10 Activacin de Linfocitos T

E.Muoz y J.Pea
La activacin de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento por parte del TCR/CD3 de la molcula HLA y el pptido presentado por la misma junto con otros procesos, como son la activacin de ciertas molculas accesorias presentes en su membrana. Tambin en este proceso de activacin se hace mas eficiente si los linfocitos reciben el estimulo de ciertas citocinas mediante su unin a los receptores especficos presentes tambin en la membrana de estos linfocitos. Una vez activados los linfocitos T, estos prioritariamente producirn citocinas o factores citotxicos, segn se trate de linfocitos T CD4+ o CD8+. De esta manera se desarrollar la respuesta inmune. Los linfocitos T CD4+ colaborarn en la posterior activacin de otras clulas, tales como NK, T CD8+, linfocitos B o macrfagos. A su vez los linfocitos T CD8+ tras su activacin ejercern su funcin citotxica destruyendo clulas blanco (Figura 10.1).
Fig.:10.1

Fenmenos de interaccin celular En muchos casos la unin del antgeno con el TCR no es suficiente para dar lugar a una respuesta inmune eficaz. Para que esta respuesta se lleve a cabo se requiere la participacin de una serie de molculas conocidas globalmente como accesorias, y cuya funcin es precisamente la de contribuir al desarrollo de una respuesta inmune efectiva facilitando la interaccin entre Fig.:10.2 las distintas clulas. Se forma as lo que se viene en denominar sinapsis entre linfocitosT y clula presentadora de antgeno (Figura 10.2) Las principales molculas implicadas en este fenmeno de reconocimiento son el CD4, CD8, CD2, CD45 y CD28 y sus ligandos respectivos. Todas estas molculas de adhesin tambin juegan un importante papel en la

transduccin de seales y activacin de la clula T. En la Figura 10.3 se recoge un esquema de las distintas posibilidades de activacin de los linfocitos T segn las molculas que intervienen en los procesos de reconocimiento y adhesin intercelular.
Fig.:10.3

Molculas CD4 y CD8. Las molculas CD4 y CD8 son glicoprotenas cuyos ligandos naturales son las molculas del MHC de clase II y de clase I respectivamente. La molcula CD4 pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y esta formada por una sola cadena. La molcula CD8 pertenece tambin a la superfamilia de las Igs, pero su estructura difiere considerablemente de la anterior, al estar formada por dos cadenas homlogas, alfa y beta, que pueden formar heterodmeros o, en menor proporcin, homodmeros (alfa/alfa). Las interacciones de estas molculas con el HLA, juegan un papel esencial en la maduracin tmica de los linfocitos. De hecho, el fenotipo CD4/CD8 de un determinado linfocito T determina su funcin efectora. As, mientras el CD4 se expresa en la mayora de los linfocitos T cooperadores, la molcula CD8 se presenta, principalmente, en aquellos linfocitos T con funcin citotxica. Es lgico que las clulas T con fenotipo CD8+ reconozcan antgenos en el contexto de molculas MHC de clase I, ya que stas tienen una distribucin tisular universal, pudindose realizar as la funcin citotxica, reconocimiento y lisis, de cualquier clula del organismo que se encuentre infectada por virus. Molculas CD2 Las molculas CD2 junto con el CD11a/CD18 (LFA-1) son las molculas de adhesin primaria que contribuyen a potenciar la afinidad de unin del linfocito T a la clula presentadora. Sus ligandos naturales que son el CD58 (LFA-3) y CD54 (ICAM-1) respectivamente, se expresan en la superficie de todas las clulas que realizan la funcin de APC. El CD2 es una glicoprotena presente en la superficie de timocitos y linfocitos T, organizada en dos dominios globulares extracitoplasmticos, una regin transmembrana y una larga regin intracitoplasmtica. Esta molcula es la primera molcula que se expresa en el linaje T durante su diferenciacin y se encuentra en todos los timocitos y clulas T maduras. Adems de su papel en la interaccin entre clulas, est implicado en una va alternativa de activacin T antgeno-independiente. Otras molculas de membrana que intervienen en el proceso de adhesin son CD5 y CD40, cuyos ligandos en la APC son, respectivamente, CD72 y CD40L.

Molculas CD28 Las molculas CD28 son tambin de especial importancia en los mecanismos de adhesin celular. El CD28 se expresa en todos los linfocitos CD4 y aproximadamente en el 50% de los linfocitos CD8, sus ligandos naturales pertenecen a la familia B7 (B7-1, CD80; B72, CD86). CD28, adems de su papel en el proceso de adhesin, tambin participa en el mecanismo de transduccin de seal y activacin de la clula T ya que el CD28 induce la denominada segunda seal de activacin celular (la primera est generada por el TCR/CD3). En ausencia de esta segunda seal, los linfocitos T pueden anergizarse por la primera seal de activacin dependiente TCR/CD3. Esta segunda seal parece ser regulada negativamente por la molcula CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4). Solo un nmero muy pequeo de molculas MHC con el pptido apropiado estn presente en un rea dada del contacto clula-clula establecido con el proceso de adhesin. Gracias a la habilidad del TCR/CD3 de formar estructuras ordenadas, los complejos MHC con el pptido correcto migran dentro de la interfase. Esto provoca una alta densidad local de complejos TCR/CD3 cooperando en la unin antignica. Transmisin de seales Todas las clulas eucariotas incluidos los linfocitos T, B y NK poseen mecanismos a travs de los cuales los estmulos externos son procesados y enviados al ncleo a travs de una serie de cambios bioqumicos que conocemos genricamente como seales de activacin intracelulares o de transduccin de seales. Estos mecanismos implican la formacin de los denominados segundos mensajeros que son capaces de regular la transcripcin especfica de un amplio nmero de genes, los cuales participan en los procesos de crecimiento, divisin y diferenciacin celular. En la activacin de esta cadena de segundos mensajeros intervienen seales procedentes tanto del TCR/CD3 como de las molculas accesorias y receptores de citocinas presentes en la membrana de los linfocitos (Figura 10.4).
Fig.10.4

Un mecanismo fundamental en la regulacin de la actividad y la funcin de numerosas protenas en las clulas eucariticas son los ciclos de fosforilacin y defosforilacin mediados por cinasas y fosfatasas. Bsicamente existen dos tipos de cinasas, dependiendo de su actividad fosfotransferasa la cual se manifiesta fosforilando protenas en aminocidos serina y treonina (serina/treonina/cinasas) o bien en aminocidos tirosina (tirosina cinasas). Igualmente hay fosfatasas que defosforilan especficamente protenas fosforiladas bien en serina/treonina o en tirosina.

Una propiedad general de los linfocitos es la necesidad de generar dos seales distintas para inducir la proliferacin hacia clulas efectoras. Como se ha comentado anteriormente la primera seal la proporciona la unin del complejo pptido-MHC al TCR (y a los co-receptores CD4 y CD8), esta seal est potenciada por molculas de adhesin (CD2, el LFA-1, el CD26, etc.). La segunda seal es suministrada por molculas co-estimuladoras del tipo CD28, que de alguna manera complementan las seales de activacin inducidas por el TCR permitiendo una activacin celular completa (Figura 10.5). Estas seales coestimuladoras son necesarias para la activacin del linfocito, ya que en su ausencia la seal mediada por el TCR puede conducir al linfocito a la muerte celular o a un estado de anergia (en la que el linfocito no responde a nuevas estimulaciones).
Fig.10.5

Despus de la ocupacin de los receptores T por el antgeno, se produce la activacin de los linfocitos y la iniciacin de eventos tempranos de traduccin de seales que finalmente conducen a la reprogramacin gnica y a la adquisicin de funciones efectoras. Para que el linfocito T pueda llevar a cabo estas funciones se requiere un complejo sistema responsable de la transmisin de seales de activacin desde la superficie al interior de la clula. En esta ltima dcada se est realizando un gran esfuerzo para identificar los componentes celulares y moleculares que estn involucrados en dicha activacin celular y determinar la secuencia de eventos bioqumicos que ocurren despus del reconocimiento del antgeno. ESTMULOS INICIADOS POR EL TCR. Uno de los primeros eventos bioqumicos que ocurren en linfocitos T despus de la interaccin Ag-TCR, es el incremento de fosforilacin en tirosina de las cadenas no polimrficas del CD3. Estas cadenas poseen en sus dominios intracitoplasmticos unas regiones denominadas ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs) que se fosforilan por la accin de las tirosina cinasas c-lck o c-fyn. La tirosina cinasa c-lck se encuentra localizada en la parte intracelular de la membrana plasmtica unida a la bicapa lipdica por un proceso de miristilacin de su regin aminoterminal (Figura 10.6). La asociacin fsica y funcional del CD4 y del CD8 con el TCR/CD3, hace que la c-lck asociada a estas molculas se aproxime a la porcin citoplsmica de las protenas del complejo CD3, donde puede fosforilar en tirosina a sus regiones ITAM. Adems del CD3 esta cinasa puede tambin fosforilar otros substratos como es el caso de PLC-gamma-1 (fosfolipasa C-gamma-1) que participa en la regulacin del sistema inositol fosfato que se describir ms adelante. C-fyn, al igual que c-lck es otra tirosina cinasa que pertenece a la familia de cinasas Src. Tambin est anclada a la cara interna de la membrana celular por miristilacin de su porcin aminoterminal. Esta cinasa est fsicamente asociada al TCR y su actividad est regulada por la ocupacin y activacin del mismo.

Una vez que los ITAM son fosforilados en residuos tirosinas, se convierten en sitios especficos de acoplamiento que se unen a protenas citoplsmicas con dominios SH2. La funcin de los dominios SH2 es interactuar con algunas protenas que se encuentran fosforiladas en residuos tirosina, as su funcin esta regulada por procesos fosforilacindesfosforilacin de estos aminocidos. Por este motivo, un dominio SH2 puede interactuar con una fosfotirosina adyacente en la misma o en otra molcula. Cuando es sobre la misma molcula contribuye al control de su propia actividad enzimtica. En otras ocasiones, la enzima con el dominio SH2 interacciona a travs de dicho motivo con otras protenas previamente fosforiladas en tirosina por otra cinasa. Esta interaccin es responsable de su activacin y de la de otros substratos. Este es el caso de la enzima ZAP-70 que se activa cuando a travs de sus dominios SH2 se une a las cadenas que han sido previamente fosforiladas por c-fyn o c-lck. ZAP-70 desempea un papel crtico en el mantenimiento de la cascada de seales que se pone en marcha tras el reconocimiento del antgeno por el TCR. En este sentido, esta enzima es un acoplador de seales desde la superficie celular al ncleo por fosforilacin de los adaptadores Lat y SLP-76. Lat es una protena transmembrana cuya funcin, una vez fosforilada, es organizar complejos multimoleculares en determinados subdominios lipdicos de la membrana plasmtica. Estos complejos contienen protenas claves en la sealizacin al interior de la clula como son la PLC-gamma1 (fosfolipasa C), el Grb-2 (growth factor binding protein), SLP-76, la PI3K y Vav-1
Fig.:10.6

FOSFATASA CD45 El CD45, LCA (Antgeno comn leucocitario) o T200 es una de las glicoprotenas ms abundantemente expresadas en la superficie de clulas hematopoyticas, pudindose detectar hasta un milln de molculas por clula El CD45 presenta una larga regin citoplasmtica que contiene dos dominios catalticos con actividad fosfatasa, una regin intra-membrana y una regin aminoterminal extracelular que se encuentra glicosilada y que vara en su estructura. Esta variedad ha sido explicada despus del clonaje e identificacin del gen que, codificada dicha protena, el cual gracias a que puede transcribir de forma alternativa los tres exones (A, B y C) que codifican la porcin aminoterminal de la protena. Esta transcripcin alternativa puede generar hasta ocho diferentes ARN mensajeros que traducen al menos seis diferentes isoformas del CD45 en la membrana celular (Figura 10.7).

Fig.:10.7

El ligando del CD45 no se conoce y la existencia de estas diferentes isoformas pueden indicar que los ligandos del CD45 sean mltiples y medien diferentes funciones en diferentes subpoblaciones de linfocitos T.

Diferentes sistemas experimentales han demostrado que el CD45 juega un papel predo-minante en los procesos de activacin celular mediados por la ocupacin del TCR. Aunque terica, la funcin que ms frecuentemente se atribuye al CD45 es la de defosforilar la tirosina de regulacin negativa de c-lck y c-fyn, con lo que estas cinasas se activaran autofosforilndose y fosforilando con toda probabilidad otros substratos prximos (como la cadena del CD3). No obstante, el CD45 podra defosforilar tambin a la tirosina de c-lck y c-fyn previamente autofosforilada conduciendo a una inhibicin de estas cinasas. Aunque estos modelos son hipotticos, se acumulan continuamente evidencias de que el CD45 pude regular positiva o negativamente los procesos de activacin celular. En este ltimo caso es importante destacar que la regin citoplasmtica del CD45 puede ser fosforilada va Protena Cinasa C (PKC) en residuos serina y como se ver a continuacin en el tiempo es posterior a los procesos de fosforilacin en tirosina descritos anteriormente por lo que es posible que esta fosforilacin de CD45 sea necesaria para inducir su actividad fosfatasa de regulacin negativa. En la Figura 10.8 se muestra la estructura de una tirosin cinasa p56.
Fig.:10.8

PLC-gamma-1 Despus del reconocimiento antignico por parte del TCR esta PLC-gamma-1, se fosforila en tirosina y se activa dentro de los complejos multimoleculares lipdicos de la membrana plasmtica donde induce la hidrlisis de su substrato especfico, el fosfatidilinositol bifosfato (PIP2), generndose los metabolitos inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) (Figura 10.9). El IP3 se une a un receptor especfico (IP3R) localizado en unas estructuras especficas del retculo endoplsmico facilitando la liberacin del calcio intracelular de sus compartimentos y aumentando la concentracin de estos iones en el espacio libre intracelular. El IP3, posiblemente en conjuncin con su metabolito, el IP4, puede regular los canales de calcio de la membrana plasmtica permitiendo la entrada de calcio del exterior al interior celular.

El calcio intracelular puede estimular la enzima calmodulina, que es una serina/treonina cinasa que puede activar a su vez a la fosfatasa calcineurina. Adems de la activacin del sistema calmodulina/calcineurina, los niveles altos de calcio intracelular tambin ayudan a la activacin de otras cinasas como son algunas isoenzimas de las protena cinasas C (PKC) y posiblemente algunas cinasas activadas por mitgenos (MAPKs). El otro metabolito de la hidrlisis del PIP2, el diacilglicerol es el principal responsable de la activacin de las enzimas protena cinasas C. PROTEINA CINASAS C Las protena cinasas C (PKCs) son una familia de isoenzimas que estn ampliamente distribuida en tejidos y rganos de mamferos. Esta familia de serina/treonina protena cinasas est constituida por varias subfamilias que engloban distintas isoformas. Hasta el momento, se conocen 11 isoenzimas de PKC diferentes, clasificadas segn su estructura y necesidad de cofactores para su activacin. Aunque todas las isoformas de PKC se activan mediante fosfolpidos, estas isoenzimas en particular se diferencian marcadamente en su sensibilidad hacia el calcio. Teniendo en cuenta este factor, podemos clasificar estos 11 genes de PKC de mamferos conocidos hasta ahora en las siguientes subfamilias: 1. PKC convencionales (cPKC): su activacin es dependiente de Ca++ y diacilglicerol (DAG). Esta subfamilia engloba las siguientes isoformas: alfa, beta (1 y 2) y gamma. 2. PKC novel (nPKC): su activacin es dependiente de diacilglicerol e independiente de Ca++. Esta subfamilia engloba distintas isoformas: delta, epsilon, etc. 3. PKC atpica (aPKC): pertenecen estructuralmente a esta familia de enzimas, pero no se activan mediante steres de forbol o diacilglicerol. Esta subfamilia engloba varias isoformas. Las PKCs en condiciones de reposo celular se encuentra localizada en el citosol donde es inactiva, una vez que recibe el estmulo del DAG conjuntamente con iones Ca++ (dependiendo del isotipo enzimtico) se transloca a la membrana celular donde en presencia de fosfolpidos (fundamentalmente fosfatidilserina) ejerce su funcin de cinasa de protenas en aminocidos serina y treonina. La implicacin de las PKCs en el transcurso de activacin de clulas T ha sido bien establecida desde finales de los aos 70. As, las clulas T expresan mltiples isotipos de PKC, incluyendo PKC-alfa,-beta1 y otros; sin embargo, el papel de los diferentes isotipos de PKC en la regulacin de la sealizacin celular y la transcripcin gnica no est an establecido definitivamente. La activacin de linfocitos T implica una compleja cascada de respuestas celulares, que incluye la entrada en el ciclo celular y la liberacin de citocinas. La estimulacin de clulas T resulta en la transcripcin de varios genes y en la expresin de una determinada variedad de molculas, incluyendo las citocinas y sus receptores especficos (como es el caso de IL-2 y su receptor). Las PKCs regulan la activacin de genes de clulas T mediante el control de varios factores de transcripcin. GAP-RAS La familia de los proto-oncogenes Ras comprende al menos tres genes que codifican otras tantas protenas denominadas Ha-, Ki- y N-Ras, que juegan un papel crtico en el control de la proliferacin celular. Las tirosinas cinasas activadas por la ocupacin del TCR no solamente inducen la hidrlisis de fosfolpidos, sino que tambin activan vas de sealizacin a travs de Ras y mediadas por Lat. Este adaptador fosforilado por ZAP-70 se une a otro adaptador intermediario (Grb-2) que contiene dominios SH2 y SH3. Este ltimo se une a protenas especficas fosforiladas en tirosina a travs de su dominio SH2 y a una protena de intercambio de nucletidos de guanina (Sos) mediante su dominio SH3. La protena de intercambio acta entonces sobre la forma inactiva de Ras (ras-GDP) convirtindola en su forma activa (Ras-

GTP), el cual se une y retiene a c-Raf cerca de la membrana plasmtica. Esta accin mediada por Ras, hace que Raf se active y acte como una cinasa de MAPK (MAPKK) que a su vez activa y fosforila una o ms MAPKs, incluyendo a ERK-1 y ERK-2, las cuales tras dicha activacin migran al ncleo donde regulan por fosforilacin a determinados factores de transcripcin involucrados en la proliferacin y diferenciacin celular. La inactivacin de Ras (Ras-GTP) se debe a la accin de la protena p120GAP o protena activadora de GTPasa que es la responsable de hidrolizar el GTP unido a Ras y convertirlo en GDP (Ras-GDP) por lo que se la puede considerar como un regulador negativo de Ras. Esta cascada de sealizacin termina con la fosforilacin de determinados factores de transcripcin que participan en la activacin y funcionalidad de los linfocitos T (Figura 10.9). FOSFATIDILINOSITOL-3' CINASA (PI3K). Adems de la PLCgamma1, otras enzimas presentes en las clulas T que participa en el metabolismo de fosfolpidos son las denominadas fosfatidilinositol-3' cinasas (PI3Ks), que fosforilan el PIP2 generando cuatro especies de inositoles especficos que son; i) el fosfatidilinositol 3-fosfato; ii) el fosfatidilinositol 3,4-bifosfato; iii) el fosfatidilinositol 3,5-bifosfato y iv) el fosfatidilinositol 3, 4,5-trifosfato. Una de las dianas mejor caracterizadas de la accin de estos lpidos fosforilados es la protena cinasa B. En respuesta a estmulos externos, la Akt citoslica (inactiva) se transloca a la mebrana plasmtica por los estos inositoles fosfatos y se fosforila y activa. Una vez que Akt est activa es capaz de fosforilar y activar a su vez una gran variedad de substratos (BAD, CREB, factores de transcripcin de la familia forhead, la cinasa IkB, la procaspasa-9, etc.), explicando el por qu de la importancia de esta cinasa como elemento clave en los procesos de proliferacin y diferenciacin celular.

PROTEINA CINASA ACTIVADA POR MITOGENOS (MAP-CINASAS). En los ltimos aos se ha identificado y caracterizado parcialmente un sistema de transmisin de seales crucial no solo para la activacin de clulas T sino tambin para todas las clulas eucariotas. Este sistema de traduccin de seales est regulado por las MAPKs (mitogen activated protein kinases) que de alguna manera actan como puente entre tirosinas cinasas prximas a la membrana con otras cinasas que fosforilan en aminocidos serina/treonina una serie de factores de transcripcin regulando as su actividad transactivadora. Estas MAPKs engloban a una familia de serina/treonina cinasas, que son activadas cuando a su vez se fosforilan en serina/treonina o tirosina. Al menos tres subfamilias de MAPKs han sido bien identificadas, i) las ERK1 y 2 (Extracellular Regulated Kinases), 2) la subfamilia de c-Jun cinasas, JNK1, JNK2 y JNK3 (tambin llamadas SAPK), y 3) la subfamilia p38 (p38, p38b, p38g, y p38d). Las ERKs activadas migran al ncleo donde regulan la transcripcin de c-fos, que forma dmeros con c-jun para formar el complejo AP-1, que es fosforilado por las JNK en la subunidad c-jun, regulando su actividad transcripcional. La p38 tambin participa en la activacin de AP-1 y recientemente se ha descrito que en linfocitos T acta como limitador de la regulacin transcripcional mediada por el factor de transcripcin NF-AT. Las MAPKs son reguladas a su vez por otras cinasas denominadas MAPKK, y estas a s vez por otro grupo de cinasas que por inercia han sido llamadas MAPKKK (ej, Raf). Estas ltimas actuaran como integradores de las seales inducidas por la ocupacin de receptores de activacin (ej. el TCR), fosforilando a las MAPKK, y estas a su vez fosforilando a las MAPKs en residuos treonina y tirosina.

FACTORES DE TRANSCRIPCION. Tras la activacin de las clulas T se transcriben alrededor de 100 genes (conocidos). La activacin de esta pltora de genes ocurre de una manera secuencial, de manera que alguno de ellos se transcribe inmediatamente despus del reconocimiento antignico y otros incluso das despus. Por este motivo se pueden clasificar de manera didctica en genes inmediatos (su transcripcin ocurre entre diez y treinta minutos despus de la activacin), tempranos (transcritos entre treinta minutos y dos das) y tardos (transcripcin entre dos das e incluso hasta dos semanas). Entre los primeros tenemos los genes c-fos, c-jun, c-myc, NF-KB/rel, etc., entre los segundos estn la mayora de las interleucinas producidas por clulas T as como alguno de sus receptores y entre los terceros podemos destacar molculas como el CTLA-4 y los genes VLA (very late antigen) (Figura 10.9).
Fig.:10.9

En general, la transcripcin de genes inmediatos ocurre en ausencia de sntesis de novo de protenas, lo cual indica que estos genes son activados por factores de transcripcin preexistentes en la clula. Estos factores despus de la cascada activacin de cinasas y fosfatasas originada por el reconocimiento antignico son fosforilados o defosforilados y de esta manera activados. En este estado se unen a regiones reguladoras de la transcripcin situadas generalmente en los promotores de determinados genes permitiendo su transcripcin o a veces incluso su represin. As, la primera etapa de su respuesta celular culmina con la expresin en el ncleo de protenas trans-activadoras que regulan la transcripcin de una serie de genes involucrados en los procesos de proliferacin, diferenciacin y adquisicin de funciones en los linfocitos T. Una de las funciones ms importantes de los linfocitos T es la produccin de linfocinas, las cuales, en ltima instancia, junto a los procesos de interaccin e celulares, van a modular el tipo de respuesta inmune producida. Los mejores ejemplos de regulacin gentica de linfocinas lo encontramos en la regulacin de la IL-2, as como de su receptor (principalmente la cadena alfa). En la parte 5' del gen de la IL-2 se encuentra una regin de aproximadamente trescientos pares de bases (entre las bases -319 y -52) que contiene los sitios de unin para factores como, NF-B, NFAT, factores octamricos, AP-1 y adems un sitio de unin conocido como CD28RE (CD28 responsive element). Estudios moleculares han demostrado que la accin conjunta de estos factores es necesaria para conseguir una activacin completa del gen de la IL-2. La expresin de

alguno de estos factores est restringida a determinados tipos celulares, como es el caso de NFAT, mientras que otros como AP-1 y NF-B estn expresados en una gran variedad de tipos celulares. Factor nuclear de la cadena K de clulas B (NF-B/rel). NF-B (factor nuclear de la cadena Kappa en clulas B) fue caracterizado por primera vez, en 1986, como un factor especfico de clulas B y que se una a una secuencia localizada en el promotor de la cadena ligera de las inmunoglobulinas. NF-kB se encuentra fundamentalmente en todos los tipos celulares y est implicado en la activacin de multitud de genes en respuesta a inflamacin, infeccin y otras situaciones de stress que requieren una rpida reprogramacin de la expresin gnica.. Este factor de transcripcin est formado por una familia de protenas que presentan una alta homologa entre ellas y que est compuesta principalmente por las protenas p50, p52, p65, RelB, y c-rel. Estas protenas pueden estar formando distintos complejos entre ellas siendo los ms comunes p50/p50 y p50/p65. Los distintos complejos tienen distintas afinidades por los sitios de unin al DNA y posiblemente tengan diferentes actividades transactivadoras. Esto se puede entender por el hecho de que la regin de DNA que se una a NF-kB es GGGRNNYYCC, este decmero palindrmico no es exactamente igual en todos los genes que contienen una regin NFkB y as, estas pequeas diferencias pueden ser las responsables de las diferentes afinidades de los complejos NF-kB/rel por el DNA. Los complejos de NF-B se encuentran retenidos en el citoplasma por molculas llamadas inhibidores de NF-B o IB. Dos de las ms estudiadas en linfocitos T son IB-a e IB-b que en condiciones de reposo estn unidas a los dmeros de NF-kB enmascarando as su seal de localizacin nuclear (NLS), previniendo de esta forma el desplazamiento de NF-kB al ncleo La activacin de linfocitos T va TCR/CD3, IL-1 o TNF entre otros estmulos extracelulares inducen una cascada de cinasas y proteasas que median la degradacin de IB por un proceso combinado de fosforilacin, ubiquitinacin y proteolisis, como consecuencia del cual se producen la liberacin de NF-B/rel y su translocacin al ncleo (Figura 10.9). Adems de participar en la transcripcin de la IL-2 y de su receptor se ha demostrado que NF-B puede trans-activar tambin un amplio nmero de genes en linfocitos T como son la cadena beta del TCR, genes HLA de clase I y clase II, beta-2-microglobulina, molculas de adhesin como ICAM-1, otras linfocinas como IL-6, IL-8 y el G-CSF, proto-oncogenes como c-myc y tambin se une a las regiones promotoras (LTR) de virus como el HIV y HTLV-1. La activacin de NF-kB representa el paradigma del control de protenas mediante un proceso de ubiquitinacin y degradacin en el proteasoma integrado a la cascada de fosforilaciones. Recientemente, ha habido un gran progreso en lo que concierne a la ruta de seales de NF-kB, especialmente las relacionadas con las citocinas proinflamatorias, IL-1 y tumor necrosis factor alfa. Activador de protena 1 (AP-1) A diferencia de NF-KB, AP-1 (Activador protein 1) es un factor de transcripcin exclusivamente nuclear que se activa por fosforilacin mediada por determinadas cinasas que se translocan al ncleo e inducen en este factor una modificacin postranslacional que le hace activo. El factor de transcripcin AP-1 (Activator Protein 1) est formado por protenas ubicuas pertenecientes a las familias Jun (c-Jun, v-Jun, JunB y JunD), Fos (c-Fos, FosB, Fra1 y Fra2) o ATF (ATF2 y ATF3) capaces de unirse a una secuencia consenso de ADN denominada TRE (TPA response element, TGACTCA) regulando la transcripcin de alto nmero de genes que incluye genes de citokinas proinflamatorias entre otros. Los miembros de las familias Jun o ATF forman homodmeros o heterodmeros con los miembros de las otras dos familias, pero en el caso de las protenas Fos, stas solo forman heterodmeros. La integracin de las seales transmitidas por las distintas MAPKs (ERK, p38, JNK) activadas tras la activacin del receptor

TCR provoca la unin de determinados factores de transcripcin (TCF, SRF) a los genes que codifican para Fos y Jun, aumentando su presencia en el ncleo. Posteriormente, Fos y Jun son fosforilados por FRK y JNK respectivamente (cinasas reguladoras de Fos y Jun). De este modo, ambos factores de transcripcin activados, dimerizan y se unen a regiones especficas de los promotores de genes como la IL-2 y otros genes que participan en la respuesta inmune e inflamatoria (Figura 10.9). Factor nuclear de clulas T activadas (NF-AT). La familia de protenas NF-AT (Nuclear Factor of Activated T cells) est constituida al menos por cuatro miembros NF-AT1/p, NF-AT2/c, NF-AT3, y NF-AT4/x, presentando cada uno de ellos, excepto NF-AT3, varias isoformas probablemente derivadas de splicing (corte y empalme) alternativo del mismo gen. Todas las isoformas presentan dos regiones de secuencia homlogas entre ellas, el dominio de unin al ADN (DBD) y la regin homloga para NF-AT (NHR). El DBD, comprendido aproximadamente entre los aminocidos 400 y 700, es la zona ms conservada entre los miembros de la familia NFAT. La regin NHR constituye el dominio principal de transactivacin de la protena y es el sitio de anclaje donde se une la fosfatasa calcineurina, que cuando se activa defosforila mltiples residuos fosforilados de esta zona, controlando as la translocacin nuclear de NF-AT. En un principio NF-AT se identific en clulas T como un complejo rpidamente inducible que se una al elemento distal de respuesta a antgeno en el promotor del gen de la IL-2. Su induccin requiere la sealizacin por calcio y se inhibe con drogas inmunosupresoras como CsA y FK506, que inhiben la actividad fosfatasa de la calcineurina. El complejo NF-AT activo unido al ADN est formado por un componente citoslico presente en clulas T y por un componente nuclear ubicuo. El componente citoslico est constituido por los miembros de la familia NF-AT mientras que el componente nuclear est formado por miembros de la familia Fos y Jun que constituyen el factor de transcripcin AP-1. En los ltimos aos se ha identificado la existencia de miembros de la familia NF-AT en otras clulas del sistema inmune distintas a los linfocitos T y donde tambin regulan la expresin de numerosos genes de citocinas (IL-4, TNFalfa y GM-CSF) y de receptores de superficie (FasL, CD40L). La expresin de NF-AT3 y NF-AT4 tambin ha sido descrita en clulas fuera del sistema inmune, lo que explicara en parte los efectos secundarios de la CsA fuera del sistema inmune. Como se ha comentado anteriormente, la activacin fisiolgica del TCR da lugar a la movilizacin de Ca++ y con ello la activacin de la fosfatasa calcineurina que defosforila a NFAT, altamente fosforilado en clulas T en reposo. La translocacin al ncleo, el aumento de afinidad para unirse al ADN y la induccin de la actividad transcripcional de NF-AT estn regulados por esta defosforilacin. La asociacin fsica entre la calcineurina y NFAT sigue incluso en el ncleo donde la calcineurina sigue defosforilando al factor mientras los niveles de calcio intracelulares sigan altos. En gran parte las secuencias de reconocimiento para NF-AT necesitan de la cooperacin de protenas AP-1 para transactivar dichos genes. Adems, esta interaccin entre AP-1 y NFAT con el ADN, confiere al complejo NFAT/AP1: ADN una estabilidad 20 veces superior a la que presentan los complejos NFAT: ADN. Por tanto las rutas de sealizacin que convergen en la activacin de AP-1 van a afectar la actividad transcripcional mediada por los complejos NFAT/AP-1 INMUNOPATOLOGIA Se han descrito alteraciones de muchas de la cinasas que intervienen en la activacin de los linfocitos T. As, se ha descrito el dficit de Zap-70 en individuos que tenan en comn valores muy bajos o ausentes de linfocitos T CD8+ en sangre perifrica. Los linfocitos de los pacientes no proliferan en respuesta a lectinas, a anticuerpos monoclonales anti-CD3, a antgenos o a clulas alognicas. Los anlisis de laboratorio revelaron la ausencia de Zap 70 en los linfocitos T de los pacientes.

BIBLIOGRAFIA

1. Clements, J.L., Boerth, N.J., Lee, J.R., and Koretzky, G.A. (1999):

Integration of T cell receptor-dependent signaling pathways by adapter proteins. Annu. Rev.Immunol. 17:89-108. 2. Dustin, M.L. and Cooper, J.A. (2000): The immunological synapse and the actin cytoskeleton: molecular hardware for T cell signaling. Nat.., 1:23-29. 3. Isakov, N. and Altman, A. (2002): Protein kinase C (theta) in T cell activation. Annu.Rev.Immunol 20:761-794. 4. Lewis, R.S. (2001): Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Annu. Rev.Immunol. 19:497-521. 5. Myung, P.S., Boerthe, N.J., and Koretzky, G.A. (2000): Adapter proteins in lymphocyte antigen-receptor signaling. Curr. Opin. Immunol. 12:256-266. 6. Nakanishi, K. (2001): Innate and acquired activation pathways in T cells. Nat.Immunol. 2:140-142. 7. Nemec, M. (2001): Web alert. Lymphocyte activation and effector functions. Curr.Opin.Immunol. 265., 13:265 8. Penninger, J.M. and Crabtree, G.R. (1999): The actin cytoskeleton and lymphocyte activation. Cell, 96:9-12. 9. Samelson, L.E. (2002): Signal transduction mediated by the T cell antigen receptor: The Role of Adapter Proteins. Annu.Rev.Immunol 20:371-394. 10. Schatz, D.G. and Malissen, B. (2002): Lymphocyte development. Curr. Opin. Immunol. 14:183-185. 11. Yakura,H. (1998): Phosphatases and kinases in lymphocyte signaling. Immunol. Today, 19:198-201.