EFECTO DEL ÁCIDO

LISOFOSFATÍDICO Y LA
PROTEÍNA CINASA C ALFA
EN EL DESARROLLO DEL
MEDULOBLASTOMA
ALUMNO: BIOL. PABLO ABERTO PEÑA CASTILLO
Tutora: Dra. Aliesha Araceli González Arenas

Comité tutor
Dra. Selma Eréndira Avendaño Vazquez (INMEGEN)
Dr. Marco Antonio Velasco Velázquez (Fac. Medicina, UNAM)
MEDULOBLASTOMA

BIOQUÍMICAS
CIENCIAS
TUMOR CEREBRAL MALIGNO DE ORIGEN EMBRIONARIO

EN
MÁS FRECUENTE EN INFANTES (20% DEL TOTAL DE

POSGRADO
CÁNCERES DEL SISTEMA NERVIOSO)

TRATAMIENTO: RESECCIÓN QUIRÚRGICA, RADIOTERAPIA

Y QUIMIOTERAPIA

SOBREVIDA DEL 70 - 80 % A 5 AÑOS

5 casos x millón
1 1.8
de personas

M
A
N
PÁGINA 1

U
(Northcott et al., 2019; Kijima y KaNemura, 2016; Brandes et al., 2015).
 CLASIFICACIÓN
HISTOLÓGICA MOLECULAR

Clásico Desmoplásico nodular

Noduladirad extensiva Céluas grandes/anaplásico

M
(Tomada y modificada de Gupta T., et al., 2017) (Tomada y modificada de De Braganca y Millard, 2015)

A
N
PÁGINA 2

U
PROTEÍNA CINASA C (PKC)

BIOQUÍMICAS
Familia de proteínas cinasas específicas de

CIENCIAS
serina/treonina dependientes de calcio y fosfolípidos.

EN
POSGRADO
Tomado y modificado de

M
Sadeghi et al, 2021

A
N
PÁGINA 3
(Carmo et al., 2013; Tarafdar y Michie, 2014; Sadeghi et al., 2021)

U
 BIOQUÍMICAS
PKCα se expresa
en la líneas

CIENCIAS
celulares de MB

EN
POSGRADO
y en biopsias

M
A
N
PÁGINA 4

U
Northcott et al., 2019; Kijima y KaNemura,
(Adesina et al 1998;2016; Brandes et 2022)
Hernández-Rojas, al., 2015).
 El tratamiento prolongado con TPA regula a la
baja la expresión de PKCα en la línea celular
DAOY

PÁGINA 5

(Hernández-Rojas, 2022)
LPA EN TUMORES

BIOQUÍMICAS
CEREBRALES DE
ALTA MALIGNIDAD

CIENCIAS
EN
POSGRADO
El receptor LPA 1 participa
en la translocación nuclear
de PKC α en líneas celulares
de GBM
La inhibición de LPA 1
disminuye el número de
células

M
A
N
PÁGINA 6

U
(Valdés-Rives et al., 2019; Valdés-Rives et al., 2021)
ÁCIDO

BIOQUÍMICAS
LISOFOSFATÍDICO (LPA)

CIENCIAS
LÍPIDO BIOACTIVO,

EN
PERTENECIENTE A LA FAMILIA

POSGRADO
DE LISOFOSFOLÍPIDOS

SEÑALIZACIÓN:

PROLIFERACIÓN, MIGRACIÓN,

DIFERENCIACIÓN CELULAR,

ETC

PRESENTE EN TODOS LOS

TEJIDOS
Suero: 10 μM
Y FLUIDOS CORPORALES Plasma: 0.1 μM

M
A
N
PÁGINA 7

U
(Yung et al., 2015; Willier et al., 2013; Geraldo et al., 2021)
 BIOQUÍMICAS
SEÑALIZACIÓN POR LPA

CIENCIAS
EN
POSGRADO
Modificaciones del Proliferación y sobrevida
citoesqueleto e invasión

Proliferación y regulación
de la apoptosis

(Tomado y modificado de Valdés-Rives y González-Arenas, 2017)

M
(Tomado y modificado de Valdés-Rives et al, 2019)

A
N
PÁGINA 8

U
 BIOQUÍMICAS
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

CIENCIAS
En líneas celulares de meduloblastoma la isoforma α de las PKCs participa en los

EN
POSGRADO
procesos de proliferación e invasión celular.
Se ha observado que la activación de los receptores LPA1 y LPA3 puede inducir la
activación de PKCs que participan en el desarrollo tumoral.

Por lo tanto estudiar el efecto de la activación de los receptores LPA1 y LPA3 sobre
la proliferación de una línea celular derivada de meduloblastoma y su relación con
la isoforma α de PKC, podría dilucidar uno de los mecanismos a través de los cuáles
se desarrolla este tipo de tumor.

M
A
N
PÁGINA 9

U
 BIOQUÍMICAS
HIPÓTESIS

CIENCIAS
EN
POSGRADO
La activación de los receptores para
LPA1 y LPA3 aumentará la proliferación
de una línea celular de meduloblastoma a
través de la activación de PKCα

M
A
N
PÁGINA 10

U
 BIOQUÍMICAS
OBJETIVO GENERAL

CIENCIAS
EN
POSGRADO
Analizar el efecto de la activación de los
los receptores LPA sobre la proliferación de la
1-3

línea celular DAOY, derivada de meduloblastoma, y

su relación con PKCα.

M
A
N
PÁGINA 11

U
OBJETIVOS

BIOQUÍMICAS
PARTICULARES

CIENCIAS
1) Determinar la expresión a nivel del RNA mensajero de LPAR1,

EN
LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5, LPAR6, PRKCA y ENPP2 en pacientes

POSGRADO
con meduloblastoma y en la línea celular DAOY

Uso de la plataforma PeCan St. Jude Cloud: 868

muestras de meduloblastoma para LPAR1 (WNT: 149,
SHH: 201, G3: 220, G4: 298), 392 muestras de
meduloblastoma para LPAR2, LPAR3, LPAR5, LPAR6,
ENPP2 y PRKCA (WNT: 42, SHH: 100, G3: 101, G4:
149).
Uso de la platorfama Xena Browser: Base de datos
TCGA GBM (172 muestras de GBM)
Uso de la plataforma CCLE: Broad Institute & the
Novartis Institutes for Biomedical Research

M
A
N
PÁGINA 12

U
RESULTADOS

BIOQUÍMICAS
Las muestras de pacientes expresan diversos genes

CIENCIAS
relacionados con la señalización por LPA excepto LPAR4

EN
POSGRADO
M
A
N
PÁGINA 13

U
RESULTADOS

BIOQUÍMICAS
CIENCIAS
EN
POSGRADO
La línea Daoy expresa
genes importantes para la
señalización por LPA

M
A
N
PÁGINA 14

U
 OBJETIVOS

BIOQUÍMICAS
PARTICULARES

CIENCIAS
2) Determinar la expresión a nivel de la proteína de los receptores

EN
LPA1-3 , PKCα y ATX

POSGRADO
WESTERN BLOT

DAOY

Transferencia a membranas Incubación Revelado por

Cultivo celular Lisis 70 µg, SDS-PAGE de nitrocelulosa quimioluminiscencia
anti-LPA 1-3
PKCα y ATX

M
A
N
PÁGINA 15

U
RESULTADOS

BIOQUÍMICAS
Los receptores LPA 1-3 se expresan en la línea celular daoy

CIENCIAS
El receptor LPA 2 se expresa significativamente menos

Western Blot representativo de tres experimentos
independientes
EN
POSGRADO
Representación gráfica de tres experimentos independientes. Para la
cuantificación se normalizó el contenido de los receptores con

M
respecto al contenido de tubulina. Los receptores se compararon

A
entre ellos. Anova de una vía. Prueba post hoc Dunnet.

N
PÁGINA 16 *p< 0.05

U
OBJETIVOS PARTICULARES
4) Evaluar el efecto de la activación de los receptores LPA 1-3
en la proliferación celular.

ENSAYO
Sal de
DE MTT LPA (0.01uM-10uM) tetrazolio

Reducción por
dehidrogensas Medición de la absorbancia
Ki16425 (1uM-8uM)
(570-690 nm) en
DAOY espectofotómetro

LPA+Ki16425

Formazano
PÁGINA 17
 BIOQUÍMICAS
RESULTADOS

CIENCIAS
EN
POSGRADO
La línea celular Daoy
presenta una fase
logarítmica de crecimiento
a las 48 hrs cuando se
siembran 1000 x pozo

M
A
N
PÁGINA 18

U
RESULTADOS

BIOQUÍMICAS
CIENCIAS
EN
POSGRADO
El tratamiento de LPA 500 nM
aumenta la viabilidad celular
relativa

Anova de una vía. Prueba post hoc Dunnet.

*p< 0.05 comarado con el control (MEMbco + SFB S/H 10%)

M
A
n= 3

N
PÁGINA 19

U
RESULTADOS

BIOQUÍMICAS
El tratamiento con Ki16425 previo a La línea celular Daoy produce y
la estimulación con LPA reduce la libera LPA al medio extracelular

CIENCIAS
viabilidad celular

EN
POSGRADO
M
A
Anova de una vía. Prueba post hoc Dunnet.
Anova de una vía. Prueba post hoc Dunnet.

N
*p< 0.05 comarado con LPA
PÁGINA 20 *p< 0.05 comarado con LPA
n= 3

U
n= 3
OBJETIVOS PARTICULARES
5) Evaluar si PKCα se transloca al núcleo por efecto de los receptores
LPA 1-3

INMUNOFLUORESCENCIA

Incubación
Microscopia
LPA de fluorescencia
8 mil células x pozo

1 μg/mL
DAOY Ki16425
anti-PKCα

Fijación PFA 4%
Incubación con anticuerpo secundario
Permeabilización Metanol 100%
conjugado con colorante fluorescente
Bloqueo Suero de albumina
bovino 1%
LPA+Ki16425

PÁGINA 21
PÁGINA
22
RESULTADOS

U N A M POSGRADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS

PÁGINA
23
RESULTADOS

U N A M POSGRADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS

 BIOQUÍMICAS
CONCLUSIONES LPAR1, LPAR2, LPAR3, LPAR5, LPAR6, ENPP2 y PRKCA se
expresan en pacientes de MB
PARCIALES

CIENCIAS
Los genes de interés LPAR1, LPAR2, LPAR3, ENPP2 y
PRKCA se expresan de manera diferencial en la línea

EN
POSGRADO
celular DAOY
El tratamiento con LPA (500nM) a tiempos de entre
2-6 hrs aumentan la viabilidad celular de la línea
Daoy
El tratamiento con el antagonista de los receptores
LPA 1-3 previo a la estimulación con LPA inhibe el
aumento en la viabilidad
El estimula con LPA (500nM) provoca la
translocación nuclear de PKC alfa
La línea celular DAOY es capaz de producir LPA

M
A
N
PÁGINA 23

U
 BIOQUÍMICAS
PERSPECTIVAS

CIENCIAS
EN
POSGRADO
Curva Ki16425 + LPA a 4hrs
WB: ATX y PKC alfa
If: Ki16425 y LPA + Ki16425

M
A
N
PÁGINA 24

U
¡MUCHAS GRACIAS!
 BIOQUÍMICAS
ACTIVIDADES
REALIZADAS

CIENCIAS
EN
POSGRADO
Tópico optativo "Biología celular y terapéutica
experimental del cáncer"

M
A
N
PÁGINA 32

U
 BIOQUÍMICAS
CIENCIAS
EN
POSGRADO
Graph Pad Prism 8.0. El análisis de
comparación entre grupos se realizará
utilizando ANOVA de una vía con la prueba
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
post hoc de Tukey, Bonferroni o Dunnet. Se
Y GRÁFICAS
considerará significativo estadísticamente
un valor de p=0.05 o menor.

M
A
N
PÁGINA 29

U
RESULTADOS

BIOQUÍMICAS
Determinación de la expresión génica de LPAR1, LPAR3, ENPP2 y

CIENCIAS
PRKCA en los subgrupos moleculares de MB DAOY: SHH
D283: G3 y G4

EN
POSGRADO
M
A
N
PÁGINA 16

U
 OBJETIVOS PARTICULARES
4) Evaluar el efecto de la activación de los receptores LPA1 y LPA3
en la invasión celular.

ENSAYO DE INVASIVIDAD
LPA (CÁMARA DE BOYDEN)
Microscopio
invertido
Ki16425 1x105
células Incubación
24hrs Fijación con
LPA+Ki16425 PFA 4%

DAOY/D283 Go6976
Cámara de Separación Tinción cristal
Tratamientos
violeta 0.1 %
Boyden de insertos
1 ml de medio
LPA+Go6976.
10 % de SFB

Vehículo
(Agua o DMSO)

PÁGINA 21
 BIOQUÍMICAS
Altas concentraciones de ATX : Carcinoma hepatocelular, cáncer de

CIENCIAS
mama, cáncer de ovario, carcinoma de células renales, linfomas de
LPA Y CÁNCER células B, carcinoma de tiroides, neuroblastoma y glioblastoma

EN
POSGRADO
Receptores para LPA y cáncer:

LPA 1 : Invasión y motilidad celular

LPA 3 : Inducción de la proliferación tumoral,
migración, invasividad y agresividad tumoral

In vitro Atenuación de la
Enzimas Inhibición de los
Inhibición ATX degradantes receptores para proliferación, supervivencia,
migración e invasión
LPA LPA célular (SK-OV-3 y A2058)

M
A
N
PÁGINA 9
(Houben y Moolenaar, 2011; Geraldo et al., 2021; Fukushima et al., 2018; Lin et al., 2010)