UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NÚCLEO DE SUCRE
ESCUELA DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

GUÍAS PRÁCTICAS DE HEMATOLOGÍA II (200-4483)

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DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS
LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA II

PRACTICA N°1

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE COAGULACIÓN

Instrucciones generales en la realización de las pruebas de coagulación

1. Personal entrenado
Se debe seleccionar entre el personal de laboratorio, a una persona para que se encargue
de realizar las pruebas de coagulación o mejor aún, a un equipo, dependiendo del tipo
de laboratorio, el cual debe tener un entrenamiento especial.

2. Equipos
a. Baño de María. Los baños de maría deben estar provistos de termostatos que
mantengan una temperatura de 37 °C ±0,5. Deben ser controlados cuidadosamente:
vigilar la temperatura antes de comenzar a realiza las pruebas, ya que las variaciones
afectan notablemente los resultados. Vigilar también el nivel del agua, el cual debe
llegar casi al borde del baño. El agua debe ser destilada para que esté libre de sales
calcáreas.
b. Centrífugas.
c. Neveras. Ciertos plasmas y reactivos necesitan ser guardados en nevera a
temperaturas de 4°C.
d. Congelador. Sirve para el almacenamiento prolongado de plasmas. Algunos plasmas
requieren de temperaturas de -20°C para su conservación. Algunos factores como F
VIII requieren por lo menos de -70 °C.
 e. Fuente de luz. Una fuente de luz es indispensable para una buena observación en la
formación de los coágulos; pero no debe proporcionar temperaturas altas, por lo que
se utiliza un lámpara de luz de Neón, que es luz fría.
f. Cronómetros. La mayoría de las pruebas de coagulación se basan en medir el tiempo
que tarda en formarse un coágulo de fibrina in vitro; a veces este tiempo es muy
corto, sólo en segundos, por lo que es necesario disponer de cronómetros.

3. Material
a. Agujas. Solo se deben utilizar agujas descartables, n° 20 y de 1 pulgada de
longitud; agujas de menor diámetro pueden producir la hemolisis de los glóbulos
rojos y por ende, contaminación de la muestra con sustancias tromboplásticas.
Agujas más largas de 1 pulgada, proporcionan mayor superficie de activación.
b. Inyectadoras. Se recomienda el uso de inyectadoras plásticas descartables. No se
recomienda el uso da vacutainer ya que la sangre entra con mucha presión, lo que
puede causar, por una parte hemólisis de los glóbulos rojos y liberación de
sustancias con activación troboplástica y por otro lado, la activación de los factores
de contacto.
c. Tubos. Para la recolección de la sangre se deben utilizar tubos plásticos
descartables, preferiblemente provistos de tapa; estos mismos se utilizan para
conservar los plasmas.Para medir el tiempo de coagulación, se utilizan tubos 10 ×
75 mm. Es indispensable que el diámetro sea uniforme, a fin de obtener resultados
reproducibles. Otros tubos para colocar reactivos tales como cloruro de calcio,
tromboplastina, cefalina, pueden ser de vidrio, bien sea de 12 ×75 mm o de 100×
13mm, pero destinados sólo a pruebas de coagulación.
d. Pipetas. En la mayoría de las pruebas se emplean las llamadas pipetas automáticas
con las ventajas adicionales de que sus puntas son plásticas (no contactables) y
descartables.
e. Bandejas con hielo. Como las muestras de plasmas y otros reactivos, hay que
mantenerlos en baño de hielo durante la realización de la prueba, se necesita
disponer de bandejas con capacidad suficiente para introducir en ellas las gradillas
que van a sostener los tubos con los reactivos.
Cuidado y lavado del material de vidrio
El lavado se hace con agua y detergentes proteolíticos especiales como el 7x, Alconox,
Buell-Cleaner. El enjuague final se practica con agua corriente, varias veces hasta que se
elimine todo resto de detergente; el enjuague final se realiza con agua destilada.
En cuanto el tratamiento del material de vidrio con mezcla sulfocrómica, se debe pasar por
ella con cierta frecuencia e incluso; dejarlo sumergido durante toda la noche; luego lavarlo
muy bien con agua de chorro y agua destilada. Se ha comprobado que el material tratado
con solución sulfocrómica, inactiva la cefalina.

4. Reactivos
Los reactivos deben ser de preparación reciente y de buena procedencia. La mayoría de
los reactivos se conservan en nevera a 4ºc, algunos requieren congelación a -20 °C o -
70 °C. Para evitar descongelaciones repetidas es aconsejable repartirlos en pequeñas
alícuotas y después de utilizarlas, descartar el resto; esto evita la contaminación y
pérdida de actividad. Si aparece turbidez o precipitados, deben descartarse.

a. Soluciones anticoagulantes. Los anticoagulantes empleados en la mayoría de las

pruebas de coagulación se fundamentan en la precipitación de los iones calcio. Los
más empleados son los de Citrato de sodio 3,8% y Oxalato de sodio 0,1 M.
 Citrato de sodio 3,8%. Preserva mejor los factores de la coagulación, tales como el
FV y el FBI y, además, la neutralización del calcio es más rápida. Se emplea en
proporción de 1 volumen de anticoagulante por 9 de sangre. La solución se conserva
a 4 °C; descartarla si hay presencia de hongos; bacterias o precipitados.
 Oxalato de sodio 0,1 M. preserva menos los factores lábiles de la coagulación. Se
emplea cuando se va a obtener plasma envejecido. (plasma desprovisto de FV)
cuando se va adsorber plasma Sulfato de Bario. Se utiliza en proporción de 1
volumen de anticoagulante por 9 volúmenes de sangre.
 EDTA. Se utiliza en la proporción de 1 mg de sal por cada ml de sangre (1 mg/ml).
Se emplea para tomar muestra para el contaje directo de plaquetas. No puede
utilizarse en casi ninguna prueba de coagulación; ya que el EDTA es un quelante del
 calcio y algunos factores de coagulación pierden su actividad cuando el calcio no
está presente. Impide la agregación plaquetaria y tampoco sirve para evaluar el
tamaño de las plaquetas, pues aumenta su tamaño.
 Oxalato de Amonio 1%. Se utiliza como liquido de dilución para el contaje de las
plaquetas por método directo. Además de ser un anticoagulante, hemoliza los
glóbulos rojos, lo que facilita el contaje de las plaquetas.
 Cloruro de calcio. Se utiliza en concentración 0,025 M y se obtiene a partir de la
solución de CaCl2 1M.

b. Tromboplastinas. Las tromboplastinas son extractos tisulares salinos. La extracción

se hace con solución salina y se obtiene actividad coagulante completa. Se obtiene,
placenta, pulmón; de diferentes especies: hombre, conejo, caballo y por técnicas
variadas.
La tromboplastina parcial (cefalina) también son extractos tisulares pero a diferencia
de las tromboplastinas, la extracción se hace con cloroformo; de este modo se
obtiene solo la fracción lipídica del principio activo coagulante. Se utiliza como
sustituto de los fosfolipídos plaquetarios. Pueden venir combinadas con sustancias
activadoras por contacto (caolín, celite y ácido elágico) y se llaman tromboplastinas
parciales activadas.

c. Plasmas
 Normal
 Plasma absorbido. Plasma desprovisto de algunos factores de la coagulación, debido
a la absorción con sales. Las mas utilizadas son el sulfato de bario y el hidróxido de
aluminio, que absorben los factores vitamina K dependientes: F II, F VII, F IX Y
FX.
 Plasma envejecido. Carece del factor V.

d. Sueros
 Normal
  Suero absorbido. Es un suero desprovisto de los factores K dependientes, mediante
la absorción con sulfato de bario o con hidróxido de aluminio. Contiene los factores
XI y XII.
 Suero envejecido. Contiene los factores XII, XI, X, IX y VII.

e. Plasma pobre en plaquetas. 3500 rpm/ 10 minutos.

f. Plasma rico en plaquetas. 800-900 rpm/ 10 minuto

5. Metodología
a. Extracción sanguínea
Se recomienda inyectadoras plásticas descartables y las agujas n ° 20
descartables. La sangre debe extraerse con un mínimo de estasis venoso, por lo
tanto el torniquete se debe utilizar en menor tiempo posible. La punción debe ser
limpia, es decir sin hacer movimientos de exploración. Al verter la sangre en el tubo
con anticoagulante hay que mezclar muy bien y rápidamente. Debe centrifugarse
inmediatamente a 3500 rpm durante 10 minutos. Separar el plasma y trasvasarlo a
envases plásticos y conservar a 4 ° C.
Las pruebas de coagulación deben realizarse dentro de las 3 horas de
extraída la muestra si el anticoagulante empleado es citrato de sodio y dentro de 90
minutos en caso de oxalato de sodio.

b. Uso de controles y de la mezcla control paciente.

Ninguna prueba de coagulación debe realizarse sin el uso de controles. Estas
mesclas (pool) de por lo menos 3 plasmas normales, procedentes de sangre extraída
al mismo tiempo y tratadas en idénticas condiciones a la del paciente. También
pueden emplearse controles comerciales.
En casos especiales, los controles deben ser una mezcla de plasmas de 6
personas normales.
Al realizar las pruebas de coagulación es indispensable introducir una
mezcla de plasma control + plasma paciente (CP) preparada volumen a volumen.
 Esta mezcla permite diferenciar si el tiempo de coagulación alargado de una prueba
obedece a deficiencia de algún factor o la presencia de inhibidores.

c. Duplicados
Tanto las muestras del control, como las del paciente y las mesclas C/P
deben ser realizadas por duplicados y el promedio de estos duplicados es utilizado
para deducir los cálculos.
Tiempo de coagulación Diferencia aceptada entre duplicados
< 20 s 1s
20- 60 s 2s
60- 100 s 3s
> 100 s 5s

d. Orden balanceado
Las muestras: control, paciente y mezcla C/P deben ser procesadas por
duplicado y en orden balanceado. Esto quiere decir que no debe trabajarse con las
dos muestras control y luego las dos del paciente; si no que ambas deben ser
procesadas conjuntamente durante la realización de las pruebas.
Al realizar las pruebas en orden balanceado se evitan errores subjetivos en la
apreciación de la formación de los coágulos, cuando se realizan por duplicados.

e. Movimiento del tubo

Se refiere al modo y frecuencia con que debe moverse el tubo donde se
formará el coágulo. El movimiento adecuado debe describir un ángulo de 90 ° y se
repite con una frecuencia no mayor de una vez por segundo.

f. Punto final de la prueba.

Hay que establecer que se toma como punto final de la prueba: Si la
aparición de las primeras mallas de fibrina o la formación de un coágulo sólido,
pues el intervalo entre uno y otro puede extenderse a varios segundos. El criterio
 que adopte tiene que mantenerse tanto en el control como en paciente y en la mezcla
control/paciente.

Pruebas de detención de trastornos de la hemostasia. Pruebas de selección.

Las pruebas de coagulación pueden ser pruebas generales, las que constituyen la
gran mayoría; estas pruebas involucran la participación de varios factores. Ejemplo: El
tiempo de tromboplastina parcial (TTP), que evalúa los factores del sistema intrínseco
de la coagulación.

Otras pruebas son semiespecíficas, como es el caso del tiempo de trombina, que
evalúa solo una determinada etapa de la coagulación: la transformación del fibrinógeno
en fibrina.

PRUEBAS GENERALES EN ESTUDIO DE COAGULACION

Prueba Modo de Valores Alteración
reportar normales
min (método) 3-7 min  Defectos plaquetarios:
(método Cuantitativos y
cualitativos.
Tiempo de Mielke)  Enfermedad de von
sangría Willebrand.
 Afibrinogenemia.
 Heparina.
 Presencia de PDF.

170- 440 ×  Trombocitopenias

Contaje de n° ×109/ l 109/ l  Trombocitosis
plaquetas (método) (Brecher-
Cronkite)
  Deficiencia de FI:
Afibrinogenemia,
Hipofibrinogenemia,
Disfibrinogenemia
Tiempo de C (seg)  FVIII: Hemofilia A,
Tromboplastina P (seg) Diferencia P- Enfermedad de von
Willebrand.
Parcial activada P-C (seg) C: hasta ± 6
 FIX: Hemofilia b.
(TTPa) VN diferencia seg
 FII, V, X, XI, XII;
Inhibidores del sistema
intrínseco.
Tiempo de  Deficiencia de F II, V,
C(seg)
Protrombina VI, X.
P(seg)
(TP)  Deficiencia de FI:
R: 0,8-1,2 Afibrinogenemia,
P (seg )
R= Hipofibrinogenemia,
C (seg)
Disfibrinogenemia
VN Razón
 Anticoagulantes del
sistema extrínseco

Tiempo de C (seg) Diferencia P-  Afibrinogenemia

Trombina P (seg) C: hasta ±  Hipofibrinogenemia.
P-C (seg) 2seg  Disfibrinogenemia.
VN diferencia  Heparina.
 Presencia de PDF
Determinación Normal o Normal:
del F XIII anormal Persistencia  Deficiencia del F XII
del coagulo a
24 horas.
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PRACTICA N°2

TIEMPO DE SANGRIA

El tiempo de sangría mide el tiempo que tarda en detenerse el sangramiento

de una pequeña herida realizada en la piel, bajo condiciones estandarizadas. Es la
expresión misma de la hemostasia primaria, ya que el sangramiento de detiene
porque las plaquetas se adhieren en la membrana basal y al colágeno que han
quedado expuestos por la herida, luego sufren agregación lo que da como resultado
la formación del tapón hemostático. El tiempo es influenciado también por la
calidad de los pequeños vasos y por un factor plasmático el factor VIII: vW, así
como también por el fibrinógeno.
Se han descrito varios métodos y la selección de la técnica varia en los
diferentes laboratorios. Los métodos más confiables son, por supuesto, lo mas
cuidadosamente estandarizados y controlados. Como las técnicas utilizadas son
diferente, es difícil interpretar los datos obtenidos entre varios laboratorios y los
valores normales oscilan un amplio rango; por ello debe reportarse el método
empleado y los valores normales.
Varios métodos han sido utilizados para valorar el tiempo de sangría, entre
estos: método de Duke, método de Luy, método de Mielke (basal) y mas
recientemente el Mielke modificado o Simplate II.
 Método Mielke modificado o Simplate II.
El Simplate II es un aparato en forma de cajita, la parte inferior es convexa y
en la superior tiene un dispositivo conectado a un resorte para disparar dos hojillas
de 5 mm de longitud.
Para realizar el tiempo de sangría, el aparato se presiona firmemente contra
la piel, previamente desinfectada: su borde convexo permite ejercer presión sin
causar molestia. Luego se dispara el dispositivo de la parte superior que liberará de
modo automático y simultaneo las dos hojillas, obteniéndose dos incisiones
idénticas 5 mm de longitud × 1 mm de profundidad. Los valores del tiempo de
sangría son de 2 a 9 minutos con una media de 5,5 minutos.
Este dispositivo ofrece varias ventajas:
1. Es descartable, lo que previene de infecciones.
2. Proporciona dos heridas simultáneamente; esto simplifica el procedimiento y
disminuye el tiempo de la prueba.
3. Es menos doloroso y menos traumático; esto lo hace más recomendable para los
niños, ya que las hojillas vienen escondidas.
4. Requiere poca experiencia.
5. Las hojillas salen automáticamente.

Los resultados de un tiempo de sangría dependen de una gran cantidad de variables

que en algunos casos pueden no revelar el verdadero diagnóstico de una enfermedad
hemorrágica. Estos son:
1. El grosor y vascularidad de la piel.
2. La temperatura.
3. La longitud y profundidad de la incisión.
4. La determinación del punto final del sangramiento.
5. La diferencia entre incisiones.
6. El hematocrito del paciente.

Tiempos más cortos que los reales, pueden obedecer a:

a. Pinchazo poco profundo, lo cual se evita con las técnicas estandarizadas.
b. Masajes fuertes en la zona donde se efectuara la prueba, pues pueden romperse
tejidos y glóbulos rojos, liberándose tromboplastina tisular y ADP, que influyen en
la agregación plaquetaria.
c. Bajas temperaturas que producen vasoconstricción.

Otras veces, los errores pueden conducir a tiempos falsamente largos:

a. Cortar vasitos de mayor calibre.
b. Separar el coágulo que se va formando, al tocar los bordes de la herida con el papel
filtro.
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PRACTICA N°3

CONTAJE DE PLAQUETAS

En la vida post-fetal, la mayor parte de las plaquetas son producidas en la médula

ósea o a partir de los megacariocitos maduros. Esto involucra procesos de endocitosis,
invaginación de la membrana plasmática del megacariocito, la eventual fusión de
membranas citoplasmáticas y la producción de 2 000 a 3 000 plaquetas del citoplasma de
cada megacariocito, las cuales son liberadas por un mecanismo casi explosivo. La vida
media plaquetaria oscila entre 9 a 12 días.

En sangre periférica las plaquetas son heterogéneas con respecto a su tamaño,

densidad y características tintoriales.

En frotis de sangre periférica coloreadas con coloración Romanowsky las plaquetas,

que tienen forma discoide, aparecen redondas, ovales o en forma de bastones. Se han
descrito dos porciones: una central, constituida por una serie de gránulos azurófilos que
están concentrados en esa zona dando el aspecto de un núcleo (cromómero) y una porción
periférica que se observa hialina, ligeramente azul (hialómero). Cuando la observación se
hace en azul brillante de cresil, en las que hay una fijación instantánea, no se observa esa
división clara entre esas dos zonas.

Las plaquetas maduras miden de 2 a 4 µm de diámetro, tienen un volumen promedio

de 8 µm3 y un espesor de aproximadamente de 1 µm.
 La ultraestructura de las plaquetas está en estrecha relación con su fisiología. Al
microscopio electrónico se le observa: la zona periférica integrada por una capa exterior
(CE) o glicocálix y una membrana; los sistemas membranosos internos (sistema canalicular
abierto (SCA) y sistema tubular denso (STD)); el citoesqueleto y unidades contráctiles
(microtúbulos (Mts) y microfilamentos (Mfs)); organelos (cuerpos densos, gránulos α,
lisosomas, peroxisomas y mitocondrias).

Las plaquetas tienen un papel muy importante en la hemostasia entre la cuales están:
formación del trombo plaquetario, contribuyen al mantenimiento de la integridad de la
pared vascular, intervienen en la coagulación principalmente por la disponibilidad del FP-3,
actúan en la retracción del coágulo. Además de su papel en la hemostasia, las plaquetas
participan en mecanismos de defensa, incluyendo respuestas inflamatorias e inmunológicas,
y mediante la remoción de partículas tales como bacterias y además sirven de transporte.

Gran número de técnicas han sido propuestas para realizar el contaje de plaquetas,
todas son pocas satisfactorias ya que debido a su pequeñez, fragilidad, a la tendencia que
tienen de adherirse entre sí a las superficies y a la facilidad que tienen de ser confundida
con restos eritrocitos, con leucocitos desintegrados o con partículas extrañas, hacen que los
resultados sean muy disímiles con las diversas técnicas. Sin embargo hoy en día se
disponen de automatizadores que realizan contajes con exactitud y precisión.

Método utilizado como líquido de dilución:

Oxalato de Amonio al 1 %.

PRINCIPIO:

Al mezclar la sangre con un diluyente apropiado (oxalato de amonio al 1 %) se

produce lisis de los glóbulos rojos, lo que permite contar las plaquetas con un microscopio
(preferentemente contraste de fase) y su concentración se obtiene sobre la base del volumen
utilizado y la dilución empleada.
MUESTRA:

 Sangre venosa con EDTA, o sangre obtenida por punción periférica.

MATERIALES:

 Cámara de Neubauer
 Pipeta de Thoma ( para contaje de GR)
 Agitador mecánico
 Microscopio

REACTIVO:

Solución de oxalato de amonio al 1 %

Oxalato de amonio……………..1 %

Agua destilada…………………..100 ml

Nota: Almacenar refrigerada, filtrar antes de usar.

PROCEDIMIENTO:

1. Aspire sangre con una pipeta para glóbulos rojos hasta la marca 1.
2. Aspire líquido de dilución con el fin de obtener una dilución 1:100.
3. Agitar la pipeta, preferiblemente en agitador mecánico, durante 3 minutos
aproximadamente.
4. Descarte las primeras 4 gotas de cada pipeta.
5. Rápidamente llene los retículos de la cámara con la pipeta.
6. Deje sedimentar las plaquetas durante 15 minutos, colocando el hematímetro en
cámara húmeda (placa de petri con papel de filtro humedecido) para evitar la
evaporación del líquido.
7. Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
 Las plaquetas se cuentan en todo el cuadrado central de cada retículo. Estas aparecen
como partículas altamente refráctiles.

CÁLCULOS:

Contaje de plaquetas= Nº de plaquetas contadas x FT

FT= FD x FV

100 = 100
FD =
1

FV= 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm= 0,004 mm3;

pero contamos en 50 cuadrados, el volumen es:

0,004 mm3 x 50= 0,2 mm3

Este volumen se corrige a 1 mm3 dividiendo 1 entre el volumen del cuadrado central:

1/ 0,2 mm3= 5 FV= 5 mm3

FT= 100 x 5 mm3= 500 mm3

MÉTODO DE BRECHER-CRONKITE UTILIZANDO UNOPETTE:

EL Unopette es un dispositivo, fabricado por los laboratorios Becton Dikinson, de

material plástico no contactable, que consta de:
  Un capilar calibrado y diseñado de modo de tomar automáticamente la cantidad
necesaria de sangre, viene protegido por una cápsula.
 Un reservorio que contiene el líquido de dilución que es una solución estéril de
oxalato de amonio al 1%.

VENTAJAS DEL UNOPETTE:

 El material es plástico no contactable, evitando así que las plaquetas se adhieran a

superficies activantes. Además es descartable.
 La pipeta se enrasa automáticamente y esto evita errores de cálculos.
 La solución de oxalato de amonio es estéril, lo que suprime uno de los más grandes
errores en el contaje de plaquetas debido a la contaminación de los líquidos, y que
trae como consecuencia confusión de las partículas con bacteria, hongos, etc.

PROCEDIMIENTO:

 Perforar bien el diafragma del reservorio, utilizando la cápsula protectora del

capilar.

 Tomar la muestra de sangre con la pipeta capilar la cual se llenará automáticamente.

Limpiar el exceso exterior teniendo cuidado de no tocar la sangre ya enrasada.
Tapar la parte superior de la pipeta con el dedo índice.

 Presionar suavemente el reservorio, teniendo cuidado de no botar el líquido e

introducir la pipeta con la sangre, manteniéndola tapada con el índice. Este paso
debe hacerse con cuidado a fin de evitar la pérdida de sangre.

 Liberar la presión del reservorio y quitar el dedo de la abertura superior de la pipeta,

la sangre será absorbida por el líquido del recipiente.
  Apretar suavemente el reservorio de 2 a 3 veces a fin de enjuagar la pipeta, teniendo
cuidado de que el líquido no salga fuera del envase.
 Manteniendo el dedo índice sobre la abertura superior de la pipeta, invertir el
reservorio con cuidado varias veces.

 Dejar en reposo por 10 minutos para que se hemolicen los glóbulos rojos.

 Mezclar nuevamente por inversión. Colocar la pipeta capilar hacia fuera, en forma
de gotero.

 Invertir el reservorio y oprimiéndolo suavemente descartar 3 ó 4 gotas, a fin de

enjuagar el capilar.

 Cargar la cámara de Neubauer en ambos retículos y dejar en cámara húmeda

durante 10 a 15 minutos para que las células sedimenten.

 Con el objetivo de 40X enfoque el cuadrado central de cada retículo y proceda a

contar las plaquetas contenidas en los 4 cuadrados de las esquinas y en el cuadrado
central.

CÁLCULOS:

Contaje de plaquetas= Nº de plaquetas contadas x FT

FT= FD x FV

1, 98
FD = = 100
0, 02
FV= 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm= 0,004 mm3;

pero contamos en 5 cuadrados, el volumen es:

0,004 mm3 x 10= 0,04 mm3

Este volumen se corrige a 1 mm3 dividiendo 1 entre el volumen del cuadrado central:

1/0,04 mm3= 25 FV= 25 mm3

FT= 100 x 25 mm3= 2500 mm3

RANGO DE REFERENCIA:

140 – 400 x 109/l

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PRACTICA N°4

TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)

TIEMPO DE QUICK

Este examen evalúa la vía extrínseca de la coagulación (mide los factores V, VII, X,
II). Al agregar tromboplastina tisular y calcio a una muestra de plasma, se produce la
activación de los factores de la coagulación, generación de trombina y formación de un
coagulo de fibrina.

En ella se obvia la activación de los factores de la vía intrínseca para activar al

factor X. Además, como el principio activo de los extractos titulares es un complejo
lipoprotéico, los fosfolípidos del reactivo actúan como sustitutos de los fosfolípidos
plaquetarios, y por lo tanto la prueba no requiere de la acción de las plaquetas.

Selección de la tromboplastina:

Las tromboplastinas son extractos titulares cuyo principio activo es un complejo

lipoprotéico.
 Tienen diferente fuentes de origen: pueden proceder de órganos tales como el
cerebro, placenta pulmón, así como también de diferentes especies: humanas, de conejo,
etc. Además existen diversos métodos para su extracción y conservación: algunas son
extraídas mediante solución salina fisiológica, otras por acetona, unas vienen líquidas y
traen formol como preservativos; otras son liofilizadas

FUNDAMENTO

La prueba se basa en el tiempo que tarda el plasma al recalcificarlo en presencia de

un exceso de tromboplastina tisular.

MATERIALES Y METODOS:

 Baño de María 37ºC

 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidrio siliconizado
 Reactivo de tromboplastina
 Agua destilada
 Plasma del paciente (citratado)
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:

1. Agregar a un tubo 0,1 ml de plasma citratado, incubamos por 1 min en Baño de

María a 37 ºC.
2. Adicionar 0,2 ml de reactivo de tromboplastina-calcio (liofilizado) previamente
incubado a 37 ºC por 2 a 3 min, y activar el cronómetro.
3. Mezclar por 8 seg, sacar e inclinar cada seg el tubo en ángulo de 90º.
4. Al observarse la formación del coágulo detener el cronómetro.
5. Ensayar el mismo procedimiento con el plasma control y realizar la prueba por
duplicado.
 VALORES DE REFERENCIA (CN) = 11-14 seg

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

Se recomienda informar los resultados del paciente en Razón del TP (paciente y

control normal); esta es la forma aceptada universalmente.

TP (pac.) seg
Razón=
TP (cn) seg

VALORES DE REFERENCIA= 0,8-1,2

Ejemplo:

Paciente= 12,9 seg

Control= 12,0 seg

Razón= 12,9 seg = 1,08

12,0seg

Nota:
 El TP puede estar prolongado por deficiencia de uno o varios factores del sistema
extrínseco de la coagulación, generalmente cuando los F V, VII o II están por debajo del 10
% de lo normal, o cuando los niveles de fibrinógeno son inferiores a 100 mg/dl. Estos
factores no influyen del mismo modo en los resultados de la prueba; esta es más sensible a
la deficiencia del F VII y luego a las del F X, V y II, en ese mismo orden.

El tiempo de Quick es la prueba más utilizada para el control de la terapia

anticoagulante con drogas cumarínicas, aunque no evalúe al F IX que es también deprimido
en esos casos.

SISTEMA INR (Razón Internacional Normalizada):

El INR está diseñado para el monitoreo del tratamiento anticoagulante oral, por lo
tanto, los resultados de todos los tiempos de protrombina deberían informarse en segundos,
en Razón del TP y el INR, ya que los laboratorios no siempre conocen el propósito de un
determinado TP.

El INR se utiliza en:

 Terapias anticoagulantes con cumarinas (Warfarina, Dicumarol), se ajusta de

acuerdo al valor del TP; el TP debe resultar de 1,5 a 2 veces por encima del control
normal.
 Prevención del embolismo sistémico en pacientes con prótesis valvulares,
fibrilación auricular y en la prevención de ACV post-infarto.

ISI
INR o RIN= TP (pac.) seg

TP (cn) seg
 ISI (Indice de Sensibilidad Internacional)

APLICACIONES:

 Prueba pre-operatoria
 Prueba de entrada

RECOMENDACIONES:

 Realizar el control con una mezcla de plasma normal.

 La prueba debe realizarse lo más rápido posible una vez obtenida la muestra. En
caso contrario, separar el plasma y congelarlo a 4ºC por más de 2 horas, tiempo
máximo permitido para realizar la prueba y obtener resultados aceptables.

 La prueba debe realizarse siempre por duplicado, comenzando por el control y en

orden balanceado.

 Cuando se trata de controlar pacientes con terapia anticoagulante se debe utilizar

siempre el mismo tipo de tromboplastina con el objeto de definir el límite de
sensibilidad, reproducibilidad.
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PRACTICA N°5

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA, PTTA)

TIEMPO DE CEFALINA

El tiempo de tromboplastina parcial es la prueba de selección para medir el sistema

intrínseco de la coagulación. Se basa en medir el tiempo de coagulación de un plasma al
recalcificarlo en presencia de un sustituto plaquetario: la tromboplastina parcial. Esta se
obtiene de los extractos tisulares de órganos ricos en tromboplastina, como el cerebro. El
principio activo es un complejo lipoprotéico con propiedades coagulantes, las cuales por
extracción de ciertos solventes de las grasas como el cloroformo, se extrae solo la fracción
lipídica y por eso se llama tromboplastina parcial; ella va a realizar en la prueba el mismo
papel de la FP-3; es decir actúa como sustituto plaquetario.

En este examen, un activador como el kaolín, ácido elágico u otro, inicia la vía
intrínseca de la coagulación, al activar los factores de contacto. En presencia de calcio y fl
(tromboplastina parcial), estos factores inician una cascada de reacciones enzimáticas que
culminan en la generación de trombina y formación de un coagulo de fibrina. Mide los
factores XII, XI, IX, VIII de la coagulación.
FUNDAMENTO:

La prueba consiste en medir el tiempo que tarda en coagular un plasma al

recalcificarlo en presencia de tromboplastina parcial (cefalina): sustituto plaquetario y una
sustancia activadora que proporciona una máxima superficie de contacto, obteniéndose
resultados más reproducibles.

MATERIALES Y REACTIVOS:

 Baño de María 37ºC

 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidrio siliconizado
 Reactivo de tromboplastina parcial más activador (kaolín, celita, ácido elágico, etc.)
 Cloruro de calcio (CaCl2)0,025 M
 Plasma del paciente. Plasma pobre en plaquetas (Ppp)
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:

1. Extraer la muestra de sangre nitratada.

2. Centrifugar a 3 500 rpm durante 10 min (Ppp).
3. Precalentar a 37ºC el CaCl2 durante 5 min.
4. Agregar en un tubo 0,1 ml de plasma del paciente, e incubar durante 1 a 2 min, en
baño de María a 37ºC.
5. Adicionar 0,1 ml de reactivo de tromboplastia parcial o cefalina, incubar 2 a 3 min.
6. Agregar 0,1 ml CaCl2 (previamente incubado) y activar el cronómetro.
7. Incubar mezclando por 20 seg, sacar e inclinar el tubo cada seg.
8. Detener el cronómetro en el momento en que se observe la aparición de las primeras
mallas de fibrina.
 9. Ensayar el mismo procedimiento con el plasma control y realizar la prueba por
duplicado.

VALORES DE REFERENCIA (CN)= 25 – 35 seg

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

Se recomienda informar los resultados del PTT del paciente en segundos y la

diferencia entre el control y el paciente.

Diferencia= PTT (pac.) – PTT (cn)

VALORES DE REFERENCIA= ± 6 seg (P-C)

Ejemplo:

Paciente= 29,3 seg

Control= 30,0seg

Diferencia= 29,3seg – 30,0 seg = -0,7 seg

Nota:

Si no hay formación de un coágulo al cabo de 180 seg se detiene el cronómetro y el

resultado se informa como >180 seg (igual que para el PT).
 El tiempo de cefalina, como también suele llamarse, es muy sensible a la deficiencia
de los factores XII, XI, IX, VIII.

También se prolonga ante la presencia de un inhibidor: anticoagulante circulante

(Heparina).

APLICACIONES:

 Prueba pre-operatoria
 Prueba de entrada
 Prueba control de terapia anticoagulante (Heparina).
RECOMENDACIONES:

Asegurarse de tener todo el material necesario a mano antes de comenzar la prueba.

La prueba debe realizarse lo más rápido posible una vez obtenida la muestra. En
caso contrario, separar el plasma y congelarlo a 4ºC por no más de 2 horas, tiempo máximo
permitido para realizar la prueba y obtener resultados aceptables.

La prueba debe realizarse siempre por duplicado, comenzando por el control y en

orden balanceado, es decir, control-paciente, paciente-control.
 UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NÚCLEO DE SUCRE
ESCUELA DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS
LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA II

PRACTICA N°6

TIEMPO DE TROMBINA (TT)

FUNDAMENTO:

La prueba se basa en medir el tiempo requerido para que una solución estándar de
Trombina transforme en fibrina, el fibrinógeno presente en el plasma.

Es una medida de la tasa de transformación del fibrinógeno en un gel insoluble: la

fibrina. A su vez esta transformación depende de la calidad y cantidad de fibrinógeno
presente, ya que como en la reacción se agrega la trombina preformada, se obvian todas las
fases anteriores a la formación de ella.

La reacción también es afectada por la presencia de inhibidores tales como la

heparina y los productos de degradación del fibrinógeno y/o de la fibrina (PDF), ya que
ellos interfieren en la acción de la trombina sobre el fibrinógeno.

La trombina puede ser bovina o humana. Debe diluirse de forma tal que un plasma
normal de un tiempo de coagulación entre 18 y 22 segundos.
 Las soluciones de trombina deben hacerse en material plástico, pues la trombina se
absorbe al vidrio y se inactiva. Todo material que se utilice en la prueba debe colocarse,
lavarse y guardarse aparte, pues puede contaminar el resto del material.

MATERIALES Y REACTIVOS:

 Baño de María 37ºC

 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidrio siliconizado
 Reactivo de Trombina ajustada 18-22 seg
 Buffer salino
 Plasma paciente (citratado)
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:

1. Agregar a un tubo 0,2 ml de plasma citratado, incubamos por 1 min en baño de

María a 37ºC.
2. Adicionar 0,2 ml de reactivo de Trombina, y se activa el cronómetro.
3. mezclar por 8 seg, sacar e inclinar cada seg el tubo, en un ángulo de 90º.
4. Al observar la formación del coagulo, detener el cronómetro.
5. Ensayar el mismo procedimiento con el plasma control y realizar la prueba por
duplicado.

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

Se reportan los resultados en función de la diferencia entre el paciente y el control

normal.
TT= TT(pac) seg – TT(cn)seg

VALORES DE REFERENCIA= ± 2 seg

Nota:

El Tiempo de Trombina prolongado es compatible con una hipofibrinogenemia

congénita o adquirida, un estado fibrinolítico o presencia de un fibrinógeno anormal.
También se observa alargado en presencia de antitrombinas (heparina) y PDF; en
hiperbilirrubineas, hipoalbuminemias y hemólisis inespecíficas.
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LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA II

PRACTICA N°7

MEZCLAS CORRECTIVAS

Al realizar las pruebas coagulación, es indispensable introducir una mezcla de

plasma control más plasma paciente (C/P) preparada volumen a volumen (v/v). Esta mezcla
permite diferenciar si el tiempo de coagulación de una prueba obedece a la deficiencia de
algún factor o a la presencia de inhibidores. Así si el plasma del paciente de un tiempo de
coagulación alargado, y en la mezcla C/P el tiempo de coagulación es normal se deduce que
en el plasma del paciente hay deficiencia de algún factor de la coagulación, que fue
suministrado por el plasma normal. Si por el contrario, la mezcla C/P continua dando
tiempo de coagulación alargado se piensa que se debe a la presencia de inhibidores de la
coagulación en el plasma del paciente.

Las mezclas correctivas deben prepararse en tubos plásticos.

MATERIALES Y REACTIVOS:

 Baño de María 37ºC

 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico
 Plasma del paciente.
  Plasma control
 Reactivos (tromboplastina o tromboplastina parcial + activador). El reactivo a
utilizar va a depender del tiempo de coagulación que resulte alargado.

PROCEDIMENTO:

Las mezclas correctivas se realizan en pacientes con tiempo de coagulación alargados.

1. Se realiza la mezcla de plasma paciente + plasma control v/v, es decir, se toman

50µl de plasma + 50 µl de plasma control.
2. Dependiendo del tiempo que haya resultado alargado se aplica la metodología
anteriormente mencionada.
3. Si se corrige induce a pensar que la alteración inicial se debe a la deficiencia o
ausencia de alguno de los factores de que participan en la cascada de la
coagulación.
4. Si por el contrario en la mezcla C/P no hay corrección, indica la presencia de
inhibidores.

Nota:

Se habla de corrección cuando la mezcla C/P, da un valor que cae dentro de los
rangos referenciales o muy cerca de ellos.
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PRACTICA N°8

DETERMINACIÓN DEL FACTOR XIII

La acción de la trombina sobre el fibrinógeno conduce a la formación de la fibrina

soluble. Este proceso involucra la formación de enlaces de hidrógeno entre los monómeros
de fibrina; los enlaces de hidrógeno son débiles y, como consecuencia, la fibrina es
mecánicamente frágil y se disocia fácilmente en los monómeros que la constituyen, cuando
se pone in vitro, en presencia de inhibidores de enlace de hidrógeno como es la solución de
urea 5M o de ácido monocloroacético a 1%.

El F XIII, una vez que es activado por la trombina transforma la fibrina soluble en
fibrina insoluble en presencia de calcio, mediante la formación de enlaces covalentes entre
los monómeros de fibrina.

La fibrina insoluble proporciona una armazón fuerte y estable que asegura una
hemostasia permanente. In vitro esta fibrina insoluble no se disuelve cuando se coloca en
solución de urea 5M.
FUNDAMENTO:

La prueba se basa en coagular un plasma citratado por adición de cloruro de calcio

(0,025M) y observar su comportamiento frente a una solución de Urea 5M.

MATERIALES Y REACTIVOS:

 Baño de María 37ºC

 Centrífuga
 Cronómetro
 Tubos o pipetas de plástico o vidrio siliconizado
 Solución Urea 5M
 Cloruro de calcio (CaCl2) 0,025 M
 Plasma del paciente.
 Plasma control

PROCEDIMIENTO:

1. Agregar a un tubo 0,3 ml de plasma.

2. Adicionar 0,3 ml de CaCl2 0, 025M.
3. Incubar a 37ºC durante 20-30 min.
4. Agregar 3 ml de Urea 5M, despegando el coagulo de las paredes.
5. dejar durante 24 horas a temperatura ambiente, observar a intervalos.
Si el coagulo permanece, no se solubiliza, significa presencia de factor XIII.

INFORME E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

Si hay disolución del coagulo, total o parcial, significa que hay deficiencia del factor XIII.

En el control normal debe permanecer el coágulo intacto.

Reporte:

Determinación del factor XIII:

Persistencia a las 24 horas (normal).

Ausente a las 24 horas (anormal).

DEFICIENCIA DEL FACTOR XIII:

 Asociado a sangramiento tardío, después de traumas y operaciones.

 Fisiológicamente: disminuye en recién nacidos y durante el embarazo.

APLICACIONES:

Pre-operatorio

Prueba de entrada

Nota:

El método es relativamente insensible: sólo detecta deficiencias muy severas (0,02

unidades por ml o menos). Sin embargo, como se ha reportado en pacientes con niveles de
0,02 a 0,03 unidades por ml, no tiene defectos hemostáticos significativos, la prueba resulta
adecuada como selección para los desórdenes que son clínicamente importantes.