Taller

Principios de Métodos Cromatográficos

Análisis Instrumental Avanzado
Programa de Bioquímica- Facultad de Ciencias

1. En una columna tubular abierta de paredes recubiertas, de 1000 cm de longitud
y 0.25 mm de diámetro, el gas portador (helio) circula a una velocidad de 37
cm/s. El tiempo de retención, tR, para el decano es de 1.27 min, y la anchura a
media altura del pico es de 0.88 s. Calcular el factor de capacidad para el decano,
el número de platos efectivos de la columna y la altura de plato.

2. En una columna de 122 cm de longitud y a una temperatura de 160 ºC se
obtuvieron los siguientes tiempos de retención en minutos: pico del aire (tM)
0.90, heptano 1.22 y octano 1.43. El ancho en la base de los picos fue de 0.14 min
para el heptano y de 0.20 min para el octano.
a) Calcular la resolución para estos picos.
b) ¿Qué longitud debería tener la columna para obtener una resolución de
1.5?

3. Considerando una columna con una altura de plato de 1.5 mm y con número de
platos de 333, por la que fluye el gas portador a un caudal de 3 mL/min, y
sabiendo que el volumen muerto es de 1.0 mL:
a) ¿Cuáles son el tiempo de retención y el volumen de retención cuando k es
1, 2 ,5 y 10?
b) ¿Cuál sería la anchura en la base de los picos a cada uno de los valores
anteriores de k?

4. Calcular a) el factor de capacidad o de retención k, y b) la resolución Rs, de los
siguientes analitos en un sistema cromatográfico por HPLC, con los datos que
figuran en la siguiente tabla: min (Dato adicional to= 1.12).

Analito tR (min) W (s)
propoxur 1.72 29
Carbaryl 5.52 39
1-naftol 7.34 30
methiocarb 7.70 65

c) Indicar si los picos cromatográficos de los componentes de la muestra están
bien resueltos;
d) calcular el número de platos teóricos efectivos para el 1-naftol.

5. En un cromatograma, los tiempos de retención de los picos A, B y C, donde A es
una sustancia no retenida, son 0.84, 10.60 y 11.08 minutos, respectivamente.
 a) Calcular los tiempos de retención corregidos y los factores de capacidad
para B y C.
b) Sabiendo que los anchos de banda en la base para B y C son 1.21 y 2.10
segundos respectivamente, calcular la resolución entre estos dos picos.

6. En una columna de 10 cm de longitud, se lleva a cabo la separación
cromatográfica de dos sustancias A y B, obteniéndose factores de capacidad de
0.8 y 1.0 respectivamente.
a) Si se considera una resolución de 1 para ambos picos, calcular la altura
equivalente de plato teórico.
b) Si el tiempo de retención de la sustancia no retenida es de un minuto,
calcular los anchos de banda en la base de los analitos A y B.

7. La siguiente tabla muestra los datos de la curva de calibración por el método de
estándar interno para calcular la concentración del compuesto A en una muestra
determinada

Estándar A (mg/L) Área de A (u.a.). EI (mg/L) Área EI (u.a.)
1 0.100 11830 0.100 13320
2 0.200 25532 0.100 12320
3 0.300 37950 0.100 12575
4 0.400 54001 0.100 13301
5 0.500 65987 0.100 12820

a) Realizar el método de mínimos cuadrados y establecer la ecuación de la
recta. Plantear la ecuación para poder calcular la concentración de A en
la muestra problema, la cual fue medida por triplicado adicionándosele
0.1000 mg/L del estándar interno a cada una de las alícuotas y
obteniéndose los siguientes datos:

Muestra Área de A (u.a.) Área EI (u.a.)
1 31010 11201
2 31315 11500
3 31240 11425

b) Calcular la concentración de A en mg/L y la precisión de éstos datos
calculando su límite de confianza.

8. En una columna tubular abierta de paredes recubiertas de 15 m de longitud y
0.25 mm de diámetro interno, el gas portador circula a un caudal de 3 ml/min.
Sabiendo que los tiempos de retención para el heptanoato de metilo y para el
 octanoato de metilo son de 60 y 89 s respectivamente, y que el número de platos
teóricos de la columna es de 3000, calcular:
a) El tiempo muerto (suponer despreciable el espesor de la fase
estacionaria)
b) El factor de capacidad o de retención
c) La anchura en la base de cada compuesto
d) La resolución entre picos e indicar si están resueltos hasta línea base

9. Se obtuvieron los siguientes datos por cromatografía de gases en una columna
empaquetada de 40 cm de longitud

Calcular:
a) La resolución para los pares metilciclohexano-metilciclohexeno y
metilciclohexeno-tolueno. Indicar si los picos están resueltos.
b) Reto: Si se utiliza el metilciclohexeno como patrón interno en una
concentración de 1 mg/L y en un cromatograma de una muestra se
obtienen áreas de 2323 para el metilciclohexano y de 3123 para el
tolueno ¿Cuál será la concentración de estas sustancias en dicha muestra?

10. Los datos de la tabla se obtuvieron a partir de un cromatograma de una muestra
con tres componentes

Con estos datos, sabiendo que el caudal de fase móvil fue de 1.0 mL/min y
teniendo en cuenta que el cromatograma no es ideal, calcular:
 a) Volumen muerto de la columna y factor de capacidad de A. ¿Qué indica el
resultado obtenido?
b) Ancho en la base de los picos.
c) Resolución entre los picos de Ay B y entre los picos de B y C.
d) Qué eficacia mínima se requiere para que un cuarto componente, D, con
tiempo de retención de 4.5 min salga resuelto, al menos aceptablemente
de B (Rs=1).

11. a) Sabiendo que, a un caudal de 1 mL/min, el pico cromatográfico de la
serotonina presenta un tiempo de retención de 4.2 min y una anchura a media
altura de 30 s, calcule el factor de capacidad, el número de platos y la altura
equivalente de plato teórico para una columna de 10 cm de longitud y 1.8 mL de
volumen muerto.
b) Para medir serotonina (5-hidroxitriptamina) por el método del patrón
interno, a una alícuota de 1.0 mL de una disolución de concentración
desconocida se le añade 1 mL de una disolución que contiene 30 ng de N-metil-
serotonina (patrón interno). Esta mezcla se trata adecuadamente para eliminar
interferencias y se inyectan 10 mL de la muestra, obteniéndose un área de
2573832 para la serotonina y de 1719818 para la N-metilserotonina. Cuando se
inyectó un volumen equivalente de una mezcla que contenía 5 ng de serotonina
y 5 ng de N-metil-serotonina se obtuvieron áreas de 30885982 y 30956727
respectivamente. Calcular la cantidad de serotonina en ng en la muestra original.

12. En un laboratorio de control de calidad se quiere poner a punto un método de
análisis por HPLC en fase inversa de una mezcla de dos compuestos A y B. Se
sabe que, en columna de octadecil sílice de 25 cm de longitud y utilizando una
fase móvil de metanol-agua, los tiempos de retención son 6.25 y 7.10 min
respectivamente, el tiempo muerto es 1.4 min y la resolución es 1.05.
a) ¿Cuál debe ser la longitud de la columna para conseguir una resolución
de 1.5?
b) Calcular los factores de retención de A y B. ¿Serán diferentes en la nueva
columna?
c) A partir de la siguiente tabla calcular la concentración de A y B en la
muestra.