NOTHOFAGUS SUDAMERICANOS Y MARCADORES MOLECULARES

Por Ingger Quezada Gonzlez Programa

MASCN

Las

especies

de

Nothofagus

sudamericanos

han

evolucionado

genticamente

aproximadamente por 100 millones de aos (Poole, 1987) adaptndose a travs de la evolucin a cambios geolgicos y macroclimticos que sucedieron al Sur de America desde el Mesozoico superior y dinmicas biogeogrficas complejas. Todos estos cambios sumados a las fuerzas de la evolucin, han modelado el gnero y las especies logrando a la actualidad patrones de adaptabilidad a suelos, humedad, climas, etc. y adaptabilidad de compartir el nicho con otras especies. Son especies longevas, lo que ha permitido que los estudios de su gentica permita adems estudiar fenmenos fitogeogrficos y relaciones geolgicas pasadas de Amrica y Australasia (Gajardo 2008, conv. Pers) Esta formado por 40 especies que se distribuyen entre Sudamrica, Australia, Tasmania, Nueva Zelanda, Nueva Celedonia y Nueva Ginea. En Amrica se han descrito 12 taxones y un Hbrido natural reconocido como especie (Nothofagus leonni), pero existen evidencias de otras hibridaciones de las cuales su estabilidad y permanencia en las poblaciones es an desconocida. Sin embargo, es importante conocer estas dinmicas de hibridacin para evaluar el flujo de genes y retrocruzas Para las especies del gnero Nothofagus el uso de marcadores moleculares se remonta hace poco mas de 20 aos (Gallo et al 1997, citando a Haase 1992) que tiene un inicio para los Nothofagus Sudamericanos hace 10 aos con el estudio de Gallo et al (1997). Tcnicas biotecnolgicas para los anlisis han sido descritas tericamente por Paredes et al (2000). La primera utilidad de la gentica molecular, fue para considerar a Nothofagus como perteneciente a la Familia Nothofagaceae y no Fagaceae. Esto finalmente se logra gracias a Manos et al (1993) luego de analizar el polimorfismo de fragmentos de 7 enzimas con tcnica Southern blot en ADN de cloroplasto. Los resultados de ste y otros estudios de tipo morfolgico, sugieren que, la familia Nothofagaceae estara ms emparentada con Betulaceae que Fagaceae. La separacin definitiva de las familias ocurre despus del estudio de Martin y Down (1993).

Tabla 1: Uso de marcadores Moleculares en Nothofagus Tcnica utilizada ADN Codomi- Polimor- Complejidad Nmero codificante nancia fismo tcnica Tema abordado en Nothofagus Referencia bibliogrfica en Nothofagus

Isoenzimas

S(1)

<30

Bajo

Baja

Haase 1992, 1993ab y 1994; Gallo 1995; Premoli 1996, 1997, 1998 y 2003; Determinacin Marchelli y Gallo 2000ab, 2001; Pineda marcadores, diversidad 2000ab; Azpilicueta y Gallo 2001 y 2002; y diferenciacin Crego y Gallo 2002 ab; Carrasco y Eaton genticas, hibridacin, 2002; Gallo 2002 y 2004; Gallo et al. filogenia, flujo gnico, 1997, 2000b y 2003; Marchelli 2002; conservacin. Stecconi et al. 2002 y 2004; Donoso et al. 2004; Premoli y Kitzberger 2005. Filogenia Manos et al. 1993.

RFLP

No

~ ilimitado . ~ ilimitado ~ ilimitado ~ ilimitado Algunos miles ~ ilimitado

Alto

Media

PCR-RFLP cpADN ISSR RAPD SSR (Microsat) Secuenciacin

No

No

(2)

Medio

Media

No No No

No No S

Muy alto Muy alto Muy alto

Baja Baja Alta

S/No

No

Muy alto

Alta

Diferenciacin, Marchelli et al. 1998; Marchelli y Gallo determinacin de 2000b, 2004b y 2006; Azpilicueta et al. refugios, caminos 2005 migratorios. Desarrollo, diversidad y Mattioni et al. 2002. diferenciacin. Desarrollo, diversidad y Mattioni et al. 2002. diferenciacin. Desarrollo, Marchelli y Gallo 2000b; transferibilidad, flujo Azpilicueta et al. 2004; gnico. Jones et al. 2004. Martn y Dowd 1993; Manos 1997; Filogenia. Manos y Steele 1997; Setoguchi et al. 1997.

(1) (2)

En algunos trabajos se les atribuye adems valor adaptativo. ADN haploide.

Fuente: Gallo et al. (2006)

Figura 1: Marcadores SSR en Nothofagus

Fuente: Azpiculeta et al., 2004

FILOGENIA DE NOTHOFAGUS Manos (1997) en si estudio molecular en base de secuencias nucleotdicas codificantes y no codificantes de ADN nuclear ribisimal (rADN) deja establecido claramente la filogenia dentro de las especies del gnero de los bosques templados chileno-argentinos, con el correspondiente rbol filogentico, luego de comparar sus resultados con los obtenidos por otros autores (Martin y Down, 1993; Hill y Jordan, 1993). Los resultados del rbol sealan que Nothofagus obliqua, Nothofagus alpina y Nothofagus glauca se encuentran en el mismo clado dentro del subgnero Lophosoria y que el taxa ms ancestral del clado corresponde a Nothofagus obliqua. Por otro lado el taxa ms antiguo de los Nothofagus sudamericanos corresponde a Nothofagus Alessandrii, informacin que se sustenta adems con estudios morfolgicos de Ramrez et al. (1997).

FIGURA 2: rbol filogentico para las especies de Nothofagus

Fuente: Manos, 1997

De aqu se observan los distintos subgneros que los Nothofagus sudamericanos representan, destacando a Nothofagus alessandrii como el taxon de mayor antigedad y tambin el grado de emparentamiento entre Nothofagus siempreverdes y los caducos de hoja larga. Para determinar el flujo se ha utilizado marcadores genticos codominantes hipervariables como repeticiones de secuencias o microsatlites, debido a ser una herramienta de anlisis de parentesco y determinar y entender la conectividad de las poblaciones, identificando espacialmente el concepto de Poblacin gentica. Se han desarrollado mtodo directos e indirectos para determinar el flujo polnico (Hamrick y Nason 2000) y otros ms aventajados en muestreo e interpretacin de resultados (Smouse et al, 2001). Los estudios de

microsatlites sealados anteriormente para Roble y Rauli con la utilizacin de primers del gnero Quercus (Azpiculeta et al, 2004) es la primera aproximacin para especies sudamericanas. El objetivo principal de esta revisin es identificar los principales usos de la gentica molecular en el estudio de Nothofagus sudamericanos y las implicancias de estos resultados para orientaciones futuras de estudios y acciones de manejo de las poblaciones. IV. VARIACION GENETICA POR ESPECIE
Figura 3: variacin gentica de Nothofagus sudamericanos

Fuente: Torres-Daz, 2007

La figura muestra los valores determinados en los estudios de marcadores isoenzimticos para las especies del gnero Nothofagus. La siguiente figura muestra los valores medio de diversidad gentica y sus componentes, cabe sealas que Nothofagus truncata es de origen Neocelands
Figura 4: Diversidad gentica registrada en l bibliografa para Nothofagus en Sudamrica

Fuente: Torres-Daz, 2007

Nothofagus alpina rbol endmico de los bosques subantrticos, forma renovales que representan una de las reservas potencial ms ricas del bosque chileno (Snchez-Olate et al, 2004). Durante el ltimo siglo ha sido sometido a una vasta explotacin con fines madereros y altamente selectiva. Lo que puede haber originado perdidas importantes para la gentica de sus poblaciones (Donoso et al, 2004). Esta situacin se repite en las poblaciones mucho ms reducidas de Argentina, motivo por el cual en 1993 se desarrolla el programa Conservacin y utilizacin de los recursos genticos forestales patagnicos del INTA Bariloche. Para esta especie, se han desarrollado estudios geoecolgicos reportando informacin de variacin y heredabilidad de las semillas. El estudio de Marchelli y Gallo (1999) concluye que el ao de mayor peso de las semillas es concordante con los aos de mayor produccin de stas. El estudio de Medina (2001) con ejemplares chilenos, determino que el peso y largo de las semillas poseen una heredabilidad moderadamente alta y que los parmetros de capacidad, energa y valor germinativo muestran una alta heredabilidad clonal, la variacin observable o fenotpica se condiciona por el ambiente (Donoso et al, 2004). A medida que aumenta la latitud el peso de las semillas disminuye (Donoso, 1979; Werner 1986). El uso de las variables de germinacin y su heredabilidad aplicado a la relacin ecolgica de dispersin, sugiere que la regeneracin por parches tiende a mantener la variabilidad gentica de las poblaciones y selecciona fuertemente algunos genotipos en el caso de dispersin post-incendios o regeneracin natural en grandes superficies (Donoso et al.2004). Por otro lado, Becker y Dautzenberg (1978) observaron en pruebas de enraizamiento de estacas tazas entre 1 y 13%, por lo cual concluyeron que en el Genero Nothofagus se condicione genticamente y el rbol madre juega un rol de importancia. Un anlisis de 7 procedencias en condiciones de vivero para procedencias de Chile entre las latitudes 35 40 (Vilches) y 40 12 (Raulintal, Valdivia), muestra que las diferencias significativas de crecimiento en altura para las procedencias no muestra una tendencia Norte Sur, como ocurre con la mayora de las caractersticas, sino ms bien genticas (Tajan, 1989). Las procedencias ms septentrionales muestran mayores perodos de crecimiento que las sureas. Los estudios de 21 procedencias argentinas de Gallo et al (2000) en plantacin, afirman la hiptesis diferencia significativas para la variable altura al segundo ao, donde dos procedencias superan la media del ensayo en un 30%.

Anlisis isoenzimticos El anlisis de isoenzimas es el comnmente utilizado para especies arbreas, codificadas por genes en uno o varios loci. Para Nothofagus alpina se determinaron marcadores gnicos isoenzimticos de rboles individuales y su progenie, con el mtodo de Gillet y Hattermer (1989). Este procedimiento obvia las cruzas controladas. Los resultados obtenidos permitieron determinar el modo de herencia de ocho enzimas en cinco sistemas enzimticos y por tanto ocho marcadores gnicos para la especie y la presencia de dos marcadores con alelos especficos de Nothofagus alpina y Nothofagus obliqua lo que permiti adems inferir el proceso de hibridacin entre estas especies, el cual ser descrito ms adelante (Marchelli y Gallo 2000a y 2000b; Gallo et al 1997; Gallo et al 2000). Los marcadores aloisoenzimaticos (alelos del mismo locus isoenzimticos) determinados en los estudios de Marchelli y Gallo (2000-2001-2003) identificaron en total ocho loci marcadores donde se identifico 28 alelos; a posterior esto permiti analizar la variacin gentica las poblaciones y la variabilidad intrapoblacional e interpoblacional mediante el anlisis seminal de 100 embriones en cada muestra de 20 procedencias argentinas en toda su distribucin versus 3 procedencias Chilenas (Marchelli, 2001) . Los resultados encontraron variaciones considerables entre procedencias provenientes de Argentina y un valor menor en las procedencias Chilenas, lo que resulta concordante con la distribucin fragmentada de las primeras y la distribucin homogneas de las segundas. Estudios posteriores (Pineda 2000; Carrasco y Eaton 2002) encontraron una diversidad intrapoblacional mayor a la encontrada por Marchelli (2001), lo que sugiere que el tipo de marcados isoenzimticos a utilizar muestran diferencias relevantes. Los estudio de Marchelli (2001) utiliza marcadores pertenecientes al grupo I (constituitivas) que presentas menores niveles de variacin que las del grupo II. Las poblaciones argentinas analizadas por Marchelli y Gallo (2003) presentaron alelos mltiples muy variables y la presencia de alelos raros compartidos (que indica una posibilidad hibridacin entre Nothofagus alpina y Nothofagus obliqua), incluso presencia de alelos en una poblacin. El numero efectivo de alelos (diversidad) fue tambin variable entre poblaciones con polimorfismo menor (1.3 promedio); un alelo muy frecuente y pocos en baja proporcin; las frecuencias allicas con un = 0.05 tambin mostraron diferencias entre poblaciones. Los valores de heterocigosis fueron Ho = 16% y He = 18%; los porcentajes de loci polimrficos fueron variables entre 65 y 100% y el nmero medio de alelo por locus 3.5. Los alelos raros en proporciones menores a 5% y exclusivos de algunas poblaciones como las de las procedencias del Oeste argentino, muestran mayor diferenciacin y presencia.

Todos estos resultados y en contraposicin a los patrones de vientos en las cuencas lacustres Argentinas (que sopla de oeste a este, por tanto las poblaciones Este debieran ser las mas variadas) concluyen que el flujo gnico entre las poblaciones poco extensivo. El estudio de Carrasco y Eaton (2004) con 18 poblaciones revel niveles de heterocigosis menores a las esperadas (FST =5.1 %). Para Chile un estudio con 22 poblaciones de Raul (bajos nmeros de individuos por poblacin) muestran altos niveles de diferenciacin entre ellas y mayor similitud por cercana, pero valores levemente menores a los de las procedencias argentinas (Pineda, 2000) y se sugiere una diferenciacin latitudinal identificando dos grandes grupos, Norte y Sur. El estudio tambin revela que las poblaciones no se encuentran en equilibrio HardyWeinberg por presencia de individuos heterocigotos menores a los esperados (FST 9.6 %), promedio un poco mayor que las Argentinas. Entre las probables causas que seala el autor para las diferencias entre las poblaciones a cada lado de la cordillera estn el tamao de las muestra, fragmentacin al flujo gnico por plantaciones, baja movilidad de propgulos, poca floracin debido a la edad de los renovales, cruzas emparentadas, entre otros (Pineda, 2000). ADN cloroplasto Con la tcnica de PCR en combinacin con RFLP se busco encontrar polimorfismos de las poblaciones argentinas y tres chilenas, sealadas en el anlisis isoenzimticos. Los fragmentos polimorfitos definieron dos tipos de ADN cloroplstico entre las poblaciones, separados en sentido latitudinal. Cabe destacar que las procedencias chilenas mostraron el mismo patrn de haplotipo y distribucin que en Argentina, resultado concordante con la evidencia de refugios glaciares al Norte y Sur del continente que luego de la glaciacin que terminado el evento, lograron expandirse nuevamente (Villagrn et al 1991).Todos estos resultados indican una alta probabilidad de existencias de refugios en Rucaancu y los Lagos Lacar y Lolog por el lado argentino; en Chile estos refugios estaran al Oeste de la Cordillera de los Andes segn seala Carrasco y Eaton (2002) y en la regin del Maule por la Costa. Microsatlites Por el alto costo y sofisticacin del material para la secuenciacin el ADN y sinterizacin de los primers (secuencias cortas del ADN donde la Tag polimerasa comienza la sntesis de ADN). Autores como Gallo et al (2000b), recomiendan el uso de primers generados para Quercus y Fagus por su transmisibilidad al estudio en Nothofagus. En un estudios de 40

primers de Quercus, 35 amplificaron el ADN de Raul y Roble y 19 con motivo microsatlite. El anlisis de polimorfismo y segregacin de ocho de los motivos microsatlites, observo diferencias en seis de ellos para variacin y consistencia respecto al genotipo materno. El nmero de alelo por locus fue entre 3 y 5, tamao mayor al nmero que presenta Quercus (Gallo, 2000b). Nothofagus obliqua Esta especie presenta una gran variabilidad de ambientes y asociaciones ecolgicas. Por ellos ha despertado el inters de botnicos sistemticos en el desarrollo de anlisis morfolgicos para la caracterizacin de este taxa en bsqueda de nuevas especies y subespecies (Donoso et al 2004), despertando la discusin de por los botnicos y eclogos debido a la alta variacin intraespecifica que presenta la especie. Dentro de los resultado de estas discusiones, est la publicacin de una nueva especie por Vsquez y Rodrguez (1999) bajo el nombre de Nothofagus macrocarpa, despertando la discusin de la comunidad cientfica, su clasificacin es an compleja (Ver Ravenna, 2002). Esta situacin a opinin de la autora de este documento, solo ser terminada con los anlisis moleculares. Como se sealo con anterioridad corresponde al taxa ms ancestral del Clado del subgnero Lophosoria de los Nothofagus sudamericanos (Manos 1997). Los estudios genticos bioqumicos y moleculares para esta especie han sido desarrollados por la Unidad de gentica Forestal INTA EEA de Bariloche argentina. Se ha mencionado por diversos autores que esta especie corresponde a una especie de alto inters comercial, debido a su presencia en diversos ambientes. Esto ha motivado trabajos de investigacin sobre los patrones de variacin geogrfica y gentica, como tambin procesos de evolucin de origen de la especie (Gallo et al 1996; Marchelli y Gallo 1999; Marchelli y Gallo 2004; Donoso et al 2004; Donoso 1979). Para estudios de Nothofagus obliqua en poblaciones argentinas, se hizo un anlisis de gentico de segregacin mendeliana en la descendencia de adultos heterocigotos. El control gentico de de la variacin enzimtica determino siete loci polimorfitos (Azpiculeta y Gallo 2001). Luego se hizo una anlisis de de variacin poblacional de semillas de 14 procedencias (100 embriones en cada una) que revel un una disminucin de la variabilidad gentica del Roble de Este a Oeste y de Norte a Sur pero no significativa, mas an en la zona del ecotono con la estepa y al Este de la cuenca presencia de alelos que indican hibridacin con Rauli. La presencia de alelos raros (no presentes en las otras) queda de manifiesto en las poblaciones ms boreales y orientales. Se encuentran en total 19 alelos,

valores de 85% de loci polimorfitos y 2.71 alelos promedio por locus. El valor de diversidad media observada es de 1.291 (Azpiculeta y Gallo, 2002). Asimismo Gallo et al, (1997) menciona al anlisis de segregacin fenotpica, descrito con anterioridad para Raul, pero para roble se hizo el estudio cuantitativo y cualitativo de zimogramas. Se estableci entonces una relacin clara entre el fenotipo observado y la presencia del gen que le controla, marcadores gnicos que incluso son especficos por especie. Microsatlites Otro estudio Azpiculeta y Gallo (2005) con anlisis de primers de Quercus mencionados para N.alpina en 14 poblaciones en argentina de cuencas lacustres y 20 poblaciones chilenas de 10 regiones de procedencias, se encontraron 6 haplotipos presentes en todas las poblaciones de Chile y solo en dos de Argentina. El patrn de distribucin en ambas cordilleras de los haplotipos encontrados, es similar al del Raul en este estudio que menciona dos haplotipos principales Norte y Sur. Nothofagus pumilio Corresponde a la especie de mayor rango de distribucin latitudinal en Chile, desde la Regin del Maule hasta la Patagonia y Tierra del fuego, desarrollndose en una variada gamma de ambientes (Donoso, 1993) que condicionan sus fenotipos y en pos de la escala de tiempo que estos ambientes y efectos han actuado, es esperable una alta diversidad y variabilidad gentica, sumados a barreras en el flujo a causas del hbitat y clima (Donoso et al, 2004). Anlisis isoenzimtico Premoli (1998), estudio el grado y distribucin de variabilidad de isoenzimas en 17 poblaciones por rango de latitud de distribucin, determinndose tres grandes grupos: norteas, cntricas y sureas. El resultado de 14 loci gnicos putativos, un 50% es de carcter polimorfito en al menos una poblacin. Las extremas muestran pocas diferencias de variacin, situacin diferente a las poblaciones cntricas, pero con una mayor diversidad gentica total (Ht 0.382) y en mayor proporcin en distintas poblaciones (GST=20%). Las del Norte (GST = 17%; HT= 0.112) y sur (GST= 14 %; HT= 0.052) presentan valores menores. Premoli (2003) analiz 14 loci de poblaciones en gradiente altitudinal de Nothofagus pumilio en tres sitios del Parque Nacional Nahuel Huapi (Argentina) con electroforesis de protenas.

Ocho de estos loci resultaron polimrficos, 57% de los alelos con frecuencia comn por lo menos en una poblacin. Las poblaciones bajo estudio son de elevada heterogeneidad allicas y frecuencias gnicas variables de forma significativamente negativa con la altura sustentndolo en el resultado de dos de las tres transectas bajo estudio. La divergencia poblacional (FST) indica marcadas barreras al flujo gnico producto de la altura que vara continuamente cada 100 metros de altitud. Se menciona tambin la influencia de la altitud sobre la fenologa de floracin de la especie como motivo de variacin entre poblaciones. Los resultados de variabilidad gentica mayor hacia las poblaciones intermedias de baja altitud, refleja la condicin mas reciente del establecimiento de estas poblaciones con acervos genticos provenientes de las poblaciones del Norte y Sur. Por otro lado, estas poblaciones poseen un ndice de similitud gentica bastante alto (0.976) los que sugiere caracteres genticos antiguos similar al de las especies de Nothofagus siempreverde (Donoso et al, 2004) que sobrevivieron a las glaciaciones en los refugios en sitios climticamente favorables, que se indican en los estudios de Villagrn et al (1996); Villagrn (1991), y una rpida recolonizacin finalizadas las glaciaciones. En el extremo de Tierra del Fuego se ha registrado un elevado polimorfismo para esta especie y en concordancia a los estudios biogeogrficos de los autores ya sealados, se cree que en esta isla se pudiera haber situado un refugio particular para el taxn en la era glaciar.
Figura 5: Diversidad gentica de Nothofagus pumilio

Fuente: Quiroga, 2000

Nothofagus antartica Nothofagus antartica habita ambientes variados, muchos de cuales son bastante restrictivos en condiciones edficas, climticas y de pluviometra (Donoso, 1993), por ello se sugiere la hiptesis que la especie debiese presentar diversos ecotipos a consecuencia de la marcada seleccin que ejerce el hbitat en su desarrollo (Donoso, 1993) con variados morfotipos y arquitectura. Anlisis isoenzimticos Solo se mencionan en la literatura consultada el estudio de Vidal Russell (2000) Citado por Donoso et al (2004) de variabilidad isoenzimtica en dos poblaciones achaparradas y otra de desarrollo normal o de ptimas condiciones. Esta ltima present una alta diferenciacin a las poblaciones achaparradas con un mayor nmero de alelos caractersticos de la poblacin ms tres alelos en distintos loci con un elevado polimorfismo (0.99); cerca de un 60% de los loci bajo anlisis son polimrficos. Este alto porcentaje puede explicarse con la existencia de genotipos adaptados a distintos tipos de ambiente y que las diferencias morfolgicas observadas presentan una base gentica. Romero (1986) postula que la diferencia en los ecotipos sera evidencia suficiente para suponer que Nothofagus antrtica se encuentra bajo presiones de seleccin recientes encaminadas a una especiacin. Anlisis ADN La clasificacin de Nothofagus antartica en el subgnero Nothofagus junto con N.pumilio, N.dombeyi, N.betuloides y N.nitida fue confirmada gracias al anlisis de de ADN Ribosomales y espaciadores de transmisin internos de Manos (1997), que adems permiti generar el rbol filogentico y secuencias de ITS, concluyendo que Lenga y irre en el anlisis del gen cloroplsmico rbcL y las combinaciones de datos estas especies estn emparentadas al nivel de hermanas, lo que explicara la hibridacin descrita ms adelante entre estas especies. Nothofagus alessandriii Nothofagus Alessandriii es una de las especies ms interesantes del bosque nativo mediterrneo chileno, posee caractersticas ecolgicas y evolutivas nicas (San Martn et al, 1984; Serra et al, 1886). Se encuentra en peligro de extincin, ya que se desarrolla en modestas 300 ha, en bosquetes de montebajo. Histricamente se ha desarrollado restrictivamente a la zona costera de la regin del Maule, pero los estudios moleculares

desarrollados coinciden que es el taxa mas antiguo de los Nothofagus sudamericanos, pudiendo ser entre 45 y 65 Myr (Ver figura 1). Santelices (2005) realiz una aproximacin al efecto del rbol madre respecto de la capacidad de enraizamiento (rizognesis) de Ruil. Del estudio de estacas de 20 madres se concluye que existe una fuerte influencia de la madre en el enraizamiento con variaciones entre 0 y 100% con el mtodo probado, 2.6 a 5.8 centmetros de longitud de races. Todas las estacas estaban en igualdad de condiciones y edades de cosecha en las madres, por lo cual se alude el efecto a causas genticas. Al termino del un ao en condiciones de vivero la sobrevivencia es de un 10%. Torres-Daz et al, (2007) utilizaron el mtodo de Electroforesis de Allozymas de siete loci de Nothofagus Alessandrii para estimar la diversidad gentica estructura y flujo de gnico en fragmentos de bosque de la Regin del Maule. Como resultado encontraron altos niveles de diversidad expresado en la heterocigocidad esperada (He= 0.182 +-0.034), 61.2 % de polimorfismo del loci, 1.8 alelos por locus en promedio y diferenciacin gentica alta Gst=0.257 y Nm=0.7. Con esto se concluye que, no encontrndose evidencias de afectacin por endogamia, sus patrones de diversidad genticos se explican por el proceso histrico y actualmente por la fragmentacin de su hbitat. Nothofagus sudamericanos siempreverdes Es la clasificacin comnmente dada para agrupar a los Coihues, Nothofagus dombeyi, Nothofagus betuloides y Nothofagus nitida. Las dos primeras poseen una amplia distribucin latitudinal de poblaciones grandes y continuas, por lo cual se espera una elevada variacin gentica, en ausencia o bajo efecto de la deriva gnica y alto flujo gnico interpoblacional. (Donoso et al, 2004, citando a Hamrick et al, 1992). Marcadores isoenzimticos Los trabajos efectuado por Premoli (1994, 1996, 1997), en su primer estudio de variabilidad isoenzimtica para Nothofagus dombeyi (especie de mas extendida distribucin) resolvi 10 sistemas isoenzimticos que entregaron informacin para 15 loci gnicos putativos (no se realiz anlisis formales para determinar la base gentica de stos). Pero sus patrones de de bandas corresponden a encontrados en otras especies vegetales; el 70% de los loci se mostraron polimrficos al menos en un poblacin ( =0.05), el alelo ms comn fue superior a 0.95. Como resultado la mayora de la variabilidad isoenzimtica se distribuye en el 92.6 %

del componente poblacional y el restante 7.4 se distribuye entre las poblaciones en anlisis (Premoli, 1994, 1997). Premoli (1997) analiz nuevamente con estos marcadores poblaciones de los Coihues Nothofagus dombeyi (de mayor distribucin), Nothofagus betuloides (tambin de amplia distribucin pero ms austral) y Nothofagus nitida (distribucin mas reducida). El resultado del estudio establece que tanto N.dombeyi como N.betuloides poseen una mayor diversidad gentica que N.nitida, la cual adems presenta cuatro alelos putativos exclusivos que indicaran su prolongado aislamiento. Asimismo otro estudio observ que el sistema de regeneracin de N.dombeyi afecta levente la estructura gentica a escala local (Premoli y Kitzberger, 2005), la regeneracin en parches permite una mayor concentracin de diversidad en las progenies, en cambio la regeneracin en grandes extensiones facilita la accin de la deriva gnica debido a los ciclos de semillacin de esto taxas; un efecto cuello de botella depender de la densidad de individuos remanentes y severidad del evento que lo genera. Esta situacin tambin fue mencionada tambin para N.alpina. El anlisis de heterogeneidad de frecuencias allicas de 7 loci arrojo un resultado en 57% de los casos como significante. El promedio de alelos por locus es de (A) varia entre 1.2-1.9; promedio de alelos polimrficos (AP) entre 2.7-3.5; heterocigosis observada (HO) 0.0630.104 y heterocigosis esperada en equilibrio H-W entre 0.059-0.130. Valores que por lo dems son similares a los encontrados para otras especies de amplia distribucin. Todo estos resultados no han incluido a el total de distribucin del taxa, pero sus valores de GST es compatible al de otras leosas de dispersin anemfila y longeva y prueban la hiptesis de que las especies de mayor distribucin.

Figura 6 : Variabilidad gentica de Nothofagus siempreverdes

Fuente: Premoli , 1997.

V. HIBRIDACION ENTRE ESPECIES Nothofagus obliqua y Nothofagus alpina Donoso et al (1990) describe por primera vez la hibridacin entre estas dos especies caducas en poblaciones naturales, luego que esta situacin fuera de conocimiento en arbotetum, pero el estudio del autor solo se remiti a un anlisis morfolgico, madera y flavonoides. Luego Gallo (1995) mediante un anlisis de progenies suma el uso de marcadores gnicos isoenzimticos para identificar hbridos. Se encontraron dos loci gnicos (Adh y Pgi) con alelos especficos por especie y de segregacin independiente (Gallo et al, 1997); con esto se logr identificar y diferenciar hbridos F1 de los parentales junto con identificar hbridos de retrocruzas. El resultado de estos estudios muestra alta correlacin positiva en el la heterocigosis media y el crecimiento inicial en altura de las familias Hibridas. Otra conclusin importante es la unidireccionalidad de la hibridacin hacia Nothofagus alpina (madre). El porcentaje de hbridos en las familias de una zona de simpatra vari entre 0 y 83% y en bosque hasta 6% de hbridos. Esto sumado a la experiencia de vivero sugiere que el dao por heladas en estados tempranos podra actuar como seleccionador natural de hbridos. Estudios posteriores de (Marchelli y Gallo 2001 a Azpiculeta y Gallo 2002) se realiz una anlisis de distribucin de espacial de la hibridacin entre estas especies, constatndose distintas etapas evolutivas de hibridacin en las poblaciones; un estudio de fenologa desarrollado por Crego y Gallo 2002) seal que Raul florece antes que Roble con un momento de traslape de perodos, situacin que favorece a la nube de polen (dos veces superior en Roble que Raul) desarrollar hbridos. Luego Gallo (2002, 2004) propone un modelo conceptual en base a las experiencias de los estudios anteriores de dinmica de hibridacin, que plantea un equilibrio dinmico de hibridacin que se mantiene en forma indefinida y que logra su balance entre incompatibilidades pre y postcigticas de los individuos. Nothofagus dombeyi-Nothofagus betuloides-Nothofagus nitida Marcadores isoenzimticos Debido a que estas tres especies se encuentran emparentadas y comparten rangos de distribucin comunes, se puede suponer la posibilidad de hibridacin. Un caso descrito en la literatura corresponde al de Nothofagus betuliodes y Nothofagus nitida descrito en un inicio con caracterizacin morfolgica por Donoso y Atienza (1983) que luego Premoli (1996)

confirma con un estudio isoenzimtico en el anlisis de marcadores para los tres Nothofagus perennes. Nothofagus antartica- Nothofagus dombeyi La hibridacin entre especies perennes y caducas ha sido descrita para Nothofagus obliqua y Nothofagus menziesii en cultivos artificiales en Inglaterra. Steconni et al, (2002, 2004) informa a travs de morfologa reproductiva y anlisis moleculares la existencia de hibridacin entre Nothofagus dombeyi y Nothofagus antrtica, en la Patagonia argentina en el ecotono cercano a los 1000 m de altitud. Seis de las enzimas analizadas mostraron buena resolucion (MDH-B, IDH, SKDH, 6-PGDH, GOT y PGI) y cuatro (PGI, MDH-B, SKDH y 6PGDH), presentaron condiciones patrones zymograficos intermedios. Los resultados tambin entregan que los hbridos putativos estn ms cercanos a N. antartica que a N. dombeyi. Morfolgicamente los hbridos presentan diferencias de relacin ancho- largo de hojas, nerviacin de la lmina y morfologa de valvas diferencial de los padres. Se destaca que la hibridacin puede existir entre individuos caducos y perennes en condiciones naturales y que estas especies pueden estar ms emparentadas que lo aparente y que son necesarios estudios genticos de polen. Nothofagus pumilio y Nothofagus antartica Por otro lado, se ha sugerido tambin la hibridacin entre Nothofagus pumilio y Nothofagus antartica, quienes debido a su cercana filogentica y comparicin de hbitat podran en la Patagonia argentina, hibridar en condiciones naturales. Quiroga et al, (2001)

desarroll un estudio de electroforesis isoenzimtica encontr individuos hbridos con una mayor heterocigosis que los padres. El polimorfismo para 13 loci en Laguna Negra fue del 61% y result mayor que el de N.antarctica (58%) y N. pumilio (43). Los alelos diagnsticos para especies puras identificaron a los hbridos que resultaron ser ms cercanos a N. antrtica con posibilidades de introgresin.

VI. DISCUSION Y CONCLUSIONES Los marcadores moleculares para el gnero Nothofagus se ha utilizado como herramienta de definicin de poblaciones genticas, variacin intra e interpoblacional, identificacin de haplotipos, evidencias de refugios en periodos glaciales, hibridacin, filogenia y flujo gnico, entre otros. Esto principalmente a que esta familia se ha datado desde hace 160 Millones de aos (Gajardo, conv. Pers). Por tanto la evidencia evolutiva plasmada en sus genes es de un alto valor cientfico. Las acciones futuras debiesen orientarse al uso de esta herramienta en el manejo silvcola de las especies y nuevos mtodos para determinar mejor el flujo gnico. Estas especies debido a su longevidad y amplia distribucin de ambientes y hbitat, presentan variabilidades y diversidad gentica altas. Situacin comn para especies arbreas de polinizacin anemfila y de alta data evolutiva. Esta situacin es observable incluso en pequeos fragmentos o relictos de bosque. En el estudio de Torres Daz et al (2007) los valores de Ht=0.246 para Nothofagus alessandriii son altos y similares al reportado por para Nothofagus siempreverdes, son valores mayores que los de N.pumilio y el polimorfismo bajo en comparacin a otras especies. Asimismo, se encontr una alta diferenciacin entre poblaciones y bajos niveles de flujo gnico histrico, en comparacin a los Nothofagus siempreverdes del estudio de Premoli (1997), que mostraron baja diferenciacin entre poblaciones pero altos niveles de flujo gnico, en contraste a lo que se describe para Nothofagus alessandrii. Los altos niveles de diversidad gentica observada y esperada, que se encontraron incluso en fragmentos de bosque muy reducidos de bosques de Nothofagus alessandrii en la Reserva Los Ruiles el Coeficiente de FLS muestra una deficiencia de heterocigotos, esto se reafirma con la presencia de alelos raros en fragmentos muy aislados y sin proteccin del estado, por tanto la proteccin y conservacin de estos bosquetes reservorios de genes e historia evolutiva cobra importancia. Nothofagus obliqua y Nothofagus alpina corresponden a taxas comprobadamente emparentados. Los marcadores utilizados para determinar su variabilidad y diversidad gentica revela que estas especies sobrevivieron en refugios durante las ltimas glaciaciones, que dada la baja tasa de mutacin de ADN de cloroplasto y pocas generaciones posteriores a los eventos glaciares (longevidad de las especies), la presencia de los haplotipos encontrados sustentan esta hiptesis y los haplotipos compartidos entre especies indican la coexistencia de Roble y Raul en refugios comunes en la Cordillera de la

Costa y de los Andes tanto en Chile como Argentina. Los anlisis adems muestran diferenciaciones importantes entre las poblaciones y alto grado de fijacin de alelos, incluso la presencia de alelos raros particulares en las poblaciones extremas. La diversidad de ambientes en que se desarrollan y comparten estas especies, en particular con otras con las que existe emparentamiento filogentico, fomenta la aparicin de hbridos F1 y de retrocruzas en las zonas de traslape o ecotonos. Generalmente la hibridacin tiende a ser introgresiva hacia la especie madre. El manejo silvcola para Roble y Raul es el ms desarrollado junto con Lenga, pero Raul es la especie de mayor valor y la extraccin selectiva de individuos estara modificando la estructura de los bosques y las dinmicas de regeneracin, que se favorecen hacia una mayor diversidad gentica en regeneracin por parches y se desfavorece en extensiones amplias. El manejo silvcola debiese estar orientado a compensar la extraccin selectiva del pasado de modo de recuperar parte del potencial gentico y evolutivo de ambas especies tomado en cuenta los resultados de dinmicas de regeneracin, ciclos fenolgicos de las especies y potencial de enraizamiento para acciones de conservacin en especies en peligro. Por otro lado tambin destaca que el uso de estas especies ha permitido identificar patrones biogeogrficos importantes, como los refugios glaciares.