Relación huésped-parásito del geoduck Panopea abbreviata y el alga verde

Coccomyxa parasitica en la costa patagónica argentina.

resumen
Se describe la asociación de la geoduck Panopea abbreviata y el alga verde Coccomyxa
parasitica.
La identidad del alga verde fue confirmada por estudios moleculares; el alga se encontró
dentro de los hemocitos que se infiltran en el tejido conectivo de los sifones geoduck.
Características citológicas de los hemocitos.
no fueron alterados por la infección de algas; muy a menudo las algas se veían envueltas
por una vacuola digestiva dentro del citoplasma de los hemocitos, evidenciando diversos
grados de reabsorción. Células conectivas de sifones rara vez estaban infectados por C.
parasitica. La prevalencia media de C. parasitica fue mayor (82%) en San Matías
Golfo (42000S, 65050W) que en el Golfo San José (45%) (40320S, 64020W); a excepción
de la primavera, cuando los dos las localidades no mostraron diferencias en las
prevalencias (80%). Independientemente de la ubicación, la temporada y el tamaño del
huésped, los geoducks infectados mostraron valores de índice de condición más bajos que
los no infectados. En cuanto a otros bivalvos especie, sólo se encontró infectado un
ejemplar de navaja Ensis macha, y ninguna de las ostras Ostrea puelchana y Pododesmus
rudis y la vieira Aequipecten tehuelchus fue parasitada por el verde alga.

1. Introducción

La geoduck Panopea abbreviata (Valenciennes, 1839) (Hiatellidae) es endémica del

Atlántico sudoccidental y se encuentra entre 23S y 48S (Scarabino, 1977). Esta especie es
una gran y bivalvo longevo que se encuentra profundamente enterrado, hasta 70 cm
en sedimentos fangosos blandos; solo las puntas de los sifones quedan expuestas sobre la
superficie del sedimento (Morsan y Ciocco, 2004). Sin embargo, esta especie representa
una valiosa pesquería potencial recurso; la explotación de sus poblaciones atlánticas
comenzó recién en los últimos años (Ciocco, 2000).
Durante una encuesta sobre el estado de salud de P. abbreviata en el norte golfos
patagónicos (Argentina), algunos geoducks mostraron las puntas de los sifones de color
verde, asemejándose a infecciones por vía intracelular algas verdes del género Coccomyxa
(Chlorococcales: Coccomyxaceae) descritas por Rodríguez et al. (2008) en Mytilus edulis.
El género Coccomyxa incluye tanto animales marinos de vida libre como especies
planctónicas de agua dulce (Guiry et al., 2005), epífitas (Lamenti et al., 2000), simbióticas
con líquenes (Lohtander et al., 2003) y protozoos (Hoshina e Imamura, 2008), y parásitos
en estrella de mar (Mortensen y Rosenvinge, 1933), vieiras (Naidu y Sur, 1970; Stevenson
y South, 1974) y mejillones (Boraso de Zaixso y Zaixso, 1979; Bala, 1995; Grey et al., 1999).
C. parasitica fue descrita por primera vez por Stevenson y South (1974), infectando
la vieira gigante Placopecten magellanicus (Pectinidae) de Terranova, Canadá. También se
reportó en M. edulis chilensis de Patagonia, Argentina (Boraso de Zaixso y Zaixso, 1979;
Bala, 1995) y de las Islas Malvinas (Falkland) (Gray et al., 1999).
Sin embargo, la identificación del alga en los últimos estudios mencionados solo fue
respaldada por características morfológicas. Rodríguez et al. (2008) confirmaron la
presencia de C. parasitica infectando a M. edulis chilensis en el Mar del Norte y las Islas
Malvinas (Falkland), basado en datos de estudios moleculares, histopatología,
ultraestructura, y pigmentos del alga verde.
En el presente estudio, la presencia de C. parasitica en P. abbreviata de los golfos
patagónicos del norte se reporta por primera vez, y el alga se caracterizó con base tanto
en la morfología como en la datos moleculares (secuenciación de ARN ribosómico de
subunidades pequeñas (ARNr SSU)). Además, las variaciones estacionales y geográficas de
prevalencia y los efectos del alga verde en el índice de condición
de geoducks fueron estudiados.

2. Materiales y métodos

2.1. Recolección y procesamiento de muestras

Durante 2007, 60 geoducks (P. abbreviata) fueron estacionalmente colectada a 15 m de

profundidad en Puerto Lobos (42000S, 65050W), Golfo San Matías (n = 240), y
aproximadamente 50 geoducks en Punta Conos (40320
S, 64020W), Golfo San José (n = 210) (Fig. 1). Cada
La temporada de muestreo se realizó en los meses de enero, abril, julio y octubre.
para ambas localidades. Adicionalmente, durante 2006 y 2007, 682 ostras
[Ostrea puelchana d’Orbigny, 1842 (Ostreidae)], 133 cascabel
ostras [Pododesmus rudis Broderip, 1834 (Anomiidae)] fueron colectadas en Puerto Lobos
y Playa Fracasso (42250S, 64070W), 480 navajas [Ensis macha (Molina, 1782) (Solenidae)]
en Playa Fracasso y 180 vieiras [Aequipecten tehuelchus (d’Orbigny, 1846) (Pectinidae)] en
Punta Conos (Fig. 1). Los bivalvos eran transportado al laboratorio y mantenido en
acuarios con agua de mar aireada a 13 C durante 24 h hasta su procesamiento.
Se midió la longitud máxima de la concha de cada espécimen; caparazón y la carne se
pesaron por separado para calcular el índice de condición (relación entre el peso de la
carne húmeda y el peso de la cáscara). Partes blandas de todos los bivalvos fueron
examinados macroscópicamente en busca de signos de infección de algas, ya que
grado de color verde, que se supone que indica colonización de algas o infección.
Intensidad de la infección, en función de la extensión del verde área en los sifones, se
calificó como: no infectado: ausencia de verde coloración; levemente infectado: color
verde confinado hasta 1 cm de la punta de los sifones; moderadamente infectado: color
verde alcanzando hasta 3 cm desde la punta del sifón; fuertemente infectado: un oscuro
color verde superior a los 3 cm desde la punta de los sifones.

2.2. Procesamiento histológico

Pequeños trozos de tejidos sifonales que muestran una coloración verde como así como
piezas de puntas de sifones no decoloradas (5 10 mm), y una sección transversal oblicua
de 5 mm de espesor de 180 geoducks, que contiene branquias, glándula digestiva, manto,
nefridio y gónada.
Los tejidos sifonales y las secciones transversales oblicuas se fijaron en fijador de Davidson
(Shaw and Battle, 1957), deshidratado en una serie de etanol e incrustado en Paraplast.
Las secciones histológicas (5 lm de espesor) se tiñeron con hematoxilina y eosina de Harris
o Mayer y se observaron bajo un microscopio de luz.

2.3. Microscopio de transmisión por electrones

Pequeños trozos de tejidos sifonales que muestran una coloración verde.

(5 x 10 mm) se fijaron en glutaraldehído frío al 2,5 % con formalina al 4 % (de
paraformaldehído) en tampón de cacodilato 0,2 M a pH7,2 durante 1 h. Después de
enjuagar en tampón de cacodilato, las muestras se posfijaron en tetróxido de osmio al 1 %
en el mismo tampón a 4 °C, se enjuagaron en Tampón de cacodilato 0,2 M, deshidratado
en una serie ascendente de etanol (70–100 %) y se transfirió a la resina de Spurr mediante
óxido de propileno.
La infiltración se realizó en resina de Spurr. Secciones ultrafinas fueron
doble teñido con acetato de uranilo y citrato de plomo, y examinado
ya sea en un Jeol 1200 EX II y un microscopio electrónico de transmisión (TEM) Philips
EM301.

2.4. Extracción de ADN y secuenciación de ARNr SSU

Trozos de tejidos de dos geoducks que muestran coloración verde fueron cortados y
conservados en etanol 96% hasta el análisis molecular fue realizado. Un sobrenadante
verde obtenido después de triturar tejidos con una espátula se pipeteó en un microtubo
Eppendorf y centrifugado (5000 rpm, 5 min) utilizando una minicentrífuga de mesa.
Se recogió un sedimento verdoso mezclado con restos de tejido. El sobrenadante se
centrifugó nuevamente (12.000 rpm, 10 min) y una segunda
Se obtuvo un sedimento de color verde oscuro. Ambos gránulos se enjuagaron en
100 ll de tampón de extracción de bromuro de N-cetil N,N,N,-trimetilamonio (CTAB)
(Ishida et al., 1999) y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 2 ml. Una cantidad de
perlas de vidrio (G-8772, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.) suficiente para llenar
la parte cónica del
Luego se añadió el tubo de centrífuga. Luego se usó un MiniBeadBeater (Biospec Products,
Bartlesville, OK, EE. UU.) para romper las células, con agitación durante 20 s a máxima
velocidad. A continuación, la mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min para separar
las fases. La fase acuosa se extrajo a un nuevo tubo de microcentrífuga y se extrajo el ADN
después de una modificación con bromuro de N-cetil N,N,N,-trimetilamonio al 1 %.
(CTAB) protocolo (Ishida et al., 1999). La posibilidad de obtener Secuencias de ARNr de
SSU de las algas infectantes utilizando cebadores específicos
Para evitar la amplificación simultánea de las secuencias de ARNr de SSU del huésped y
eludir, si es posible, el paso de clonación, se probado Una secuencia parcial del gen SSU
rRNA (568 bases, idéntica para los dos gránulos mencionados anteriormente) se amplificó
utilizando los cebadores de oligonucleótidos (SSUF) 50-CCG ACT CGC GGT GAA TCA-30 y
(SSUR) 50-GGC CAG AGT CCT ATC GTG-30
Los cebadores se diseñaron con base en el conjunto de datos SSU rRNA utilizado por
Rodríguez et al. (2008) para amplificar secuencias parciales de ARNr de SSU
pertenecientes a Trebouxiophyceae, incluidas las algas similares a Coccomyxa que se
encuentran en M. edulis. Secuencias adicionales de ARNr de SSU de Panopea japonica y
P. abrupta fueron inspeccionados para confirmar eso e interacciones (Newey et al., 2005).
También se utilizó el análisis GLM para probar el efecto de la presencia, la ubicación, la
estación y el tamaño del parásito en el índice de condición. En este caso, se utilizó una
distribución de error gaussiana junto con una función de vínculo de identidad. Los
intervalos de confianza para las medias de tratamiento estimadas se obtuvieron mediante
una rutina de arranque no paramétrico utilizando 2000 repeticiones (Efron y Tibshirani,
1993). Todos los análisis se realizaron utilizando lenguaje R (R Development Core Team,
2008).

2.5. Análisis filogenéticos

El análisis filogenético incluyó ARNr de SSU de longitud parcial

de otros trebouxiophyceans depositados en GenBank por un total
de 43 secuencias en el conjunto de datos final. Se utilizaron dos secuencias de grupos,
Trebouxia impressa y T. asymmetrica, para enraizar los árboles.
Secuencias parciales de ARNr de SSU (correspondientes a los sitios 311–879 en
la alineación 18S completa) se alinearon utilizando CLUSTALW múltiples alineación en
BioEdit (Hall, 1999). Diferentes modelos anidados de
La sustitución de ADN y los parámetros asociados se estimaron utilizando
Prueba modelo 3.06 (Posada y Crandall, 1998). El criterio de información de Akaike (AIC)
en Modeltest seleccionado Tamura y Nei (1993) modelo con sitios invariables y
distribución c (TrNef + I + G, proporción de sitios invariables = 0,3990) y distribución de
tasas en sitios variables con parámetro de forma (a) = 0,5071. El maximo
parsimonia (MP), unión de vecinos (NJ) y máxima verosimilitud (ML) se utilizaron métodos
para el análisis filogenético (versión PAUP4.0b10, Swofford, 2002) y los valores de
arranque fueron estimado a partir de 1000 repeticiones.

2.6. Análisis cuantitativo

Diferencias en la prevalencia de infección por C. parasitica entre geoducks se probaron
utilizando modelos lineales generalizados (GLM) condistribución de error binomial y
función de enlace logit. Los efectos de la ubicación de las muestras, la temporada y el
tamaño de los especímenes se agregaron a un modelo completo y el modelo mínimo
aceptable se derivó por eliminación hacia atrás de un modelo completo que incluía todos
los términos

3. Resultados

3.1. Observaciones macroscópicas

De un total de 450 geoducks, el 68% mostró un área verde coloreada en la porción distal
de la superficie interna de los sifones (1 a 4 cm de largo) (Fig. 2a yb).
El cincuenta por ciento de estos geoducks registraron un moderado intensidad de la
infección. El único espécimen de una navaja que muestra el color verde se registró en el
Golfo San Matías; y ninguno de las ostras y vieiras mostraron coloración verde.

3.2. Histopatología del alga verde

Microscópicamente, secciones histológicas de sifonal de color verde
Los tejidos mostraron agregados densos de aproximadamente 65 um de diámetro (SE =
15,2 um, n = 10), distorsionando la orientación del músculo y fibras conectivas (Fig. 3a y
b), y que contienen colonias de algas, restos celulares e infiltración de hemocitos, que
fueron encapsulando las células de alga (Fig. 3c). Examen histológico secciones de otros
tejidos (branquias, glándula digestiva, manto, nefridios)
y gónada) no pudo detectar células de algas.

3.3. Morfología de las algas

En TEM, las algas mostraron una forma redonda u ovalada, midiendo 3,23 um (SE = 0,11)
de largo y 2,44 um (SE = 0,1) de ancho (n = 8).
Se observaron hasta seis células Coccomyxa encapsuladas en una membrana común en un
solo hemocito (Fig. 4a). En otros casos, los hemocitos infectados incluían células de algas
libres dentro del citoplasma, es decir, no rodeado por una membrana. Cada célula de alga
contenía una o dos cloroplastos que muestran pilas de tilacoides y gránulos de almidón,
mitocondrias y núcleo con un nucléolo (Fig. 4b). Dos células hijas o autosporas dentro de
la membrana parental fueron frecuentemente observado (Fig. 4c). Ocasionalmente, las
células de algas se desintegraban dentro de una vacuola digestiva en el citoplasma de los
hemocitos. observado; en estos casos dos membranas, la membrana celular de algas
y la membrana de la vacuola digestiva (Fig. 4d); pero la mayoría de las colonias de algas
parecían muy resistentes a la digestión.

3.4. posición filogenética

Análisis filogenético basado en una secuenciación parcial de ARNr SSU
se construyó incluyendo la información de algas verdes que infectan a P. abreviadas, y
otros trebouxiophyceans marinos y de agua dulce, endosimbiontes verdes en líquenes y
plantas terrestres (Fig. 5).
Las algas verdes que infectan a P. abbreviata de Argentina se agruparon junto con
secuencias de C. parasitica (2–4 nucleótidos diferentes (nt)) obtenido de mejillones (M.
edulis chilensis) del norte Mar. El patrón de ramificación separado del grupo C. parasitica
de un clado hermano que incluye otras especies de Coccomyxa y endófitos relacionados
fue respaldado por valores de arranque moderados (> 70) con el excepción del método
MP.

3.5. Relación entre prevalencia de algas, estacionalidad y ubicación

variaciones y efectos en el índice de condición de geoducks
Para el análisis de prevalencia, los resultados indicaron efectos significativos de los
principales factores ubicación (p < 0,001) y temporada (p < 0,001) y sus interacciones (p <
0,01). La prevalencia media de geoducks de San Golfo Matías fue del 82% y el del Golfo
San José fue del 54%. A lo largo de
Durante el año, los ejemplares del Golfo San Matías mostraron valores de prevalencia
superiores a los del Golfo San José, excepto en la época de primavera, donde las dos
localidades no mostraron diferencias (Fig. 6). Entre temporadas no se encontraron
diferencias en geoducks de San Matías Golfo, pero los del Golfo San José mostraron
prevalencias más altas en primavera y los valores más bajos en otoño (Fig. 6). La
interacción entre tamaño y ubicación evidenció que en el Golfo San Matías de mayor
tamaño
los geoducks tienen más probabilidades de ser parasitados que los más pequeños dentro
del rango de longitud de la concha del geod
geoducks mostró
un índice de condición más bajo que los no infectados (Fig. 7).
4. Discusión
SSU rRNA filogenia incluyendo secuencias de algas verdes en
M. edulis previamente estudiada por Rodríguez et al. (2008) obtenido
en el presente estudio, mostró que las algas que infectan a P. abbreviata
pertenece a un clado similar a Coccomyxa. Rodríguez et al. (2008) concluyeron, tras la
comparación de características morfológicas e histopatológicas
resultados, que las algas verdes de M. edulis en el Mar del Norte y
Islas Malvinas (Falkland) correspondería con el original
descripción de C. parasitica por Naidu y South (1970). como hay
no había registros GenBank disponibles de C. parasitica, secuencias
obtenido por Rodríguez et al. (2008) fueron las únicas secuencias para
esta especie conocida hasta la fecha. No incluimos en nuestra filogenia
las secuencias de las Islas Malvinas (Falkland) porque solo
compartió 310 nt con nuestra alineación. La filogenia de ARNr SSU resultante para dicha
alineación no sería satisfactoria, ya que no podría
separar las secuencias de C. parasitica de otros taxones relacionados, no
incluso Paradoxia bilobata (datos no mostrados).
Aunque C. parasitica se ha informado previamente en varios bivalvos como mejillones y
vieiras, en nuestro estudio ninguna de las ostras y vieiras examinadas estaba infectada por
esta alga. este estudio es
el primer informe que registra C. parasitica en el geoduck P. abbreviata,
y en la navaja E. macha. Sin embargo, la navaja
estar actuando como huésped accidental, ya que el alga se encontró sólo en
uno de los 480 especímenes examinados. Esto parece estar relacionado con el grado de
exposición de los tejidos a la luz, ya que es vital para la supervivencia de las algas. Aunque
P. abbreviata y E. macha son infaunales
almejas, los sifones de estas últimas no quedan expuestos sobre el sedimento
superficie. Así, el metabolismo fotosintético de las algas dentro de su
los tejidos estarían limitados debido a la irradiancia disponible muy baja, si es que hay
alguna. Por el contrario, P. abbreviata extiende sus sifones sobre
20 cm por encima de la interfase sedimento-agua, lo que resulta en una exposición
adecuada a la luz para la supervivencia de las algas. Se ha considerado la luz
ser un factor importante que controla la distribución y abundancia de C. parasitica dentro
de los tejidos de la vieira P. magellanicus (Naidu, 1971). Aunque C. parasitica se encontró
distribuida
a lo largo de los tejidos del huésped en M. edulis chilensis y P. magellanicus (Naidu, 1971;
Gray et al., 1999), en P. abbreviata el alga establece
y se reproduce solo dentro de los hemocitos y ocasionalmente en las células
del tejido conectivo de la porción terminal de los sifones.
Tanto las mayores concentraciones de nutrientes como la mayor densidad de lechos
naturales de geoducks en Puerto Lobos (Golfo San Matías) (Ciocco
et al., 2004; Gagliardini y Rivas, 2004), podría ser determinante
las prevalencias más altas de C. parasitica en P. abbreviata encontradas en este
ubicación en comparación con los valores más bajos en Punta Conos (San José
Golfo). La zona de Puerto Lobos recibe agua con altas concentraciones de fitoplancton
durante todo el año (Gagliardini y
Rivas, 2004), que podría estar suministrando células del alga Coccomyxa;
mientras que el área de Punta Conos muestra un pico de concentración de fitoplancton
solo durante la temporada de primavera.
Si bien el tipo de asociación entre C. parasitica y
su huésped bivalvo no está del todo claro, la infección de las algas provoca alteraciones
patológicas en los tejidos del huésped. La presencia del verde
las algas causaron daño a los tejidos geoduck provocando interrupciones y trastornos en la
disposición de los músculos y conectivos
fibras de los sifones. También hubo infiltración hemocítica en tejidos infectados y
procesos fagocíticos, que pueden actuar como drenaje.
en energía Cheng (1976) señaló que la energía para la fagocitosis en la almeja Mercenaria
mercenaria parecía derivarse
de una vía glucolítica, ya que los hemocitos utilizan glucosa
y glucógeno. Los resultados obtenidos en el presente trabajo avalan
esta hipótesis por el hecho de que el índice de condición más bajo se asoció
estadísticamente a los geoducks infectados. Esto sugiere que C.
parasitica podría tener un efecto adverso en la salud de P. abbreviata
lo que significa la naturaleza parasitaria de esta alga.