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INVESTIGACIÓN | INFORMES
señales mecanosensoriales. Para identificar la función
de este comportamiento adicional, se presentaron anguilas
con presas escondidas debajo de una fina barrera de agar (Fig.
3C). En algunos casos, las anguilas detectaron a sus presas a través de
la barrera y atacó directamente, pero en otros
En algunos casos, la anguila investigó la superficie del agar con un
descarga eléctrica de órganos de baja amplitud y luego
produjo un doblete de alto voltaje. El doblete provocaba
invariablemente el movimiento de la presa. presa estimulada
El movimiento fue seguido de cerca (en 20 a 40 ms).
por un ataque depredador completo que consiste en un fuerte
volea de descarga eléctrica y ataque dirigido
(Fig. 3 y película S5), como se caracteriza en la primera
experimentos. La forma distinta de la descarga.
rastro en estos ensayos consistió en un doblete (o
triplete) seguido de una pausa de 20 a 40 ms (durante
qué presa se movió) y luego una descarga completa
volea (Fig. 3, D y F).
Los resultados del experimento del doblete sugieren
que las anguilas pueden utilizar descargas dobles y triples para
detectar presas crípticas induciendo el movimiento. Para probar
esta hipótesis, se utilizó un pescado deshuesado.
colocado en una bolsa de plástico delgada para aislarlo del
secreción de anguila. El pez aislado eléctricamente fue
colocado debajo de una barrera de agar, con electricidad
cables incrustados en la región de la cabeza y la cola (10)
que permitió la producción de peces artificiales
el experimentador. La contracción artificial del pez se activó de
forma remota a través de un estimulador (Fig. 4A), lo que permitió
controlar su momento y ocurrencia.
Cuando los electrodos estimulantes estaban inactivos, la anguila
los dobletes no provocaron respuesta en el pescado deshuesado
y las anguilas no atacaron la preparación (Fig. 4B
y película T6). Sin embargo, cuando el estimulador estaba
configurado para desencadenar la contracción del pez cuando la
anguila producía un doblete, se replicó el comportamiento
completo de “ataque doblete” de la anguila (Fig. 4C y película S6). El
El patrón de ataque consistía en un doblete, seguido de
una breve pausa, durante la cual la presa se movió (resultante
del estimulador activado), seguida de
una volea de alto voltaje y un golpe. Este experimento clave
demostró que las anguilas nunca (10 de 10 ensayos para
cada una de dos anguilas) siguió un doblete con un ataque
volea sin un “eco mecanosensorial” del
presa, pero atacado en respuesta a la contracción del pez
generada por el estimulador (10 de 10 ensayos para cada uno de
dos anguilas; P < 0,0001, prueba binomial). Espasmos provocados
por el experimentador, en ausencia de caza de anguilas
dobletes, también generó ataques (película S6) con
el curso del tiempo observado anteriormente (Fig. 4D y materiales
complementarios). Así, el movimiento de presas,
ya sea generado por doblete o generado de forma independiente,
provocó ataques de latencia corta (20 a 40 ms). Las anguilas
también parecían utilizar activos o
Electrolocalización pasiva para detectar presas vivas bajo
agar y a menudo atacado sin un doblete anterior. Pero en ningún
caso una volea de ataque siguió a una
doblete en ausencia de respuesta de presa. Por lo tanto, la
Doublet parece responder a la pregunta: "¿Estás
¿presa viva? cuando la información es limitada. Las observaciones
preliminares sugieren que la “caza de dobletes”
Es más común en entornos complejos (películas).
S7). Una serie de controles confirmaron que las anguilas estaban
respondiendo a contracciones mecanosensoriales generadas
señales en este paradigma (Fig. 4 y película S6).
En conjunto, los resultados de estos experimentos muestran
que las descargas de alto voltaje de las anguilas eléctricas
1234 5 DE DICIEMBRE DE 2014 • VOL 346 NÚMERO 6214
motelly activan los eferentes de las neuronas motoras cercanas. 9. GM Westby, Comportamiento. Ecológico. Sociobiol. 22, 341–354 (1988).
animales. Las presas detectadas pueden ser inmovilizadas y 10. Los materiales y métodos están disponibles como complementarios.
materiales en Science Online.
capturadas. Se puede inducir a las presas ocultas a contraerse,
11. AJ Kalmijn, J. Exp. Biol. 55, 371–383 (1971).
revelando su ubicación. El 12. R. Hennig, T. Lømo, Naturaleza 314, 164­166 (1985).
Esta última estrategia, que a menudo desencadena una respuesta 13. KK Pedersen, OB Nielsen, K. Overgaard, Physiol. Reps.
de escape, depende del corto tiempo de reacción de la anguila. 1, e00026 (2013).
14. AJ Cheng, N. Place, JD Bruton, HC Holmberg,
Una anguila puede descargar su tren de alto voltaje en 20 ms
H. Westerblad, J. Physiol. 591, 3739–3748 (2013).
después de un estímulo mecanosensorial, permitiéndole 15. J. Celichowski, K. Grottel, Acta Neurobiol. Exp. (Warsz.) 58,
cancelar la respuesta de escape que ha generado. 47–53 (1998).
En general, este estudio revela que la anguila eléctrica tiene 16. FE Zajac, JL Young, J. Neurofisiol. 43, 1206­1220 (1980).
17. FE Zajac, JL Young, J. Neurofisiol. 43, 1221­1235 (1980).
desarrolló un mecanismo de control remoto preciso para
captura de presas, aquella que se aprovecha del propio sistema EXPRESIONES DE GRATITUD
nervioso de un organismo. Agradezco a E. Catania por sugerir diseños experimentales y
comentarios del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Pradel
REFERENCIAS Y NOTAS Premio de la Academia Nacional de Ciencias, un Guggenheim
1. H. Grundfest, prog. Biofísica. Biop. Química. 1957, 1–85 (1956). Beca y subvención NSF 0844743. Los datos sin procesar están disponibles en
2. S. Finger, M. Piccolino, La impactante historia de los peces eléctricos: los materiales complementarios.
De las épocas antiguas al nacimiento de la neurofisiología moderna
(Oxford Univ. Press, Oxford, 2011), pág. 5. MATERIALES COMPLEMENTARIOS
3. J. Keesey, J. Hist. Neurociencias. 14, 149­164 (2005).
www.sciencemag.org/content/346/6214/1231/suppl/DC1
4. JR Gallant et al., Science 344, 1522­1525 (2014).
Materiales y métodos
5. R. Bauer, Comportamiento. Ecológico. Sociobiol. 4, 311–319 (1979).
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Texto complementario
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6. CW Coates, RT Cox, WA Rosemblith, MB Brown,
Higos. S1 a S4
Zoológica 25, 249 (1940).
Películas T1 a S7
7. S. Hagiwara, T. Szabo, PS Enger, J. Neurofisiol. 28,
775–783 (1965). 4 de septiembre de 2014; aceptado el 13 de noviembre de 2014
8. TH Bullock, Comportamiento cerebral. Evolución. 2, 85­101 (1969). 10.1126/ciencia.1260807
INFLAMACIÓN
Exploración de neutrófilos en busca de activados.
plaquetas para iniciar la inflamación
Vinatha Sreeramkumar,1 José M. Adrover,1 Ivan Ballesteros,2 María Isabel Cuartero,2
Jan Rossaint,3 Izaskun Bilbao,1,4 Maria Nácher,1,5 Christophe Pitaval,1 Irena Radovanovic,1
Yoshinori Fukui,6 Rodger P. McEver,7 Marie­Dominique Filippi,8 Ignacio Lizasoain,2
Jesús Ruiz­Cabello,1,4 Alexander Zarbock,3 María A. Moro,2 Andrés Hidalgo1,9*
Las respuestas inmunes e inflamatorias requieren que los leucocitos migren dentro y a través de
la vasculatura, un proceso que se ve facilitado por su capacidad de cambiar a un estado polarizado
Morfología con una distribución asimétrica de receptores. Informamos que los neutrófilos
La polarización dentro de las vénulas activadas sirvió para organizar un dominio sobresaliente que participaba.
plaquetas activadas presentes en el torrente sanguíneo. El ligando de selectina PSGL­1 transduce señales
que emana de estas interacciones, lo que resulta en la redistribución de receptores que impulsan
migración de neutrófilos. En consecuencia, los neutrófilos son incapaces de polarizar o transducir señales.
a través de PSGL­1 mostró un rastreo aberrante y el bloqueo de este dominio protegió a los ratones
contra la lesión tromboinflamatoria. Estos resultados revelan que los neutrófilos reclutados exploran en busca de
plaquetas activadas, y sugieren que la bipolaridad de los neutrófilos permite la integración de
señales presentes tanto en el endotelio como en la circulación antes de que prosiga la inflamación.
Los eutrófilos son efectores primarios de la respuesta rápido cambio de una morfología simétrica a
inmune contra patógenos invasores. una forma polarizada, en la que las proteínas y los receptores
norte pero también son mediadores centrales de lesiones intracelulares se segregan rápidamente (4). En esto
inflamatorias (1). Ambas funciones dependen de De esta manera, los neutrófilos generan un frente móvil o
su notable capacidad para migrar dentro y a través de vanguardia donde la constante formación de
los vasos sanguíneos. La migración de los lamellipodios (proyecciones de actina) guían el movimiento y
Los neutrófilos se inician al atar y rodar. un urópodo o borde de salida donde se acumulan los receptores
sobre vénulas inflamadas, proceso mediado por selectinas altamente glicosilados (5, 6). Nosotros
endoteliales (2). La activación de las integrinas activada por Consideró poco probable que esta dramática reorganización
selectinas y quimiocinas permite una firmeza sirviera para generar exclusivamente un eje de adelante hacia
adhesión, después de lo cual los leucocitos se arrastran activamente atrás para el movimiento direccional, y
en el endotelio antes de que se extravasen o exploró la posibilidad de que la polarización de los neutrófilos
volver a la circulación (3). Una característica distintiva funcione como un punto de control adicional
de leucocitos reclutados en los vasos inflamados es la durante la inflamación.
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INVESTIGACIÓN | INFORMES

Realizamos imágenes de microscopía intravital (IVM) de
vénulas en músculos cremáster de ratones.
tratado con la citoquina factor de necrosis tumoral –a
(TNF­a), un modelo inflamatorio en el que el
La gran mayoría de los leucocitos reclutados son neutrófilos
(fig. S1). Segundos después de la detención, los leucocitos
formaron un dominio rico en lamellipodios, o
vanguardia y un urópodo enriquecido con CD62L,
que pudimos identificar por su localización opuesta al borde
de ataque y la dirección de la celda
movimiento (película S1 y Fig. 1A) (6–8). Confirmando
informes anteriores, observamos numerosas interacciones de
las plaquetas con el borde anterior de
neutrófilos adherentes [Fig. 1A y fig. S2A (8­10)].
Durante estos experimentos, notamos que el
El urópodo sufrió colisiones continuas con plaquetas
circulantes, una fracción de las cuales estableció
interacciones medibles que generalmente eran transitorias
(Fig. 1B y película S2). Porque las plaquetas
capturado por el urópodo representó una fracción sustancial
IVM, podríamos obtener imágenes tridimensionales (3D)
reconstrucciones de neutrófilos polarizados dentro
vénulas inflamadas de ratones Dock2­GFP (Fig. 1D),
demostrando que los grupos PSGL­1 de hecho
proyectado hacia la luz del vaso en aproximadamente el 40%
de neutrófilos adherentes, mientras que en el 60% restante
de las células, se extendía lateralmente, paralelo
a la superficie endotelial (Fig. 1, D y E, y
película T4). En consecuencia, el espacio luminal
de vénulas inflamadas estaba poblada por múltiples
Grupos que contienen PSGL­1 ubicados adecuadamente para
interactuar con las células circulantes (Fig. 1F y película S5).
La observación de que sólo una pequeña fracción de
plaquetas circulantes que interactúan con
el urópodo nos impulsó a buscar subconjuntos
de plaquetas propensas a este comportamiento. Marcado in
vivo para P­selectina o para integrinas b3 activas
reveló que prácticamente todas las plaquetas que interactúan
con el urópodo fueron activados (P­selectina+ o con
integrinas b3 activas), mientras que una fracción de esas
las plaquetas activadas podrían estar mediando las
interacciones con los grupos de PSGL­1. Análisis de
ratones deficientes en selectina P ( ratones Selp–/–) de hecho
patrones demostrados de interacciones plaquetarias
con los dos subdominios de leucocitos que fueron
similares a los encontrados en ratones que carecen de PSGL­1
(Figura 1B). Estos resultados indicaron que los neutrófilos
reclutados en los vasos inflamados extienden un microdominio
que contiene PSGL­1 hacia la luz del vaso.
que busca plaquetas activadas presentes en el
torrente sanguíneo a través de P­selectina.
Durante el curso de nuestros experimentos IVM,
También notamos alteraciones en el sistema intravascular.
comportamiento de los neutrófilos adherentes en los diferentes
ratones mutantes. La deficiencia de Mac­1 comprometió
gravemente a los neutrófilos que se arrastran sobre las personas inflamadas.
vasculatura (Fig. 2, A y B), un proceso previamente reportado
como mediado por esta integrina
(3). Sorprendentemente, aunque se excluyó PSGL­1
desde el área de contacto con el endotelio

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de todas las interacciones (31%), buscamos enganchar el borde de ataque no lo eran (Fig. 1G y (Fig. 1, D y E), los neutrófilos deficientes en esta glicoproteína

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para el receptor(es) que median estos contactos. Nosotros higos. S2B y S4). Estos hallazgos sugirieron además que la también mostraron reducciones en el desplazamiento y la
razonó que PSGL­1, un ligando de glicoproteína para selectina P presente en la superficie de velocidad del rastreo (Fig. 2, A y B).
P­selectina (11) que se segrega al urópodo de
neutrófilos polarizados (12), podrían ser responsables
para estas interacciones. Análisis de ratones deficientes.
en PSGL­1 (ratones Selplg–/– ) reveló marcadas reducciones
en las interacciones de las plaquetas con el urópodo,
mientras que los que estaban a la vanguardia permanecieron
no afectado (Fig. 1B). En cambio, la deficiencia en el
La integrina b2 Mac­1 (Itgam–/– ) resultó en reducciones tanto
en el urópodo como en el borde de ataque (Fig.
1B). El etiquetado in vivo de Mac­1 y PSGL­1 confirmó estos
datos funcionales, con Mac­1 localizado
en todo el cuerpo celular y PSGL­1 exclusivamente
en el urópodo (Fig. 1C). Específicamente, PSGL­1 se agrupó
en una pequeña región del urópodo, mientras que
CD62L se distribuyó ampliamente en este dominio.
(Figura 1C). Análisis de ratones que expresan un funcional.
Proteína Dock2­GFP (GFP, proteína verde fluorescente), un
factor de intercambio de nucleótidos de guanina de
Rac GTPases (13), reveló colocalización de Dock2
con grupos de PSGL­1 en neutrófilos rastreros
(fig. S3 y película S3), lo que sugiere una dinámica estructural
activa dentro de esta región. Esta observación junto con la
alta frecuencia de plaquetas
Las colisiones con los grupos PSGL­1 sugirieron que
este dominio podría estar sobresaliendo activamente en
la luz del vaso. Usando un disco giratorio de alta velocidad

1
Departamento de Aterotrombosis, Imagenología y Epidemiología,
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC),
2
Madrid, España. Unidad de Investigación Neurovascular,
Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad
Complutense e Instituto de Investigación Hospital 12 de Fig. 1. Los neutrófilos reclutados en las vénulas inflamadas interactúan con las plaquetas activadas mediante
3
Octubre (i+12), Madrid, España. y Departamento de Anestesiología Clústeres de PSGL­1. (A) Micrografías de neutrófilos polarizados que interactúan con plaquetas (rojo; puntas de flecha amarillas) a
Medicina de Cuidados Críticos, Universidad de Münster y Max
4 ciberde través del borde anterior o del urópodo marcado con CD62L (azul). (B) Cuantificación de interacciones plaquetarias totales o específicas
Instituto Planck Münster, Münster, Alemania.
Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Madrid, España.
5
Facultad de dominio en ratones de tipo salvaje o ratones deficientes en P­selectina (Selp–/– ), PSGL­1 (Selplg–/– ),
de Ciencia, Medicina y Salud, Universidad de Wollongong, o Mac­1 (Itgam–/– ); n = 5 a 8 ratones, 38 a 133 interacciones. (C) Distribución del receptor in vivo en polarizados.
Nueva Gales del Sur, Australia. 6
División de Inmunogenética, neutrófilos de tipo salvaje. (D) Ejemplos de proyecciones luminal y lateral de reconstrucciones 3D de polarizadas.
Departamento de Inmunobiología y Neurociencia, Kyushu
7 Neutrófilos Dock2­GFP (ver también película S4). (E) Frecuencia de neutrófilos que extienden los grupos de PSGL­1 hacia
Universidad, Japón. Programa de Investigación en Biología Cardiovascular,
Fundación de Investigación Médica de Oklahoma, Oklahoma City, OK, la luz (Lu), lateralmente (La) o entre el cuerpo celular y el endotelio (En). n = 6 ratones, 251 células. (F)
EE.UU. 8 División de Hematología Experimental y Biología del Cáncer, Reconstrucciones 3D de un vaso inflamado que muestra la distribución de grupos de PSGL­1 (película S5). (GRAMO)
Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati, Universidad de Micrografías representativas de neutrófilos que interactúan con P­selectina+ no activada (flecha) o activada
9 Instituto
Facultad de Medicina de Cincinnati, Cincinnati, OH, EE. UU.
plaquetas (punta de flecha) y cuantificación de las interacciones de cada dominio con P­selectina+ o JON/A+
de Prevención Cardiovascular, Universidad Ludwig­Maximilians,
Munich, Alemania. plaquetas. n = 3 a 4 ratones, 66 a 116 interacciones. Barras de escala de 10 mm. Las barras muestran la media T SEM. *P < 0,05; ***P<
*Autor correspondiente. Correo electrónico: ahidalgo@cnic.es 0,001, análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con prueba post­hoc de Tukey.

CIENCIA sciencemag.org 5 DE DICIEMBRE DE 2014 • VOL 346 NÚMERO 6214 1235

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y estos defectos eran intrínsecos a las células (fig. S5 y

película S6). Para excluir posibles defectos originados
por las contribuciones de PSGL­1 en los primeros pasos
del reclutamiento de leucocitos mediante la unión de la P­
selectina endotelial (14), evitamos la unión de PSGL­1 a
la P­selectina utilizando un anticuerpo bloqueador
inyectado después de que los neutrófilos se hubieran
adherido. . La inhibición en esta etapa no afectó la
adhesión de los leucocitos a las vénulas inflamadas, pero
disminuyó específicamente las interacciones con el
urópodo (fig. S6) y provocó reducciones en la cinética de rastreo (Fig. 2, A y B).
Por lo tanto, especulamos que la participación de PSGL­1
en el urópodo podría promover el arrastre de neutrófilos
polarizados. Para probar esta hipótesis, primero indujimos
un agotamiento transitorio de plaquetas, un tratamiento
que resultó en una supresión virtual del rastreo (Fig. 2, A
y B, y fig. S7A). A continuación, analizamos dos modelos
en los que la polarización o señalización de neutrófilos a
través de PSGL­1 estaba alterada.
En el primer modelo, indujimos la eliminación

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hematopoyética específica del gen que codifica Cdc42

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(fig. S8A), una pequeña Rho­GTPasa necesaria para la
polarización de neutrófilos (15). Confirmando observaciones Fig. 2. PSGL­1 controla la motilidad intravascular y la
in vitro anteriores, los neutrófilos deficientes en Cdc42 no distribución de Mac­1 y CXCR2. (A) Rastros de neutrófilos
pudieron formar un eje de borde de ataque a urópodo y, reptantes dentro de vasos inflamados en ratones de tipo
en cambio, formaron múltiples protuberancias, carecían salvaje no tratados, ratones deficientes en PSGL­1 (Selplg–/– )
de un urópodo distinguible y no lograron formar grupos de o Mac­1 (Itgam–/– ) y ratones con depleción de plaquetas por
PSGL­1 in vivo (fig. S8B). La polarización alterada en suero antiplaquetario o tratados con un anticuerpo bloqueador de PSGL­1. (B) Cuantificación de los desplazamientos de
estos mutantes comprometió las interacciones entre los rastreo y velocidades instantáneas de los neutrófilos en los mismos grupos que (A); n = 50 a 56 células, 4 a 9 ratones. (C)
neutrófilos y las plaquetas circulantes (fig. S8C), y los Pistas de neutrófilos con deleción condicional de Cdc42 o que expresan una forma mutante de PSGL­1 que carece de cola
neutrófilos en estos ratones mostraron una cinética de citoplasmática (PSGL­1DCyt) y (D) cuantificación del desplazamiento por minuto y velocidades instantáneas de neutrófilos
rastreo gravemente alterada (Fig. 2, C y D). En el segundo adheridos. n = 50 a 55 células, 3 a 5 ratones. (E) Micrografías representativas y cuantificación (F) de la distribución in vivo
modelo, analizamos ratones en los que PSGL­1 de CXCR2 y Mac­1 en neutrófilos polarizados de ratones de tipo salvaje y deficientes en PSGL­1; n = 17 a 19 células, 3
normalmente se distribuye en la superficie celular y puede ratones. Barra de escala, 10 mm. Los datos muestran la media T SEM. *P < 0,05; ** P < 0,01; ***P < 0,001; ANOVA con
interactuar con prueba multigrupo de Tukey (B) o prueba t no pareada (F).
P­selectina pero no puede propagar señales de afuera
hacia adentro debido a la ausencia del dominio
citoplasmático [ ratones PSGL­1DCyt (16)]. Aunque la
adhesión de neutrófilos a los vasos estimulados por TNF­
a estuvo parcialmente comprometida en ratones
PSGL­1DCyt debido a reducciones en los niveles
superficiales de PSGL­1, aquellas células que se adhirieron se polarizaron normalmente (fig.
S9A) y mostró marcadas reducciones en la cinética de
rastreo (Fig. 2, C y D) a pesar de los niveles elevados de
Mac­1 en la superficie (fig. S9B). Por tanto, la polarización
de un PSGL­1 competente en señalización impulsa la
migración intravascular de neutrófilos.
Para buscar posibles mecanismos mediante los cuales
las señales derivadas de PSGL­1 promovieron el rastreo,
analizamos la distribución in vivo de Mac­1 y el receptor
de quimiocina CXCR2, dos receptores necesarios para la
migración intravascular de neutrófilos (3, 17). En las
células de tipo salvaje, Mac­1 se distribuyó
homogéneamente por todo el cuerpo celular, mientras que
CXCR2 se localizó preferentemente en el borde anterior
(Fig. 2E y película S7). Los neutrófilos deficientes en Fig. 3. PSGL­1 en el urópodo se convierte en un sitio de acoplamiento preferido para las plaquetas durante la inflamación
PSGL­1 exhibieron una mala localización de ambos patológica. (A) Curvas de supervivencia de ratones Balb/c tratados con lipopolisacárido (LPS) solo o LPS más anti­MHC­I
receptores (Fig. 2E, fig. S10 y película S8). Estas (MHC, complejo mayor de histocompatibilidad) para inducir ALI. Los neutrófilos se agotaron con anti­Ly6G y las plaquetas
alteraciones fueron aún más dramáticas en ratones de con suero antiplaquetario antes de la inducción de ALI; n = 5 a 20 ratones. (B) (Izquierda)
tipo salvaje tras el agotamiento de plaquetas (figs. S7B y Micrografías representativas de vénulas inflamadas durante ALI. Los asteriscos indican plaquetas que interactúan con el
S10 y película S9), lo que concordó con la supresión del urópodo de los neutrófilos. (Derecha) Cuantificación de las interacciones plaquetarias con el borde de ataque o urópodo en
rastreo en estos ratones (Fig. 2A). La ausencia o inhibición control (solo LPS) y ratones inducidos por ALI. Barra de escala, 10 mm. n = 3 a 4 ratones, 32 a 73 interacciones.
de PSGL­1 en ratones con deficiencia de Mac­1 no condujo (C) Frecuencia de interacciones con el borde de ataque o urópodo en ratones tratados con TNF­a o inducidos por ALI, y
a mayores reducciones en las interacciones plaquetarias distribución de interacciones en ratones de tipo salvaje y ratones deficientes en PSGL­1 (Selplg–/– ) o Mac­1 (Itgam–/– ); n
o en la cinética de rastreo (fig. S11), lo que indica que = 3 a 5 ratones, 23 a 137 interacciones. (D) Frecuencia de interacciones con el borde de ataque o urópodo durante la sepsis
estos receptores funcionan a lo largo de la misma vía y en ratones de tipo salvaje y ratones deficientes en PSGL­1 o Mac­1. n = 3 a 4 ratones, 32 a 56 interacciones. Las barras
muestran la media T SEM. *P < 0,05; ***P < 0,001 según lo determinado por ANOVA con la prueba multigrupo de Tukey.

1236 5 DE DICIEMBRE DE 2014 • VOL 346 NÚMERO 6214 sciencemag.org CIENCIA

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Fig. 4. Mediada por PSGL­1
interacciones desencadenan vascular
lesión. (A) Curvas de supervivencia de
Ratones Balb/c tratados con LPS
solo o LPS más anti­MHC­I
para inducir ALI. La ausencia de
Mac­1 o inhibición de PSGL­1
protege de la muerte; norte = 5 a
19 ratones. (B) Representante
cortes axiales del tórax de
Ratones Balb/c en diferentes momentos.
después de la inducción de ALI. El
señal blanca en el pulmón
el espacio identifica edema,
que se cuantifica en (C); norte = 7
a 8 ratones por grupo. (D)
Cuantificación de la lesión hepática.
como niveles de AST y ALT
transaminasas en plasma de
el grupo de ratones indicado
24 horas después del tratamiento con
LPS; n = 7 a 11 ratones. (MI)
Secciones cerebrales representativas.
de ratones de tipo salvaje 24 horas
después de inducir isquemia,
mostrando vasos en aumento
magnificaciones y neutrófilos
intravasculares (Ly6G,
verde)–plaquetas (CD41, rojo)
agregados. Barras de escala de 10 mm. (F) Porcentajes de hemisferios infartados 24 horas después de la oclusión arterial en ratones control de tipo salvaje, ratones deficientes en Mac­1 (Itgam–/– ),
y ratones de tipo salvaje después de bloquear PSGL­1. Las imágenes son secciones representativas del cerebro teñidas con TTC y muestran el grado de isquemia como áreas blancas con un borde rojo.
describir; n = 5 a 8 ratones. Las barras muestran la media T SEM. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ANOVA con la prueba multigrupo de Tukey.
que mediadores adicionales derivados de plaquetas y
Los receptores de neutrófilos desconocidos que median las
interacciones entre plaquetas pueden regular el rastreo. Por lo
tanto, la distribución intacta y la señalización a través de PSGL­1
en el urópodo regula el rastreo de neutrófilos, en
al menos en parte orquestando la distribución adecuada de
receptores adhesivos y quimiotácticos.
A continuación exploramos cómo este fenómeno podría
Contribuir a la inflamación patógena. Nosotros usamos
un modelo de lesión pulmonar aguda (ALI) en ratones Balb/c
que simula estrechamente la ALI relacionada con transfusiones
(18). En este modelo, la eliminación transitoria de
Los neutrófilos o plaquetas protegen de la muerte.
[Higo. 3A y (19)], lo que indica que esto podría ser
un modelo apropiado para estudiar el funcionamiento
asociación entre estas células. Análisis intravitales de los
microvasos cremaster en pacientes inducidos por ALI
Los ratones confirmaron los hallazgos en la cinética de rastreo.
distribución del receptor y proyecciones luminal o lateral
realizadas con TNF­a (fig. S12 y película
S10) y reveló además que durante ALI, el
urópodo se convierte en el dominio predominante para
interacciones plaquetarias, que contrastaron con las
uso preferido del borde de ataque en el modelo no patógeno
inducido por TNF­a (Fig. 3, B
y C). Interacciones en el urópodo durante ALI.
fueron mediados por PSGL­1, mientras que las interacciones
mediadas por Mac­1 con ambos dominios (Fig. 3C
y fig. S13). Obtuvimos respuestas similares en
un modelo de endotoxemia (Fig. 3D), que indica que
durante la inflamación patológica, el urópodo
se convierte en el dominio de interacción dominante para
plaquetas circulantes.
CIENCIA sciencemag.org
Para probar si el compromiso de PSGL­1 en
el urópodo estaba causalmente relacionado con la inflamación
vascular mediada por neutrófilos, exploramos
su contribución en el modelo de ALI. intravital
Las imágenes de la microcirculación pulmonar revelaron un
rápido aumento de plaquetas capturadas por
reclutaron neutrófilos que fueron fuertemente inhibidos al
bloquear PSGL­1 (fig. S14). Además,
deficiencia en PSGL­1 o Mac­1, o inhibición de
PSGL­1, resultó en una protección moderada contra
Muerte inducida por ALI (Fig. 4A y fig. S15A). El
El uso de tomografía computarizada para rastrear el edema
pulmonar a lo largo del tiempo reveló una protección parcial
contra ALI en ratones deficientes en Mac­1 y
protección casi completa cuando se bloquearon las interacciones
de PSGL­1 (Fig. 4, B y C). Este
protección correlacionada con reducción de neutrófilos
se infiltra en el pulmón (fig. S16) y sugiere
que las interacciones en el urópodo contribuyen de manera
crítica a la lesión vascular. Deficiencia en cualquiera de los dos
receptor o la inhibición de PSGL­1 también impidió
daño hepático durante la endotoxemia (Fig. 4D
y fig. S15B). Consistente con informes anteriores
(20, 21), detectamos elevaciones en el plasma
niveles de trampas extracelulares derivadas de neutrófilos
(NET) durante ALI y sepsis. Estas elevaciones
fueron completamente embotados cuando las plaquetas fueron
agotado, bloqueando PSGL­1, o en ausencia
de Mac­1 (fig. S17), lo que sugiere que otras formas
La activación de los neutrófilos puede desencadenarse
Interacciones plaquetarias a través de PSGL­1.
Finalmente, examinamos si la respuesta mediada por PSGL­1
interacciones también subyacen a la lesión isquémica, una
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forma frecuente de enfermedad vascular (22). Usamos un
Modelo de accidente cerebrovascular desencadenado por la
oclusión permanente de la arteria cerebral media, en el que el
agotamiento de los neutrófilos reduce significativamente la muerte del tejido.
medido por el porcentaje de hemisferio infartado [fig. S18 y
(23))] Interacciones entre
Los neutrófilos y las plaquetas dentro de la microvasculatura de
los cerebros infartados fueron inhibidos por
bloqueando PSGL­1 (Fig. 4E y fig. S19), y esto
correlacionado con reducciones significativas en el infarto
volúmenes cuando PSGL­1 fue inhibido o en el
ausencia de Mac­1 (Fig. 4F).
Hemos descubierto un punto de control crítico durante las
primeras etapas de la inflamación: los neutrófilos.
reclutados para buques lesionados extienden un dominio en
la luz, donde los grupos de PSGL­1 escanean en busca de
Presencia de plaquetas activadas. Sólo cuando se producen
interacciones productivas los neutrófilos organizan receptores
adicionales necesarios para la comunicación intravascular.
migración o generación de NET e inflamación
sobreviene (fig. S20 y película S11). Nuestros hallazgos
revelan que la reorganización dinámica de los dominios y
receptores de los neutrófilos permite interacciones simultáneas
tanto con la pared vascular
y plaquetas activadas en la circulación para proporcionar un
mecanismo regulador rápido y eficiente.
temprano durante la inflamación.
REFERENCIAS Y NOTAS
1. M. Phillipson, P. Kubes, Nat. Medicina. 17, 1381­1390 (2011).
2. K. Ley, C. Laudanna, MI Cybulsky, S. Nourshargh, Nat. Rdo.
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5 DE DICIEMBRE DE 2014 • VOL 346 NÚMERO 6214 1237
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INVESTIGACIÓN | INFORMES
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7. Para obtener más detalles sobre este y otros procedimientos, consulte la
sección Materiales y métodos en Materiales complementarios.
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11, 264–274 (2011).
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11. KL Moore y col., J. Cell Biol. 128, 661–671 (1995).
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4, 219–222 (2007).
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14. A. Zarbock, K. Ley, RP McEver, A. Hidalgo, Blood 118, 6743–
6751 (2011).
15. K. Szczur, Y. Zheng, MD Filippi, Sangre 114, 4527–4537
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16. JJ Miner et al., Blood 112, 2035–2045 (2008).
17. B. McDonald y otros, Science 330, 362–366 (2010).
TRANSCRIPCIÓN
La descondensación de la cromatina
es suficiente para alterar la
organización nuclear en células madre embrionarias
Pierre Therizols, Robert S. Illingworth, Celine Courilleau, Shelagh Boyle, Andrew J. Wood,
Wendy A. Bickmore*
Durante la diferenciación, miles de genes se reposicionan hacia o lejos de la envoltura nuclear. Estos
movimientos se correlacionan con cambios en el tiempo de transcripción y replicación. Utilizando factores de
transcripción sintéticos (TALE), encontramos que la activación transcripcional de genes endógenos
mediante un transactivador viral es suficiente para inducir el reposicionamiento de genes hacia el interior
nuclear en células madre embrionarias. Sin embargo, la reubicación de genes también fue inducida por el
reclutamiento de un péptido ácido que descondensa la cromatina sin afectar la transcripción, lo que indica que la
reorganización nuclear está impulsada por la remodelación de la cromatina en lugar de la transcripción.
Identificamos una herencia epigenética de descondensación de cromatina que mantuvo el posicionamiento nuclear
central a través de la mitosis incluso después de que se perdió el factor de transcripción TALE. Nuestros
resultados también demuestran que la activación transcripcional, pero no la descondensación de la cromatina, es
suficiente para cambiar el tiempo de replicación.
La organización nuclear radial del genoma se
conserva en los eucariotas (1), con una
R acumulación de heterocromatina, dominios de
cromatina pobres en genes y de replicación
tardía que se encuentran cerca de la envoltura
nuclear (2). Los dominios asociados a láminas (LAD)
son pobres en genes, muestran niveles bajos de
transcripción y están agotados para las marcas de
histonas activas (3). La unión artificial a la envoltura
nuclear ha demostrado que un entorno nuclear periférico
es suficiente para inducir una regulación negativa
transcripcional tanto de los genes informadores como
de algunos genes endógenos en las células somáticas
(4, 5), y durante la diferenciación muchos genes
cambian su asociación con los componentes. de la lámina nuclear,
durantea la
menudo
diferenciación de ESC a NPC (6) y, al mismo
Unidad de Genética Humana del MRC, Instituto de Genética y
Medicina Molecular, Universidad de Edimburgo, Crewe Road,
Edimburgo EH4 2XU, Reino Unido.
*Autor correspondiente. Correo electrónico: wendy.bickmore@igmm.ed.ac.uk
1238 5 DE DICIEMBRE DE 2014 • VOL 346 NÚMERO 6214
18. MR Looney, BM Gilliss, MA Matthay, Curr. Opinión. Hematol.
17, 418–423 (2010).
19. MR Looney y otros, J. Clin. Invertir. 119, 3450–3461 (2009).
20. A. Caudrillier y otros, J. Clin. Invertir. 122, 2661–2671 (2012).
21. SR Clark y otros, Nat. Medicina. 13, 463–469 (2007).
22. GA Donnan, M. Fisher, M. Macleod, SM Davis, Lancet 371,
1612­1623 (2008).
23. MI Cuartero et al., Stroke 44, 3498–3508 (2013).
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a G. Crainiciuc, JA Quintana, I. Ortega y A. Santos por el apoyo
técnico y a D. Sancho y S. González por sus valiosos comentarios. Los
datos presentados en este manuscrito se pueden encontrar en el artículo
principal y en los materiales complementarios. Este estudio fue
financiado por las subvenciones NIH HL03463, HL085607 (RPM) y
HL090676 (M.­DF); La Fundación Alemana de Investigación concede
las subvenciones ZA428/8­1, ZA428/6­1 y SFB 1009­TP A05 (AZ); FP7
Marie Curie (ITN­264864; p­net) y S2010/BMD­2326 de la Comunidad de
Madrid (JR­C.); Subvenciones para la investigación científica de la
Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (YF); CSD2010­00045
y SAF2012­33216 del Ministerio de Economía y Competitividad
(MINECO) y S2010/BMD­2336 del
con expresión genética alterada (6). Sin embargo, estas
correlaciones no determinan si la relocalización relativa
a la periferia nuclear es una causa o una consecuencia
de la regulación genética durante la diferenciación.
Dos tercios de los genes que pierden la asociación
con la lámina B1 durante la diferenciación de células
madre embrionarias (ESC) en células precursoras
neurales (NPC) están regulados transcripcionalmente.
Es más probable que los demás se activen fuertemente
más adelante en la diferenciación (6). Ptn, Sox6 y Nrp1
son tres genes que están regulados positivamente
durante la diferenciación de ESC (7); exhiben algunas
de las mayores pérdidas de asociación de la lámina B1
correlacionada
P = 5,3 × 10−14; tSox6­VP64, P = 6,4 × 10−12) o a
tiempo, Ptn pierde su posición nuclear periférica (8). construcciones que carecen del dominio de activación
La expresión de Ptn y Nrp1 comienza a aumentar a (tPtn­ D, P = 3 × 10−6 ; tNrp1­D, P = 8,1 × 10−10; tSox6­
medida que las ESC se diferencian en células madre de epiblasto
D, P =(EpiSC).
8 × 10−12)
(Figura 1B). Aunque no hay datos sobre LAD en EpiSC,
la hibridación fluorescente in situ
Comunidad de Madrid (MAM); y una beca Ramón y Cajal (RYC­2007­00697),
SAF2009­11037 y 2012­31142 del MINECO, S2010/BMD­2314 de
la Comunidad de Madrid y 246655 del FP7­People­IRG Program (AH).
El CNIC cuenta con el apoyo del MINECO y la Fundación Pro­CNIC.
RPM es cofundador de Selexys Pharmaceuticals, que está desarrollando
anticuerpos monoclonales contra PSGL­1 y P­selectina para tratar
Enfermedades inflamatorias y trombóticas. Se ha presentado una
solicitud de patente para el bloqueo del PSGL­1 en la tromboinflamación.
presentada por VS y AH (EP14382425.8). Los autores declaran no tener
otros conflictos de intereses.
MATERIALES COMPLEMENTARIOS
www.sciencemag.org/content/346/6214/1234/suppl/DC1 Materiales
y métodos
Higos. S1 a S20
Tablas S1 y S2
Referencias (24 a 29)
Películas T1 a T11
27 de mayo de 2014; aceptado el 7 de noviembre de
2014 10.1126/science.1256478
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(FISH) mostraron que los loci Ptn, Sox6 y Nrp1 se
reubican lejos de la periferia nuclear y hacia posiciones
nucleares más centrales, correlacionados con sus
cambios de expresión, durante la diferenciación de
ESC a EpiSC o NPC (P <0,01; Fig. 2B y Fig. S1).
Para abordar directamente el papel de la transcripción
en la reorganización nuclear, activamos ectópicamente
Ptn, Sox6 o Nrp1 en ESC mediante factores de
transcripción sintéticos compuestos de dominios de
unión al ADN TALE (efector similar al activador de la
transcripción) con especificidad para los respectivos
promotores de genes. (9) fusionado a VP64, un
tetrámero del activador transcripcional ácido VP16 (10, 11) (Fig.
1A). Cuando se transfectó en ESC, tPtn­VP64 indujo la
expresión de su objetivo en un factor de> 30 a 90 (Fig.
1, B y C). Aparte de Ptn, sólo dos genes adicionales
(Il33 y Nnmt) estaban regulados significativamente, y
los genes implicados en la pluripotencia o diferenciación
de las ESC no cambiaron significativamente. Esto
sugiere que la regulación positiva de Ptn no es solo una
consecuencia indirecta de la diferenciación provocada
por la transfección o la expresión inespecífica de un
activador ácido (Fig. 1C y Fig. S2). La activación
específica de Nrp1 o Sox6 en células transfectadas por
tNrp1­VP64 o tSox6­VP64, respectivamente, tampoco
mostró ninguna firma de expresión de diferenciación
(Fig. 1B).
Los plásmidos de control que carecen del dominio
VP64 (tPtn­D, tSox6­D y tNrp1­D) casi no tuvieron
ningún efecto (Fig. 1, B y C). Además, no detectamos
ningún cambio en la expresión de genes vecinos a
aquellos a los que se dirigen los TALE (Fig. 1C y fig.
S3).
Además de activar Ptn, Nrp1 o Sox6, FISH demostró
que tPtn­VP64, tNrp1­VP64 y tSox6­VP64 causaron
una relocalización específica de los loci objetivo hacia
el centro de los núcleos ESC, en relación con el control
[proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). )]
transfección (tPtn­VP64, P = 4,6 × 10−9 ; tNrp1­VP64,
(Figura 2, A y B). El alcance de esta relocalización fue
similar al observado en condiciones normales.
sciencemag.org CIENCIA
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Exploración de neutrófilos en busca de plaquetas activadas para iniciar la inflamación

Vinatha Sreeramkumar, José M. Adrover, Ivan Ballesteros, María
Isabel Cuartero, Jan Rossaint, Izaskun Bilbao, Maria Nácher, Christophe
Pitaval, Irena Radovanovic, Yoshinori Fukui, Rodger P.
McEver, Marie­Dominique Filippi, Ignacio Lizasoain, Jesús Ruiz­Cabello,
Alexander Zarbock, María A. Moro y Andrés
Hidalgo (4 de diciembre de 2014)
Medicina traslacional científica 346 (6214), 1234­1238. [doi:
10.1126/ciencia.1256478]

Resumen del editor

Una colaboración de dos células para la inflamación.

Las células inmunes llamadas neutrófilos son las primeras en responder a la infección. Los neutrófilos se mueven dentro y
a través de los vasos sanguíneos para llegar rápidamente a los sitios de infección. Sreeramkumar et al. encontré ese ratón
Los neutrófilos dependen de las plaquetas para ayudar a encontrar dichos sitios. Los neutrófilos extendieron protuberancias hacia los vasos sanguíneos.

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Cuando estas protuberancias entraron en contacto con las plaquetas, los neutrófilos migraron al tejido circundante para llevar a cabo
sus funciones inflamatorias. Prevenir estas interacciones entre neutrófilos y plaquetas
alivió el daño inflamatorio colateral a los tejidos en varios modelos de lesiones en ratones.

Ciencia, este número p. 1234

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