Teórico Nº14

2023
Microscopía I
Biologia Celular y Molecular
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Universidad de Buenos Aires

Prof. Dr. Nicolás O. Favale

Un poco de historia…
- Robert Hooke (1635-1703)
Micrographia
compuesto
?

“Célula”

- Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723)

simple

espermatozoide

“corpusculos rojo”

Bacterias
Pasteur (1822-1895)
x200 “no contesto pero lo
hizo contestable”
Microscopia

Básicamente la función del microscopio ópticos es obtener

una imagen magnificada, para así facilitar la observación de
los detalles que escapan a la simple observación.

!"#$
%&'()*+,&(-$.*,$/,)+0(,$-1',)23)$-14,(-'$5,+3'035-$
/,.*,6-'$/3)3$',)$/,)70105-'$3$'0+/8,$20'(39

Microscopía Óptica ✔
Tipos de Microscopía

Límite de
Microscopía Electrónica 0,2 µm difracción
de Abbe
+07)-'7-/0-$.*,$,'(:$7-+/*,'(-$/-)$*&$'0'(,+3$5,$8,&(,'$;$
*(080<3$8*<$20'018,$=&-$,'$5,8$(-5-$7-)),7(3>9

Lente convergente o biconvexa

Avances

Avances en Microscopia

Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014

S U P E R - R E S O LV E D F L U O R E S C E N C E M I C RO S C O P Y
How the optical microscope became a nanoscope
Eric Betzig, Stefan W. Hell and William E. Moerner are awarded the Nobel Prize in Chemistry 2014 for having bypassed a
presumed scientific limitation stipulating that an optical microscope can never yield a resolution better than 0.2 micrometres.
Using the fluorescence of molecules, scientists can now monitor the interplay between individual molecules inside cells; they can
observe disease-related proteins aggregate and they can track cell division at the nanolevel.

Stimulated Emission Depletion

Single-molecule microscopy
(STED) microscopy
Microscopia Óptica
Microscopía Óptica
Microscopio Microscopio Invertido
Partes del microscopico
Partes de un microscopio

Retina

Detector
Ocular
Ocular
Iris

Ocular
Revolver

Estativo
Objetivo
Objetivo

Platina Espécimen
Tornillo
Condensador
condensador
Diafragma Condensador
Apertura Tornillo Tornillo
Condensador
X-Y macrométrico

Tornillo
Diafragma
Campo Fuente luz micrométrico Fuente luz
Iluminación
Conceptualmente un microscopio

Camino óptico Procesamiento de la información

Retina

Receptor
Iris
Parametros Básicos

• Magnificación
• Resolución
• Contraste

Espécimen Fundamento de la microscopia

Interacción
• Luz-Luz
• Luz-Materia

Fuente de iluminación
Luz - radiaciones electromagnéticas

Dos modelos se usan para describir a las radiaciones electromagnéticas: Modelos

de Onda y Modelo Partícula

modelo de partícula modelo de onda

fotones

Propagación en el espacio de la Onda Electromagnética (vibran perpendicular).

Parametros de la onda Período espacial/temporal

Longitud de onda, de una onda sinusoidal, es el período espacial de la onda. La distancia

sobre la cual se repite la forma de la onda, o la distancia entre dos puntos de una misma
fase (ej: dos máximos)

𝜆= distancia = metro (µm o nm)

longitud de onda (𝜆) periodo (T)

modelo de onda E = h.v
c= 𝜆.v

E = h.c/𝜆

espacio

Frecuencia es una magnitud que mide el número de repeticiones por unidad de tiempo de
cualquier fenómeno o suceso periódico. Es es la inversa del período temporal de la onda.

1/T = ν = evento. tiempo-1 = 1/s = Hertz (Hz)

Parametros de la onda Período espacial/temporal
Siempre debemos recordar que la visión humana posee un fuerte ses

https://iie.fing.edu.uy/proyectos/esopo/eem/
Interacción Luz-Luz y Luz-Materia
Interacción Luz-Materia /Luz-Luz

Emisión Fluorescencia
dispersión
esparcimiento
reflectada (scattering)
absorción
Transmitida

refracción dispersión
(medio) (𝜆)

difracción interferencia Luz-Luz

Parametros Básicos

• Magnificación
• Resolución
• Contraste
Microscopia Óptica
La parte fundamental del microscopio
Retina

Detector

Iris

Ocular

Objetivo

Espécimen

Condensador

Fuente luz
 Microscopia Óptica
La parte fundamental del microscopio
• Magnificación
• Resolución
• Contraste

Rosca

Correcciones óptica
Plan Apo
Apertura numérica (NA)
Magnificación 60x/1.40 Oil Medio de inmersión
Diseño especializado DIC
Longitud del tubo ∞/ 0.17 WD 0.15 Distancia de Trabajo (WD)
Espesor de cubreobjetos
Código de color

mat
de magnificación
Código de color
medio de inmersión

Lente

e of
g agents
bjective lens
agents. The
tion over a
 proyecci n. 2.3. Contraste
Magnificación
Como puede observarse en este ejemplo sobre- El contraste resulta un par metro fundamental en
Magnificación
simplificado, la utilizaci n del ocular da como resultado
una imagen de mayor magnificaci n que la lograda solo
el reconocimiento de estructuras por el observador. El
ojo humano puede identificar un l mite entre dos
con el objetivo. Para veces
calcular la más
magnificaci n total es • asMagnificación
estructuras sólo si hay una diferencia de brillo (y de
Cuantas grande la imagen generada en
contraste) mayor al 2% y no gradual entre ellas. Es por
lograda se utiliza la siguiente ecuaci n: • Resolución
comparación con el objeto
esto que el correcto ajuste del contraste resulta
fundamental en la observaci n. Mientras que •losContraste
dos
Mtotal = Mobjetivo x M ocular
par metros anteriores (resoluci n y magnificaci n)

Fig. 24-9. Ejemplo sobre simplificado de la marcha de rayos en un sistema ptico que consta de objetivo y ocular. El esp cimen situado a un distancia, mayor
a la distancia focal (f) y menor a dos 2 veces a esta (2f), dar como resultado una imagen real invertida y magnificada, por efecto del objetivo (Imagen A). EL
ocular por su parte generar a partir de esta Imagen A, una imagen invertida virtual, y de mayor tama o aun (Imagen B).

256

Mtotal = Mobjetivo x Mocular

600x = 60x . 10x
 Microscopia Óptica
La parte fundamental del microscopio
• Magnificación
• Resolución
• Contraste

Rosca

Correcciones óptica
Plan Apo
Apertura numérica (NA)
Magnificación 60x/1.40 Oil Medio de inmersión
Diseño especializado DIC
Longitud del tubo ∞/ 0.17 WD 0.15 Distancia de Trabajo (WD)
Espesor de cubreobjetos
Código de color

mat
de magnificación
Código de color
medio de inmersión

Lente

e of
g agents Magnificación Apertura Numerica
bjective lens
agents. The Resolución
tion over a
Resolución

Resolución
Capacidad de un sistema óptico de • Magnificación
diferenciar dos puntos como tales • Resolución
• Contraste

Patrón de Airy Patrón de Airy

97%
1,7%
97%

1,7%
Disco de Airy
Disco de Airy

¿Cuál es la relación entre el John W. Strutt -

¿Por qué el cielo es celeste?
disco de Airy y la resolución? Lord Rayleigh (1842-1919) https://www.youtube.com/watch?
v=NqlxzUx7Z_E
Criterio de Rayleigh
El ojo humano pude distinguir dos puntos cuando el máximo de un punto coincide con el
primer mínimo del otro.
Resolución

Resolución
• Magnificación
Criterio de Rayleigh • Resolución
El ojo humano pude distinguir dos puntos cuando el • Contraste
máximo de un punto coincide con el primer mínimo

x x x

x x

Límite de Resolución
(d0 ) = r
Microscopia

Resolución
Capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales

Límite de Resolución
(d0 )
d0

≠
d= rairy = 0.61 𝜆 / sen 𝛳

Ernst Karl Abbe

(1840-1905) (Zeiss)
Padre del microscopio
𝛳 moderno

No es igual cuando luz es transmitida o

reUlejada en la observación
Microscopia

Resolución
Capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales

Límite de Resolución
(d0 )
d0

d= rairy = 0.61 𝜆 / sen 𝛳 d = 1,22 𝜆 /2.NA NA=(sen α) 𝑛

aire diferentes medios

𝛳 do= 0,61 xluz 𝜆transmitida
muestra
vidrio AN
aire
Microscopia

Resolución
Capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales

Límite de Resolución
(d0 )
d0

Límite de Resolución

do= 0,61 x 𝜆 Longitud onda

AN Apertura Numérica

Poder Resolución o Resolución

R= do-1 = 1
do
Importancia del angulo
Resolución y Apertura numérica
Cuanto más rayos pueda capturar el objetivo, mejor resolución tendrá.
La apertura numérica es una medida que nos indica la capacidad del objetivo de capturar la luz.
NA=(sen α) . 𝑛

Importancia de 𝛂
Objetivo 1 Objetivo 2

α=14,5º α α=64º
𝑛=1 𝑛=1
α 𝜆=500 nm
𝜆=500 nm

NA=(sen 14,5º) . 1 NA=(sen 64º) . 1

NA=0,25 NA=0,9
d0 = 0,61 . 500 nm / 0,25 d0 = 0,61 . 𝜆 / AN d0 = 0,61 . 500 nm / 0,9
d0 = 1220 nm d0 = 340 nm
Distancia de Trabajo
Resolución y Apertura numérica
Cuanto más rayos pueda capturar el objetivo, mejor resolución tendrá.
La apertura numérica es una medida que nos indica la capacidad del objetivo de capturar la luz.
NA=(sen α) . 𝑛

Importancia de 𝛂
Objetivo 1 Objetivo 2

Distancia de
trabajo (WD)
α=14,5º α α=64º
𝑛=1 𝑛=1
α 𝜆=500 nm
𝜆=500 nm
Importancia del 𝑛
Resolución y Apertura numérica

NA=(senα) . 𝑛

Importancia de 𝑛 Indice de refracción

La refracción es el cambio de dirección y velocidad que experimenta una onda al pasar

de un medio a otro con distinto índice refractivo.

haz incidente
𝑛2
haz resultante
𝝷1 ángulo incidente
𝝷2 ángulo refracción
𝝷2 𝝷2=90º
haz paralelo
Interfase haz reflejado

𝝷1 𝝷1 𝝷1 𝝷2

𝑛1

Ley de Snell
𝑛1 . sen 𝛳1 = 𝑛2 . sen 𝛳2

Propio de cada 𝜆
Importancia del 𝑛
Refracción Luz-Materia

𝑛agua = 1.33 𝑛aire = 1.0 𝑛vidrio = 1.5 𝑛aceite ≅ 1.465

𝑛vidrio = 1.5 𝑛vidrio = 1.5
Importancia del 𝑛
Resolución y Apertura numérica
Importancia de 𝑛

NA=(senα) . 𝑛
Objetivo 2 Objetivo 2
Lente Seca Lente inmersión

𝜆=500 nm Aire Aceite

𝑛=1 𝑛=1,515
α=64º
Vidrio
𝑛=1,5

NA=(sen 64º) . 1 NA=(sen 64º) . 1,515

NA=0,9 NA=1,36
d0 = 0,61 . 500 nm / 0,9 d0 = 0,61 . 𝜆 / AN d0 = 0,61 . 500 nm / 1,36
d0 = 340 nm d0 = 224 nm
Resolución vs Magnificación

Resolución vs Magnificación

• Magnificación
• Resolución
• Contraste

X 9X

Aumento no es sinónimo de Resolución Resolución no es sinónimo de detección

Resolución vs Detección

Resolución
Capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales

Límite de Resolución

D= 0.61x400nm/1.4 = 200nm

¿Puedo distinguir una estructura de menor tamaño?

Resolución no es sinónimo de detección
Resolución vs Detección

Resolución vs Detección

20 nm

200 nm

Detecto
no resuelvo
Contraste “Starry Night over the Rhone” each of the stars in this familiar constellat
single entity (Figure 2.14).
¿ Qué es el contraste ( ) ?
But a star chart shows that the second star in the handle is actually double
• Magnificación
are an
El contraste se optical double
define como — two stars
la diferencia that appear
de intensidad closeentre
(brillo) together but are at diffe
• Resolución
unhave
puntonodegravitational
una imagen yrelationship
su fondo. El ojo humano
to each 2-5%They are separated by abo
other. • Contraste
arc, and being able to detect the two as separate has been considered by m
the American Indians to the desert dwellers of the near east as a test of goo
2% diferencia de brillo

Figure 2.1
ences s
varying
visually
(a) orig
(b) pro
“un
to s
cha
deta

(a) (b)
Visión no es absoluta sino
comparativa
Contraste ¿Qué vemos?
Percepción de las Imágenes • Magnificación
• Resolución
Comparativo - Expectativa • Contraste

El tablero de Adelson
“Checkershadow”
Edward H. Adelson

La visión depende de la comparación local

NO ES POSIBLE DETERMINAR EL VALOR DE BRILLO ABSOLUTO
Contraste físico

¿Cómo lograr el contraste necesario?

Iluminación

a) Voltímetro

Cambio Intensidad de
la iluminación
Partes del Microscopia
Funciones de las partes del Microscopio Óptico

Condensador

Diafragma de
Apertura
Contraste físico

¿Cómo lograr el contraste necesario?

Iluminación
b) Diafragma
del condensador

Cambio de cono de
iluminación nunca usar el
diafragma
Incremento Contraste para disminuir la
intensidad
de luz

NA=(senα) . 𝑛
Disminución AN

do= 0,61 x 𝜆
AN
Perdida de Resolución
Tipos de Microscopía Óptica

¿Cómo lograr el contraste necesario?

Tejidos
Microscopia Óptica [
Células

Con marcación Colorantes

dispersión refractiva

Luz blanca esta formada por diferentes longitudes de onda

Tipos de Microscopía Óptica

¿Cómo lograr el contraste necesario?

Tejidos
Microscopia Óptica [
Células

Con marcación Colorantes

luz no
absorbida

luz blanca
Tipos de Microscopía Óptica

Tipos de Microscopia
Tejidos
Microscopia Óptica [
Células

Sin marcación
(contraste óptico) Con marcación
Colorantes
Observación directa

Contraste de Fases

Campo Oscuro

Contraste de Fases
interferencia diferencial
(DIC - Nomarski)

Células vivas
Contraste del espécimen Campo Oscuro

Muy baja diferencia

n del espécimen

Sólo ingresa luz que sufre

difracción y dispersión

Excelente contraste

Alta intensidad de luz

Artefactos
Contraste Óptico Campo Oscuro

Sin marcación

Observación Claro

Campo Oscuro
Contraste del espécimen Contraste de fases

Frits Zernike (1888-1966)

Células vivas con poco espesor

y homogéneas

Combina cambio de fase entre los

diferentes haces de luz

Anillo de CF
- Atenuar luz no dispersada
- Incremento en el cambio
de fase en luz dispersada

Especímenes
poco espesor e IR

Especimenes gruesos
Contraste Óptico Contraste de fases

Contraste de Fases
Contraste del espécimen Contraste por interferencia diferencial (DIC)

George Nomarski (1919-1997)

Células vivas

Interferencia de haces de luz

polarizada muy próximos

Polarizadores
Prismas de Wollastron
- Birefringente genera dos haces
polarizados (opuestos)
separados por 0,2 um
- solo ingresa luz que haya
- interactuado

Especímenes
Gruesos

Especimenes finos
Contraste Óptico Contraste por interferencia diferencial (DIC)

Campo claro

DIC
Time-lapse de microscopia DIC
Tipos de Microscopía Óptica

Tipos de Microscopia
Tejidos
Microscopia Óptica [
Células

Sin marcación Con marcación

Observación directa Colorantes

Fluorescentes
Contraste de Fases Moléculas Orgánicas

Campo Oscuro Semiconductores

Contraste de Fases
interferencia diferencial
(DIC - Nomarski)

Celulas vivas
Contraste del espécimen
¿Cómo lograr el máximo contraste?

El contraste se define como la diferencia de intensidad (brillo) entre un punto de una

imagen y su fondo.

Fluorescencia Gran contraste (epi-iluminación)

Contraste selectivo-Única molécula

Observar la presencia de estructuras por

debajo del límite de resolución
Resolución vs Detección

¿Puedo ver una Proteína?

¿Puedo ver algo que es inferior a que mi capacidad visual?

Luciérnagas

Puedo ver por debajo

del límite de resolución
si emite luz
Resolución vs Detección

Resolución
Capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales

Límite de Resolución

D= 0.61x400nm/1.4 = 200nm

¿Puedo distinguir una estructura de menor tamaño?

Si la estructura es la emisora de luz, si.

¿De qué tamaño se observa la estructura?

Resolución vs Detección

Resolución - Fluorescencia

20 nm

200 nm
Muchas Gracias