orgnica no presente fluorescencia, con 2.5 ml de HCl 1.5 N cada vez. Se recoge el extracto clorhdrico en un tubo graduado midiendo este volumen. 5. En forma alternativa puede realizarse una separacin mediante el sembrado de 1 ml de orina en una columna de intercambio aninico Dowex 1X8, dejando eluir con 3 ml de agua destilada. Se eluyen luego las porfirinas con HCl 3 N hasta fluorescencia negativa. 6. A continuacin, se lee la absorbancia del extracto clorhdrico a tres diferentes: 380, mximo entre 400 y 410 (generalmente 402) y 430 nm. Expresin de resultados: A corregida = 2 A max - (A 380 + A 430 ) 1.835
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Coproporfirinas ( g/24 hs) = A corregida . V c .V t . D . V alcuota orina donde: A 380 y A 430 : indican absorbancia a 380 y 420 nm, respectivamente A max : indica la absorbancia mxima en el rango 400 - 410 nm Vc : volumen total de los extractos clorhdricos Vt : volumen total de orina recolectada en 24 hs. D: factor de dilucin, si se diluy la orina : coeficiente de extincin (ml/ g) de coproporfirinas en HCl 1.5 N = 0.673 Valores normales = 0 - 160 g / 24 hs. Determinacin de la actividad de la enzima Delta- aminolevulinico dehidratasa. Berlin, A; Schaller, H.M.. Klim. Chim. Klim. Biochem., 12, 389-390 (1974). Muestra: Se utiliza sangre entera que debe ser recogida con jeringa descartable de plstico usando heparina como anticoagulante, en un volumen mnimo de 1 ml. No deben emplearse NaF ni EDTA debido a que inhiben la actividad enzimtica. La misma muestra puede usarse para la determinacin del hematocrito y Plomo. La muestra se mantendr en heladera a 4oC hasta su procesamiento. Se recomienda efectuar la determinacin en el da de recoleccin, pues la actividad enzimtica desciende en un 12% a 15% luego de 24 horas. El material de vidrio deber ser preferentemente de borosilicato. Para ser utilizado es necesario tratarlo previamente con HNO3 1:1 durante 24 horas. Posteriormente enjuagarlo tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada, para evitar cualquier contaminacin. El material de plstico ser preferentemente de polipropileno. Reactivos: 1. Buffer fosfato: 29 ml de fosfato disdico 0.1 M con 71 ml de fosfato monosdico 0.1 M. Ajustar el pH a 6.4 con la solucin correspondiente. Mantener en heladera a 4oC. 2. Buffer sustrato: disolver 0.01676 gr de -ALA p.a. en 5 ml de fosfato monosdico 0.1 M, llevar a pH 6.4 con fosfato disdico 0.1 M. Completar a 10 ml con buffer fosfato de pH 6.4. Se conservar en freezer a -18oC. 3. Reactivo de Erlich: Disolver 0.24 gr de p-DMAB en 7.2 ml de cido actico glacial, posteriormente agregar 1.92 ml de cido perclrico, completando a un volumen de 12 ml con cido actico glacial. Se prepara en el momento de usar o se mantiene en heladera a 4oC. 4. cido tricloro actico (TCA) 10%: Pesar 10 gr de TCA y disolver en 100 ml de agua destilada. Equipos. Espectrofotmetro UV-visible Bao termostatito Centrfuga Procedimiento: 1. A un volumen de 0,2 ml de sangre agregar 1,3 ml de agua bidestilada y 1,0 ml de buffer sustrato. Se produce la hemlisis total de la muestra de sangre. 2. Paralelamente se procesa un blanco con 0.2 ml de sangre a la que se le agrega 1,3 ml de agua bidestilada, 1 ml de TCA 10% y 1 ml de buffer sustrato. Incubar los tubos de blanco y muestra durante 60 minutos a 38oC; el tiempo de incubacin se empieza a contar desde el agregado de buffer sustrato a las muestras. 3. Cumplido el tiempo de incubacin, se le agrega al tubo de muestra 1 ml TCA 10%. Se centrifugan luego todos los tubos durante 10 minutos a 2000 RPM.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 4. Reaccin de color: A un volumen de 1.5 ml del centrifugado agregar 1.5 ml de reactivo de Erhlich. Mezclar en Vrtex y leer luego de 10 minutos las absorbancias respectivas contra reactivo de Erhlich a 555 nm.

Expresin de resultados:
Act delta ALA DEHIDRATASA = Abs x 100 x f x D Hto x t x m donde: Abs. Es la absorbancia de la muestra menos la Absorbancia del blanco m: coeficiente de extincin molar en l / mol. cm = 0.062 Act ALA DEHIDRATASA: en U/ L de hemates f: factor de conversin de deltaALA a Plomo = 2 D: factor de dilucin = 35 t: tiempo de incubacin. Valor de referencia para la actividad enzimtica en sujetos sanos no expuestos al plomo: mayor a 20 U / L hemates

Determinacin de Plomo en una muestra de alimentos de origen vegetal por el mtodo de absorcin atmica
La determinacin de la concentracin de Plomo se puede realizar sobre cualquier tipo de una muestra de alimentos, en este caso se presenta el protocolo ya puesto a punto para el caso de muestras de producto vegetales y en particular tomate enlatado. El primer paso del anlisis, consiste en una digestin de la materia orgnica (DMO) para volver ms sencilla la matriz que contiene el analito, as como obtener una solucin lmpida y ms fluida que la muestra original, hecho que facilita el proceso de inyeccin de la muestra. Reactivos. cido ntrico concentrado libre de plomo. Equipos. En este caso se describe el procedimiento para un equipo Shimadzu AA-6701F provisto de un quemador con cmara de premezclado y horno de grafito. Digestor de microondas CEM modelo MDS 2100. Procedimiento. La DMO se realiza en un digestor de microondas especialmente diseado. Se pesan 0,5 gr. de la muestra a digerir, y se colocan dentro de un vaso especial, junto con 5 ml de cido ntrico concentrado de calidad pro-anlisis, mas 1 ml de agua desionizada. Los tubos de digestin y la tapa de ellos son de tefln. En la tapa se distingue una vlvula de seguridad, a la cual debe acoplarse un tubo que conecta el vaso con un recipiente situado en el centro del aparato, este recipiente sirve como trampa para los vapores nitrosos que salen del vaso, y/o para recibir cualquier sustancia que salga del vaso. La vlvula de seguridad debe revisarse en cada utilizacin del aparato, esta consiste en una membrana, semipermeable, que permite la salida del vapor contenido en el vaso si la presin desarrollada dentro de este resulta excesiva. La tapa se ajusta al vaso, por medio de un cierre a rosca hecho de keblar. Una vez cerrado el vaso, se encamisa con un tuvo hecho del mismo material que el cierre. Luego de armar los vasos con las muestras a digerir, se disponen en un carrusel situado dentro del horno, y se conecta el tubo de seguridad que corresponde a cada uno. Uno de los vasos que se utiliza tiene una tapa diferente a las otras. Esta estar provista de tres salidas, una se usa para introducir una fibra ptica que hace las veces de sensor de temperatura, a otra de las salidas se conecta el sensor de presin, y la ltima se utiliza para acoplar el tubo de seguridad. Una vez que se introdujeron todos los vasos a utilizar, se procede a la programacin del esquema de calentamiento. Se elige es la presin y temperatura usada durante ese proceso. Antes de comenzar la digestin, limpiar escrupulosamente los vasos, las tapas, los cierres, y las camisas de los vasos, con un pao limpio y seco.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa Al terminar el proceso, se debe esperar a que se enfren los vasos para que disminuya la presin en ellos, luego, se retiran los vasos, se trasvasa su contenido a un matraz de 10 ml y se lleva a volumen con cido ntrico 15%. La digestin debe ser evaluada por el operador, considerndose terminado el proceso, cuando el producto sea una solucin lmpida, sin residuos slidos. Si esto no sucede, se debe someter la muestra a un nuevo ciclo de digestin.

Curva de calibracin:
La determinacin de la cantidad de Plomo en la muestra se realizara en base a una curva de calibracin que se confecciona con una serie de soluciones estndar. Estas soluciones son preparadas a su vez, a partir de una solucin madre comercial pro-analisis cuya concentracin es 1000 mg/L, o 1000 ppm. El metal se encuentra por lo general en forma de nitratos o sulfatos solubles, esta solucin esta casi libre de la presencia de otros metales. Las soluciones que se recomiendan en general son: 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 30 ppm, 50 ppm. Estas soluciones se prepara tomando 50 ml de la solucin madre, que se llevan a 500 ml con agua destilada desionizada. Con eso se tiene una solucin de concentracin igual a 100 ppm de plomo. De esta se preparan las soluciones estndar, tomando 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml, 3 ml, 5 ml, para luego llevar a un volumen final de 100ml con cido ntrico 15%. Adems se usara una sexta solucin patrn para definir el 0 de concentracin, este no es mas que una solucin de cido ntrico 15%.

Clculos:
La concentracin en la muestra se determina mediante la siguiente expresin:

ppm

ppb.leida * 0.02

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