Natural Killer Cells - Compressed Comprimido (201 372)

Machine Translated by Google
188 Srinivas S. Somanchi y Dean A. Lee
100 100
80 80
60 60
específica
lisis
de
% específica
lisis
de
%
40 40
20 20
K562 A375
0 0
10 5 2.5 1,25 0,625 0,3125 10 5 2.5 1,25 0,625 0,3125
Relación E:T Relación E:T
100 100
80 80
60 60
específica
lisis
de
% específica
lisis
de
%
40 40
20 20
IMR32 CHP134
0 0
10 5 2.5 1,25 0,625 0,3125 10 5 2.5 1,25 0,625 0,3125
Relación E:T Relación E:T
Fig. 3 Análisis de la citotoxicidad de las células NK mediante el ensayo de liberación de calceína. Las células NK expandidas son
altamente citotóxicas contra diversos objetivos tumorales. Los datos muestran el potencial citotóxico de las células NK humanas
expandidas contra: K562 (línea celular de leucemia mieloide crónica), A375 (melanoma maligno), IMR32 y CHP134 (neuroblastoma),
determinado mediante el ensayo de liberación de calceína. Reproducido parcialmente (datos de A375 y CHP134) de PloSOne
“Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012) La IL-21 unida a la membrana promueve la proliferación ex vivo sostenida
de células asesinas naturales humanas. PLoS One 7: e30264”
1. Teñir K562 y la(s) línea(s) celular(es) tumoral(es) elegida(s) con Calcein AM: contar y
transferir 2 × 10 6 células objetivo a5un tubo cónico de 15 ml y girar a 400 g durante
min.
2. Vuelva a suspender los sedimentos celulares a 1 × 10 6 células/mL de medio de cultivo

completo.
3. Agregue 3 ÿL/mL de calceína madre (1 mg/mL) para una dilución de 333 veces (esto
está optimizado para K562, para otras líneas de células tumorales titule Calcein AM
entre 250 y 500 veces para obtener resultados óptimos).
4. Incube durante 30 min a 37 °C en una incubadora de CO 2 y agite
células cada 10 min para promover la tinción uniforme.

Expansión de células NK usando K562 mbIL21 189
5. Lavar las células con 10 ml de medio completo RPMI para eliminar

exceso de Calceína AM, centrifugar a 400 g durante 5 min.
6. Repita el paso de lavado dos veces más.
7. Vuelva a suspender las células diana marcadas con calceína en 10 ml de RPMI com
Complete el medio y transfiéralo a un tubo de 50 ml.
8. Realice el recuento de células y agregue medio completo RPMI para ajustar la

densidad celular a 1 × 10 5 células/mL.
9. Contar y resuspender las células NK a 1 × 10 6/mL en medio completo RPMI ( ver

Nota 19 ).
10. En una placa de 96 pocillos con fondo en “U”, sembrar 200 ÿL de células NK por
pocillo por triplicado por línea celular objetivo (condición) utilizada en el ensayo.
11. Agregue 100 ÿL de medio completo RPMI a las 5 columnas adyacentes

umnas de pozos.
12. Mezcle suavemente las células NK y realice una dilución en serie doble en las 5
columnas de pocillos (transfiera 100 ÿL de las células de la primera columna de
pocillos). Cambie las puntas entre cada dilución en serie.
13. Retire y deseche el exceso de 100 ÿL de medio de la última (6.ª) columna de pocillos
( consulte la Nota 20 ).
14. Agregue 100 ÿL de medio completo RPMI a 6 pocillos para controlar la liberación
espontánea.
15. Agregue 100 ÿL de Triton X-100 al 2 % a 6 pocillos para obtener el máximo control de
liberación ( consulte la Nota 21 ).
16. Agregue 100 ÿL de K562 cargado con calceína a los pocillos que contienen células NK
y controles.
17. Mezcle suavemente para promover una mezcla uniforme de las células y gire la placa
a 100 g durante 1 min para promover el contacto célula-célula.
18. Incube la placa en CO 19. Después incubadora durante 4 h a 37 °C.

2
de la incubación, retire la placa y mezcle suavemente el contenido para promover una

distribución uniforme de la calceína liberada en el sobrenadante.
20. Girar la placa a 400 g durante 1 min.
21. Recupere con cuidado 100 ÿL del sobrenadante y transfiéralo a una placa transparente
de 96 pocillos con fondo plano (o placas con fondo transparente de paredes negras),
mantenga el mismo diseño de las muestras en la placa de análisis.
22. Lea la intensidad de la fluorescencia utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia

(fi ltro de excitación 485 nm: fi ltro de emisión 530 nm).
23. Calcule el porcentaje de lisis específi ca de las células NK en cada grupo usando la
fórmula [(Liberación de prueba ÿ Liberación espontánea)/(Liberación máxima ÿ
Liberación espontánea)] × 100.
4 notas
1. Una mayor dilución de la sangre en PBS mejorará la recuperación de las PBMC al

evitar la agregación con los glóbulos rojos.
2. Se carga una muestra de capa leucocitaria típica (diluida con PBS) en cuatro tubos
cónicos de 50 ml. El tubo cónico se puede sostener en un ángulo de 45 grados
para facilitar la estratificación de la sangre sin perturbar el Ficoll-Paque. Una
interfaz clara entre la sangre y Ficoll-Paque es esencial para una buena
recuperación de las PBMC. Si la capa está alterada, cambie a un tubo diferente.
Se puede agregar un volumen menor de sangre (25–30 ml) a cada tubo para evitar
posibles derrames durante la centrifugación.
3. Tenga cuidado de no alterar las células (capa blanca) en la interfaz mientras retira
la capa superior de plasma. Tenga en cuenta que se puede producir cierta
retención de glóbulos rojos en la interfaz de PBMC si la densidad celular es muy
alta.
4. La succión de las ayudas de pipetas estándar puede ser demasiado alta o abrupta
y puede causar la recuperación de alguna capa de Ficoll-Paque, perturbar la
interfaz o causar el reflujo de células al interior del tubo. El uso de la pipeta P-1000
brinda un mayor control para recuperar células de la interfaz. Coloque siempre la
punta de la pipeta justo encima de la capa de células para recuperar completamente
las PBMC y evitar recuperar demasiada capa de Ficoll-Paque. Combine las PBMC
de varios tubos en un solo tubo de 50 ml en esta etapa.
5. Si se recupera una gran cantidad de Ficoll-Paque junto con la interfaz de PBMC,

centrifugue a 400 g durante 10 min durante los pasos de lavado.
6. Mientras aspira el sobrenadante, raspe la capa de glóbulos rojos para eliminar la

capa de células de granulocitos "blanca".
7. Deseche los glóbulos rojos restantes o guárdelos para más tarde. Para guardar,
centrifugue los glóbulos rojos a 400 g durante 5 min, aspire el sobrenadante y
agregue al precipitado de glóbulos rojos un volumen igual de solución de Alsever
y guárdelo a 4 oC. Estos glóbulos rojos se pueden almacenar hasta por 4 semanas
y se pueden usar para la repurificación de células NK expandidas si la
contaminación de células T persiste después de la expansión.
8. El volumen del sedimento de células RBC-PBMC debe incluirse en el volumen de

resuspensión final, p. ej., para 500 millones de PBMC (+100 veces el exceso de
RBC), agregue tampón de lavado hasta la marca de 10 ml.
9. El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep™ contiene

complejos de anticuerpos tetraméricos contra CD3, CD4, CD36, CD66b, CD19,
CD123 y contra la glicoproteína A para la conjugación con glóbulos rojos, para
agotar las células no NK de las PBMC y permitir el aislamiento de células intactas.
células NK.
10. La expansión de células NK puede ser mejor a partir de células NK recién aisladas.
La congelación puede causar una pérdida de viabilidad y, dependiendo de la
recuperación total de células NK, esto puede afectar la expansión general.
11. El sistema de microesferas CD3 de Miltenyi está disponible como reactivo de

investigación o reactivo clínico (microesferas CliniMACS ® CD3).
También hay disponibles otros reactivos comerciales para el agotamiento
de CD3 de PBMC para uso clínico, preclínico o de laboratorio de las células.
12. Si se utilizan menos de 300 millones de PBMC para el agotamiento de CD3,

agregue 2 ml de tampón MACS por cada 10 × 10 6 PBMC para lavar.
13. El irradiador GammaCell 1000 (MS Nordion) puede acomodar hasta cuatro
tubos cónicos de 50 mL o un tubo cónico de 250 mL a la vez.
14. Se puede usar K562 mbIL21 recién irradiada o irradiada y congelada para la
expansión de células NK sin perder la eficacia de la estimulación.
15. Si se requieren grandes cantidades de células NK de la expansión, por

ejemplo, para usarlas en estudios preclínicos de transferencia adoptiva, lleve
todas las células del día 7 para una segunda estimulación.
16. Si se transfieren más de 5 × 10 6 células para una segunda ronda de
expansión, sembrar un máximo de 10 × 10 6 células expandidas del día
107×+
10 6 células K562mb.IL21 por frasco T75 en 40 ml de medio . Utilice varios
frascos T75 según sea necesario.
17. El volumen de cultivo a utilizar (y, por lo tanto, el número de matraces)
dependerá del número total de células en cada cambio de medio. Es ideal
realizar un conteo de células los días 10 y 12 para determinar el número total
de células. Mantenga la densidad celular por debajo de 5 × 10 5 células/mL
en el
momento del cambio de medio en los días 10 y 12.
18. Dado que todas las células viables se incluyen en los recuentos de células
(incluidos los monocitos y granulocitos), para tener en cuenta el número de
células NK directamente del gráfico CD3 frente a CD56 (correlacionado con
los recuentos de células) se sobrestimará el porcentaje inicial de células NK,
por lo que se subestimará el expansión de pliegues.
19. Para el ensayo de citotoxicidad, se pueden usar células NK recién extraídas
del cultivo al final de la expansión. Si se utilizan células NK congeladas para
el ensayo, descongele un vial de células NK dos días antes para permitir que
se recuperen de la congelación.
20. Los pocillos ahora contendrán células NK que van desde las 100ÿ000 células
por pocillo en la columna 1 (por condición) hasta las 3125 células en la
columna 6. Las proporciones efector-diana (E:T) logradas según el protocolo
descrito son 10: 1, 5:1, 2,5:1, 1,25:1, 0,625:1, 0,3125:1. Si se desea una
relación E:T inicial más alta o más baja, aumente o disminuya la densidad de
células NK inicial en consecuencia (por ejemplo, 2 × 10 6 para 20:1 y 0,5 ×
10 6 para la relación E:T inicial 5:1).
21. Es recomendable dejar una fila de pocillos en blanco entre las muestras y el
control de liberación espontánea y el control de liberación máxima para evitar
la contaminación cruzada accidental.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación St.

Baldrick.
Referencias
1. Buddingh EP, Schilham MW, Ruslan SE et al (2011) 11. Shlomchik WD, Couzens MS, Tang CB et al (1999) Prevención
El osteosarcoma resistente a la quimioterapia es muy de la enfermedad de injerto contra huésped mediante la
susceptible a las células NK alogénicas y autólogas inactivación de las células presentadoras de antígeno del huésped.
activadas por IL-15. Cancer Immunol Immunother Ciencia 285: 412–415
60:575–586 12. Olson JA, Leveson-Gower DB, Gill S et al (2010) Las
2. Alici E, Sutlu T, Bjorkstrand B y otros (2008) células NK median la reducción de la GVHD al inhibir
La actividad antitumoral autóloga de las células NK las células T alorreactivas activadas mientras retienen
se expandió de pacientes con mieloma utilizando los efectos de la GVT. Sangre 115:4293–4301
componentes compatibles con GMP. Blood 111:3155–
3162 3. Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A et al 13. Pittari G, Fregni G, Roguet L y otros (2010)
(2005) Transferencia adoptiva exitosa y expansión in Evaluación temprana de la actividad asesina natural
vivo de células NK haploidénticas humanas en en pacientes con leucemia mieloide aguda
pacientes con cáncer. Sangre 105: 3051–3057 postrasplante. Trasplante de médula ósea 45:862–871
4. Iliopoulou EG, Kountourakis P, Karamouzis MV et al 14. Meyer-Monard S, Passweg J, Siegler U et al (2009)

(2010) Un ensayo de fase I de transferencia adoptiva Purificación de grado clínico de células asesinas
de células asesinas naturales alogénicas en pacientes naturales en el trasplante de células madre
con cáncer de pulmón de células no pequeñas hematopoyéticas haploidénticas. Transfusion 49:362–
avanzado. Cancer Immunol Immunother 59:1781–
371 15. Shi J, Tricot G, Szmania S et al (2008) Infusión de
1789
células NK no coincidentes con el ligando del receptor
5. Rubnitz JE, Inaba H, Ribeiro RC et al (2010) similar a la inmunoglobulina asesina haplo-idénticas
NKAML: un estudio piloto para determinar la seguridad para el mieloma recidivante en el contexto del
y viabilidad del trasplante de células asesinas trasplante autólogo de células madre. Hermano J
naturales haploidénticas en la leucemia mieloide Haematol 143:641–653
aguda infantil. J Clin Oncol 28:955–959 6. Bachanova 16. Clausen J, Petzer AL, Vergeiner B y otros (2001)
V, Burns LJ, McKenna DH et al (2010) Células asesinas Momento óptimo para la recolección y expansión in
naturales alogénicas para el linfoma refractario. vitro de linfocitos CD56 (+) citotóxicos de pacientes
Cancer Immunol Immunother 59:1739–1744 sometidos a trasplante autólogo de células madre de
sangre periférica.
7. Geller MA, Cooley S, Judson PL et al (2011) Un estudio J Hematother Stem Cell Res 10:513–521 17.
de fase II de terapia alogénica con células asesinas Clausen J, Vergeiner B, Enk M et al (2003)
naturales para tratar pacientes con cáncer de ovario Importancia funcional de los receptores asociados a
y de mama recurrente. Citoterapia 13:98–107 8. la activación CD25 y CD69 en células NK humanas y
células T similares a NK.
Kiessling R, Klein E, Wigzell H (1975)
Células asesinas “naturales” en el ratón. I. Células Immunobiology 207:85–93 18.
citotóxicas con especificidad para células de leucemia Klingemann HG, Martinson J (2004) Expansión ex vivo de
de Moloney de ratón. Especificidad y distribución células asesinas naturales para aplicaciones clínicas.
según genotipo. Eur J Immunol 5:112–117 9. Seaman Cytotherapy 6:15–22 19. de Rham C, Ferrari-Lacraz
WE, Sleisenger M, Eriksson E et al (1987) Agotamiento S, Jendly S et al (2007) Las citocinas proinflamatorias IL-2,
de células asesinas naturales en ratones por IL-15 e IL-21 modulan el repertorio de receptores de
anticuerpo monoclonal contra NK-1.1. Reducción de células asesinas naturales humanas maduras.
las defensas del huésped contra la malignidad sin
pérdida de la inmunidad celular o humoral. J Immunol Artritis Res Ther 9:R125
138:4539–4544
20. Koehl U, Sorensen J, Esser R et al (2004) Inmunoterapia
10. Imai K, Matsuyama S, Miyake S y otros (2000) con células NK activadas con IL-2 de tres niños
Actividad citotóxica natural de los linfocitos de sangre después de un trasplante de células madre
periférica e incidencia de cáncer: un estudio de haploidénticas. Células sanguíneas Mol Dis 33:261–266
seguimiento de 11 años de una población general. 21. Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D y otros (2010)
Lanceta 356: 1795–1799
Expansión a alta escala logarítmica del ser humano funcional
Células asesinas naturales de células CD34 positivas de 31. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012) La IL-21
sangre de cordón umbilical para inmunoterapia adoptiva unida a la membrana promueve la proliferación ex vivo
contra el cáncer. PLoS One 5, e9221 22. Sutlu T, Stellan B, sostenida de células asesinas naturales humanas. PLoS
Gilljam M et al (2010) One 7, e30264 32. Kucuk C, Hu X, Iqbal J et al (2013)
Expansión de grado clínico, a gran escala y sin alimentador HACE1 es un candidato a gen supresor de tumores en las
de células asesinas naturales humanas altamente activas neoplasias de células asesinas naturales. Am J Pathol
para inmunoterapia adoptiva utilizando un biorreactor 182:49–55 33. Kucuk C, Iqbal J, Hu X et al (2011) PRDM1
automatizado. Citoterapia 12:1044–1055 23. Torelli GF, es un gen supresor de tumores en las neoplasias malignas de
Guarini A, Palmieri G et al (2002) células asesinas naturales. Proc Natl Acad Sci EE. UU.
Expansión de efectores citotóxicos con actividad lítica frente 108:20119–20124
a blastos autólogos de pacientes con leucemia mieloide
aguda en remisión hematológica completa. Hermano J 34. Shah N, Martin-Antonio B, Yang H et al (2013) El antígeno que
Haematol 116: 299–307 presenta la expansión mediada por células de la sangre del
cordón umbilical humano produce una expansión a escala
24. Berg M, Lundqvist A, McCoy P Jr y otros (2009) logarítmica de las células asesinas naturales con actividad
Las células asesinas naturales humanas expandidas ex vivo antimieloma. PLoS Uno 8, e76781
de grado clínico regulan al alza los receptores de activación
y los ligandos de los receptores de muerte y tienen una 35. Liu Y, Wu HW, Sheard MA y otros (2013)
actividad citolítica mejorada contra las células tumorales. Crecimiento y activación de células asesinas naturales ex
Citoterapia 11:341–355 vivo de niños con neuroblastoma para terapia celular
25. Clemenceau B, Gallot G, Vivien R et al (2006) adoptiva. Clin Cáncer Res 19:2132–2143
Preservación a largo plazo de la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células asesinas 36. Sheard MA, Asgharzadeh S, Liu Y et al (2013)
naturales amplificadas in vitro de la sangre periférica de TRAIL unido a la membrana complementa la citotoxicidad
pacientes con cáncer de mama después de la quimioterapia. de las células asesinas naturales contra las células de
J Immunother 29:53–60 26. Cho D, Campana D (2009) neuroblastoma. J Immunother 36:319–329 37. Knorr DA, Ni
Expansión y activación de células asesinas naturales para Z, Hermanson D et al (2013)
inmunoterapia contra el cáncer. Korean J Lab Med 29:89–96 Derivación a escala clínica de células asesinas naturales a
27. Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N et al (2009) Expansión partir de células madre pluripotentes humanas para la terapia
de células asesinas naturales humanas altamente citotóxicas para contra el cáncer. Stem Cells Transl Med 2:274–283 38. Bock
la terapia de células cancerosas. AM, Knorr D, Kaufman DS (2013)
Desarrollo, expansión y monitorización in vivo de células
Cáncer Res. 69:4010–4017
NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas
28. Zhang H, Cui Y, Voong N et al (2011) (hESC) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC). J Vis
Las señales de activación dominan las señales inhibidoras Exp: e50337 39. Schafer JL, Colantonio AD, Neidermyer WJ
en las células asesinas naturales activadas con CD137L/IL-15. et al (2014) KIR3DL01 reconocimiento de ligandos Bw4 en el
J Immunother 34:187–195 29. macaco rhesus: mantenimiento de la especificidad Bw4
Somanchi SS, Senyukov VV, Denman CJ et al (2011) Expansión, desde la divergencia de los simios y los monos del Viejo
purificación y evaluación funcional de células NK de sangre Mundo. J Immunol 192:1907–1917 40. Alter G, Malenfant
periférica humana. J Vis Exp 48, e2540. doi:10.3791/2540 JM, Altfeld M (2004)
30. Parrish-Novak J, Dillon SR, Nelson A et al (2000) La
interleucina 21 y su receptor están involucrados en la expansión
de las células NK y la regulación de la función de los CD107a como marcador funcional para la identificación de
linfocitos. Naturaleza 408: 57–63 la actividad de las células asesinas naturales. J Immunol
Methods 294:15–22
capitulo 16
Cultivo a gran escala y modificación genética de humanos

Células asesinas naturales para terapia celular
, Adrián P. Gee,
, Lisa A. Rollins
Natalia Lapteva,Robin Parihar
y Cliona M. Rooney
Resumen
Avances recientes en métodos para la expansión ex vivo de células asesinas naturales (NK) humanas han facilitado
el uso de estas poderosas células inmunes en protocolos clínicos. Además, la capacidad de modificar genéticamente
las células NK humanas primarias después de una rápida expansión permite seleccionar y mejorar su función
inmunitaria. Hemos adaptado con éxito un método de expansión para células NK primarias a partir de células
mononucleares de sangre periférica o de productos de aféresis en dispositivos de expansión rápida permeables al gas
(G-Rexes). Aquí, describimos un protocolo optimizado para la expansión rápida y robusta de células NK, así como un
método para la transducción retroviral altamente eficiente de estas células expandidas ex vivo. Estas metodologías
cumplen con las buenas prácticas de fabricación (GMP) y podrían usarse para la fabricación de productos de grado clínico.
Palabras clave Células asesinas naturales, Expansión a gran escala , g-rex , Modificación genética con retroviral
vector
1. Introducción
Aunque las terapias con células asesinas naturales (NK) han mostrado resultados
prometedores en pacientes con cáncer [ 1–4 ], están limitadas por la expansión
transitoria de las células NK transferidas adoptivamente en pacientes y la
persistencia corta después de la infusión. Por lo tanto, se requiere un gran
número de células para lograr resultados clínicos significativos. Las dosis de
células NK pueden
pueden seroscilar entreinfusión
necesarias 1 × 1015de
hasta ×células/kg
10
un10 y 1 de
paciente
células ×NK
10
1008 células/kg
para
kguna
[ 5, solay
6]. Hemos
adaptado un método robusto de expansión ex vivo de células NK utilizando
células alimentadoras K562 negativas para HLA irradiadas que están modificadas
genéticamente con IL-15 unida a la membrana y ligando BB 4-1
(K562mbIL15-41BBL) para impulsar la diferenciación y supervivencia de las
células NK. , y la proliferación [ 7, 8]. Con este método, generamos una gran
cantidad de células NK funcionales a partir de productos de aféresis no
separados o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) después de
solo 10 días de cultivo en frascos de cultivo de células estáticas permeables al
gas (G-Rex).
Srinivas S. Somanchi (ed.), Células asesinas naturales: Métodos y protocolos, Métodos en biología molecular, vol.
1441, DOI 10.1007/978-1-4939-3684-7_16, © Springer Science+Business Media Nueva York 2016
195
196 Natalia Lapteva et al.
Los cultivos en G-Rexes (óptimo 10 ml de medio por cm 2 de superficiede una

membrana permeable a los gases) normalmente no requieren manipulación celular
ni alimentación durante los 10 días del período de cultivo. Con el fin de ampliar las
aplicaciones de estas células NK activadas y expandidas a los ensayos de cáncer,
también optimizamos un método para su transducción con vectores retrovirales que
codifican receptores de antígenos quiméricos (CAR), con especificaciones que van
desde CD19 (expresado en muchas leucemias [ 9] ) al diasialogangliósido, GD2
(expresado en tumores sólidos, como neuroblastoma, sarcomas y melanoma [ 10]).
Estos métodos para la expansión de células NK y la transducción retroviral cumplen

con las buenas prácticas de fabricación (GMP) y se utilizan fácilmente en protocolos
clínicos.
2 materiales
1. Células de aféresis o PBMC criopreservadas o frescas.
2. La línea celular K562mbIL15-41BBL fue proporcionada amablemente por Dario

Campana (Universidad Nacional de Singapur).
3. SCGM completo (C-SCGM): CellGro® Stem Cell Growth Media (CellGenix

GmbH) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (HI-
FBS, HyClone).
4. Interleucina-2 (IL-2) (Proleukin, Prometheus Laboratories Inc.).

2+
5. Medio de descongelación: 1x PBS sin Ca 2+ y Mg 5 % HI-FBS. que contiene
6. Ficoll-Paque.
7. Matraz de cultivo G-Rex10 y G-Rex100 (Wilson Wolf Manufacturing). 8,1× PBS
sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio. Albúmina sérica humana (HSA) al 9,5
%/Buminato al 5 % (Baxter).
10. Vectores gammaretrovirales que codifican un CAR para CD19 o GD2.
11. Placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejidos.
12. Solución de retronectina (Takara Bio Company).
3 métodos
3.1 Expansión El tiempo esperado para crecer >1,5 × 10 9 células K562mbIL15-41BBL, necesarias
de células para la expansión de las células NK, a partir de un vial con 2 × 10 7 células
K562mb15-41BBL en matraces G-Rex
crioconservadas es de aproximadamente dos semanas. El número de células
K562mbIL15-41BBL necesarias dependerá del número deseado de células NK (Tabla
1 ).
1. Precaliente 9 mL de C-SCGM.
2. Descongele un vial de 2 × 10 7 K562mbIL15-41BBL master cell bank (MCB) en

un baño de agua a 37 °C.
Expansión a gran escala y transducción retroviral de células NK 197
tabla 1
Ejemplo de células alimentadoras K562mbIL15-41BBL estimadas y células de aféresis requeridas para iniciar un cultivo de
células NK a gran escala
Número de % de células CD56 # de El numero total de

Pliegue de
células NK requeridas + CD3 ÿ en aféresis Número de celdas para G-Rex Células
NK para expansión de infusión sembrar el producto en un G-Rex100 requerido K562mbIL15-41BBL requeridas +20 %
1 × 10 10 ~100 10 % 5 × 10 7 células de aféresis y 20 5 × 1,2 × 10 9

10 7 de células irradiadas
K562mbIL15-41BBL
3. Transferir y resuspender las células descongeladas en 9 ml de agua tibia

C-SCGM.
4. Centrifugar las células a 400 × g durante 5 min, aspirar el sobrenadante.
5. Resuspender las células en 30 mL de C-SCGM y contar las células viables.

6. Transfiera las células K562mbIL15-41BBL descongeladas a un G-Rex10 durante 3 o 4
días en 30 ml de volumen total ( consulte la Nota 1).
7. En los días 3 y 4 de cultivo, extraiga 20 ml de sobrenadante de G-Rex10 y cuente las

células.
8. Cuando los números de K562mbIL15-41BBL alcancen 15 × 10 6 celdas/G Rex10,
transfiera todas las celdas a un G-Rex100. Agregue medio C-SCGM a 400 ml de

volumen total por G-Rex100. Si se contaron menos de 15 × 10 6 células, agregue 20
ml de C-SCGM fresco a las células en G-Rex10.
9. Cuando el crecimiento de células K562mbIL15-41BBL en un frasco G-Rex100 alcance

más de 300 × 10 6, divida las células entre tres frascos G-Rex100. Transfiere entre 50
× 10 6 y 100 × 10 6 celdas por G-Rex100. Continúe cultivando y contando las células
cada 2 o 3 días ( consulte la Nota 2).
3.2 Gradiente de Ficoll 1. Medio de descongelación tibio. El volumen del medio de descongelación debe ser
Separación aproximadamente 10 veces el volumen del producto crioconservado ( ver Nota 3).
de criopreservados
Sangre Periférica o 2. Descongele las células de aféresis en un baño de agua a 37 °C ( consulte la Nota 4).
Células de aféresis
3. Transfiera las células del vial/bolsa a tubos de centrífuga de tamaño adecuado que
contengan tres volúmenes de medio de descongelación calentado. Centrifugar a 400
× g durante 10 min.
4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tres volúmenes

del medio de descongelación.
5. Superponga 30–40 mL de células en 15 mL de medio de separación de linfocitos (Ficoll-

Paque) y centrifugue durante 30 min a 400 × g con el freno de centrífuga en OFF.
6. Recolectar la capa de células mononucleares en 2 volúmenes de medio de

descongelación y centrifugar a 450 × g durante 10 min.
7. Vuelva a suspender las células de aféresis en uno a cuatro volúmenes de C-SCGM y

centrifugue a 400 × g durante 5 min.
8. Vuelva a suspender las células de aféresis en C-SCGM que contenga 500 U/ml de
IL-2 y agrupe todas las células en un recipiente estéril.
9. Analice una alícuota de células por citometría de flujo para determinar la

frecuencia de células CD56 + CD3 ÿ NK.
10. Mantenga las células de aféresis en la incubadora (37 °C y 5 % de CO 2 ) hasta que

estén disponibles los resultados de la citometría de flujo ( consulte la Nota 5).
3.3 Recolección 1. Cuente y calcule el número necesario de células K562mbIL15-41BBL expandidas. Las
e irradiación de células K562mbIL15-41BBL se utilizan en una proporción de 10:1 de K562 a NK.
células alimentadoras Use la Tabla 1 como referencia ( ver Nota 6).
K562mbIL15-41BBL
2. Aspire los sobrenadantes, recolecte y combine las células K562mbIL15-41BBL. Irradie

las células K562mbIL15-41BBL con 100 Gray utilizando un irradiador validado
( consulte la Nota 7).
3. Lave las células K562mbIL15-41BBL irradiadas en C-SCGM (con 500 U/ml de IL-2) y
vuelva a contar las células (espere una pérdida del 20 %) .
3.4 Expansión de células 1. Prepare C-SCGM que contenga 500 U/ml de IL-2. Se requieren cuatrocientos ml de
NK en G-Rex 100 medio por cada G-Rex100.
2. Alícuotas de células de aféresis o PBMC que contengan 5 × 10 6 células NK por cada

G-Rex100.
3. Alícuota de 5 × 10 7 K562mbIL15-41BBL (100 grises irradiados, lavados y recontados

del Subtítulo 3.3) en cada G-Rex100.
4. Agregue medio C-SCGM a 400 ml por G-Rex100 y 500 U/ml de IL-2 (200 000 unidades
en total).
5. En el día 6 de cultivo, analice la glucosa en un G-Rex100 representativo.

Tome 10–50 ÿL de sobrenadante de cultivo y colóquelo en una tira de prueba de un
dispositivo de autocontrol de glucosa validado, diseñado para diabéticos (p. ej., Accu-
Chek Aviva, Roche). Si la glucosa está por debajo de 70 mg/dL, aspire ~300 mL del
medio del representante G-Rex100, cuente las células y calcule el número total de
células en todos los G-Rex sembrados. Coseche las células cuando se alcance el
número total requerido de células NK. Si el número de células no es suficiente,
reemplace 300 mL de sobrenadante de cada G-Rex con C-SCGM fresco suplementado

con IL-2 (concentración final 500 U/mL). Si la glucosa está por encima de 70 mg/dL,
devuelva todos los G-Rex a la incubadora ( consulte la Nota 8).
6. Coseche las células NK aspirando 300 ml de sobrenadante de cada G-Rex. Vuelva a

suspender la hoja de células en cada G-Rex y agruparlos en tubos de centrífuga. Si
las células se van a utilizar clínicamente, las células se deben agrupar en un
recipiente de tamaño adecuado antes de trans
fer a tubos de centrífuga. Las alícuotas de las células agrupadas y el medio de

cultivo celular agrupado deben guardarse para las pruebas de control de calidad.
7. Lave las células NK recolectadas tres veces con 300–400 ml de PBS suplementado
con HSA al 2,5 %. Concentre las células en HSA al 5 % (buminato al 5 %) a 1 ×
10 7 células/mL y transfiera las células
Las células
a paquetes
son estables
de transferencia
en estaspara
condiciones
infusión.
hasta 48 h si se refrigeran a 4 °C o se envían en bolsas de hielo congeladas a -20
°C, envueltas en bolsas de plástico y materiales absorbentes para evitar posibles
fugas y/o contacto directo con las bolsas de hielo.
8. Los productos clínicos alogénicos de células NK deben someterse a una depleción

de células T CD3 + antes de la formulación. Reduzca las células T CD3 + usando
el reactivo CD3 CliniMACS con un sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante.
3.5 Transducción 1. Realice la expansión de las células NK como se describe anteriormente en los
de células NK humanas Subtítulos 3.1 – 3.4. Esta “expansión primaria” asegura la activaciónadecuada
y proliferación
de
con vectores retrovirales las células NK que permite una eficiencia de transducción retroviral óptima entre
los días 3 y 4 de expansión.
2. Recubra los pocillos de una placa de 24 pocillos no tratada con cultivo de tejido con
0,5 ml/pocillo de una solución de retronectina (7 ÿg/ml en 1x PBS): incube la placa
durante la noche a 4 °C para que se una la molécula de retronectina a el plato.
3. Al día siguiente, aspire PBS que contenga retronectina de la(s) placa(s), lave ×1
con C-SCGM frío y luego agregue el sobrenadante viral (1 ml/pocillo) a la(s)
placa(s) recubierta(s) de retronectina ( consulte la Nota 9).
4. Girar en ultracentrífuga a 2000 × g durante 1 h. Después del centrifugado, aspire

completamente todo el sobrenadante viral de cada pocillo.
5. Coseche las células NK de las preguntas G-Rexfl como se indicó anteriormente ,

en el subtítulo 3.4 , cuente las células NK y llévelas a una concentración
10 5 células/ml
de 2,5en
×
C-SCGM fresco que contenga 500 U/ml de IL-2 6. Placa 2 mL/pocillo de solución .
de células NK en cada pocillo de la placa recubierta de retrovirus/retronectina, dando

una concentración final de 5 × 10 5 células NK/pocillo.
7. Girar a 1000 × g durante 5 min.
8. Placas de cultivo durante 48–72 h (conocido como “cultivo de transducción”).
9. Coseche las células NK del cultivo de transducción a las 48–72 h mediante pipeteo
repetido. Fenotipe y evalúe la eficacia de la transducción mediante tinción de flujo
de células con mAbs anti-CD56 y CD3 y el marcador de selección de construcción
de elección. Consulte la Fig. 1 para ver un diagrama de flujo representativo que
muestra la eficiencia de transducción de varios CAR
construcciones
10. Si se requiere una mayor expansión de las células NK modificadas genéticamente

(es decir, "expansión secundaria"), vuelva a sembrar células NK en G-Rexfl pides
con células alimentadoras según el Subtítulo 3.4. Figura 2
No
transducido COCHE CD19 COCHE GD2
84% 0,4% 27% 57% 4% 81%
Post-Transducción CD56 0,5% 68% 95%
(día 7)
15% 13% 11%
Marcador de selección de COCHE
Fig. 1 Generación de células NK expandidas y activadas transducidas con moléculas CAR. Las células NK se transdujeron con
vectores retrovirales que expresan moléculas CAR contra CD19 y GD2, respectivamente, con moléculas de superficie truncadas
como marcadores de selección. Después de una transducción de 3 días como se describe en el Subtítulo 3.5 , se obtuvo
eficiencia
una
de transducción de aproximadamente 65–95 % para las diversas construcciones de CAR en la superficie de las células NK.
Se usó una transducción simulada con un vector retroviral vacío como control "no transducido"
Día 0 Día 4 Día 7 día 17
1o Expansión: retrovirales 2o Expansión:

K562-mb15-41BBL transducción K562-mb15-41BBL
sistema g-rex en placas de 24 pocillos sistema g-rex
10% 6% 55% 18% 72% 12% 93% 4%
CD56 CD56
55% 24% 14% 2%
CD3 CD3
Fig. 2 Esquema de expansión/transducción de células NK y análisis fenotípico. Las PBMC obtenidas de donantes normales se
cocultivaron en presencia de K562 mb15-41BBL e IL-2 subletalmente irradiadas en frascos G-Rex durante 4 días y se
transdujeron con construcciones retrovirales que expresan CAR durante 3 días adicionales. A continuación, las células NK
transducidas se expandieron secundariamente durante 10 días adicionales. Las células se recogieron en los puntos de tiempo
indicados y se analizaron para el fenotipo por citometría de flujo. Las células NK se caracterizan por un fenotipo CD56 + CD3
ÿ . Se muestra un donante representativo de más de 20 donantes normales diferentes examinados
representa el esquema global de expansión/transducción empleado aquí

y muestra el análisis fenotípico de la expansión de las células NK a lo
largo del tiempo.
4 notas
1. Sembrar un G-Rex10 con al menos 5 × 10 5 y no más de 1 × 10 7 de
células K562mbIL15-41BBL. El volumen de cultivo total en un G-Rex10
es de 30 ml.
2. Debido a que las células K562 modificadas genéticamente pueden regular a la baja
la expresión de 4-1 BBL y la IL-15 unida a la membrana después de un cultivo
prolongado, planifique el día de inicio de NK en función del tiempo de duplicación
de las células K562. El tiempo de duplicación de nuestro banco celular maestro
es de aproximadamente 48 h. No permita que las celdas K562mbIL15-41BBL se
vuelvan estáticas, es decir, 8 × 10 8 por G-Rex100.
3. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) congeladas o frescas se

pueden utilizar como población celular inicial para la expansión de células NK.
Espere las mismas tasas de expansión para las PBMC y las células de aféresis.
4. Trabajar rápidamente para reducir la toxicidad de DMSO.
5. Debido a que el porcentaje de células NK CD56 + CD3 ÿ es específico del

donante, el número total de células nucleadas (que contienen 5 × 10 6 células
NK) que se sembrarán en cada G-Rex100 variará entre los diferentes productos.
6. La expansión de células NK esperada es de aproximadamente 100 veces para los

días 8 o 10 de cultivo. Por lo tanto, para obtener 1 × 10 10 células NK, normalmente
sembramos 20 G-Rex100 con 5 × 10 6 NK por G-Rex100. Se debe sembrar un
frasco de G-Rex con 5 × 10 6 NK y 5 × 10 7 células K562mbIL15-41BBL. Para
estimar el número de células de aféresis necesarias para producir un determinado
número de células NK, se puede realizar un cultivo preliminar a pequeña escala
en un G-Rex10 con las células de un vial de referencia que contiene una alícuota
del producto de aféresis crioconservado. Siembre cada G-Rex10 con células de
aféresis o PBMC que contengan 5 × 10 5 células CD56 + CD3 ÿ y 5 × 10 6 células
K562mbIL15-41BBL irradiadas con 100 grises en 40 ml de C-SCGM
complementadocultivos
con 500de
U/ml de IL-2.
escala El pliegue
pequeña de expansión
(G-Rex10) y grandeserá el mismo en
(G-Rex100).
7. Se requiere la confi rmación de la eficacia para la irradiación de células

alimentadoras para los productos clínicos de células NK. Con este fin, hemos
adaptado el ensayo de proliferación celular Click-iT basado en citometría de flujo [ 11 ].
8. Por lo general, la C-SCGM fresca contiene ~400–450 mg/dL de glucosa.

Las células NK están listas para la recolección cuando la glucosa cae por debajo
de 100 mg/dL. Las células se pueden recolectar antes si se ha logrado el número
de células y la pureza requeridos. La mayoría de nuestros productos clínicos se
recolectaron el día 8 de cultivo. Si se siembra a las densidades especificadas por
este protocolo, recomendamos cosechar entre los días 8 y 10 de cultivo. Los
cultivos recolectados antes del día 7 pueden contener células alimentadoras
K562mbIL15-41BBL detectables por citometría de flujo, particularmente si la tasa
de expansión de células NK es baja. A partir del día 10 de cultivo las células NK
empiezan a perder viabilidad y expresión de marcadores de activación y se
requiere una segunda reestimulación con K562mbIL15-41BBL para potenciarlas.
9. Los sobrenadantes virales se generaron de la siguiente manera: las células 293T

se transfectaron en presencia de GeneJuice con un plásmido vector que contenía
el gen de interés + RDF, un plásmido de expresión
suministrando la envoltura RD114 + PeqPam-env, un

plásmido de expresión de gagpol, durante 48 h a 37 °C. El
sobrenadante del cultivo (es decir, el sobrenadante viral)
se aspiró, se filtró en condiciones estériles y se congeló
rápidamente para su uso posterior en cultivos de
transducción, como se indicó anteriormente en el Subtítulo
3.5, Paso 3. Se requeriría una línea celular productora de virus.
Referencias
1. Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A et al (2005) demostrar una proliferación robusta in vivo en pacientes con
Transferencia adoptiva exitosa y expansión in vivo de células mieloma múltiple (MM) recidivante de alto riesgo.
NK haploidénticas humanas en pacientes con cáncer. Sangre (Resumen de la reunión anual de ASH) 120 7.
Sangre 105:3051–3057 2. Curti A, Ruggeri L, D'Addio A et Imai C, Iwamoto S, Campana D (2005)
al (2011) La modificación genética de las células asesinas naturales
Transferencia exitosa de células asesinas naturales no primarias supera las señales inhibitorias e induce la
coincidentes con el ligando KIR aloreactivo haploidéntico destrucción específica de las células leucémicas.
después de la infusión en pacientes ancianos con leucemia Sangre 106:376–383
mieloide aguda de alto riesgo. Sangre 118:3273–3279 3. 8. Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N et al (2009) Expansión de
Rubnitz JE, Inaba H, Kang G et al (2015) células asesinas naturales humanas altamente citotóxicas
Terapia con células asesinas naturales en niños con para la terapia de células cancerosas.
leucemia recidivante. Pediatr Blood Cancer 62: 1468–1472 Cáncer Res. 69:4010–4017
9. Weiland J, Elder A, Forster V y otros (2015)

4. Bachanova V, Cooley S, Defor TE y otros (2014) CD19: una molécula diana inmunológica multifuncional y
La eliminación de la leucemia mieloide aguda por células sus implicaciones para la leucemia linfoblástica aguda de
asesinas naturales haloidénticas se mejora utilizando la Blineage. Pediatr Blood Cancer 62:1144–1148
proteína de fusión de toxina diftérica IL-2. Sangre 123:3855–
3863
10. Suzuki M, Cheung NK (2015) Disialogangliósido GD2 como
5. Shah NN, Baird K, Delbrook CP y otros (2015) diana terapéutica para enfermedades humanas.
EICH aguda en pacientes que reciben células NK activadas Opinión de expertos sobre objetivos 19:349–362
con IL-15/4-1BBL después de un trasplante de células 11. Lapteva N, Durett AG, Sun J y otros (2012)
madre sin células T. Sangre 125:784–792 6. Szmania S, Expansión y caracterización ex vivo a gran escala de
Garg TK, Lapteva N et al (2012) células asesinas naturales para aplicaciones clínicas.
Células asesinas naturales expandidas ex vivo frescas dem Citoterapia 14:1131–1143
capitulo 17
Modificación génica de células asesinas naturales humanas

utilizando un vector retroviral
Joshua N. Kellner , Conrado R. Cruz, Catalina ,

M. Bollard
y Eric S. Yvon
Resumen
Como parte del sistema inmunitario innato, las células asesinas naturales (NK) se consideran células efectoras prometedoras
para los enfoques de terapia celular adoptiva para tratar a pacientes con cáncer. En algunos casos, se puede considerar la
modificación genética de las células NK, pero dicha manipulación debe integrarse en el método de expansión para permitir la
generación de cantidades clínicamente relevantes de células NK modificadas genéticamente. Por lo tanto, se necesita un
procedimiento de transferencia de genes eficiente.
Nuestro grupo desarrolló un protocolo de transducción basado en retrovirus capaz de una expansión robusta de
células NK modificadas genéticamente con una alta tasa de expresión transgénica. La división activa de células es un
requisito previo para la transferencia génica eficiente cuando se utiliza un vector retroviral. En el procedimiento presentado
aquí, una combinación de IL-15 y las células alimentadoras K-562 proporcionó una fuerte activación de las células NK.
Además del interés en desarrollar un procedimiento simple que cumpla con las buenas prácticas de fabricación (GMP) para
la producción de productos terapéuticos, este enfoque también proporciona un medio valioso para generar células NK
primarias modificadas genéticamente para futuros estudios preclínicos.
Palabras clave Células asesinas naturales , vector retroviral , transferencia de genes , transducción simple, alimentador K-562
,
células Expansión de células NK
1. Introducción
Las células asesinas naturales (NK) representan un subconjunto de

células único del sistema inmunitario innato ampliamente definido en
humanos como linfocitos CD56+/CD3ÿ. Las células NK desempeñan un
papel fundamental en la respuesta inmunitaria temprana con funciones
reguladas principalmente por receptores inhibidores y activadores. El
reconocimiento de células infectadas por virus o células tumorales
involucra receptores de citotoxicidad natural (NCR) como NKp30, NKp44
y NKp46, la molécula de adhesión DNAX accessory molécula-1 (DNAM-1),
el receptor Natural Killer Group 2, miembro D (NKG2D) así como 2B4 y TRAIL [ 1– 3].
Hasta la fecha, la mayoría de los ligandos reconocidos por NCR son
desconocidos, con la excepción de NKp30 y NKp44 [ 4, 5]. El estrés inducible
203
204 Joshua N. Kellner et al.
las proteínas MICA/B y ULBP son reconocidas por NKG2D, mientras que las
proteínas relacionadas con el poliovirus CD112 (Nectin-2) y CD155 (PVR)
son reconocidas por DNAM-1. Finalmente, 2B4 y TRAIL reconocen la
molécula CD48 y los receptores TRAIL (TRAIL-RI y TRAIL-RII) respectivamente.
Junto con los receptores activadores, las células NK también expresan
receptores inhibidores llamados receptores similares a inmunoglobulina de
células asesinas (KIR), así como el complejo receptor CD94-NKG2A. Los KIR
reconocen grupos de alelos HLA-A, -B y -C y el complejo CD94-NKG2A
reconoce HLA E. Aunque los productos del gen KIR se distribuyen clonalmente
en el repertorio de células NK, la gran mayoría de las células NK expresan al
menos un KIR. específi co para un alelo MHC de clase I propio. Las señales
recibidas por las células NK a través de ambos tipos de receptores (es decir,
receptores activadores e inhibidores) determinarán la respuesta frente a
microorganismos o tumores. La respuesta citotóxica de las células NK está
mediada principalmente por la apoptosis inducida por perforina/granzima y,
tras la activación, las células NK estimularán la respuesta
adaptativa
inmunitaria
e inflamatoria
secretando interferón-ÿ (IFN-ÿ), factor de necrosis tumoral-ÿ (TNF- ÿ), y factor
estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) [ 1].
Debido a su actividad antitumoral “incorporada”, las células NK se han

evaluado para el tratamiento de pacientes con neoplasias malignas
hematológicas [ 6] así como con tumores sólidos [ 7, 8] con cierto éxito que
promete como células efectoras para células adoptivas. terapéutica.
Sin embargo, en un microambiente tumoral complejo donde la actividad de
las células NK está controlada por numerosos eventos y con células tumorales
que desarrollan mecanismos de evasión para eludir la vigilancia inmunitaria
de las células NK, se necesitan estrategias para superar la modulación
inmunitaria del microambiente tumoral [ 9]. Algunas opciones incluyen la
transformación genética de las células NK para hacerlas resistentes al factor
inhibidor TGF-ÿ [ 10], la redirección de las células NK a diferentes órganos
[ 11] o la reorientación de las células NK a antígenos asociados a tumores
como CD19 o SLAMF7 [ 11 ]. En el último par de décadas, la transferencia de
genes retrovirales a células madre hematopoyéticas y células T ha tenido
éxito utilizando procedimientos bien establecidos [ 12, 13]. Sin embargo, no
ocurre lo mismo con las células NK y la modificación genética de las células
NK sigue siendo un desafío [ 11]. Nuestro objetivo era desarrollar una
metodología para la generación de células NK modificadas genéticamente de
grado clínico bajo condiciones controladas por buenas prácticas de fabricación
(GMP). Las especificaciones ideales para la generación de dichos productos
serían una sola ronda de transducción retroviral con el paso de transducción
incorporado en los pasos de activación y expansión de células NK ya
establecidos. Además, las estipulaciones incluían una eficiencia de
transducción mínima del 50 % (es decir, expresión transgénica) sin ningún
efecto perjudicial sobre la viabilidad o función celular.
Estamos informando aquí un simple procedimiento de transducción

basado en retrovirus compatible con GMP para células NK que puede usarse para
Transducción retroviral de células asesinas naturales humanas 205
la generación de productos terapéuticos basados en NK que cumplan con las

especificaciones enumeradas anteriormente. Al igual que las células T, se requiere
.
que las células NK tengan una división celular activa para permitir una transferencia
génica eficiente . La transducción retroviral
Lasse inicia NK
células a las
se96 h después
cultivan de la
durante 24 h en
,
activación de células NK por la línea celular K-562 utilizando un método descrito
anteriormente para la transducción de células T [ 15]. Debido a la alta tasa de
transducción obtenida utilizando el procedimiento descrito, no es necesario el
enriquecimiento posterior a la transducción de células NK modificadas
genéticamente.
2 materiales
®
2.1 Separación de 1.Lymphoprep (AXIS-BLINDAJE).
células mononucleares
2.Tampón CliniMACS ® : Agregar 20 mL de HSA (25 %) a 1 L de CliniMACS ®
y selección de células NK
Tampón PBS/EDTA (Miltenyi Biotec Inc.).
Transfiera el tampón a un tubo cónico de 250 ml.
3. Microesferas CD56 (Miltenyi Biotec Inc.).

4.Columna LS (Miltenyi Biotec Inc.).
5. Solución de Turk (EMD Millipore Corporation).
2.2 Activación 1. Medio de células NK: medio SCGM de Cellgro (Cellgenix) suplementado con
y expansión de FBS inactivado por calor al 10 % (HyClone o equivalente) y Glutamax 2 mM
®
células NK (Gibco ).
2.IL-2 (Proleukine): Prepare la solución de trabajo (200 UI/ÿL) en agua estéril con
FBS al 1 % y guárdela en alícuotas congeladas a ÿ80 °C.
3. IL-15 (R&D Systems): Prepare la solución de trabajo (5 ng/ÿL) en agua estéril

con FBS al 1 % y guárdela en alícuotas congeladas a ÿ80 °C.
4. Línea celular de leucemia mielógena crónica K-562 (ATCC) ( ver

Nota 1).
5. Medio completo RPMI: RPMI con 10 % de FBS inactivado por calor (HyClone
®
o equivalente) y Glutamax 2 mM (Gibco ).
6. Solución de azul tripán al 0,4 % (SIGMA).
2.3 Transducción 1. Generación y almacenamiento de sobrenadante retroviral ( ver Nota 2).

de células NK 2.RetroNectin® (CH-296) (TaKaRa Bio Inc.): Prepare la solución de trabajo
(7 ÿg/ÿL) en agua esterilizada y guárdela en alícuotas congeladas a -20 °C.
3. Placa de 24 pocillos no tratada con cultivo de tejidos (BD Falcon™ o

equivalente).
3 métodos
Las células mononucleares (MNC) se pueden aislar de varias fuentes de sangre. El

método presentado en este capítulo describe el aislamiento de MNC de sangre periférica
y sangre de cordón utilizando un enfoque idéntico. Por conveniencia, usamos la
terminología "sangre" para describir las muestras de sangre periférica o sangre del cordón
umbilical no separadas.
3.1 Separación 1. Diluya la muestra de sangre en tampón CliniMACS ® con una dilución 1:1 para
de células mononucleares sangre periférica y una dilución 1:3 para sangre de cordón umbilical.
2. En un tubo cónico de 50 mL, agregue 15 mL de Lymphoprep ®. Prepare tantos tubos

de 50 ml como sea necesario sabiendo que se pueden procesar 30 ml de sangre
diluida por tubo.
3. En la parte superior de cada tubo que contiene Lymphoprep ®, pipetee con cuidado
®
30 ml de la sangre diluida en Lymphoprep ® intacto. mantener la interfase sangre-
Lymphoprep
4. Centrifugar a 400 × g durante 30 min a temperatura ambiente ( ver

Nota 3).
5. Con una pipeta de 5 ml, transfiera cuidadosamente la capa de MNC a tubos cónicos
nuevos de 50 ml que contengan 20 ml de tampón CliniMACS® . Llene los tubos con
tampón CliniMACS ® si es necesario.
6. Centrifugar a 400 × g durante 10 min, a temperatura ambiente.
7. Retire por completo y deseche el sobrenadante. juntar la celda

gránulos en un tubo cónico de 50 ml.
8. Repetir el procedimiento de lavado con tampón CliniMACS ® para

dos lavados adicionales.
9. Vuelva a suspender el sedimento en 5–10 ml de tampón CliniMACS ® según el

número total de células estimado obtenido después del aislamiento de las MNC.
10. Cuente las celdas en la solución de Turk y calcule el total

cantidad de multinacionales.
11. Se tomará una muestra para el recuento de células y se reservarán 1 × 10 6 células

para el análisis de fenotipo mediante análisis de citometría de flujo.
3.2 Selección de células 1. Centrifugar la suspensión de MNC a 400 × g durante 10 min, a temperatura ambiente.
NK (ver nota 4) la temperatura.
2. Retirar por completo y desechar el sobrenadante.
3. Con el tampón CliniMACS® , ajuste la concentración de la suspensión de células

MNC a 125 × 10 6 MNC por ml (equivale a 10 × 10 6 células/80 ÿL de tampón según
las recomendaciones del fabricante).
4. Agregue 250 ÿL de CD56 MicroBeads por 125 × 10 6 MNC (equivale a 20 ÿL de CD56

MicroBeads/10 × 10 6 células según las recomendaciones del fabricante).
5. Mezcle bien la suspensión de células MNC y las microesferas CD56 e incube

durante 15 min en un refrigerador a 4 °C.
6. Llene el tubo cónico de 50 mL que contiene la mezcla de MNC y CD56 MicroBeads

con tampón CliniMACS® y centrifugue a 400 × g durante 10 min, temperatura
ambiente.
7. Durante el lavado, coloque una columna LS en el campo magnético del Separador

MACS (imán) y prepare la columna enjuagándola con 3 mL de tampón CliniMACS
®.
8. Después del lavado, retire completamente y deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender las MNC marcadas con CD56 MicroBeads hasta 500 ÿL de
tampón CliniMACS ® por 10 8 MNC.
9. Aplique la suspensión de células MNC en la columna LS y recolecte las células sin

marcar en un tubo cónico de 50 ml.
10. Lave las células en la columna LD tres veces con 3 mL de

tampón CliniMACS® cada vez.
11. Retire la columna LS que contiene las células seleccionadas con CD56 del imán
separador MACS y coloque la columna en un tubo cónico de 15 ml.
12. Pipetee 5 ml de tampón CliniMACS® en el depósito de la columna y aplique el

émbolo inmediatamente para eliminar las células positivas para CD56 ( consulte la
Nota 5).
13. Cuente las células en la solución de Turk y calcule la cantidad total de
células CD56+.
14. Se tomará una muestra para el recuento de células y se reservarán 1 × 10 6 células

para el análisis de fenotipo mediante análisis de citometría de flujo.
3.3 Activación 1. Se cultivan 4 × 10 6 células seleccionadas con CD56 en un matraz T25 en 8 ml de

de células NK medio NK-Cell (concentración celular de 0,5 × 10 6 células por ml) suplementado
con IL-15 a 15 ng/ml y se incuba durante 24 h a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de
3.3.1 Día ÿ1
CO 2 ( ver Nota 6).
2. El cultivo de células alimentadoras K-562 se dividirá en tres y se agregarán medios

de cultivo nuevos para asegurar un número suficiente de células alimentadoras
K-562 y una viabilidad adecuada para la activación de células CD56+ ( consulte la
Nota 7).
3.3.2 Día 0 1. Recoja las células alimentadoras K-562 en un tubo cónico de 50 ml, irradie a 100
Gy y centrifugue a 400 × g durante 10 min.
3. Llene el tubo de 50 ml que contiene las células alimentadoras K-562 irradiadas con
medio de células NK y repita el paso de lavado dos veces más.
4. Vuelva a suspender el sedimento celular en 5–10 ml de medio NK-Cell según el

número total estimado de células alimentadoras K-562.
5. Realice el recuento de células y la viabilidad utilizando Trypan Blue.

6. Recoja las células seleccionadas con CD56 del matraz T25 ( consulte la Nota 8).
7. Llene el tubo cónico de 50 ml que contiene las células seleccionadas con CD56 con
medios de células NK y centrifugue a 400 × g durante 10 min.
9. Vuelva a suspender el sedimento de células seleccionadas con CD56 en 2 ml de NK-Cell

medio.

11. Para activación celular , Las células seleccionadas con CD56 se cocultivan con
células alimentadoras K-562 irradiadas en una proporción de 1:2 (es decir, 1 célula
NK por 2 células alimentadoras K-562 irradiadas). En un T25 (acostado), agregue hasta
3 × 10 6 células seleccionadas con CD56 y 6 × 10 6 células alimentadoras K-562
irradiadas en 6 ml de medio de células NK suplementado con 200 UI/ml de IL-2 e

incubadas. a 37 °C con 95 % de humedad y 5 % de CO 2.
1. Recoja las células seleccionadas con CD56 cocultivadas con células alimentadoras
3.3.3 Día 3
K-562 irradiadas en un tubo cónico de 50 ml y llene el tubo con medio de células NK
2. Centrifugar las células a 400 × g durante 10 min, a temperatura ambiente.
3. Retire por completo y deseche el sobrenadante. resuspender

el sedimento celular en 5 ml de medio NK-Cell.
5. En un matraz T25, agregue hasta 3 × 10 6 células activadas con CD56 en 6 ml de medio

NK-Cell suplementado con 200 UI/ml de IL-2 e incubado a 37 °C, 95 % de humedad y 5
% CO 6. Prepare la placa de 24 pocillos no tratada con cultivo de tejido recubierta
2 . con
retronectina: Diluya la solución de trabajo de retronectina hasta una concentración final de

7 ÿg/ml en PBS y añada 1 ml de retronectina diluida a cada pocillo. Prepare tantos como
sea necesario.
7. Envuelva la placa recubierta con retronectina en Parafi lm “M” y coloque la placa en un

refrigerador a 4 °C durante la noche ( consulte la Nota 9).
3.4 Células NK Siga diligentemente todas las normas al manipular el vector retroviral y elimine los materiales
Transducción de desecho en consecuencia. El enfoque del capítulo es la transferencia de genes a las
células NK humanas; la producción del vector retroviral no se discutirá aquí.
3.4.1 Día 4 1. Retire la placa recubierta de retronectina del refrigerador a 4 °C y colóquela en el

gabinete de bioseguridad durante 10 min.
2. Retire la retronectina de los pozos y agregue 1 mL de pre

medio de células NK calentado por pocillo.
3. Coloque la placa de 24 pocillos en la incubadora durante 30 min.

4. Durante los 30 min, retire el sobrenadante retroviral del

ÿ80 °C y descongelarlo en un baño de agua a 37 °C.
5. Tan pronto como el sobrenadante retroviral esté completamente descongelado,

coloque el tubo en hielo durante el procedimiento de transducción ( consulte la Nota
10).
6. Retire la placa recubierta de retronectina de la incubadora y aspire el medio de células

NK de los pocillos.
7. Agregue 0,5 mL de sobrenadante retroviral y coloque la placa en la incubadora a 37

durante
°C, 95 % de humedad y 5 % de CO 8. Retire la placa de la incubadora, 30 min.
aspire los 0,5
2
mL de sobrenadante retroviral.
9. Por segunda vez, agregue 0,5 mL de sobrenadante retroviral y coloque la placa en la

incubadora a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de CO
durante 30 min.
2
10. Durante la segunda incubación de 30 min del sobrenadante retroviral, recolecte las
células NK activadas en un tubo cónico de 50 ml y llene el tubo con medio de células
NK ( consulte la Nota 8).
12. Retire por completo y deseche el sobrenadante. resuspender

el sedimento celular en 5 ml de medio NK-Cell.
13. Realice el recuento de células y la viabilidad con Trypan Blue.
14. Ajuste la concentración de células a 300 000 células NK por ml en medio de células NK
y agregue IL-2 a 400 UI/ml.
15. Después de los últimos 30 minutos de incubación, retire el sobrenadante retroviral de

los pocillos y agregue 1 ml de suspensión de células NK (es decir,
300.000 células NK) por pocillo.
16. Agregue 1 ml de sobrenadante retroviral por pocillo. El volumen final por pocillo es
ahora de 2 ml y la concentración final de IL-2 es de 200 UI/ml ( consulte la Nota 11).
17. Mantenga siempre en cultivo algunas células NK no transducidas. Agregue 1 ml de

suspensión de células NK por pocillo en una placa de 24 pocillos separada sin tratar
con tejido y agregue 1 ml de medio de células NK más IL-2 a la concentración final
de 200 UI/ml.
18. Centrifugar las placas a 400 × g durante 1 min, a temperatura ambiente.
19. Incube las placas que contienen las células NK con y sin sobrenadante retroviral a 37
°C en 95 % de humedad y 5 % de CO 2.
3.5 células NK 1. Retire 1 ml de sobrenadante de cada pocillo de las dos condiciones de cultivo (es
Expansión decir, transducido y no transducido) y reemplácelo con medio de células NK nuevo

que contenga 400 UI/ml de IL-2.
3.5.1 Día 6
2. Incube las placas que contienen las células NK con y sin sobrenadante retroviral a 37
°C en 95 % de humedad y 5 % de CO 2.
3.5.2 Día 7 1. Recoja las células NK transducidas y no transducidas en tubos cónicos de 50

ml separados y llénelos con medio de células NK ( consulte la Nota 8).
3. Retire por completo y deseche el sobrenadante. Resuspender los sedimentos

celulares en 5 ml de medio NK-Cell.
4. De cada cultivo, recolecte una alícuota de células y realice el recuento de
células y la viabilidad usando Trypan Blue.
5. Recoja las células alimentadoras K-562 en un tubo cónico de 50 ml, irradie a
100 Gy y centrifugue a 400 × g durante 10 min.
7. Reúna las células alimentadoras K-562 irradiadas en un tubo cónico de 50 ml
y llénelo con medio de células NK y repita el paso de lavado dos veces más.
8. Vuelva a suspender el sedimento celular en 10–20 ml de medio NK-Cell según

el número total estimado de células alimentadoras K-562.
9. Realice el recuento de células y la viabilidad con Trypan Blue.
10. Para la expansión de células NK, cocultivar células NK transducidas y no
transducidas con células alimentadoras K-562 irradiadas en una proporción
de 1:2 (es decir, 1 célula NK por 2 células alimentadoras K-562 irradiadas).
En un matraz T75 (aplanado), agregue hasta 6 × 10 6 células NK y 12 × 10 6
células alimentadoras K-562 irradiadas en 20 ml de medio NK-Cell
suplementado con 200 UI/ml de IL-2 e incubadas. a 37 °C con 95 % de
humedad y 5 % de CO 2.

ml separados y llene los tubos con medio de células NK ( consulte la Nota 8).
3. Retire por completo y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender los

sedimentos de células agrupadas de cada cultivo en 5 a 10 ml de medio de
células NK.
4. Se tomará una muestra para el recuento de células y la viabilidad utilizando

Trypan Blue, y se reservarán 0,5 × 10 6 células para el análisis de la expresión
del transgén mediante análisis de citometría de flujo (si es una técnica
apropiada para detectar el transgén) (Fig. 1 ).
5. En un matraz T75 (aplanado), sembrar 6 × 10 6 células NK en 20 ml de medio
NK-Cell suplementado con 200 UI/ml de IL-2 e incubar a 37 °C en 95 % de
humedad y 5 % CO2 2.

ml separados y llénelos con medio de células NK ( consulte la Nota 8).
Fig. 1 Un ejemplo representativo de transducción y expansión de células NK de sangre de cordón. ( a ) Se transdujeron

células CD56+ de una unidad de sangre de cordón umbilical con un retrovirus de membrana pseudotipado RD114 que
codifica un receptor de antígeno quimérico (scFv) específico para el gangliósido GD2. El análisis de citometría de flujo,
realizado el día 10 del cultivo NK (6 días después de la transducción), muestra una baja contaminación de células CD3+ (~1
%) en ambos cultivos con una eficiencia de transducción >90 %. ( b ) En este ejemplo, el procedimiento de transducción no
afecta la expansión de las células NK (n = 5) (ver Nota 12)

3. Retire por completo y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender los
sedimentos de células agrupadas de cada cultivo en 5 a 10 ml de medio de
células NK.
4. Realice el recuento celular y la viabilidad con Trypan Blue, así como el

análisis de flujo para determinar la eficiencia de la expresión génica, si
corresponde, así como las características fenotípicas de las células NK
modificadas genéticamente.
5. Las células NK transducidas y no transducidas ahora están listas para que
el investigador las use para evaluar los efectos del gen de interés.
4 notas
1. La línea celular K-562 parental (es decir, la línea celular no modificada) así
como la línea celular K-562 modificada [ 16] pueden usarse para la
activación y expansión de las células NK.
2. El método de producción y almacenamiento de sobrenadante retroviral SFG
pseudotipado con virus endógeno felino RD114 se ha descrito previamente
[ 15 ].
3. La centrifugación debe realizarse en una centrífuga de rotor de cubeta oscilante

sin freno y con una aceleración mínima.
4. Consulte las instrucciones del fabricante para conocer los requisitos de los
reactivos y las limitaciones de la columna de selección positiva.
Aunque nunca se probó en nuestro laboratorio, las células CD56+ también se
pueden enriquecer usando otros sistemas disponibles comercialmente.
5. El enriquecimiento esperado de las células CD56+ es superior al 95 % de la

fracción de MNC. Sin embargo, y según la recomendación del fabricante, es
posible aumentar la pureza de las células seleccionadas pasando las MNC
marcadas con CD56 a través de una columna LS recién preparada siguiendo
el procedimiento descrito.
6. Por lo general, comenzamos con 4 × 10 6 células CD56+ seleccionadas para

nuestro experimento de transducción, ya que el proceso de expansión utilizado
en este procedimiento nos permite generar una gran cantidad de células NK
activadas y transducidas. Las células restantes seleccionadas con CD56 se
crioconservan para su uso posterior. Cuando se usan células crioconservadas,
se puede usar el mismo procedimiento para la transducción de células NK con
resultados de eficiencia de transducción idénticos a los de las células CD56+
recién aisladas. Sin embargo, el procedimiento de crioconservación y
descongelación de células seleccionadas con CD56 será responsable de una
pérdida significativa de células viables (~50 % en algunos casos).
7. Las células K-562 se alimentan con medio fresco cada 2 o 3 días. Para alimentar
las células K-562, el cultivo se divide en tres y se añade medio fresco. Es
importante alimentar las células K-562 el día -1 y el día 6, el día anterior a la
activación inicial de las células seleccionadas por CD56 y la expansión de las
células NK, respectivamente.
8. No es inusual observar células NK activadas adheridas (de forma suelta o fuerte

según la muestra y el estado de activación de las células NK) al recipiente de
cultivo. Por lo tanto, para recoger las células NK del recipiente de cultivo es
necesario rasparlas y mezclarlas bien con el medio de células NK. No use
tripsina ya que no es necesaria para recolectar las células NK del recipiente de
cultivo.
9. También es posible preparar una placa recubierta de retronectina

incubando la placa durante 4 h a 37 °C.
10. No deje el sobrenadante retroviral en el baño de agua más tiempo del necesario,
ya que podría provocar una disminución en el título del virus, lo que resultaría
en una eficiencia de transducción deficiente.
11. Para la transducción de células NK, se necesita un total de 2 ml de sobrenadante
retroviral por pocillo. El sobrenadante retroviral debe almacenarse a -80 °C en
alícuotas de volumen adecuado para garantizar la transducción de múltiples
pocillos.
12. Dependiendo de la naturaleza del transgén injertado, la expansión de las células

NK modificadas genéticamente puede variar en comparación con las células
NK no transducidas.
Reconocimiento
Este trabajo fue apoyado por la subvención CA140114 del

Departamento de Defensa (EY, CRC y CMB) y la Subvención de
Investigación Interna (EY) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Te
Referencias
1. Caligiuri MA (2008) Células asesinas naturales humanas. 9. Gajewski TF, Schreiber H, Fu YX (2013)
Sangre. doi: 10.1182/blood-2007-09-077438 2. Células innatas y adaptativas en el microambiente
Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG et al (2006) Sinergia tumoral. Nat Immunol. doi:10.1038/ ni.2703
entre receptores en células NK en reposo para la
activación de la citotoxicidad natural y la secreción de 10. Bollard CM, Rossig C, Calonge MJ et al (2002) Adaptación
citoquinas. Sangre. doi:10.1182/ blood-2005-04-1351 3. de una estrategia de protección tumoral relacionada con
Marcus A, Gowen BG, Thompson TW et al (2014) el factor de crecimiento transformante beta para mejorar
Reconocimiento de tumores por el sistema inmunitario la inmunidad antitumoral. Sangre. doi:10.1182/
innato y células asesinas naturales. Adv Immunol. blood.V99.9.3179 11. Carlsten M, Childs RW (2015)
doi:10.1016/B978-0-12-800267-4.00003-1 Manipulación genética de células NK para inmunoterapia
contra el cáncer: técnicas e implicaciones clínicas.
inmunol frontal. doi:10.3389/fi mmu.2015.00266 12.
4. Brandt CS, Baratin M, Yi EC et al (2009) El miembro de Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G
la familia B7 B7-H6 es un ligando de células tumorales et al (2000) Terapia génica de inmunodeficiencia humana
para la activación del receptor de células asesinas combinada (SCID)-X1 enfermedad. Ciencias. doi:10.1126/
naturales NKp30 en humanos. J Exp Med. doi:10.1084/ severo ciencia.288.5466.669
jem.20090681 5. Baychelier F, Sennepin A, Ermonval M
et al (2013) Identifi cación de un ligando celular para el
receptor de citotoxicidad natural NKp44. Sangre. 13. Pule MA, Savoldo B, Myers GD y otros (2008)
doi:10.1182/blood-2013-03-489054 6. Miller JS, Soignier Células T específicas de virus diseñadas para coexpresar
Y, Panoskaltsis-Mortari A et al (2005) Transferencia receptores específicos de tumor: persistencia y actividad
adoptiva exitosa y expansión in vivo de células NK antitumoral en individuos con neuroblastoma. Nat Med.
haploidénticas humanas en pacientes con cáncer. doi:10.1038/nm.1882
Sangre. doi:10.1182/blood-2004-07-2974 7. Geller MA, 14. Pillet AH, Bugault F, Theze F et al (2009) Un cambio
Cooley S, Judson PL et al (2011) Un estudio de fase II programado de activación dependiente de IL-15 a IL-2
de terapia alogénica con células asesinas naturales para en células NK humanas.
tratar pacientes con cáncer de ovario y de mama recurrente. J Immunol. doi:10.4049/jimmunol.0801933 15. Yvon E,
Citoterapia. doi:10.3109/1 4653249.2010.515582 Del Vecchio M, Savoldo B et al (2009)
Inmunoterapia del melanoma metastásico utilizando
células T específicas de GD2 modificadas genéticamente.
Clin Cáncer Res. doi:10.1158/1078-0432.
CCR-08-3163
8. Parkhurst MR, Riley JP, Dudley ME et al (2011) La
transferencia adoptiva de células asesinas naturales 16. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012) La
autólogas conduce a altos niveles de células asesinas IL-21 unida a la membrana promueve la proliferación ex
naturales circulantes, pero no interviene en la regresión vivo sostenida de células asesinas naturales humanas.
del tumor. Clin Cáncer Res. doi:10.1159/ Más uno. doi:10.1371/jour nal.pone.0030264
1078-0432.CCR-11-1347
capitulo 18
Modificación de células NK expandidas con antígeno quimérico

ARNm de receptor para terapia celular adoptiva
yaya chu , Flor de Allyson , y Mitchell S. Cairo
Resumen
Las células NK son linfocitos citotóxicos derivados de la médula ósea que juegan un papel importante en el rechazo de
tumores y células infectadas por virus. La regulación de la activación de NK frente a la inhibición está regulada por la expresión
de una variedad de receptores de NK (NKR) y ligandos de NKR específicos expresados en sus objetivos. Sin embargo, los
factores que limitan la terapia con NK incluyen un pequeño número de células NK activas en la sangre periférica no expandida
y la falta de un objetivo específico para el tumor. Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) generalmente incluyen un
fragmento variable Fv de cadena única de un anticuerpo monoclonal, una región bisagra transmembrana y un dominio de
señalización como endodímeros CD28, CD3-zeta, 4-1BB (CD137) o 2B4 (CD244). . La redirección de las células NK con un
CAR evitará las limitaciones de la falta de especificidad de direccionamiento de NK. Este capítulo se centra en los métodos
para expandir las células NK humanas de la sangre periférica mediante el cocultivo con células alimentadoras y para modificar
las células NK expandidas de manera eficiente con el ARNm de CAR transcrito in vitro mediante electroporación y para probar
la funcionalidad de CAR-modifi ed células NK expandidas para su uso en inmunoterapia celular adoptiva.
Palabras clave Receptor de antígeno quimérico,Terapia de células asesinas, ARNm , Electroporación , Celda adoptiva
naturales
1. Introducción
Se necesitan urgentemente nuevas terapias que sean efectivas para erradicar

la malignidad resistente y que estén asociadas con baja toxicidad para
mejorar el éxito de la terapia contra el cáncer. La inmunoterapia dirigida es
una estrategia que aumenta el sistema inmunitario existente para mejorar la
citotoxicidad específica del tumor mientras se evitan las toxicidades sistémicas
asociadas con la quimioterapia citotóxica tradicional. Esencial para este
enfoque es la identificación de un antígeno ideal de la superficie de la célula
diana, que se expresa en gran medida en las células tumorales resistentes
pero se expresa mínimamente en el tejido sano.
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos especializados que
son un componente esencial del sistema inmunitario innato y desempeñan
un papel fundamental en la vigilancia y el rechazo de tumores [ 1, 2]. La
función de las células NK está regulada por una combinación de activación e inhibición.
215
216 Yaya Chu et al.
señales que incluyen citocinas proinflamatorias y la interacción del receptor de

superficie de células NK con ligandos de células diana [ 3 - 5]. Sin embargo,
existen varias limitaciones para la citotoxicidad inducida por las células NK,
incluidos pequeños números en la sangre periférica circulante, falta de
especificidad para el objetivo del tumor y regulación negativa inducida por el
tumor de los receptores de citotoxicidad naturales de las células NK [ 5, 6]. Los
receptores similares a inmunoglobulinas asesinas (KIR) son un grupo de
receptores inhibidores de células NK que se unen a ligandos de antígenos
leucocitarios humanos determinados por el complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) de clase I. El reconocimiento KIR de células NK de
moléculas MHC de clase propia media la autotolerancia de la actividad de las
células NK. Esta interacción conduce a la supresión de la citotoxicidad de las
células NK y contribuye al escape inmunológico [ 7]. Los métodos descritos aquí,
incluida la expansión de células NK aisladas de sangre periférica y la
incorporación de un CAR específico del tumor, detallan un mecanismo para superar estas limit
El desarrollo inmunoterapéutico de células NK se ha visto limitado por una
expansión in vitro deficiente y una vida útil prohibitivamente corta. Expansión de
células NK derivadas de sangre periférica (PBNK) después de la exposición de
células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) a células presentadoras
de antígenos artificiales K562 modificadas genéticamente inactivadas (aAPC)
que expresan interleucina unida a la membrana (IL)-15 y ligando 4-1BB en el la
presencia de IL2 produce un rendimiento significativo de células NK con más
del 96 % de pureza y alta expresión de receptores activadores [ 8, 9].
Alternativamente, la aAPC basada en K562 que expresa IL21 demuestra un
fenotipo y una citotoxicidad similares, mejora la producción
aumentade
significativamente
citoquinas y
la expansión de las células NK y una proliferación más sostenida en comparación
[ 10 ].
La inmunoterapia basada en CAR crea un mecanismo para dirigir el
sistema inmunitario innato hacia un objetivo específico de células cancerosas.
Los CAR son receptores artificiales compuestos por un fragmento variable de
cadena única derivado de un anticuerpo monoclonal específico de antígeno
unido a un dominio de señalización intracelular [ 11]. Los CAR específicamente
dirigidos incorporados en las células T o NK crean una oportunidad para que el
reconocimiento específico del objetivo se combine con la activación
terapia
celular.
de La
células T con CAR se ha mostrado prometedora en los ensayos clínicos, pero
puede estar asociada con complicaciones graves, como el síndrome de
liberación de citocinas y la aplasia de células B [ 12–15 ]. La terapia con células
NK no se ha asociado con estas toxicidades y se ha demostrado que induce un
efecto antitumoral significativo en ausencia de enfermedad de injerto contra huésped (EICH)
[ 16]. Nuestro grupo ha demostrado que las células NK modificadas con CAR
anti-CD20 aumentaron significativamente la citotoxicidad in vitro y redujeron la
carga tumoral y prolongaron significativamente la supervivencia de los
xenoinjertos in vivo contra el linfoma no Hodgkin de células B CD20 + (B-NHL)
en comparación con Controles CAR-negativos [ 9].
El ARNm de CAR específico del tumor se genera y se incorpora en células
NK expandidas utilizando un método de transfección basado en electroporación
no viral. Posteriormente, la expresión de CAR se detecta mediante citometría
de flujo utilizando un anticuerpo específico de fragmento. cuando se usa para
Modificación de células NK expandidas con ARNm de receptor de antígeno quimérico… 217
el desarrollo de células NK modificadas con CAR anti-CD20, la transfección basada

en electroporación no afectó la expresión de los receptores activadores de PBNK
(CD16, CD69, NKG2D, CD244, NKp30, NKp44, NKp46) o los receptores inhibidores
(NKG2A, KIR2DS4 , CD94, CD158a, CD158b, CD158e). Además, la citotoxicidad in
vitro y la producción de interferón intracelular (IFN)-ÿ mejoraron significativamente
con las células NK modificadas con CAR anti-CD20 contra las líneas celulares de
leucemia/linfoma de células B CD20 + [ 9 ].
Una vez activadas, las células NK funcionan por citotoxicidad directa y por la
producción de citocinas activadoras que reclutan la respuesta inmunitaria antitumoral
adaptativa. La producción de células NK de IFN-ÿ y TNF inhibe directamente el
crecimiento y la propagación de tumores y recluta células T y células dendríticas,
que son los componentes clave de la inmunidad antitumoral adaptativa [ 17, 18].
CD107a como marcador de desgranulación de células NK y citotoxicidad directa,
expresión de IFN gamma como marcador de producción de citocinas y ensayo
estándar de liberación de europio se utilizan para medir la activación de células NK y
la citotoxicidad in vitro [ 19 ].
La siguiente es una descripción detallada de los métodos para el desarrollo de

células PBNK modificadas con CAR y la evaluación de la citotoxicidad mejorada in
vitro. Aquí, las células PBNK expandidas modificadas con CAR anti-CD20 y su
citotoxicidad contra las líneas celulares B-NHL se utilizan como ejemplo. Sin
embargo, este método es generalmente aplicable a una célula tumoral diana
alternativa con un antígeno de superficie celular elegible y una célula CAR NK
modificada reactivamente.
2 materiales
2.1 Expansión de 1. Leucocitos obtenidos tras consentimiento informado de personas sanas

células NK donantes
2. Células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) obtenidas por separación

2.1.1 Expansión de
en gradiente de Ficoll (Amersham Biosciences).
células NK por cocultivo con
las células alimentadoras irradiadas 3. La línea celular K562-mb15-41BBL o la línea celular K562-mb21-41BBL
línea celular [ 8 ] ( ver Nota 1 ).
4. Medio de cultivo NK: RPMI-1640 (Life Technologies), +10 % de suero fetal bovino
(FBS) y penicilina y estreptomicina + 40 UI de interleucina-2 humana
recombinante (IL-2)(Life Technologies).
5. Irradiador de rayos X RS 2000 (Rad Source Technologies, Inc.).
2.1.2 Aislamiento NK 1. Tampón de separación celular: Solución salina tamponada con fosfato (PBS): pH
7,2, BSA al 0,5 % y EDTA 2 mM.
2. Medio de cultivo NK.
3. Kit de aislamiento de NK humano (Miltenyi Biotec).
4. Separador MidiMACS y columna LS (Miltenyi Biotec).

218 Yaya Chu et al.
2.2 Nucleofección 1. Vectores: pcDNA3 o pVAX1 (Life Technologies) que contienen un promotor
de ARNm de CAR T7 y un fragmento CAR anti-CD20 ( ver Nota 2 ).
2.2.1 Generación 2. Enzimas de restricción: XhoI o XbaI y tampón de digestión (New England
de ARNm de CAR
Biolabs).
3.Kit Wizard ® SV Gel y PCR Clean-Up System (Promega).
4. Kit de transcripción in vitro (mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit, Life
Technologies) que contiene agua libre de nucleasas, T7 Enzyme Mix, 10×T7
Reaction Buffer, T7 2×NTP/ARCA, TURBO DNase, E-PAP, 25 mM MnCl 10
solución mM ATP, tampón 5xE-PAP y cloruro de litio
2, (LiCl).
2.2.2 Nucleofección 1.Nucleofector (Lonza).

2. ARNm de CAR.
3. Agua libre de nucleasas.
4.Amaxa ® HumanNK Cell Nucleofector ® Kit (Lonza) que contiene solución

nucleofectora de células NK humanas, suplemento, cubetas certificadas y
pipetas de plástico.
5. Medio de cultivo NK.
2.2.3 Análisis de citometría 1. IgG anti-ratón de cabra, anticuerpo específico de fragmento F(abÿ) 2
de flujo de expresión de CAR conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch).
en células NK
2. Tampón de tinción: PBS que contiene 0,1 % (v/v) de NaN 3

con 1 %
[p/v] albúmina de suero bovino.
3.Analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec).
2.3 Análisis funcional 1. Líneas celulares y dianas tumorales: las líneas celulares humanas Ramos,
de células NK Daudi, RS4;11, U698M y las líneas ALL de células T Jurkat adquiridas de
expandidas modificadas con American Type Culture Collection, ATCC; Raji, células Raji-2R y Raji-4RH
CAR in vitro resistentes a rituximab proporcionadas por Matthew Barth, MD y Myron
Czuczman, MD del Roswell Park Cancer Institute [ 20 ] ( consulte la Nota 3 ).
2.3.1 Citotoxicidad in vitro
2. Medio de cultivo: RPMI-1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al

10 % (FBS; Gibco) y penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (Gibco).
3. Kit de citotoxicidad DELFIA ® EuTDA (Perkin Elmer) que contiene reactivo

DELFIA BATDA, 1 vial (50 ÿL), tampón de lisis DELFIA, 1 vial (0,5 mL),
solución de europio DELFIA, 1 frasco (200 mL) y 10 placas de microtitulación
DELFIA (96 -bien).
4. Un fluorómetro de resolución temporal (Perkin Elmer).
2.3.2 Célula tumoral 1. Células PBNK expandidas (CAR ÿ exPBNK) y células PBNK expandidas
Recuperación modificadas con ARNm de CAR (CAR + exPBNK).
2. Células diana tumorales.
3. Medio de cultivo: RPMI-1640 suplementado con 10 % fetal

suero bovino (Life Technologies).
4. CD19-Ficoeritrina (BD Biosciences) y 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (BD

Biosciences) ( ver Nota 4 ).
5.BD FACScan (BD Biociencias).
2.3.3 Intracelular 1. Células PBNK expandidas (CAR - exPBNK) y ARNm de CAR

Ensayos de CD107a e IFN-ÿ Células PBNK expandidas modificadas.
2. Células diana tumorales.
3. Medio de cultivo: RPMI-1640 suplementado con 10 % fetal

suero bovino (Life Technologies).
4. Anticuerpos: Anti-CD107a-FITC, anti-CD56-PE, anti-INF ÿ-PE, anti-CD56-PE-Cy5

(todos de BD Biosciences).
5. Kit BD Cytofi x/Cytoperm™ Plus Fixation/Permeabilization (BD GolgiPlug™ protein

transport inhibitor) (BD Biosciences) que contiene la solución Fixation/
Permeabilization, BD Perm/Wash™ Buffer y brefeldina A.
6. Un citómetro de flujo FACScan (BD) o un analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec).
3 métodos
3.1 Expansión 1. Resuspender PBMNC en medio de cultivo NK a una concentración de 1 × 10 6

de células NK células/mL.
2. Irradie las células K562-mb15-41BBL con una irradiación ÿ de 100 Gy.

3.1.1 Expansión de células NK
mediante cultivo conjunto con

3. Lave las células K562-mb15-41BBL irradiadas una vez y resuspéndalas en medio
células alimentadoras irradiadas de cultivo NK a una concentración de 1 × 10 6 células/ml.
4. Mezcle el mismo volumen de PBMNC resuspendido y células K562-mb15-41BBL

irradiadas en tubos cónicos de 50 ml.
5. Transfiera las células mixtas a placas de 24 pocillos con 2 ml de células mixtas en

cada pocillo ( consulte la Nota 5 ).
6.Incubar a 37 °C en CO2 al 5 % 2.
7. Alimente las células cada dos días retirando suavemente la mitad del sobrenadante
y agregando el mismo volumen de medio de cultivo NK.
8. El día 7 y 14, cuente las células y también controle el NK

expansión por citometría de flujo ( ver Nota 6).
3.1.2 Aislamiento NK 1. Recoja las células expandidas después de 14 días de cocultivo con células
alimentadoras irradiadas en tubos cónicos de 50 ml y determine el número total
de células.
2. Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante

por completo.
220 Yaya Chu et al.
3. Vuelva a suspender el sedimento celular en 40 ÿL de tampón de separación celular por

1 × 10 7 células totales.
4. Agregue 10 ÿL de cóctel de biotina-anticuerpo de células NK por 1 × 10 7

celdas totales ( ver Nota 7 ).
5.Mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 °C.
6.Agregue 30 ÿL de tampón de separación celular por 1 × 10 7 células totales.
7. Agregue 20 ÿL de cóctel de microesferas de células NK por 1 × 10 7 en total

células.
8. Mezcle bien y refrigere por 15 min adicionales (4–8 °C).
9. Lave las células agregando 1–2 mL de tampón de separación celular por 1 × 10 7

células y centrifugue a 300 × g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante por completo.
10. Vuelva a suspender hasta 10 8 células en 500 ÿL de tampón de separación celular

11. Coloque una columna LS en un campo magnético de un separador adecuado y enjuague

la columna con 3 ml de tampón de separación.
12.Aplique la suspensión celular en la columna.
13. Recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través de la columna.
14. Lavar la columna dos veces con 3 ml de tampón de separación celular y

recoger el efluente total.
15. Centrifugar el efluente a 300 × g durante 10 min.
16. Resuspender las células en medio de cultivo NK a una concentración de 2,5 × 10 6

células/mL.
17. Transferir las células a matraces de cultivo de tejidos.
18.Incubar a 37 °C en CO al 5 % 2.
19. Cada 2 días, retire suavemente la mitad del sobrenadante y agregue el mismo volumen
de medio de cultivo NK (complementando IL2 para todo el volumen) hasta su uso ( ver
Nota 9 ).
3.2 Nucleofección de 1. Linealice el plásmido pcDNA3 o pVAX1 que contiene un sitio promotor de T7 y el CAR
ARNm de CAR con una enzima de restricción ( consulte la Nota 10 ).
2. Purificar el plásmido linealizado con Wizard ® SV Gel y PCR

3.2.1 Producción
Kit de sistema de limpieza (Promega).
de ARNm de CAR
3. Disolver el plásmido purificado en tampón TE a una concentración de

0,5–1 mg/ml.
4. Conjunto de reacción de transcripción con tapa para una reacción de 20 ÿL: Mezcle 1
ÿg del plásmido linealizado, 10 ÿL de T7 2×NTP/ ARCA, 2 ÿL de tampón de reacción
10× T7, 2 ÿL de T7 Enzyme mix y sin nucleasas agua hasta un total de 20 ÿL en un
tubo libre de ARNasa ( ver Nota 11 ).
5. Incubar a 37 °C durante 2 h ( ver Nota 12 ).

6. Agregar 1 ÿL de TURBO DNase, mezclar e incubar a 37 °C por

15 minutos.
7. Procedimiento de colas de poli (A): agregue 36 ÿL de agua libre de

20 ÿL de tampón 5xE-PAP, 10 ÿL de solución de MnCl ATP 2, nucleasas, 10 ÿL de
25 mM y 4 ÿL de E-PAP a la reacción de transcripción tapada de 20 ÿL y
mezcle bien.
8.Incubar a 37 °C durante 45 min.
9. Recuperación de ARN: agregue 50 ÿL de LiCl, mezcle bien y enfríe durante

ÿ30 min a ÿ20 °C.
10. Centrifugar a 12 000 g durante 15 min a 4 °C para sedimentar el ARN.

11.Retire el sobrenadante.
12. Agregue 1 mL de etanol al 70 % e invierta el tubo varias veces para
mezcla.
13. Centrifugar a 12.000 g durante 15 min a 4 °C.

14. Retire el sobrenadante y seque al aire el sedimento durante 10 min.
15. Disuelva el ARNm en agua libre de nucleasas a una concentración
de 1,0 mg/mL ( ver Nota 13 ).
16. Conservar a ÿ80 °C hasta su uso.
3.2.2 Nucleofección 1. Para una sola reacción, mezcle 82 ÿL de Nucleofector ® Solution con 18 ÿL
de suplemento para hacer 100 ÿL de tampón de electroporación total en
cabina de bioseguridad.
2. Centrifugue 5–6 × 10 6 células NK purificadas expandidas a 200 g, para
10 min, a temperatura ambiente (RT) ( ver Nota 14 ).
3.Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en PBS.
4. Centrifugar a 200 g , durante 10 min, a temperatura ambiente.
5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 ÿL de

tampón de electroporación.
6. Agregue ARNm de CAR a las células NK en un tampón de electroporación
a 80–100 ÿg/mL.
7. Transfiera la suspensión de células/ARNm a la cubeta de electroporación
certificada. Cierre la cubeta con la tapa ( ver Nota 15 ).
8.Seleccione el Nucleofector ® Programa U-001 ( ver Nota 16 ).
9. Introducir la cubeta en el Nucleofector ® y aplicar el seleccionado
programa.
10. Regrese la cubeta a la cabina de bioseguridad y con un aspirador agregue
~500 ÿL del medio de cultivo NK precalentado a la cubeta y transfiera
suavemente la muestra a una placa de 12 pozos (volumen final de 4 mL de
medio NK por pozo/ muestra).
11. Incubar las células en humidifi cado a 37 °C/5 % CO hasta su 2
incubadora
uso.
222 Yaya Chu et al.
3.2.3 Análisis de citometría 1. Después de 16 h de electroporación, transfiera las células NK nucleofectadas

de flujo de expresión de CAR (aproximadamente 2 × 10 5 células)5aml.
un tubo de ensayo de polipropileno de
en células NK
2. Centrifugar la suspensión de células durante 3 min a 400 × g, desechar el

sobrenadante y lavar las células en PBS helado 3 veces.
3. Vuelva a suspender las células en 100 ÿL de tampón de tinción que contenga

un anticuerpo de cabra anti-ratón IgG, fragmento F(abÿ) 2 específico conjugado
con FITC (dilución 1:100). Vórtice los tubos antes de la incubación.
4. Incubar durante 30 min en hielo.
5. Lavar las células dos veces con PBS helado.
6. Deseche la solución de lavado, resuspenda las células en 200 ÿL de tampón

de tinción que contenga 20 ÿL de 7-AAD. Analizar las células por citometría de
flujo.
La figura 1 proporciona los datos representativos del diagrama de puntos de

citometría de flujo de la expresión y la duración de CAR en células
electroporatedexPBNK.
Fig. 1 Expresión de CAR anti-CD20 en células PBNK expandidas ex vivo mediante nucleofección de ARNm de CAR. ( a ) El ARNm
anti-CD20 se nucleofectó en células PBNK expandidas y se siguió la expresión de CAR mediante citometría de flujo .
Los diagramas de densidad de citometría de flujo ilustran la expresión de CAR anti-CD20 en uno de los 10 donantes y el porcentaje
de células NK que expresan CAR anti-CD20 determinado por citometría de flujo 16 h después de la nucleofección (p < 0,001).
Los valores promedio se informan como la media ± SEM (n = 10). Se anotó el valor de p utilizando la prueba t de Student no apareada.
( b ) La expresión de CAR anti-CD20 se controló mediante citometría de flujo en los tiempos indicados después de la nucleofección.
Reproducido con autorización de: Chu Y, Hochberg J, Yahr A et al (2015) Targeting CD20 + linfoma no Hodgkin agresivo de células
B mediante células asesinas naturales expandidas modificadas con ARNm CAR anti-CD20 in vitro y en ratones NSG. Cáncer Immunol
Res 3: 333–344. doi:10.1158/2326-6066.CIR-14-0114
3.3 Funcional Aquí describimos un procedimiento para un ensayo de citotoxicidad de europio TDA (EuTDA)
Análisis de CAR no radiactivo, de fluorescencia resuelta
DELFIA de Perkin en el
Elmer. Latiempo,
Figura basado en la la
2 ejemplifica conocida tecnología
citotoxicidad in vitro de
NK ampliado modifi cado exPBNK CAR + anti-CD20 contra células B-NHL CD20 + .
células in vitro
3.3.1 Citotoxicidad in vitro

1. Caliente el tampón de lisis en un baño de agua (37 °C) justo antes de usarlo. Deje que
los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de usarlos. Compruebe que el
ligando potenciador de la fluorescencia esté completamente descongelado antes de su uso.
Fig. 2 El ARNm de CAR anti-CD20 potencia la actividad citolítica in vitro de PBNK expandida contra células B-NHL CD20 + .
Las células PBNK expandidas se sometieron a electroporación en ausencia (simulacro, color gris) o en presencia de ARNm de
CAR anti-CD20 (CAR, color negro). La citotoxicidad in vitro se midió mediante un ensayo estándar de liberación de europio. ( a )
Células MOCK y CAR exPBNK se incubaron con Ramos sensibles a CD20 + NK marcados con BATDA (arriba a la izquierda),
Daudi resistente a CD20 + NK (arriba en el centro) y U-698-M (arriba a la derecha) en la E indicada relaciones /T. ( b ) Células
MOCK y CAR exPBNK se incubaron con Jurkat sensible a CD20 ÿ NK marcado con BATDA (arriba) y Rs4;11 resistente a CD20
ÿ NK (abajo) en las proporciones E/T indicadas como controles. ( c ) Células MOCK y CAR exPBNK se incubaron con Raji
sensible a rituximab CD20 + marcado con BATDA y Raji-2R y Raji-4RH resistentes en la relación E/T = 10:1. Cada punto de
datos representa el porcentaje medio (±SEM, n = 4) de liberación específica de europio después del cultivo. Se anotaron los
valores de p utilizando la prueba t de Student no apareada. Reproducido con autorización de: Chu Y, Hochberg J, Yahr A et al
(2015) Targeting CD20 + linfoma no Hodgkin agresivo de células B mediante células asesinas naturales expandidas modificadas
con ARNm CAR anti-CD20 in vitro y en ratones NSG. Cáncer Immunol Res 3: 333–344. doi:10.1158/2326-6066.CIR-14-0114
224 Yaya Chu et al.
2. Lave las células diana del tumor una vez con un cultivo de PBS o NK
medio.
3. Ajuste el número de células a aproximadamente 1 × 10 6 células/mL. Agregue 5 ÿL del

reactivo de etiquetado DELFIA ® BATDA a 2–4 mL de células en medio de cultivo.
Incubar durante 20–30 min a 37 °C en una incubadora de células ( ver Nota 17 ).
4. Centrifugue las células y resuspéndalas en PBS.
5.Lave las celdas de 3 a 5 veces. Vuelva a suspender el sedimento celular con cuidado.
6. Después del lavado final, resuspender el precipitado en medio de cultivo y ajustar a

aproximadamente 1 × 10 5 células/mL.
7. Pipetee 100 ÿL de células objetivo cargadas (10 000 células) por pozo, para
una placa de 96 pocillos estéril de fondo redondo.
8. Vuelva a suspender las células NK en el medio de cultivo y agregue 100 ÿl de células

CAR + o CAR ÿ exPBNK en una proporción variable de efector:objetivo (de 1:1 a 10:1)
9. Establecer pozos para la detección de fondo, liberación espontánea,

y liberación máxima ( ver Nota 19 ).
10. Incubar durante 4 h en una atmósfera humedecida con 5 % de CO 2 a 37 °C.
11. Centrifugar durante 5 min a 500 × g .
12. Transfiera 20 ÿL del sobrenadante a una placa de fondo plano.
13.Agregue 200 ÿL de solución Eu.
14.Agitar a 250 rpm con un agitador de placas de al menos 3 mm.

15. Mida la fluorescencia en un fluorómetro de resolución temporal dentro de las 5 h
16. El porcentaje de liberación específica se calculó de la siguiente manera:
% de liberación específica = 100 × (Liberación experimental ÿ liberación espontánea)/

(Liberación máxima ÿ liberación espontánea)
Todas las pruebas se realizaron por triplicado o por cuadruplicado.
3.3.2 Célula tumoral

Para examinar más a fondo si las células CAR + exPBNK destruyen y lisan las células
Recuperación
tumorales, aquí describimos un procedimiento para el ensayo de recuperación de células
tumorales.
1. Lavar las células diana tumorales con PBS o medio de cultivo 3

veces.
2. Después del lavado final, resuspender el sedimento en medio de cultivo y ajustar a

aproximadamente 1 × 10 5 células/mL.
3. De manera similar al Subtítulo 3.3.1, agregue 100 ÿL de células objetivo (10 000 células)
por pocillo a una placa estéril de 96 pocillos de fondo redondo.
4. Agregue 100 ÿL de células CAR + o CAR ÿ exPBNK resuspendidas a una concentración

de 1 × 10 6 células/mL (E:T 10:1).
5. Para controlar los pozos (sin células exPBNK), agregue 100 ÿL de medio de cultivo.
6. Incube durante la noche en una atmósfera humedecida con 5 % de CO 2 a

37 °C.
7. Centrifugar la suspensión de células durante 3 min a 400 × g, desechar el

sobrenadante y lavar las células una vez en PBS helado 3 veces.
8. Vuelva a suspender las células en 100 ÿL de tampón de tinción que contenga

CD19-PE (BD Biosciences) ( consulte la Nota 4 ).
9.Incubar durante 30 min en hielo.
10. Lavar las células dos veces con PBS helado.
11. Deseche la solución de lavado y resuspenda las células en 200 ÿL de tampón

de tinción que contenga 7-AAD. Analizar las células por citometría de flujo.
3.3.3 Intracelular CD107a e IFN-ÿ producidos por las células NK están ligados funcionalmente a sus
Ensayos de CD107a e IFN-ÿ actividades citolíticas. Aquí describimos el procedimiento para examinar el CD107a
intracelular y el IFN-ÿ producidos por las células CAR + y CAR - exPBNK.
1. Centrifugue las células CAR + y CAR ÿ exPBNK y resuspender en medio de

cultivo a 1 × 10 6 células/mL.
2. Agregue 100 ÿL de la suspensión de células efectoras por pocillo a la placa de

96 pocillos de fondo redondo.
3. Centrifugue las células objetivo y resuspender a 1 × 10 5 células/mL en

medio cultural.
4. Pipetee 100 ÿL de suspensión de células diana por pocillo en la placa de 96

pocillos de fondo redondo para mezclar con las células efectoras.
5. Agregue 20 ÿL de anti-CD107a-FITC (BD Biosciences) a cada pocillo e incube

durante 1 hora a 37 °C.
6. Después de 1 h, agregue 20 ÿL de medio de cultivo suplementado con inhibidor

del transporte de proteínas BD GolgiPlug™ que contiene brefeldina A (diluido
1:100) e inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ que contiene
monensina (diluido 1:150) a cada pocillo, y devuelva las células a la incubadora
a 37 °C durante 4 a 6 h ( consulte la Nota 21 ).
7.Después de 4 a 6 h, centrifugue las células a 450 × g durante 3 min.
8. Vuelva a suspender las células en 50 ÿL de solución de tinción que contenga

anti-CD56-PE-Cy5 e incube las muestras en la oscuridad durante 30 min a 4
°C.
9. Centrifugar las células a 450 g durante 3 min.
10. Vuelva a suspender completamente las células en 100 ÿL de solución de fijación/

permeabilización por pocillo para placas de micropocillos e incube durante 20
min a 4 °C.
11. Lave las células dos veces en tampón 1x BD Perm/Wash™ (250 ÿL por pocillo)
y centrifugue las células a 450 g durante 3 min ( consulte la Nota 22 ).
226 Yaya Chu et al.
12. Vuelva a suspender completamente las células fijadas/permeabilizadas en 50

ÿL de tampón BD Perm/Wash™ que contiene 20 ÿL de anti-INF ÿPE. Incubar
a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
13. Lave las células 2 veces con tampón BD Perm/Wash™ 1x y vuelva a
suspender en tampón de tinción para el análisis de citometría de flujo.
4 notas
El grupo de Dean Lee ha demostrado recientemente que las células 1.K562-

mbIL21-41BBL soportan una expansión media de 47.967 veces de las
células NK con un aumento significativo en la longitud de los telómeros en
las células NK [ 10]. Habíamos expandido con éxito las células NK con
ambas células alimentadoras y habíamos modificado con éxito ambas
células NK expandidas con ARNm CAR anti-CD20 [ 9]. Los métodos y pasos
descritos en este capítulo que usan células PBNK expandidas K562-
mbIL15-41BBL se aplicarán a las células PBNK expandidas K562-
mbIL21-41BBL.
2. Utilizamos CAR anti-CD20 como ejemplo para describir los métodos y pasos
sobre cómo electroporar las células NK expandidas modificadas con ARNm
de CAR transcrito in vitro. Los métodos se pueden adaptar y aplicar en
cualquier otro CAR para modificar las células NK expandidas con la
electroporación de ARNm de CAR.
3. Las células tumorales enumeradas aquí son para ensayos citolíticos que
utilizan células NK expandidas modificadas con CAR anti CD20, como se
describe en nuestro estudio anterior [ 9]. Si se usa un CAR diferente para
modificar las células NK expandidas, se deben elegir células tumorales que
expresen un antígeno específico que pueda ser reconocido por ese CAR.
4. El anticuerpo CD19-Ficoeritrina se eligió para monitorear los objetivos
modificadas con ARNmtumorales
anti-CD20
totales
CAR
cuando
CD20se+usaban
CD19 +células
como describimos
exPBNK
[ 9]. Si se usa un CAR diferente para modificar las células NK expandidas,
se debe elegir un anticuerpo diferente que reconozca el antígeno específico
de la célula tumoral.
5. Las células NK se expandirán y crecerán mejor cuando se cultiven a

densidades celulares que permitan el contacto entre células. Por lo general,
transferimos 2 mL de las células diluidas mezcladas a un pozo en una placa
de 24 pozos a una concentración final de 1–1.5 × 10 6/mL para PBMC10 y 16 ×/
mL de células K562-mb15-41BBL por así como lo informado previamente
por el Dr. Darío Campana [ 8]. Cuando se utilizan células K562-mbIL21 -
41BBL irradiadas como alimentadores, las PBMC se cocultivarán con células
K562-mbIL21-41BBL irradiadas en matraces T-75 en una proporción de 1:2
(PBMC:alimentador) en medio de células NK en 2 × 105 PBMC/ml.cultivos
Los
se actualizarán con cambios de medio de medio volumen cada 2 o 3 días y
se volverán a estimular con células K562-mbIL21-41BBL irradiadas en una
proporción de 1:1 cada 7 días [ 10 ].
6. Después de 5 a 7 días de cocultivo, las células deben controlarse diariamente para

detectar cambios en el pH y la morfología del medio. Si la expansión va bien,
podrás ver los cambios de forma de las celdas. Las células NK continuarán
expandiéndose en cultivo durante 1 o 2 semanas más. Las celdas deben dividirse
si están demasiado llenas.
7. Para aislar las células NK intactas de la mezcla de expansión.

Las células no NK, es decir, las células T, las células B, las células madre, las
células dendríticas, los monocitos, los granulocitos y las células eritroides, se
marcan magnéticamente indirectamente mediante el uso de un cóctel de anticuerpos
conjugados con biotina y el cóctel de microesferas de células NK. El aislamiento de
células NK altamente puras se logra mediante el agotamiento de las células
marcadas magnéticamente. La pureza de las células NK después del aislamiento
debe ser superior al 95 %.
8. Para números de celda más altos, aumente el volumen del búfer en consecuencia.
9. Las células NK aisladas pueden ser viables durante unas 2 o 3 semanas en medio
de cultivo NK. Luego pasarán por apoptosis y morirán.
10. El ADN del plásmido debe estar relativamente libre de proteínas y ARN contaminantes
y debe linealizarse con una enzima de restricción aguas abajo del inserto que se
va a transcribir. En general, vale la pena examinar el ADN molde linealizado
mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que la escisión es
completa porque incluso una pequeña cantidad de plásmido circular puede afectar
la síntesis del ARNm deseado.
11. Las siguientes cantidades son para una sola reacción de 20 ÿL cuando el ARN
producido tendrá una longitud de 300 bases a 5 kb. Las reacciones se pueden
escalar hacia arriba o hacia abajo si se desea. Vórtice el tampón de reacción T7
10× y el NTP/ARCA T7 2× hasta que estén completamente disueltos. Una vez
descongelados, almacene los ribonucleótidos T7 (2x NTP/ARCA) en hielo, pero
mantenga el tampón de reacción 10x T7 a temperatura ambiente mientras ensambla
la reacción. La espermidina en el tampón de reacción T7 10x puede coprecipitar el
ADN molde si la reacción se ensambla en hielo.
12. Por lo general, se logra un rendimiento del 80 % después de 1 hora de incubación. Para
obtener el máximo rendimiento, se recomienda una incubación de 2 h.
13. Las concentraciones y la calidad del ARN se midieron con un espectrofotómetro

Nano (Thermo-Fisher) a 260 nm frente a 280 nm.
Se espera que el rendimiento de ARNm sea de aproximadamente 30 ÿg para cada
reacción.
14. Para células exPBNK recién aisladas, no se requiere cultivo antes de Nucleofection
®. Para las células exPNK crioconservadas, recomendamos incubar las células
descongeladas durante la noche a 37 °C en medio NK antes de Nucleofection ®
.
15. La muestra debe cubrir el fondo de la cubeta sin aire

burbujas
228 Yaya Chu et al.
16. U-01 para dispositivo Nucleofector ® I, U-001 para Nucleofector ® II

Dispositivo.
17. Temperatura de etiquetado: 4–37 °C, use la temperatura que su línea celular
soporte mejor. La alta temperatura se correlaciona con una carga más
rápida. Tiempo de etiquetado: de 5 a 30 minutos, por lo general, una línea
celular muy sensible no debe etiquetarse por más de 5 a 10 minutos. Etiquete
hasta que obtenga una señal máxima superior a 15,000–20,000, evite cargar
demasiado tiempo. Concentraciones de etiquetado: las concentraciones
más altas de BATDA dan como resultado una señal más alta hasta que se
alcanza una meseta.
18. Dependiendo de la línea celular, la cantidad óptima de células diana por pozo
normalmente está en el rango de 5000 a 10 000 células. Usualmente usamos
10,000 celdas objetivo. El ligando debe usarse solo en ensayos a corto plazo
y el tiempo de incubación no debe exceder las 4 h.
19. Antecedentes: Se centrifuga una alícuota (tomada inmediatamente) de la
suspensión de células diana etiquetadas diluidas. Se pipetean 100 ÿL del
sobrenadante en los pozos y se agregan 100 ÿL de medio. Se transfieren 20
ÿL a la placa de medición y se agregan 200 ÿL de solución de Eu. Agite la
placa durante 15 minutos y mida la fluorescencia. Liberación espontánea:
Incubar las células diana (100 ÿL) con 100 ÿL de medio en lugar de células
efectoras. Después de la centrifugación, transfiera 20 ÿL del sobrenadante a
la placa de fondo plano y agregue 200 ÿL de solución de Eu.
Agitar durante 15 min y medir. Añadir probenecid (1–2 mmol/L)

(Sigma P8761) en la solución de lavado si es necesario para reducir la
liberación espontánea. Liberación máxima: Incubar las células diana (100
ÿL) con 100 ÿL de medio suplementado con 10 ÿL de tampón de lisis DELFIA
o 100 ÿL de células diana en 100 ÿL de Triton X-100 al 2 % (concentración
final al 1 % de Triton X- 100). Después
del sobrenadante de ladecentrifugación,
a la placa fondo plano y transfiera 20 ÿL
agregue 200 ÿL
de solución de Eu. Agitar durante 15 min y medir.
20. La actividad citolítica se puede evaluar usando un fluorómetro de resolución

temporal usando el vector (Perkin Elmer) o el lector de microplacas multimodo
FilterMax F5 (Molecular Device).
21. Por lo general, incluimos mAb anti-CD107a conjugado con fluorocromo durante
el ensayo de estimulación para mejorar la sensibilidad para la detección de
células desgranuladas como se describió previamente por Alter et al. [ 21].
Para evitar la degradación de CD107a internalizado, se puede agregar
monensina a dichos ensayos [ 21]. Brefeldin A se agrega para prevenir la
secreción de citoquinas [ 22 ].
22. La agregación celular se puede evitar agitando en vórtex antes de agregar la
solución de fijación/permeabilización. El tampón BD Perm/Wash™ debe
mantenerse en los pasos de lavado para mantener las células permeabilizadas.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Erin Morris, RN, por su excelente ayuda en

la preparación de este manuscrito. Los autores también agradecen al Dr.
Dario Campana (St. Jude Children's Research Hospital) y el Dr.
Terrence Geiger (St. Jude Children's Research Hospital) por
proporcionar amablemente scFv anti-CD20. La investigación para este
estudio fue apoyada por la subvención de la Pediatric Cancer Research
Foundation y el New York Medical College Intramural Research Award.
Referencias
1. Paust S, von Andrian UH (2011) Memoria de células 11. Eshhar Z, Waks T, Gross G et al (1993) Activación
asesinas naturales. Nat Immunol 12:500–508 2. específica y orientación de linfocitos citotóxicos a
Vivier E, Raulet DH, Moretta A et al (2011) través de cadenas simples quiméricas que consisten
¿Inmunidad innata o adaptativa? El ejemplo de las en dominios de unión a anticuerpos y las
células asesinas naturales. Ciencia 331: 44–49. subunidades gamma o zeta de inmunoglobulina y
doi:10.1126/science.1198687 3. Vivier E, Tomasello receptores de células T. Proc Natl Acad Sci USA
90:720–724 12. Porter DL, Levine BL, Kalos M et al
E, Baratin M et al (2008)
Funciones de las células asesinas naturales. Nat (2011)
Immunol 9:503–510. doi:10.1038/ni1582 4. Raulet Células T modificadas con receptor de antígeno
quimérico en la leucemia linfoide crónica. N Engl J
DH, Vance RE (2006) Autotolerancia de las células
asesinas naturales. Nat Rev Immunol 6:520– 531. Med 365:725–733. doi:10.1056/NEJMoa1103849
doi:10.1038/nri1863 5. Shereck E, Satwani P, Morris 13. Grupp SA, Kalos M, Barrett D et al (2013)
Células T modificadas con receptor de antígeno
E et al (2007)
Células asesinas naturales humanas en salud y enfermedad. quimérico para la leucemia linfoide aguda. N Engl J
Pediatr Blood Cancer 49:615–623. doi:10.1002/ Med 368: 1509–1518. doi:10.1056/NEJMoa1215134
14. Brentjens RJ, Dávila ML, Riviere I et al (2013)
pbc.21158
6. Fauriat C, Just-Landi S, Mallet F y otros (2007)
Las células T dirigidas a CD19 inducen rápidamente
Expresión deficiente de NCR en células NK de
remisiones moleculares en adultos con leucemia
leucemia mieloide aguda: evolución durante el
linfoblástica aguda refractaria a la quimioterapia.
tratamiento de la leucemia e impacto de las células
Sci Transl Med 5:177ra138. doi:10.1126/
de leucemia en la inducción del fenotipo NCRdull.
scitranslmed.3005930
Sangre 109: 323–330. doi: 10.1182/
15. Kochenderfer JN, Dudley ME, Feldman SA et al
blood-2005-08-027979 7. Verheyden S, Bernier M, Demanet C (2004)
(2012) Agotamiento de células B y remisiones de
Identificación de fenotipos de receptores de células
malignidad junto con toxicidad asociada a citoquinas
asesinas naturales asociados con la leucemia.
en un ensayo clínico de células T transducidas por
Leucemia 18:2002–2007. doi:10.1038/sj.leu.2403525
receptor de antígeno quimérico anti-CD19. Sangre
8. Imai C, Iwamoto S, Campana D (2005) La 119:2709–2720. doi:10.1182/sangre-2011-10-384388
modificación genética de las células asesinas
naturales primarias supera las señales inhibidoras
16. Ruggeri L, Capanni M, Urbani E y otros (2002)
e induce la destrucción específica de las células
Eficacia de la actividad allore de células asesinas
leucémicas. Sangre 106: 376–383. doi: 10.1182/
naturales del donante en trasplantes
blood-2004-12-4797 9. Chu Y, Hochberg J, Yahr A et al (2015)
hematopoyéticos no coincidentes. Ciencia 295:2097–
Dirigirse al linfoma no Hodgkin de células B 2100. doi:10.1126/science.1068440 17. Smyth MJ,
agresivas CD20 + mediante células asesinas
Hayakawa Y, Takeda K et al (2002)
naturales expandidas modificadas con ARNm CAR
anti-CD20 in vitro y en ratones NSG. Cancer Nuevos aspectos de la vigilancia de células
Immunol Res 3:333–344. doi: asesinas naturales y la terapia del cáncer. Nat Rev
Cancer 2:850– 861. doi:10.1038/nrc928 18. Degli-
10.1158/2326-6066.CIR-14-0114 10. Denman CJ,
Esposti MA, Smyth MJ (2005) Encuentros cercanos de
Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012) La IL-21
diferentes tipos: las células dendríticas y las células
unida a membrana promueve la proliferación
sostenida ex vivo de células asesinas naturales NK ocupan un lugar central. Nat Rev Immunol
5:112–124. doi:10.1038/nri1549
humanas. PLoS Uno 7:e30264. doi:10.1371/journal.pone.0030264
230 Yaya Chu et al.
19. Ayello J, van de Ven C, Cairo E et al (2009) 14:1561–1570. doi:10.1158/1078-0432.

Caracterización de las células T asesinas naturales y CCR-07-1254, 14/5/1561 [pii]
similares a las asesinas naturales derivadas de 21. Alter G, Malenfant JM, Altfeld M (2004)
células mononucleares de sangre del cordón umbilical CD107a como marcador funcional para la
expandidas y activadas ex vivo: implicaciones para la identificación de la actividad de las células asesinas
inmunoterapia celular adoptiva. Exp1229.
Hematol
doi:10.1016/
37:1216– naturales. J Immunol Methods
10.1016/j. 294:15–22. doi:
jim.2004.08.008 ,
j.exphem.2009.07.009 20. Czuczman MS, Olejniczak S0022-1759(04)00292-3 [pii]
S, Gowda A et al (2008) La adquisición de resistencia a 22. Schuerwegh AJ, Stevens WJ, Bridts CH et al (2001)
rituximab en líneas celulares de linfoma está asociada Evaluación de monensina y brefeldina A para la
con la regulación negativa global del gen CD20 y la determinación citométrica de flujo de interleucina-1
proteína regulada en los niveles pretranscripcional y beta, interleucina-6 y factor de necrosis tumoral alfa
niveles postranscripcionales. Clin Cancer Res en monocitos. Citometría 46:172–176. doi:10.1002/
cyto.1102 [pii]
capitulo 19
Transfección de ARNm para mejorar la localización de células NK en tumores
Emily R. Levy, Mattias Carlsten , y Richard W. Childs
Resumen
La capacidad de las células asesinas naturales (NK) para mediar en los efectos antitumorales después de la transferencia adoptiva
depende de su capacidad para transitar hacia el microambiente donde residen los tumores. Estudios recientes han demostrado que las
células NK activadas por citoquinas y expandidas ex vivo carecen o expresan en niveles bajos los receptores dirigidos necesarios para
lograr que las células administradas por vía intravenosa se dirijan a tumores específicos de tejido. En este capítulo, describimos un método
para mejorar la orientación de las células NK hacia quimioatrayentes específicos expresados en tejidos linfoides secundarios a través de la
modificación genética de las células NK mediante electroporación de ARNm. El método descrito aquí es escalable, cumple con cGMP y
ofrece una estrategia para reforzar la eficacia de la inmunoterapia con células NK adoptivas para el tratamiento de neoplasias malignas
hematológicas en la clínica.
,
Palabras clave Células asesinas naturales Inmunoterapia celular , Localización de ganglios linfáticos , Electroporación ,
quimiotaxis
1. Introducción
Las células asesinas naturales (NK) son células inmunitarias citotóxicas involucradas
en la vigilancia inmunológica tumoral [ 1]. Aunque se sabe desde hace mucho tiempo
que las células NK son capaces de matar células cancerosas independientemente
del reconocimiento del antígeno [ 1 - 3], el potencial terapéutico completo de la
inmunoterapia basada en células NK aún no se ha realizado en la clínica.
Como efectores inmunes innatos, las células NK pueden matar a sus objetivos
a través de varias vías diferentes. La desgranulación de las células NK provocada
por la interacción con células estresadas con baja o nula expresión de MHC de clase
I conduce a la liberación de gránulos citotóxicos que contienen perforina y granzimas,
así como citoquinas, como IFN-ÿ y TNF-ÿ.
Las células diana también pueden ser eliminadas por las células NK a través de la
participación de vías de receptores de muerte como FAS/FasL, TRAIL/TRAIL-R [ 2, 3 ].
Los perfiles de toxicidad fuera del objetivo de las células NK transferidas
adoptivamente parecen mínimos, ya que su vida relativamente corta en circulación
evita las peligrosas tormentas de citoquinas que ocurren comúnmente con muchas
inmunoterapias basadas en células T [ 3]. La investigación dirigida a aumentar la
destrucción de tumores de células NK se ha centrado en esfuerzos que promueven
su supervivencia in vivo, proliferación homeostática y tráfico a sitios tumorales.
231
232 Emily K. Levy et al.
Estas estrategias, además de combinar la terapia con células NK con una variedad
de medicamentos que refuerzan la inmunidad antitumoral de las células NK al
interrumpir la señalización del receptor inhibitorio de las células NK o aumentar
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por células NK
(ADCC) o la eliminación a través de TRAIL son desarrollos importantes en el
campo emergente de las inmunoterapias clínicas con células NK [ 3 , 4 ].
A pesar de estos avances, los datos recientes de modelos animales y
humanos han generado inquietudes con respecto a la capacidad de las células NK
expandidas ex vivo transferidas de forma adoptiva para albergar los ganglios
linfáticos y la médula ósea donde residen las neoplasias malignas hematológicas
como la leucemia y el linfoma. En base a lo anterior, los investigadores ahora han
comenzado a explorar una variedad de estrategias novedosas para manipular el
fenotipo de las células NK y, por lo tanto, su función in vivo para optimizar su
capacidad de ubicarse en los objetivos tumorales deseados [ 3–5 ]. La expresión
de receptores de quimiocinas en las células NK puede ser fundamental para este proceso.
Las células NK expandidas con células K562 genéticamente modificadas o EBV
LCL contienen predominantemente poblaciones de células NK CD56+/CD16+ que
, un receptor
no expresan CCR7 tate celular homing a los ganglios
de quimioquinas
linfáticos [ conocido
6, 7]. Somanchi
por facili
et
al. demostraron recientemente que las células alimentadoras K562 que expresan
mbIL-21 pueden modificarse genéticamente para expresar otros transgenes, cuyos
productos pueden expresarse rápida y transitoriamente en células NK a través de
la trogocitosis mediante el cocultivo con células NK expandidas. Las células K562
que expresan mbIL-21 y CCR7 (clon 9. CCR7) transfirieron rápidamente CCR7 a
NK expandido luego de un breve cultivo conjunto de 1 h, con hasta el 80 % de las
células NK adquiriendo la expresión de superficie de CCR7 [ 8]. Aunque la
expresión superficial fue transitoria, descendiendo a la línea de base a las 72 h, las
células NK que se volvieron positivas para CCR7 habían mejorado la migración de
células NK hacia los ligandos de CCR7 CCL19 y CCL21 en experimentos de
migración transwell y habían aumentado la localización en los ganglios linfáticos
de los ratones.
Recientemente, nosotros y otros hemos demostrado que la electroporación

de ARNm se puede utilizar para modificar genéticamente el fenotipo de las células
NK para mejorar su localización [ 9]. El método de electroporación requiere que las
células se combinen con el ARNm de una proteína elegida en una pequeña cámara
donde las células reciben pequeños pulsos eléctricos que perturban
momentáneamente la bicapa de fosfolípidos de la membrana celular. A continuación,
el ARNm puede entrar en la célula y transcribirse para su expresión.
Hemos encontrado que la electroporación de ARNm utilizando el sistema MaxCyte
compatible con cGMP con ARNm no modificado que codifica para GFP y el
marcador de superficie celular CD34 da como resultado una expresión de proteína
rápida y altamente eficiente en células NK sin comprometer su viabilidad y función
citotóxica. Las células NK electroporadas con ARNm de GFP rápidamente se
volvieron positivas para GFP y permanecieron fluorescentes durante más de dos
semanas. Después de la transfección del ARNm de CD34, casi el 100 % de las
células NK expresaron CD34 que permaneció detectable en la superficie celular
hasta por 5 días. La viabilidad celular no se vio afectada por la transfección; con la
excepción de una ligera reducción en
Mejora de la búsqueda de células NK 233
capacidad proliferativa en comparación con los controles, no se observaron

impactos negativos de la electroporación de ARNm usando la plataforma MaxCyte
[ 10]. La transfección de células NK expandidas no alteró la expresión de 20
marcadores celulares evaluados mediante citometría de flujo, incluidos los
receptores de células NK activadores e inhibidores y los ligandos de receptores
de muerte como TRAIL. Además, las células NK sometidas a electroporación
mantuvieron una alta función citotóxica frente a las células K562 y otras líneas de células tumora
Sobre la base de los hallazgos de Somanchi et al., ahora hemos utilizado la
transfección de ARNm con el sistema MaxCyte para alterar genéticamente las
células NK expandidas ex vivo para expresar altos niveles de superficie de CCR7.
Utilizando este enfoque, las células NK sometidas a electroporación de ARNm
habían aumentado sustancialmente la expresión de CCR7 en la superficie. El
nivel de expresión de CCR7 dependía de la dosis de ARNm (Fig. 1a ), alcanzó su
punto máximo 8 h después de la transfección y persistió hasta 48 h [ 10]. Es
importante destacar que las células NK electroporadas con ARNm de CCR7
mostraron una marcada capacidad de migración in vitro hacia CCL19 y
Fig. 1 La electroporación de células NK humanas expandidas in vitro con ARNm de CCR7 mejora la expresión
superficial de CCR7, lo que da como resultado una ventaja de migración in vitro funcional hacia los ligandos
quimioatrayentes CCL19 y CCL21 . ( a ) Titulación de ARNm de CCR7 para electroporación de células NK : 0,5–8 ÿg de ARNm por 1 millón
La expresión superficial de CCR7 se analizó 8 h después de la electroporación. ( b ) Migración in vitro transwell de células
NK hacia 300 ng/mL de CCL19 y CCL21. Las células NK expandidas no electroporadas (no EP) se compararon con células
NK expandidas que habían sido electroporadas con ARNm CCR7 8 h antes (CCR7 EP)
CCL21, mientras que las células NK no sometidas a electroporación permanecieron

incapaces de migrar hacia el ligando para este receptor de quimiocinas (Fig. 1b). La
disponibilidad de la plataforma compatible con cGMP descrita en este documento
ofrece un método para modificar genéticamente de manera eficiente las células NK
utilizando una variedad de diferentes receptores de quimiocinas que podrían mejorar
la orientación del tumor NK en tejidos como los ganglios linfáticos y la médula ósea
donde residen las neoplasias malignas hematológicas.
2 materiales
Prepare y almacene todos los reactivos a temperatura ambiente (a menos que se

indique lo contrario).
2.1 Componentes de 1. Instrumento: sistema de transfección Maxcyte® GT (Maxctyte Inc.) con protocolos
electroporación de transfección celular optimizados precargados ( ver Nota 1).
2. Tampón HyClone: tampón patentado (termocientífico).
3. Medio de cultivo de células NK: 89 % de X-Vivo 20 (Lonza), 10 % de suero

humano AB inactivado por calor, 1 % de GlutaMAX-1 2 mM, 500 UI/ml de IL-2
humana. Conservar a 4 °C, alícuota y preparar a 37 °C para su uso.
4.ARNm (TriLink BioTechnologies). Conservar a -80 °C.
5. Filtrado estéril 10xPBS ( ver Nota 2 ).
6. Cubeta de electroporación (Maxcyte Inc.). Placa de
cultivo celular de 7,48 pocillos, área de crecimiento de 0,95 cm 2.
8. Matraz de cultivo celular de plástico ( ver Nota 3 ).
2.2 Fenotipo de 1.Citómetro de flujo LSRFortessa (BD biosciences) ( ver Nota 4 ). Placa de
los componentes
cultivo tisular de polipropileno de fondo redondo de 2,96 pocillos.
de expresión del
3. Anticuerpos conjugados con fluorocromo disponibles comercialmente ( ver Nota
receptor de quimioquinas
5 ).
4. Tampón FACS (89,5 % PBS, 10 % suero fetal bovino, 0,5 % 0,5 M

EDTA).
Solución de paraformaldehído al 5,1 % en PBS.
6.Software de análisis Flowjo (Treestar Inc.).
2.3 Componentes del 1.Warm X-Vivo 20 (Lonza).

ensayo de migración in vitro 2. Ligandos de quimioquinas específicos de CCR7 CCL19 y CCL21 (BioLegend).
® Placas e insertos de cultivo celular Costar ® Transwell ® 3. Corning (Sigma-
Aldrich),
tubo por pozo de poros(Eppendorf).
migración de 5 µm. 4. Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml; 1
®
5. Solución CyQUANT® : kit de proliferación CyQUANT (Thermofi sher Scientifi c): diluya el
®
tampón de lisis CyQUANT 1:20 en ddH 2O y agregue el tinte de proliferación
1:600.
CyQUANT
®
Prepare 350 ÿL de solución para cada muestra, más un 10 % extra (p. ej., para 10
muestras necesitará 3,9 mL de solución CyQUANT® : 3,69 mL ddH 2O, 195 ÿLtampón
de
de lisis y 6,5 ÿL de colorante de proliferación). Placa de ensayo blanca con fondo plano
de 96 pocillos (Costar).
6. Lector de placas de luminiscencia Wallac 1420 Victor2 (PerkinElmer).
3 métodos
El siguiente protocolo está optimizado para las células NK aisladas de PBMC seleccionadas
para CD56 y con depleción de CD3 de donantes sanos (departamento de medicina
transfusional, NIH). A continuación, las células NK se cocultivan con una línea celular
transformada con EBV-LCL irradiada y se expanden en medio que contiene IL-2 durante 14
días antes de su uso. Es posible que los protocolos a continuación deban optimizarse aún
más para las células NK recién aisladas y/o las células NK activadas por citoquinas durante
la noche, o las células NK expandidas utilizando otros medios.
3.1 Electroporación 1. Encienda el instrumento Maxcyte ® GT y abra el programa Maxcyte Electroporation.

de células NK Seleccione el protocolo de electroporación NK2-OC.
2. Descongele el ARNm y manténgalo en hielo.
3. Determine la cantidad de células necesarias para el estudio y recolecte la cantidad

deseada de células del matraz de cultivo en un matraz cónico de 50 ml ( consulte la
Nota 6 ).
4. Centrifugar la muestra a 311 g durante 7 min.
5. Aspire completamente el sobrenadante.
6. Lave la muestra con 5 ml de tampón HyClone; centrifugar a 311 g durante 7 min.
7. Determinar la densidad y el volumen total de suspensión celular necesarios para la

transfección ( ver Nota 7). Suspenda con cuidado las células en el tampón HyClone
para lograr este volumen.
8. Prepare un tubo Eppendorf de 1,5 ml con el volumen deseado de ARNm ( consulte la

Nota 8 ). Vuelva a colocar el material de ARNm en hielo.
9. Agregue PBS 10x estéril a la alícuota de ARNm ( consulte la Nota 9 ).
10. Sin esperar, agregue cuidadosamente las células a la mezcla de mRNA/10xPBS y mezcle
cuidadosamente 3 veces con la misma punta de pipeta.
11. Transfiera el contenido del Eppendorf a una cubeta estéril.

Barra cada una de las cuatro esquinas de la cámara con suspensión celular para
asegurarse de que no queden burbujas de aire en el
taza decorativa.
12. Coloque la tapa en la cubeta y enchufe la cubeta en el Maxcyte ® GT.
13. Haga clic en "Iniciar" y espere hasta que el programa indique "completo".
14. Con cuidado, devuelva la cubeta a la cabina de bioseguridad y transfiera todo el

contenido al centro de un pocillo vacío de una placa de 48 pocillos de fondo
plano.
15. Incubar la placa a 37 °C, 6,5 % CO min). 2 durante 20 min (10–30
16. Mientras las células se incuban, transfiera el medio tibio de células NK a un

matraz de cultivo T75 o T25. La densidad celular óptima es de 0,5 a 2 × 10 6
células/mL de medio de células NK.
17. Una vez que las células hayan tenido tiempo de recuperarse, coloque la placa de
48 pozos en el gabinete de bioseguridad. Usando una pipeta estéril de 1 mL,
enjuague cuidadosamente el pocillo con células con 300 ÿL de medio de cultivo
de células NK tibio y transfiéralo a un matraz de cultivo.
Dar a las células al menos 1 h para la recuperación en cultivo antes de su
uso ( ver Nota 10 ).
3.2 Titulación de ARNm 1. Muestras de electroporación con una cantidad creciente de ARNm (p. ej., 1, 2, 4
y fenotipo de y 8 ÿg de ARNm por millón de células). Cada muestra de titulación por separado
quimiocina utilizará un volumen diferente de ARNm, por lo tanto, utilice ddH2O para
Expresión del receptor equilibrar el volumen total de líquido en la muestra ( consulte la Nota 11 ).
2. Elija un punto de tiempo o una escala de tiempo para medir la expresión del
receptor de superficie para la proteína de interés. Para la mayoría de los
receptores que hemos analizado, la expresión máxima se encuentra dentro de
las 24 h posteriores a la electroporación. CCR7 tiene un pico de expresión 8 h
después de la electroporación .
3. En el momento seleccionado, enjuague el fondo del matraz de cultivo celular con

una pipeta serológica estéril de 5 ml para crear una suspensión celular uniforme.
Extraiga aproximadamente 300 ÿL (el cono de la punta) y transfiéralo
directamente a un pocillo de una placa de fondo redonda vacía de 96 pocillos.
Divida la muestra por la mitad para crear un pozo para la tinción de isotipos (tiñe
aproximadamente 0,1 × 10 6–0,5 × 10 6 células por muestra).
4. Centrifugar la placa a 550 g durante 3 min. Vierta el líquido de la placa en un

recipiente de desecho adecuado.
5. Suspenda cada muestra en 50 ÿL de tampón FACS y agregue la cantidad

adecuada de mezcla maestra de anticuerpos ( consulte la Nota 5 ).
También existe la opción de agregar un anticuerpo bloqueador del receptor FC
antes de agregar la mezcla maestra para minimizar la unión no específica de
los anticuerpos conjugados.
6. Incube las muestras en la oscuridad, a 4 °C, durante 15 min. Agregue 150 ÿL de

tampón FACS y suspenda suavemente las células. Placa centrífuga
a 550 g durante 3 min. Tirar el sobrenadante en un recipiente de desecho adecuado.
7. Lave una vez más con 200 ÿL de tampón FACS, centrifugue la placa a la misma
velocidad y tiempo y mezcle el sobrenadante como se indicó anteriormente.
8. Resuspender las muestras en una solución de paraformaldehído al 1 %.

Guarde las muestras en el frigorífico (4 °C) y protéjalas de la luz.
exposición.
9. Repita el procedimiento para cada punto de tiempo.
10. Antes de analizar las muestras en el citómetro de flujo, aísle los sedimentos celulares y
vuelva a suspender las muestras en 250 ÿL de tampón FACS.
11. Analice la expresión del receptor mediante la cuantificación geométrica de MFI

utilizando el software de análisis flowjo.
3.3 Ensayo 1. 8 h después de la electroporación, cree una suspensión uniforme de células lavando el
de migración in vitro fondo del matraz de cultivo con una pipeta serológica de 5 ml. Recoja la cantidad
adecuada de células para el ensayo ( consulte la Nota 12 ).
2. Lave y vuelva a suspender las células en X-Vivo 20 simple para obtener una suspensión
de 0,5 × 10 6 células/mLque
de medio. Deje para
estén listas que las células descansen a 37 ° C hasta
usar.
3. Diluya el ligando de quimiocina en X-Vivo 20 simple tibio hasta la concentración de

ligando máxima deseada. Para CCL19 y CCL21, 300 ng/mL es suficiente para una
migración significativa.
La solución de ligando se puede diluir aún más a concentraciones en serie.
4. Retire los insertos transwell de la placa y transfiera 600 ÿL de la solución de quimioquinas

a los pozos apropiados. Vuelva a colocar con cuidado los insertos Transwell en los
pocillos.
5. Agregue 100 ÿL de la suspensión de células en la parte superior de cada inserto transwell

(5 × 10 4 células NK en total por pozo).
6. En tres pocillos, designados controles máximos, agregue 5 × 10 4 células NK directamente

en los pocillos sin insertos transwell. Estos pozos se utilizarán para calcular el
porcentaje de migración.
7. Incubar durante 2 h a 37 °C.
8. Una vez finalizado el ensayo, levante con cuidado los insertos transwell de los pocillos.
Recoja los medios de comunicación de cada testamento en un tubo de microcentrífuga
individual de 1,5 ml. Lave los pozos dos veces con 400 normal X-Vivo 20.
9. Girar los tubos a 1200 g durante 6 min.
10. Aspire todos los medios. Los gránulos aislados se pueden almacenar a -80 °C
hasta que estén listos para el análisis.
11. Suspender todas las muestras en 350 ÿL de solución CyQUANT® y sembrar por triplicado
en una placa de ensayo blanca de fondo plano de 96 pocillos (100 ÿL por pocillo).
12. Proteja la placa de la luz y colóquela en hielo hasta que la muestra esté lista
para analizarse.
13. Con un lector de microplacas, como el Wallac 1420 Victor2, mida la fluorescencia
de cada pocillo (485/535 nM durante 1 s por pocillo). Los datos se pueden
exportar y analizar en Microsoft Excel.
14. El porcentaje de migración se puede calcular promediando los valores por

triplicado y dividiendo el valor promedio de cada muestra por el control máximo
(5 × 10 4 células NK). El índice de migración
porcentajese
depuede
migración
calcular
por el
dividiendo
control cero
el
.
4 notas
1. Utilizamos el programa precargado NK-2 OC.
2. Uso de 10xPBS para equilibrar la osmolalidad de la suspensión de ARNm que

entrará en la muestra de células.
3. El tamaño del matraz se puede determinar por el número de celda.

La densidad celular óptima es de 0,5 a 2 × 10 6 células/ml de medio de células
NK (p. ej., 10 × 10 610células/5
6 célulasmlenen17unmlfrasco
en unde
frasco
cultivo
deT25
cultivo
en reposo
en reposo
o 50 ×
T75) . pedir).
4. Utilizamos el citómetro de flujo BD LSRFortessa con un cargador de placas de

96 pocillos. Es posible que este experimento deba optimizarse aún más si se
utiliza un citómetro de flujo diferente y/o si se utilizan tubos de polipropileno de
fondo redondo de 5 ml en lugar de placas.
5. Para evaluar la expresión de CCR7, utilizamos un cóctel de anticuerpos que

constaba de 0,5 ÿL de PeCy7 CD56 (BD Biosciences) por 50 ÿL de tampón
FACS, 2 ÿL de CCR7 BV605 (Biolegend) por 50 ÿL de tampón FACS y 1 ÿL de
marcador Aqua Live Dead (Life Technologies ) por 50 ÿL de tampón FACS. La
mezcla de cóctel de isotipo contiene BV605 IgG2a (Biolegend) en lugar de
CCR7.
También se pueden usar marcadores celulares adicionales conjugados con
otros fluorocromos para el análisis de citometría de flujo.
6. Este procedimiento suele provocar una pérdida de células de aproximadamente

un 20-30 %. Es posible que se pierdan varias células en la cubeta de
electroporación. Se pueden perder células adicionales al transferir la muestra
de la placa de 48 pocillos al matraz de cultivo final. Tenga en cuenta el número
de celdas con las que comienza.
7. La suspensión total debe ser de aproximadamente 1–2 × 10 6 células/10 ÿL de

suspensión. La suspensión incluye células en tampón hyclone, ARNm y PBS
10x estéril. El volumen total de la suspensión celular depende del tamaño de
la cubeta.
El OC-100 contiene un volumen máximo de 100 ÿL de líquido, y el OC-400
contiene un volumen máximo de 400 ÿL de líquido (p. ej., OC-100 contiene de
10 a 20 × 10 6 células en 100 ÿL de suspensión y
OC-400 tendrá de 40 a 80 × 10 6 células en 400 ÿL). No es necesario

llenar el volumen máximo de la cubeta. Por ejemplo, 5 × 10 6 células
se suspenderán en 50 ÿL en una cubeta OC-100 y 30 × 10 6 células se
suspenderán en 300 ÿL usando una cubeta OC-400.
8. La cantidad deseada de ARNm se puede determinar valorando dosis

crecientes de ARNm con las células para conferir la máxima expresión
de proteína (Fig. 1a). Nuestro laboratorio utiliza 4 ÿg/1 × 10 6 células
de ARNm de CCR7. La concentración de mRNA stock puede oscilar
entre 0,5 y 3 mg/ml.
9. El volumen de 10×PBS será 1/10 del ARNm total
volumen.
10. Cada tipo diferente de ARNm tendrá una expresión temporal diferente.
Hemos encontrado que la expresión superficial máxima de CCR7 es 8
h después de la electroporación.
11. La muestra de 8 ÿg utilizará 4 ÿL de ARNm y la muestra de 2 ÿg utilizará
1 ÿL de ARNm (la reserva de CCR7mRNA de Trilink Biotechnologies es
de 2 mg/mL). Agregue 3 ÿL de ddH2O a la muestra de 2 ÿg para
compensar esta diferencia de volumen. La cantidad de 10xPBS será
constante en todas las muestras. 12. Se cargarán 5 × 10 4 células en
cada pocillo. Al planificar las muestras, asegúrese de incluir un control
negativo y un control positivo para cada muestra de células
electroporadas. El control cero es 600 ÿL de X-Vivo 20 simple cargado
en la cámara inferior, 100 ÿL de células cargadas en la cámara superior
y el control máximo es 100 ÿL de células cargadas en 600 ÿL de X-Vivo
simple sin el inserto de membrana Transwell.
Reconocimiento
Emily Levy es estudiante predoctoral en el Programa de Medicina Molecular
del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad George Washington.
Este trabajo es de una disertación que se presentará al programa anterior en
cumplimiento parcial de los requisitos para el Ph.D. la licenciatura.
Referencias
1. Vivier E, Raulet DH, Moretta A y otros (2011) Hematología Am Soc Hematol Educ Program
¿Inmunidad innata o adaptativa? El ejemplo de las 2013:234–246
células asesinas naturales. Science 331:44–49 2.
4. Childs RW, Carlsten M (2015) Enfoques terapéuticos
Cheng M, Chen Y, Xiao W et al (2013) Inmunoterapia para mejorar la citotoxicidad de las células asesinas
basada en células NK para enfermedades malignas. naturales contra el cáncer: la fuerza despierta. Nat
Cell Mol Immunol 10:230–252 3. Childs RW, Berg Rev Drug Discov 14:487–498 5. Carlsten M, Childs
M (2013) Traer células asesinas naturales a la clínica: RW (2015) Manipulación genética de células NK para
manipulación ex vivo. inmunoterapia contra el cáncer:
técnicas e implicaciones clínicas. Frente Immunol 6:266 9. Carlsten M, Li LH, Su S et al (2014) Electroporación de
ARNm de grado clínico de células NK: un método
6. Mailliard RB, Alber SM, Shen H y otros (2005) novedoso y altamente eficiente para reprogramar
Células auxiliares NK CD83+CCR7+ inducidas por IL-18. genéticamente células NK humanas para inmunoterapia
J Exp Med 202:941–953 7. Somanchi SS, Senyukov VV, contra el cáncer. Sangre 124(21)
Denman CJ et al (2011) Expansión, purificación y evaluación 10. Carlsten M, Levy E, Karambelkaret A et al (2016)
funcional de células NK de sangre periférica humana. J Ingeniería genética eficiente basada en ARNm de células
Vis Exp 8. Somanchi SS, Somanchi A, Cooper LJ et al NK humanas con alta afinidad CD16 y CCR7 Aumenta
(2012) Ingeniería de localización de ganglios linfáticos la ADCC inducida por rituximab contra el linfoma y se
dirige a la migración de células NK hacia los ganglios
de células asesinas naturales humanas expandidas ex vivo
linfáticos asociados Quimiocina CCL19.
a través de la trogocitosis del receptor de quimiocinas
CCR7.
Frente en Immunol 7:105
Sangre 119:5164–5172
capitulo 20
Generación in vitro de células NK humanas que expresan quimérico

Receptor de antígeno a través de la diferenciación de genes modificados
Células madre hematopoyéticas
, y Satiro N. De Oliveira
emily lowe , Laurel C. Truscott
Resumen
Las células NK representan una fuente muy prometedora de enfoques celulares adoptivos para la inmunoterapia contra el
cáncer, y se han llevado a cabo numerosas investigaciones, incluidos ensayos clínicos. La modificación genética de las células
NK puede dirigir su especificidad y mejorar su función, pero la eficacia de las técnicas de transferencia de genes es muy limitada.
Aquí describimos dos protocolos diseñados para generar células NK humanas maduras a partir de células madre hematopoyéticas
genéticamente modificadas. Estos protocolos utilizan un receptor de antígeno quimérico como transgén, pero podrían modificarse
potencialmente para la expresión de cualquier transgén en particular en las células NK humanas.
Palabras clave Células madre hematopoyéticas, transferencia de genes , vector lentiviral , línea celular OP9, células NK
1. Introducción
Las células asesinas naturales (NK) son células inmunitarias innatas que median
la citotoxicidad espontánea contra células tumorales e infectadas por virus, y
muchos ensayos clínicos han intentado aprovechar sus propiedades para
terapias celulares [ 1 - 6]. La tecnología de transferencia de genes puede mejorar
la eficacia de tales esfuerzos al mejorar la función o la supervivencia de las
células NK, o la especificidad del antígeno por ingeniería [ 7 - 9 ].
Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son proteínas de fusión
diseñadas que combinan la especificidad antigénica de los restos de unión a
antígeno de anticuerpos monoclonales y motivos de activación intracelular
capaces de activar células inmunitarias. La evidencia preliminar sugiere que las
células NK con especificidad dirigida por receptores de antígenos quiméricos
pueden tener una mayor citotoxicidad [ 10 - 12 ].
La generación de células NK maduras a partir de células madre
hematopoyéticas brinda la oportunidad de generar células NK más jóvenes y la
expansión de clones modificados genéticamente específi cos a partir de un
número menor de células iniciales previamente aisladas y crioconservadas, con
la ventaja añadida de la generación de múltiples lotes a partir de la
241
242 Emily Lowe et al.
mismo donante [ 13 – 16]. En este capítulo, describimos un protocolo para la

diferenciación de células NK a partir de células madre hematopoyéticas humanas
(HSC) modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos mediante el
cultivo conjunto con un estroma alimentador de células OP9-DL1 murinas en
presencia de citocinas recombinantes humanas [ 15]. Alternativamente, describimos
un protocolo sin alimentador para la generación de células NK modificadas
genéticamente a partir de células madre hematopoyéticas humanas utilizando el
factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) [ 17]. El transgén utilizado en este
protocolo es un CAR específico de CD19, pero HSC podría recibir potencialmente
cualquier tipo de modificación genética persistente para la expresión en células NK
diferenciadas.
2 materiales
2.1 Aislamiento 1. Células primarias humanas de sangre de cordón umbilical recolectadas dentro
y crioconservación de de las 48 h para el procedimiento de aislamiento de CD34 ( ver Nota 1).
HSC de sangre de
2.Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences).
cordón umbilical
3.CD34 MicroBead Kit UltraPure (Miltenyi Biotec).
4.Kit de inicio MidiMACS con columnas LS (Miltenyi Biotec).
5. Solución madre MACS BSA (Miltenyi Biotec). 6. Solución
de lavado autoMACS (Miltenyi Biotec).
7. PBS de Dulbecco (DPBS).
8. Medio de congelación: DMSO al 10 % en suero bovino fetal inactivado por calor

(Omega).
2.2 Transducción 1. Células madre hematopoyéticas ( HSC ) positivas para CD34 humanas primarias
Lentiviral de HSC crioconservadas aisladas de sangre de cordón umbilical ( ver Nota 1).
2. Medio de transducción: Medio X-Vivo15 recién preparado (Lonza), 50 ng/ml de

factor de células madre (SCF) humano recombinante (R&D Systems), 50 ng/ml
de ligando de Flt-3 humano recombinante (R&D Systems) y 50 ng/mL de
trombopoyetina humana recombinante (R&D Systems).
3. Fragmento de fibronectina CH-296 RetroNectin (Takara Shuzo

Co.).
Placa de 4,48 pocillos no tratada con cultivo de tejidos, estéril.
5. Construcción de receptor de antígeno quimérico de segunda generación

portadora de vector lentiviral de tercera generación (Fig. 1a ) ( ver Nota 2).
2.3 Diferenciación 1. Línea de células estromales OP9 (ATCC) genéticamente modificada para
de HSC a células NK expresar Delta like 1 (OP-DL1) ( ver Nota 3).
Linaje 2. Medio alfa-20: Medio esencial mínimo alfa (MEM alfa) enriquecido con un 20 %
de suero bovino fetal inactivado por calor (Omega), L-glutamina 2 mM, penicilina
2.3.1 Cocultivo con
50 U/ml y estreptomicina 50 ÿg/ml.
Células estromales OP9-DL1
Células CAR-NK de HSC 243
a
RRE
cPPT MND WPRE

VH VL FC CD3z T2A
CD28
Enlazador eGFP
Pep
Sig
MND-CD19RCD28-EGFP
b
10
5
13,8% 34,6%
104
103
COCHE
CD19
Anti-
102
0,2%
102 103 104 105

EGFP
Fig. 1 Vector lentiviral para la transducción de HSC humana. ( a ) Diagrama del

vector lentiviral de tercera generación que lleva CAR y EGFP anti-CD19. ( b )
Coexpresión de CAR y EGFP detectada por citometría de flujo en células NK
diferenciadas in vitro de HSC
detectó humana,eldía
utilizando 40 de cultivo.
fragmento F(abÿ)La expresiónconjugado
2 policlonal de CAR secon
PE-Texas Red IgG1 Fcÿ antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories)
[ 15 ]
3. Medio de diferenciación NK: medio alfa-20, enriquecido con 5 ng/mL de

SCF humano recombinante (R&D Systems), 5 ng/mL de ligando Flt-3
humano recombinante (R&D Systems), 5 ng/mL de IL-7 (R&D Systems),
y 10 ng/mL de IL-15 (R&D Systems). Placas tratadas con cultivo de
tejidos de 4.12 pocillos, estériles.
5. Frascos de cultivo T-75 y T-150.
6,0,05 % tripsina EDTA 1×.

7. PBS de Dulbecco (DPBS).
Filtro de células de 8,70 ÿm.
2.3.2 Sin alimentador 1. Medio AIM V CC: Medio completo AIM V (Life Technologies), suero AB
Protocolo de diferenciación humano al 5 % (Corning) y GlutaMAX 2 mM (Life Technologies),
suplementado recientemente con 30 ng/ml de citoquinas humanas
recombinantes SCF (R&D
Systems), 50 ng/mL de ligando Flt-3 humano recombinante (R&D Systems), 50

ng/mL de IL-15 humana recombinante (R&D Systems) y 100 ng/mL de IGF-1
humano recombinante (R&D Systems).
2. Microplacas tratadas con cultivo de tejidos Falcon de 48, 12 y 6 pocillos,

estéril.
3 métodos
3.1 Aislamiento El aislamiento de células positivas para CD34 de la sangre del cordón umbilical
y crioconservación de recolectada dentro de las 48 h aumentará la recuperación celular. La unidad de sangre
HSC de sangre de de cordón se puede mantener a temperatura ambiente hasta el procedimiento de
cordón umbilical (ver aislamiento. El procedimiento de aislamiento debe realizarse en una cabina de
nota 1) bioseguridad para garantizar la esterilidad y la protección personal.
1.Diluya la sangre del cordón umbilical con el mismo volumen de PBS.
2.Pipete 15 mL de Ficoll en un tubo cónico de 50 mL.
3.Coloque 35 mL de sangre de cordón en Ficoll.
4. Centrifugar a 400 × g durante 30 min a 20 °C sin freno.
5. Prepare el tampón de aislamiento diluyendo MACS BSA Stock Solution en

autoMACS Rinsing Solution de acuerdo con las instrucciones del fabricante y
manténgalo helado.
6. Recoja la capa leucocitaria de todos los tubos Ficoll posteriores a la centrifugación

con una pipeta Pasteur estéril o una pipeta serológica en un tubo cónico nuevo
de 50 ml.
7. Diluya la capa leucocitaria recogida con un volumen igual de PBS.
8. Centrifugar a 300 × g durante 15 min a 4 °C, con el freno puesto.
9. Retire el sobrenadante.
10. Recoja todos los sedimentos celulares en un tubo cónico de 50 ml y complete

hasta 50 ml con tampón de aislamiento enfriado con hielo.
11.Contar células.
12. Centrifugar a 250 × g durante 5 min a 4 °C, con el freno puesto.
13. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender hasta 1 × 10 8 células en

300 ÿL de tampón de aislamiento enfriado con hielo.
14. Siga las instrucciones del fabricante para usar los reactivos de Miltenyi Biotec
CD34 MicroBead Kit UltraPure y MidiMACS Kit para realizar una selección
inmunomagnética positiva de CD34 HSC usando las columnas LS.
15. Después de completar el protocolo de aislamiento, cuente las HSC positivas para
CD34 y utilícelas inmediatamente para la transducción, o conserve
criogénicamente para su uso posterior. Las células HSC mantenidas en cultivo
con citocinas humanas experimentarán principalmente una diferenciación de
linaje mieloide y perderán la expresión de CD34.
3.2 Lentivirales Nuestro protocolo para el empaquetamiento y el análisis de títulos de vectores

Transducción de HSC lentivirales de alto título para la modificación genética de células humanas primarias
es muy extenso y ha sido publicado en otros lugares [ 15, 18]. En resumen, tales
3.2.1 Título alto vectores deben tener un título de al menos 5 × 10 7–1 × 10 8una
TU/mL para asegurar
transducción muy
Lentivirus para Modifi cación
eficiente, lo que requiere procedimientos posteriores al empaque para obtener una
de HSC
concentración de 100–1000 veces. El vector utilizado en este protocolo es un
lentivirus basado en VIH de replicación incompetente de tercera generación que
lleva un CAR específico de CD19 y proteína fluorescente verde mejorada (EGFP)
(Fig. 1 ) ( ver Nota 2).
3.2.2 Lentivirales Antes de iniciar un protocolo de diferenciación de NK, los investigadores deben
Transducción de HSC evaluar en experimentos preliminares las condiciones óptimas de transducción
utilizando las preparaciones disponibles de vectores lentivirales en HSC humana
[ 18] ( ver Nota 4). Las HSC genéticamente modificadas deben colocarse en
condiciones de cultivo de diferenciación NK inmediatamente después de la
transducción lentiviral, y la expresión completa de las copias del vector integrado
tendrá lugar alrededor de 10 días después de la transducción. Rutinariamente
utilizamos preestimulación con citocinas durante la noche de placas HSCin
recubiertas con fragmento de fibronectina CH-296 RetroNectin antes del tratamiento
con el vector lentiviral [ 15 ]. , 18 ].
1. Recubrimiento de RetroNectin de la placa de transducción: llene los pocillos de

una placa de 48 pocillos no tratada con cultivo de tejidos con 500 ÿL/pocillo de
RetroNectin 20 ÿg/mL en PBS e incube durante 2 h a temperatura ambiente;
después de aspirar la solución de RetroNectin, llene los pocillos con 1 mL/
pocillo de solución de bloqueo con suero fetal bovino (FBS) al 2 % en PBS e
incube durante 30 min a temperatura ambiente; retire la solución de bloqueo y
lave dos veces con 1 ml/pocillo de tampón de lavado con HEPES 0,025 M en
PBS ( ver Nota 5).
2. Vuelva a suspender las células positivas para CD34 humanas a 1 × 10 6 células/

mL en medio de transducción.
3. Coloque 400 ÿl/pocillo en la placa de transducción de 48 pocillos recubierta

con RetroNectin (del paso 1 ).
4. Incubar la placa durante 14 h en CO2 al 5 % a 37 °C para la preestimulación;

las células se unirán al fondo recubierto con RetroNectin.
5. Después de la preestimulación, agregue el volumen necesario de vector

lentiviral para asegurar la eficiencia de la transducción en un número de
copias del vector viral de 1–3 copias/célula [ 15, 18] según lo determinado en
experimentos preliminares usando preparaciones de vectores disponibles ( ver Nota 4).
6. Incubar la placa de transducción con vectores lentivirales añadidos durante 24

h en CO2 al 5 % a 37 °C antes de transferir las HSC a cultivos de diferenciación.
3.3 Cultura Es fundamental mantener células estromales sanas, de paso bajo, para el cocultivo
y paso de con las células humanas primarias ( véanse las Notas 3 y 6).
OP9-DL1 estromal 1. Inicie el cultivo de células estromales OP9-DL1 con 2 × 10 6–5 × 10 6 células en
Células
un matraz T-75 utilizando medio de cultivo alfa-20 sin citocinas ( consulte la Nota
7).
2. Para pasar OP9-DL1, primero aspire cuidadosamente y retire el medio de cultivo;

enjuague con 20 ml de PBS a temperatura ambiente y elimine completamente
el PBS.
3. Agregue 12 mL de tripsina para un matraz T-75 (o 30 mL para un matraz T-150)

e incube a 37 °C durante 5 a 15 min hasta que se disperse la capa celular.
4. Agregue al menos el mismo volumen de medio alfa-20 para resucitar

células pendientes para inactivar la tripsina.
5. Cuente las células y agregue 2 × 10 6–5 × 10 6 células a un matraz T-75, o 5 ×

10 6–10 × 10 6 células a un matraz T-150, para continuar el cultivo ( consulte la
Nota 8).
6. Para el cocultivo con células humanas, coloque 2 × 10 5–5 × 10 5 por pocillo en

una placa de 12 pocillos tratada con cultivo de tejidos, en medio alfa-20 ( consulte
la Nota 9).
3.4 Diferenciación Todos los cocultivos deben realizarse utilizando medio de diferenciación NK recién
de HSC a células NK preparado desde el primer día.
Linaje
1. Pipetee enérgicamente las HSC en la placa de transducción después de agregar
3.4.1 Diferenciación por 0,5 a 1 ml de medio de diferenciación NK por pozo, para separar todas las
cocultivo con células células adheridas al fondo.
estromales OP9-DL1
2. Cuente las células y ajuste la concentración a 5 × 10 5 células/mL en
Medio de diferenciación NK.
3. Retire con cuidado el medio alfa-20 del estroma OP-DL1 confluente cultivado en
las placas de 12 pocillos ( consulte la Nota 9).
4. Siembre las células HSC transducidas suspendidas en el medio de diferenciación

NK mediante pipeteo lento y suave contra la pared, a razón de 3 × 10 5–5 × 10
5 células por pocillo.
5. Agregue suavemente el medio de diferenciación NK recién preparado pipeteando

lentamente contra la pared hasta obtener un volumen total de 2 ml por pocillo.
6. Dividir HSCcada 3–4 días; pipetear vigorosamente usando P-1000 para

resuspender las células y separar el estroma; Retire las células del estroma
usando un filtro de células de 70 ÿm en un tubo cónico de 50 ml, luego repita los
pasos 2 a 5 en esta sección ( consulte la Nota 10).
7. Mantenga el cultivo conjunto de HSC transducidas con células del estroma
durante 35 a 40 días para obtener células NK funcionales ( consulte las Notas 11 y 12)
(Figura 2a ). Las células NK CD56+ se pueden clasificar mediante la clasificación
de células activadas por fluorescencia (FACS) o la selección de perlas
inmunomagnéticas para cultivos continuos o ensayos funcionales como citotoxicidad.
evaluación.
Fig. 2 Expresión de marcadores de superficie específicos de NK a lo largo de la progresión del cultivo de diferenciación in vitro a partir
de HSC humanas modificadas genéticamente. ( a ) Cocultivo con células estromales OP9-DL1. ( b ) Cultivo sin comederos. Se tomaron
parcelas representativas en los días 14, 29 y 40 de ambos protocolos de cultivo de diferenciación de NK. Se evaluaron células humanas
seleccionadas positivas para EGFP para los marcadores de superficie CD56, CD16, CD94, CD57, CD158 y CD335
3.4.2 Sin alimentador

Todos los cambios de medios y divisiones deben realizarse utilizando AIM V CC desde el primer
Cultura de diferenciación
día ( consulte la Nota 13).
(Protocolo alternativo)
1. Pipetee enérgicamente el HSC en la placa de transducción después de agregar 0,5–1 ml
de AIM V CC por pozo, para separar todas las células adheridas al fondo.
2. Transfiera las células a un tubo cónico del tamaño adecuado. Centrifugar a 300 × g durante
10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular moviendo el
tubo ( ver Nota 14). Agregue 1 mL (o volumen apropiado) de AIM V CC.
3. Cuente las células con un tinte de viabilidad (p. ej., azul de tripán) y ajuste la concentración
de células viables a 0,5 × 10 6 células/mL en AIM V CC.
4. Coloque las células en placas en pocillos del tamaño adecuado de microplacas tratadas
con cultivo de tejidos. Por ejemplo, coloque en placa hasta 0,5 × células en 1 ml de AIM V
CC en un pocillo de una placa de 24 pocillos, o hasta 3 × 10 6 células en 6 ml de AIM V
CC en el pocillo de una placa de 6 pocillos.
5. Las células se incuban a 37 °C en una atmósfera humidificada con

5 % CO2 2 .
6. Las células de diferenciación deberán dividirse hasta dos veces por semana.
Pipetee para separar las células adheridas suavemente y transfiera la mitad de los medios
y las células a un pocillo vecino que no se haya utilizado o a una placa nueva del mismo
tamaño. Vuelva a llenar los medios hasta el volumen original en ambos pocillos con AIM
V CC nuevo ( consulte la Nota 15).
7. Para eliminar los restos celulares, cada 10 a 12 días se deben lavar las células y
reabastecerlas por completo con medios frescos y citocinas. Pipetee para separar las
células ligeramente adheridas, ignorando las poblaciones de células fuertemente adheridas.
Transferir las células no adherentes a tubos cónicos y centrifugar a 300 × g durante 10
min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en un volumen
apropiado de AIM V CC para contar las células. Cuente las células usando un tinte de
viabilidad y ajuste la concentración de células viables a 1 × 10 6 células/mL en AIM V CC.
Coloque las células en pocillos de tamaño adecuado de microplacas tratadas con cultivo
de tejido Falcon.
CC en Por ejemplo,
un pocillo de coloque ende
una placa placa hasta 5( consulte
6 pocillos × 10 6 células en15).
la Nota 5 ml de AIM V
8. Las células NK CD56+ comenzarán a aparecer alrededor del día 14, alcanzarán su punto
máximo alrededor del día 28 y comenzarán a disminuir a partir de entonces (Fig. 2b ).
9. Entre los días 14 y 28, las células NK CD56+ se pueden clasificar mediante la clasificación
de células activadas por fluorescencia (FACS) o la selección de microesferas
inmunomagnéticas para cultivos continuos o ensayos funcionales como la evaluación de
citotoxicidad. Las células NK ordenadas se pueden cultivar a 1 × 10 6 células/mL, pero ya
no se expandirán apreciablemente,
con sueroen
ABmedio AIMalV5(Life
humano Technologies)
% (Corning) complementado
y GlutaMAX 2 mM
(Life Technologies) y 20 ng/mL de IL-15 humana recombinante (R&D

Systems). En nuestras manos, las células NK ordenadas en este medio
siguen siendo citotóxicas durante aproximadamente 2 semanas más.
4 notas
1. Los protocolos presentados se pueden aplicar a cualquier fuente de células

positivas para CD34 humanas [ 14]. Sin embargo, el rendimiento final de
células NK diferenciadas es mayor cuando se utiliza sangre de hígado fetal o
de cordón umbilical, en comparación con la médula ósea o las células madre
periféricas movilizadas [ 19 ].
2. La presencia de un marcador coadministrado, como la proteína fluorescente

verde mejorada (EGFP) o un componente de selección, permitirá el
enriquecimiento de precursores de células NK modificados genéticamente en
cualquier paso del protocolo de diferenciación.
3. No está claro si la expresión de DL1 es necesaria para la generación exitosa
de células NK maduras y funcionales. La evidencia preliminar sugiere que el
cocultivo OP9-DL1 promueve una diferenciación más rápida y una mayor
, 15 , 20 ].el
proliferación celular [ 13 4. En experimentos clínicamente relevantes,
número de copias del vector viral por célula en HSC debe mantenerse entre 1 y
3 copias/célula, para evitar genotoxicidad.
5. Una placa recubierta con RetroNectin se puede conservar a 4 °C hasta 7 días

bien llena con 1 ml de tampón de lavado.
6. En el protocolo de cocultivo, hemos utilizado no irradiados
Células estromales OP9-DL1.
7. Comience el cultivo de células estromales OP9-DL1 1 o 2 semanas antes de
la transducción de HSC, para tener al menos un matraz T-75 completo con
estroma confluente antes de comenzar el protocolo.
8. Pase células OP9-DL1 cultivadas en frascos cada 3 a 5 días y cuando no haya
más confluencia del 90 %, divida las células en 1:5 a 1:10, es decir, usando
una quinta parte a una décima parte del volumen. de suspensión celular de
un frasco para volver a sembrar un nuevo frasco. El estroma totalmente
confluente se descompone en alrededor de 10 a 14 días. El momento del
paso de las células OP9-DL1 con la siembra de placas para el cocultivo con
HSC optimizará el protocolo y evitará el desperdicio.
9. Las células OP9-DL1 deben tener una confl uencia del 90 % antes de sembrar las
células humanas, lo que suele tardar de 2 a 4 días después de la siembra en una
placa de 12 pocillos tratada con cultivo de tejidos.
10. Sembrar las células estromales OP9-DL1 confluentes frescas de HSCover
cada vez que se pase HSCare. Durante las primeras 2 semanas, las células
humanas proliferarán más rápido y pueden requerir pases más frecuentes.
11. En el protocolo de cocultivo OP9-DL1, las células NK diferenciadas

desarrollarán citotoxicidad contra las células del estroma alrededor del día
35 de cultivo, como sustituto de una diferenciación exitosa.
12. El uso de un protocolo de expansión de células NK aumentará el rendimiento
final de la generación de células cuando se utilice en secuencia con los
protocolos descritos en este capítulo. Las células deben transferirse al
protocolo de expansión el día 30 o más tarde, cuando las células tengan
una mayor expresión de CD16 y otros marcadores específicos de células
NK maduras.
13. En la preparación de AIM V CC, el suero AB humano debe inactivarse con

calor a 56 °C durante 30 min y filtrarse en condiciones estériles para eliminar
el exceso de lípidos. Como alternativa, el medio AIM V Complete se puede
esterilizar por filtración antes de agregar las citocinas.
14. Para volver a suspender el sedimento celular, es importante mover el tubo
para dispersar las células en lugar de pipetear directamente el sedimento,
lo que puede causar cizallamiento y disminuir la viabilidad de las células en
este punto.
15. A medida que se diferencian las HSC, las células adherentes, como las
células endoteliales y los macrófagos, se vuelven observables. Sin embargo,
los progenitores NK y NK no son muy adherentes; por lo tanto, durante las
divisiones, pipetee para separar las células que se pueden separar
fácilmente y no intente eliminar las células fuertemente adheridas. Si el
pocillo se cubre de células adheridas, no continúe utilizándolo para la
diferenciación y expansión de NK .
Reconocimiento
El apoyo fue proporcionado por el Departamento de Pediatría de UCLA (K-12

UCLA Child Health Research Center Development Award (CHRCDA)), Gwynne
Hazen Cherry Memorial Fund, Pediatric Cancer Research Foundation, UCLA
Children's Discovery and Innovation Institute, UCLA Jonsson Comprehensive
Cancer Center, UCLA /CFAR Virology Core Lab, UCLA Clinical and Translational
Science Institute Grant UL1TR000124, Lights Camera Cure y St. Baldrick's
Foundation.
Referencias
1. Campbell KS, Hasegawa J (2013) Biología de células células asesinas como terapia adoptiva para
asesinas naturales: una actualización y direcciones enfermedades malignas. Citoterapia 16:1453–1466
futuras. J Allergy Clin Immunol 132:536–544 2. 4. Leung W (2014) Infusiones de células asesinas
Childs RW, Berg M (2013) Traer células asesinas naturales alogénicas como terapia contra el cáncer.
naturales a la clínica: manipulación ex vivo. Clin Cancer Res 20:3390–3400 5. Moretta L,
Hematología Am Soc Hematol Educ Program Montaldo E, Vacca P et al (2014)
2013:234–246
Células asesinas naturales humanas: origen,
3. Davies JOJ, Stringaris K, Barrett JA et al (2014) receptores, función y aplicaciones clínicas. Int Arch
Oportunidades y limitaciones de los recursos naturales Allergy Immunol 164:253–264
6. Knorr DA, Bachanova V, Verneris MR et al (2014) Utilidad 14. Luévano M, Madrigal A, Saudemont A (2012)
clínica de las células asesinas naturales en la terapia y el Generación de células asesinas naturales a partir de células
trasplante del cáncer. Semin Immunol 26:161–172 madre hematopoyéticas in vitro para inmunoterapia.
Cellular Mol Immunol 9:310–320 15. De
7. Micucci F, Zingoni A, Piccoli M et al (2006) Oliveira SN, Ryan C, Giannoni F et al (2013) Modificación de
Transferencia de genes mediada por vectores lentivirales de células madre/progenitoras hematopoyéticas con receptores
alta eficiencia en células NK humanas primarias. Exp de antígenos quiméricos específicos de CD19 como enfoque
Hematol 34:1344–1352 novedoso para la inmunoterapia contra el cáncer. Hum Gene
8. Shook DR, Campana D (2011) Ingeniería de células asesinas Ther 24: 824–839
naturales para la terapia celular del cáncer.
Tissue Antigens 78:409–415 9. Chu 16. Cany J, van der Waart AB, Tordoir M et al (2013) Las células
J, Deng Y, Benson DM et al (2014) Células asesinas naturales asesinas naturales generadas a partir de células progenitoras
diseñadas con receptor de antígeno quimérico (CAR) específi hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical se dirigen
co CS1 mejoran la actividad antitumoral in vitro e in vivo de manera eficiente a las células de leucemia humana que
contra el mieloma múltiple humano. Leucemia 28:917–927 residen en la médula ósea en ratones NOD/SCID/IL2Rgnull.
PLoS Uno 8:1–11
10. Boissel L, Betancur M, Wels WS et al (2009)
17. Ni F, Sun R, Fu B et al (2013) IGF-1 promueve el desarrollo y
La transfección con ARNm para el receptor de antígeno la actividad citotóxica de las células NK humanas. Nat
Commun 4:1479 18. Cooper AR, Patel S, Senadheera S et
quimérico específico de CD19 restaura la destrucción de
células de CLL mediada por células NK. Leuk Res 33:1255– al (2011)
1259 11. Boissel L, Betancur-Boissel M, Lu W et al (2013) Concentración de vectores lentivirales a gran escala
La reorientación de células NK-92 por medio de receptores de altamente eficiente mediante filtración de flujo tangencial en
antígenos quiméricos específicos de CD19 y CD20 se tándem. J Virol Methods 177:1–9 19. Luevano M, Domogala
compara favorablemente con la citotoxicidad celular A, Blundell M et al (2014) Las células madre hematopoyéticas de
dependiente de anticuerpos. la sangre del cordón umbilical congeladas se diferencian en
un mayor número de células asesinas naturales funcionales
Oncoinmunología 2, e26527 12. in vitro que las células madre hematopoyéticas movilizadas
Glienke W, Esser R, Priesner C et al (2015) o las células madre hematopoyéticas recién aisladas. Células
Ventajas y aplicaciones de las células asesinas naturales madre hematopoyéticas de sangre de cordón.
que expresan CAR. Front Pharmacol 6:1–7 13. De Smedt M, PLoS One 9:e87086 20.
Taghon T, Van de Walle I et al (2007) La señalización de Notch La Motte-mohs RN, Herer E, Zu JC (2005)
induce la expresión citoplasmática de CD3 épsilon en células Inducción del desarrollo de células T a partir de células
NK de diferenciación humana. Sangre 110:2696–2703 madre hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical
humano por Delta like 1 in vitro. In Vitro 105: 1431–1439
capitulo 21
Expresión de receptores de ingeniería en células asesinas naturales

A través de trogocitosis
anitha somanchi
, Decano A. Lee, y Srinivas S. Somanchi
Resumen
La trogocitosis es un proceso rápido dependiente del contacto mediante el cual los linfocitos adquieren parches de membrana de las
células diana (células "donantes") con las que interactúan y se ha demostrado que este fenómeno ocurre en varias células inmunitarias.
Las moléculas de superficie adquiridas a través de la trogocitosis se incorporan funcionalmente en las células "aceptoras" de forma
transitoria. Anteriormente habíamos demostrado que la trogocitosis se puede utilizar en lugar de la transferencia de genes para diseñar
la expresión del receptor de superficie en las células NK para aplicaciones de inmunoterapia adoptiva. En este capítulo, describimos un
protocolo detallado para la trogocitosis: cultivo conjunto de células NK con la línea celular donante, evaluación fenotípica de la captación
y persistencia del receptor, y evaluación de la función de las células NK (migración) después de la adquisición del receptor.
Palabras clave Células NK, Trogocitosis , CCR7 , Inmunoterapia adoptiva
1. Introducción
La trogocitosis es un proceso de transferencia intercelular rápida y

dependiente del contacto de célula a célula de parches de membrana. El
fenómeno se describió inicialmente a través de la transferencia de LPS
marcado con 14C de macrófagos a linfocitos [ 1]. Desde entonces, se ha
demostrado que la trogocitosis ocurre en muchos tipos diferentes de células
inmunitarias, incluidas las células T, las células B, las células dendríticas,
las células NK y los macrófagos/monocitos, y los neutrófilos [ 2 - 13] e
incluso entre las células tumorales [ 14 ], ambas in vitro e in vivo. Aunque el
propósito biológico de la trogocitosis sigue siendo desconocido, se ha
especulado que genera plasticidad inmune más allá de la programación
genética y epigenética [ 15 - 18]. Además, se ha demostrado que las
proteínas unidas a la membrana adquiridas a través de la trogocitosis emiten
, funcionalidad
señales dentro de las células
única"aceptoras" [ 19, 20
para las células ], lo que ofrece una
aceptoras.
En el contexto de las células NK, se demostró que la trogocitosis no
solo genera células NK supresoras a través de la captación de HLA-G1
[ 21 ], células NK hiposensibles a través de la captación de ligandos de
receptores activadores [ 22 ] y causa fratricidio de células NK que adquieren tumores
253
254 Anitha Somanchi et al.
ligandos derivados para NKG2D [ 23], pero también se demostró que permiten su
migración, a través de la adquisición de CCR7 de células dendríticas [ 24 ] con la
consecuencia potencial de disminuir la reacción de injerto contra huésped.
Con base en la capacidad del proceso de trogocitosis para transferir moléculas de
superficie intactas a las células NK y el impacto funcional que imparten a las células NK,
propusimos el uso de la trogocitosis como una herramienta para diseñar la expresión de
proteínas de membrana en las células NK, en lugar de modificación genética, para la
aplicación de inmunoterapia adoptiva y demostró la viabilidad del enfoque usando un
modelo in vivo de localización de ganglios linfáticos [ 25]. Más recientemente, este
enfoque también se utilizó para modificar las células NK con el receptor de antígeno
quimérico (CAR) para atacar la leucemia linfoblástica aguda de células B [ 26 ].
En este capítulo, se describe un protocolo detallado para la modificación eficiente

de las células NK a través de la trogocitosis. Este método se puede utilizar para evaluar
el fenómeno de la trogocitosis en las células NK o para modificar las células NK con
proteínas unidas a la membrana de interés, como los receptores de quimiocinas o los
receptores dirigidos a tumores, como los CAR.
Dado que la trogocitosis implica la transferencia de parches de membrana, este método
se puede usar para transferir simultáneamente múltiples proteínas o complejos de
proteínas de múltiples componentes a las células NK.
2 materiales
1. Células NK humanas (células NK activadas/expandidas o células NK

líneas).
2. Medio de células NK: RPMI 1640, 10 % FBS, 1x GlutaMAX (2 mM) y 1x Pen/Strep.

Agregue 50 UI/ml de IL2 al medio justo antes de usar.
3.Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences).
4. Línea celular parental K562 (K562-P).
5. Gen de la línea celular K562 modificado con el receptor de quimioquina deseado

(CCR7 para el ejemplo dado aquí) o proteína de elección (K562-GM).
6. Medio completo RPMI: RPMI 1640, 10 % FBS, 1× Pen/

estreptococo, 1 × GlutaMAX.
7. Irradiador Gammacell 1000.
8. Baño de nitrógeno líquido o hielo seco/etanol en hielo de poliuretano

balde.
Baño de agua a 9,37 °C.
10. Colorante azul tripán y hemocitómetro. Tubos

cónicos de 11,50 ml.
Placas de 12,24 pocillos (o frascos T-75 para una configuración de cocultivo más grande).
13.PBS.
Trogocitosis para modificar células NK 255
14. Tampón de lavado ácido: Prepare un tampón de citrato que contenga ácido cítrico
0,133 M y fosfato de sodio dibásico 0,066 M, guárdelo a temperatura ambiente.
15. Tampón de parada: prepare RPMI 1640 que contenga FBS al 10 % y HEPES 10
mM, guárdelo a 4 °C.
16. Cóctel de anticuerpos: Prepare un cóctel de anticuerpos con Anti-CD16 PE-Cy5,

anti-CD56 PE-Cy5 o anti-NKG2D PE-Cy5 y anticuerpo contra el receptor elegido
(p. ej., CCR7) conjugado con FITC. formaldehído al 17,1 % en PBS.
18.CFSE o Calceína AM.
19. Medio RPMI sin suero: RPMI 1640, 1x GlutaMAX (2 mM) y 1x Pen/Strep.
20. Quimiocinas: quimiocinas recombinantes (CCL19 y CCL21 en el ejemplo dado aquí)

correspondientes al receptor de quimiocina de elección.
21. Insertos individuales Corning 3 ÿM trans-well (Sigma Aldrich).

22. Tubos FACS.
23.Cuenta de perlas para citometría de flujo (BD Biosciences).
24. Citómetro de flujo.
25. Software como FlowJo o equivalente para el análisis de datos de citometría de flujo.
3 métodos
Recomendamos la línea de células K562 como la célula "donante" para la transferencia

de receptores mediada por trogocitosis a las células NK. Inicialmente, los genes
modifican las células K562 para expresar receptores de superficie (o ligandos) de
interés y crear una línea celular estable. Aquí, describimos el protocolo que usa células
NK expandidas en K562 mbIL21 para la captación,
de la de
línea
receptores
celular K562
de membrana
modificadodel
para
gen
expresar los receptores deseados: célula aceptora. Las células NK primarias o las
células NK activadas con citoquinas se pueden usar como células aceptoras usando
este protocolo.
3.1 Cocultivo de 1. Descongele las células NK expandidas y colóquelas en cultivo en medio de células
trogocitosis NK a una densidad celular de 1 × 10 6–3 × 10 6 células/ml,
permitir
durante
quelalas
noche
células
para
se recuperen de la descongelación antes de realizar el cultivo conjunto con la
3.1.1 Preparación de
célula donante línea ( ver Nota 1 ).
células NK 'aceptoras'
2. Al día siguiente, mezcle las células NK y realice un recuento de células y pruebe la
viabilidad mediante la exclusión con azul de tripán utilizando un hemocitómetro.
3. Si la viabilidad de las células NK es superior al 85 %, proceda con el tro

experimento de cocultivo de gocitosis.
4. Si la viabilidad de las células NK es inferior al 85 %, se recomienda realizar una

centrifugación de densidad Ficoll-Paque para eliminar las células muertas ( ver
Nota 2 ).
3.1.2 Preparación de células Para los experimentos de trogocitosis, la línea celular del donante se puede utilizar
'donantes' recién extraída del cultivo (células vivas) o irradiada (para evitar la proliferación). Para
modelos animales de inmunoterapia adoptiva de células NK modificadas por
trogocitosis, es recomendable irradiar la línea celular donante, para prevenir el
crecimiento tumoral in vivo. Alternativamente, habíamos demostrado previamente que
las células del donante se pueden congelar/descongelar lisadas de manera controlada
[ 25] para facilitar la eliminación de la mayoría de las células del donante del co-cultivo
a través de la centrifugación por densidad de Ficoll-Paque.
1. Mantenga la línea celular K562(K562-GM) modificada genéticamente y el K562

original (K562-P) en medio RPMI completo. Es importante probar periódicamente
la expresión de la proteína deseada en estas células ( ver Nota 3 ).
2. Si se desean células donantes irradiadas, recolecte hasta 100 × 10 6 células

K562 -GM en un tubo cónico de 50 ml e irradie a 100 Gy (10 000 rads) con un
irradiador Gammacell ( consulte la Nota 4 ) y congele el donante K562 irradiado.
células. En paralelo, irradie K562-P para que sirva como control.
3. Descongelar un vial de células de donante el día de realizar la trogocitosis

co-cultura.
4. Lavar tres veces con PBS, girando cada vez a 400 × g durante 5 min y resuspender
en medio de células NK.
5. Si desea congelar/descongelar células K562-GM lisadas del donante, resuspenda

las células irradiadas ( consulte la Nota 5 ) a 5 × 10 6 células por ml de medio
completo RPMI y congele el medio sumergiendo el tubo en nitrógeno líquido ( o
hielo seco-baño de etanol) durante 2 min, transferir inmediatamente el tubo a
baño de agua a 37 °C y mantener en baño de agua hasta que el contenido se
descongele por completo. Paralelamente, congelar/descongelar lisar la línea
celular K562-P para que sirva como control.
6. Mezcle las células suavemente y verifique la viabilidad utilizando el método de

exclusión con azul tripán. El objetivo es tener células positivas para azul de
tripano que estén estructuralmente intactas (redondas y no desintegradas)
(Figura 1). Si menos del 5 al 10 % de las células son viables, deténgase en esta
etapa ( consulte la Nota 6 ). Si hay más células viables, repita el proceso de
congelación/descongelación una vez más, seguido de una verificación de viabilidad.
7. Si se logra el grado deseado de daño de la membrana celular, lave las células

dos veces con medio de células NK fresco, girando cada vez a 100 × g durante
10 min. Resuspender el sedimento en 10 ml de medio de células NK.
8. Cuente las células utilizando el método de azul tripán (incluya las células positivas
y negativas de azul tripán en los recuentos) para establecer un cultivo conjunto
con células NK.
Fig. 1 Imagen de campo brillante de células K562 tratadas con congelación/descongelación. Se tomaron imágenes de las células K562
después del tratamiento de congelación/descongelación, la imagen muestra el impacto de un solo ciclo de congelación/descongelación en
K562 (1); aquí las células parecen estructuralmente intactas pero se vuelven positivas para el azul de tripano, también observe la presencia de
pocas células viables. Los ciclos posteriores de congelación/descongelación (2 y 3) causan un daño excesivo a las células que conduce a la
agregación y no son deseables para el cocultivo. Reproducido
Ingeniería de Blood
de localización , “Somanchi,
de ganglios SS,de
linfáticos Somanchi, A., Cooper,
células asesinas LJ, Dean
naturales A. Leeexpandidas
humanas (2012)
ex vivo a través de la trogocitosis del receptor de quimioquinas CCR7. Sangre 119
, 5164–5172”
3.1.3 Configuración de 1. Semillas de células NK y K562 -células de donante GM en una relación E:T de 1:1 (5
cocultivo de trogocitosis × 10 5 células cada una) en una placa de 24 pocillos en un volumen total de 2 ml
de medio de células NK por pocillo. Para un lote grande de trogocitosis, sembrar las
células en un matraz T75, en un máximo de 20 ml de medio de células NK.
Paralelamente, configure el cultivo conjunto con K562-P como control ( consulte la
Nota 7 ).
2. Haga girar la placa o el matraz (en el adaptador del soporte del matraz) a 100 × g
durante 10 min sin freno, para iniciar el contacto célula-célula. incubadora (a 37 °C)
3.Incubar en CO2 al 5 %
2 durante 1 h.
4. Después de la incubación, mezcle el contenido para romper los agregados celulares.
5. Si se utilizan células lisadas congeladas/descongeladas como células donantes

(K562-GM y K562-P), cargue las células en Ficoll-Paque y centrifugue como se
describió anteriormente ( consulte la Nota 2) .
3.1.4 Lavado con ácido Es importante realizar un lavado con ácido después de la trogocitosis, para disociar la
interacción (receptores-ligando) de restos de células del donante de NK, para medir con
precisión la absorción de la membrana por las células NK, a través de la trogocitosis.
1. Vuelva a suspender las células NK recuperadas de la interfase Ficoll-Paque (NK+

K562 -GM; NK+K562-P) o las células NK cocultivadas con células del donante
irradiadas, a una densidad de 5 × 10 6 células/ml en tampón de
durante
lavado4ácido
min a 20
°C, como se describió anteriormente [ 20] en un tubo cónico de 15–50 ml.
2. Para detener el tratamiento de lavado con ácido, llene el tubo cónico hasta el
volumen máximo con Stop buffer.
3. Girar las células a 400 × g durante 5 min.
4. Lave las células tres veces más con 10 ml de medio de células NK, girando cada vez
a 400 × g durante 5 min. Antes de
último lavado, divida las células en dos alícuotas, una (alícuota más pequeña) para
citometría de flujo y la segunda (alícuota más grande) para la aplicación prevista, por
ejemplo, ensayo de migración in vitro, transferencia adoptiva in vivo, etc.
3.2 Citometría de flujo 1. Para analizar la adquisición del receptor por parte de las células NK a través de la
trogocito sis, resuspender los sedimentos de células lavadas con ácido (NK+ K562-GM y
3.2.1 Adquisición de datos
NK+K562-P) en tampón de bloqueo a una densidad de 5 × 10 5 células/50 ÿl 4
e °C
incubar
durante
a
15 min. Divida las células cocultivadas NK+K562-GM en dos grupos (5 × 10 5 células
cada uno).
2. Al grupo uno, no agregue ningún anticuerpo (grupo sin teñir).
3. Al grupo dos, agregue el cóctel de anticuerpos de tinción a las células: CD16 (5 ÿl), CD56
(5 ÿl) o NKG2D (5 ÿl) más el anticuerpo contra el receptor elegido (5 ÿl) ( consulte las
Notas 8 y 9) .
4. Al grupo NK+ K562 -P, agregue el cóctel de anticuerpos como se indicó anteriormente.
Este grupo servirá como control de tinción negativo para el receptor adquirido.
5.Incubar a 4 °C en la oscuridad durante 30 min.
6. Lave las células tres veces en PBS, girando cada vez a 400 × g
durante 5 min.
7.Fijar las células en formaldehído al 1 %.
8. Analice la muestra por citometría de flujo y realice el análisis de datos en FlowJo o

cualquier software de citometría de flujo de su preferencia.
3.2.2 Esquema de activación 1. En FlowJo, o cualquier otro software preferido para analizar los datos de citometría de
para el análisis flujo, abra los datos para el control sin teñir en un gráfico de dispersión frontal (FSC)
frente a dispersión lateral (SSC).
2. Seleccione la población de linfocitos, tenga en cuenta que estará presente una población
de células granulares más grande que representa las células del donante K562 en
cocultivos que utilizan células del donante irradiadas. Esta población estará ausente o se
reducirá significativamente si se utilizan células donantes K562 congeladas/descongeladas
para el cocultivo (Fig. 2 ).
3. Seleccione los linfocitos sincronizados y la gráfica como CD16/CD56 (en este ejemplo, PE-
Cy5) frente a SSC-H. Luego, seleccione la población de células positivas para CD16/
CD56 y grafítelas en CD16/CD56 frente a la tinción del receptor (en este ejemplo,
CCR7FITC) como se muestra en la Fig. 3a, y dibuje la puerta de corte para el canal de
fluorescencia perteneciente al receptor adquirido (en este ejemplo, , CCR7) basado en
el grupo de control NK+ K562 -P.
Este gráfico mostrará el porcentaje de células NK que han adquirido el receptor de la

línea celular donante y la intensidad de fluorescencia general del receptor adquirido en las
células NK (cantidad de receptor adquirido). El porcentaje de células NK que son positivas
para el receptor adquirido será menor si se utilizan células donantes lisadas por congelación/
descongelación, por ejemplo, Figura 3b. Esto se puede superar aumentando la proporción de
células donantes lisadas por congelación/descongelación a células NK en el cocultivo.
Fig. 2 Comparación de la dispersión frontal y lateral del cocultivo de células NK con células "donantes"
K562. Los diagramas de flujo muestran células NK incubadas con células K562 intactas (izquierda) y
células NK cocultivadas con K562 tratadas con congelación/descongelación después de la separación
con Ficoll-Paque (derecha). Las células NK se pueden separar de las células K562 tratadas con
congelación/descongelación después de la centrifugación con Ficoll-Paque (recuadro rojo).
de Blood
Reproducido
,
“Somanchi, SS, Somanchi, A., Cooper, LJ, Dean A. Lee (2012) Ingeniería de localización de ganglios
linfáticos de células asesinas naturales humanas expandidas ex vivo a través de la trogocitosis del
receptor de quimioquinas CCR7. Sangre 119 , 5164–5172”
3.3 Evaluación Para aplicar con éxito las células NK modificadas para expresar nuevos receptores a
de la función través del proceso de trogocitosis, es esencial comprender si los receptores adquiridos
y persistencia se incorporan funcionalmente en las células NK y la duración de la persistencia de
de receptores adquiridos estos receptores adquiridos. Anteriormente habíamos demostrado que las células NK
pueden adquirir simultáneamente múltiples receptores de la célula donante, debido a
la transferencia de parches de membrana de la célula donante a la célula aceptora
durante el proceso de trogocitosis, y que diferentes receptores/moléculas persisten
durante períodos variables en la célula donante. superficie de las células NK [ 25]. El
análisis funcional de los receptores adquiridos se puede realizar evaluando la
señalización intracelular [ 20] o evaluando el resultado funcional deseado, como la
migración o la citotoxicidad mejorada [ 25, 26]. Aquí describimos métodos para evaluar
la migración de células NK y la persistencia de los receptores adquiridos.
3.3.1 In Vitro Hay muchos métodos disponibles para evaluar la migración in vitro, ya sea mediante
Ensayo de migración un ensayo de migración entre pozos o mediante imágenes en tiempo real de la
migración mediante micropocillos o microfabricaciones basadas en el flujo. Aquí
estamos describiendo el ensayo estándar de migración entre pozos.
1. Tiñe las células NK con un marcador fluorescente de elección, como CFSE o

Calcein AM (según el protocolo del fabricante), para distinguirlas de cualquier
K562 -P/ K562-GM contaminante en una etapa posterior (mientras se determina
la migración).
2. Configure el cocultivo de trogocitosis y prepare las células NK para el ensayo de

migración como se describe en los Subtítulos 3.1.3 y
Fig. 3 Estrategia de activación para identificar células NK positivas para trogocitosis. La figura muestra la estrategia de activación
para identificar positivamente las células NK y evaluar la adquisición del receptor por parte de las células NK a través de la
trogocitosis. Tenga en cuenta que aquí las células NK se tiñeron con CD16 y CD56 y se conjugaron con el mismo fluorocromo para
teñir brillantemente las células NK para discriminar la autofluorescencia de cualquier K562 contaminante. Reproducido
“Somanchi,
de Blood
SS, ,
Somanchi, A., Cooper, LJ, Dean A. Lee (2012) Ingeniería de localización de ganglios linfáticos de células asesinas naturales humanas
expandidas ex vivo a través de la trogocitosis del receptor de quimioquinas CCR7. Sangre 119 , 5164–5172”
3.1.4 y resuspender a una densidad celular de 1 × 10 6/ml utilizando

medio RPMI sin suero.
3. Coloque una placa de 24 pocillos en la cabina de bioseguridad y

agregue 1 ml de medio RPMI sin suero por pocillo (cámara inferior)
con o sin el quimioatrayente deseado ( consulte la Nota 10 ). Determina el
número de pozos para el ensayo basado en el número de condiciones que se

están probando. Para conocer las condiciones de ensayo recomendadas, ,
. por
consulte la Nota 11 Es triplicado.
aconsejable ensayar cada condición en
4. Coloque insertos trans-well de 3 ÿm en cada pozo y agregue 500 ÿl de células NK

por inserto (5 × 10 5 células por inserto) (cámara superior) según las condiciones
determinadas para el ensayo (p. ej ., consulte la Nota 11 ).
5. Coloque la tapa en la placa de 24 pocillos e incube a 37 °C en una incubadora

CO durante 6 h (se puede hacer una incubación más larga hasta
2
24 h en función de las necesidades del ensayo).
6. Regrese la placa al gabinete de bioseguridad y retire con cuidado el

inserciones
7. Mezcle suavemente el contenido de la cámara inferior y recupere en tubos FACS

de 5 ml para determinar los recuentos de células (migración).
8. Agregue perlas de conteo al medio y analice la muestra en un citómetro de flujo.
9. Configure la adquisición de datos para contar un número específi co de cuentas en

todas las muestras (p. ej., 10 000 cuentas).
10. Analice los datos como número de células NK por 10 000 microesferas en cada
muestra para obtener recuentos comparativos de células NK presentes en cada
condición.
11. Grafique los resultados como el número de células NK que han migrado en cada
condición normalizadas al control (el control negativo más apropiado para esta
comparación serían las células NK cocultivadas con K562 -P—Condición 5,
según la Nota 11 ), o como aumento porcentual en la migración del grupo de
prueba en comparación con el control, en presencia de quimioatrayente.
3.3.2 Persistencia 1. Configure el cocultivo de trogocitosis y prepare las células NK como se describe
de receptores adquiridos en los subtítulos 3.1.3 y 3.1.4 .
2. Tomar una alícuota de células (tiempo 0 h), lavar dos veces en PBS, fijar en
formaldehído al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente y realizar la tinción
para el análisis de adquisición del receptor por citometría de flujo como se
describe en el subtítulo 3.2.1 ( pasos 2 a 7). Almacenar a 4 ° C.
3. Devuelva las células NK restantes a cultivo en medio de células NK.
4. Tome una alícuota de células en varios puntos temporales ( consulte la Nota 12 ),

lave dos veces en PBS, fije en formaldehído al 1 % ( consulte la Nota 13 ), luego
tiñe las células como antes (si se recolectan múltiples puntos temporales en un
día). , luego almacene las células teñidas a 4 °C hasta que se recolecten todas
las muestras del día) y analice la muestra por citometría de flujo (Fig. 4 ).
Fig. 4 Persistencia del receptor adquirido por trogocitosis. Los receptores adquiridos se
pierden de la superficie de las células NK con el tiempo. Aquí se muestra la cinética mediana
(rango ±) de persistencia de CCR7 adquirido a partir de tres células NK independientes
derivadas de donantes. Reproducido de
Dean
Blood
A. ,Lee
“Somanchi,
(2012) Ingeniería
SS, Somanchi,
de localización
A., Cooper,
de LJ,
ganglios linfáticos de células asesinas naturales humanas expandidas ex vivo mediante
trogocitosis del receptor de quimioquinas CCR7. Sangre 119 5164–5172” ,
4 notas
1. Para un lote grande de células NK, aumente el tamaño del matraz según corresponda.
Para las células NK primarias, aísle las células NK mediante selección negativa y
utilícelas inmediatamente para experimentos de trogocitosis o manténgalas en cultivo
durante la noche con un soporte mínimo de IL2 (20–50 UI/ml) para ayudar a
recuperarse del proceso de aislamiento y proporcionar cierta activación. El proceso
de congelación/descongelación
NK provocará
primarias yuna pérdida
podría de viabilidad
disminuir de las
la captación células por
mediada
trogocitosis de la membrana de la célula diana, por lo que debe evitarse para las
células NK primarias.
2. Recoja las células NK y páselas a través de un filtro de células de 70 ÿm para eliminar

grandes agregados de células muertas y colóquelas con cuidado en Ficoll-Paque y
centrifugue a 400 × g durante 20 min sin freno.
Recoja las células NK vivas de la interfaz y transfiéralas a un tubo cónico nuevo de
15 ml y lávelas 3 veces con PBS (10 ml).

Resuspender las células NK en medio de células NK y contar el rendimiento celular
y la viabilidad como antes.
3. Haga un gran banco de células de la línea celular del donante K562 y no mantenga
las células en cultivo durante largos períodos de tiempo (más de 6 meses), y analice
periódicamente la línea celular para detectar contaminación por micoplasma.
4. La capacitación formal y la autorización para usar el irradiador son obligatorias en la

mayoría de las instituciones, de ahí el protocolo detallado para la irradiación.
aquí no se proporciona la diación de las células del donante. Se puede irradiar

una gran cantidad de células y congelarlas en alícuotas.
5. Recomendamos el uso de células de donante K562 irradiadas para la lisis por

congelación/descongelación para aplicaciones de transferencia adoptiva in vivo.
Dado que la congelación/descongelación se realiza de manera que no se
desintegren todas las células, el proceso retiene del 5 al 10 % de las células
viables y, en una aplicación in vivo, esta contaminación de células viables puede
conducir al desarrollo de un tumor no deseado.
6. La congelación/descongelación excesiva desintegrará las células y los restos de

membrana generados no favorecen la captación de parches de membrana
mediada por trogocitosis por parte de las células NK.
7. Hemos observado previamente una menor captación de parches de membrana por

parte de las células NK cuando utilizamos células donantes lisadas congeladas/
descongeladas. Esto podría deberse a una trogocitosis deficiente de las células
NK de las células de un donante muerto o a una disparidad en la relación E:T
creada debido al asentamiento inadecuado de las células muertas (flotantes) en la
superficie de la placa en comparación con las células vivas. Por lo tanto, es
recomendable utilizar una mayor proporción de células de donante a células NK.
8. Anteriormente, habíamos usado anticuerpos CD16 y CD56 conjugados con el

mismo fluorocromo: PE-Cy5 para marcar fuertemente las células NK con el fin de
distinguirlas de la autofluorescencia de fondo de las células K562 contaminantes,
y usamos anticuerpos anti-CCR7 conjugados con FITC [ 25 ].
9. Como alternativa, preteñir las células NK con colorantes fluorescentes (colorantes

de membrana o citoplásmicos) para distinguirlas de K562. Para
evaluar la absorción de la membrana por parte de las células NK, las células K562
se pueden teñir previamente con colorantes de membrana (con compatibilidad de
fluorescencia con el colorante utilizado para teñir las células NK). Sin embargo,
para evaluar específicamente la adquisición del receptor de elección por parte de
las células NK, es recomendable teñir con anticuerpos contra el receptor en lugar
de teñir la línea celular donante con un colorante de membrana.
10. Dado que el suero tiene quimioatrayentes, el uso de un medio sin suero en el
ensayo de migración reducirá significativamente la migración de fondo o no
específica en el grupo de control. Determine la concentración del quimioatrayente
utilizado en el ensayo basándose en la literatura o por titulación. Anteriormente
hemos utilizado 300 ng/ml de CCL19/CCL21 en la migración transpozo de células
NK.
11. Sin quimioatrayente en la cámara inferior—Condición 1: Células NK sin cocultivo de
trogocitosis; Condición 2: células NK cocultivadas con K562-P; y Condición 3:
células NK cocultivadas con K562-GM. (Estas condiciones proporcionan migración
de fondo/no específica de células NK en ausencia de cualquier quimioatrayente).
Con quimioatrayente apropiado en la cámara inferior— Condición 4: Células NK

sin cocultivo de trogocitosis; Condición 5: células NK cocultivadas con K562-P; y
condición
6: Células NK cocultivadas con K562-GM. (Las condiciones 4 y 5

proporcionan una migración de fondo de las células NK en presencia de
cualquier quimioatrayente y la condición 6 proporciona una migración
específica en respuesta al quimioatrayente).
12. Hemos analizado previamente la persistencia del receptor hasta las 72 h.
Evaluar la duración de la persistencia hasta que las células NK pierden
por completo todos los receptores adquiridos de su superficie.
13. Realice una tinción de prueba con K562 -GM fijo para asegurarse de que
la fi jación no interfiere con la tinción de los receptores. Si la fijación
interfiere con la tinción, omita el paso de fijación antes de la tinción.
Referencias
1. Bona C, Robineaux R, Anteunis A y otros (1973) células asesinas naturales que expresan receptores
Transferencia de antígeno de macrófagos a linfocitos. inhibidores Ly49. J Exp Med 194:1519–1530 10.
II. Importancia inmunológica de la transferencia de Zimmer J, Ioannidis V, Held W (2001) La expresión del
lipopolisacáridos. Inmunología 24: 831–840 ligando H-2D por las células asesinas naturales (NK)
Ly49A+ impide la captación del ligando de las células
2. Rosenits K, Keppler SJ, Vucikuja S y otros (2010) ambientales: implicaciones para la función de las
Las células T adquieren determinantes de APC en la células NK. J Exp Med 194:1531–1539 11. Tabiasco J,
superficie celular a través de la trogocitosis in vivo Espinosa E, Hudrisier D et al (2002) Captura transináptica
durante las infecciones virales. Eur J Immunol 40:3450– activa de fragmentos de membrana por células asesinas
3457 3. Hudrisier D, Aucher A, Puaux AL et al (2007) naturales. Eur J Immunol 32:1502–1508
La captura de los componentes de la membrana de la célula
diana a través de la trogocitosis es desencadenada por un 12. Xu H, Dhanireddy KK, Kirk AD (2006)
conjunto seleccionado de moléculas de superficie en las células Los monocitos humanos como intermediarios entre las
T o B. J Immunol 178:3637–3647
células endoteliales alogénicas y las células T
4. Aucher A, Magdeleine E, Joly E y otros (2008) aloespecíficas: un papel para la captación de la
La captura de fragmentos de membrana plasmática de membrana endotelial mediada por el receptor de barrido
células diana por trogocitosis requiere señalización en directo en el inicio de la aloinmunidad. J Immunol
células T pero no en células B. Sangre 111:5621–5628 176:750–761
13. Whale TA, Beskorwayne TK, Babiuk LA et al (2006) Las
5. Hudrisier D, Riond J, Mazarguil H y otros (2001) células polimorfonucleares bovinas adquieren
Vanguardia: los CTL capturan rápidamente fragmentos de pasivamente lípidos de membrana y proteínas integrales
membrana de las células diana en un Immunol 166:3645– de membrana de células apoptóticas y necróticas. J
3649 dependiente demanera. j TCR
la señalización de Leukoc Biol 79:1226–1233 14. LeMaoult J, Caumartin
J, Daouya M et al (2015) Intercambios de membranas
6. Batista FD, Iber D, Neuberger MS (2001) Las células B intercelulares trogocíticas entre tumores hematológicos.
adquieren el antígeno de las células diana después de
la formación de sinapsis. Nature 411:489–494 7. J Hematol Oncol 8:24
Harshyne LA, Watkins SC, Gambotto A et al (2001) Las 15. Caumartin J, Lemaoult J, Carosella ED (2006)
células dendríticas adquieren antígenos de células Los intercambios intercelulares de parches de
vivas para la presentación cruzada a CTL. J Immunol membrana (trogocitosis) resaltan el siguiente nivel de
166:3717–3723 plasticidad inmunológica. Transpl Immunol 17:20–22
8. Carlin LM, Eleme K, McCann FE y otros (2001) 16. LeMaoult J, Caumartin J, Carosella ED (2007)
Transferencia intercelular y organización supramolecular Los intercambios de parches de membrana (trogocitosis)
del antígeno leucocitario humano C en las sinapsis dividen las funciones teóricas y reales de las células
inmunes de las células asesinas naturales inhibitorias. inmunitarias. Hum Immunol 68:240–243 17. Galli SJ,
J Exp Med 194:1507–1517 9. Borregaard N, Wynn TA (2011)
Sjostrom A, Eriksson M, Cerboni C et al (2001) Adquisición Plasticidad fenotípica y funcional de células de la
de moléculas de clase I del complejo de inmunidad innata: macrófagos, mastocitos y neutrófilos.
histocompatibilidad principal externo por Nat Immunol 12:1035–1044
18. Roda-Navarro P, Reyburn HT (2007) 23. Nakamura K, Nakayama M, Kawano M et al (2013)

Transferencia de proteínas intercelulares en la sinapsis Fratricidio de células asesinas naturales vestidas con
inmune de células NK: mecanismos y significado ligando NKG2D derivado de tumor. Proc Natl Acad Sci
fisiológico. FASEB J 21:1636–1646 19. Osborne DG, USA 110:9421–9426 24. Marcenaro E, Cantoni C, Pesce
Wetzel SA (2012) La trogocitosis da como resultado una S et al (2009)

señalización intracelular sostenida en células T CD4(+). J Captación de CCR7 y adquisición de propiedades
Immunol 189:4728–4739 20. HoWangYin KY, Caumartin migratorias por parte de células NK KIR+ humanas que
J, Favier B et al (2011) El reinjerto adecuado de la transcripción interactúan con líneas celulares DC o EBV derivadas de
2 similar a Ig después de la trogocitosis permite una monocitos: regulación por interacción KIR/HLA-clase I.
Sangre 114:4108–4116
transferencia de sensibilidad célula a célula funcional. J
Inmunol 186: 2210–2218 25. Somanchi SS, Somanchi A, Cooper LJ et al (2012)
Ingeniería de localización de ganglios linfáticos de células
21. Caumartin J, Favier B, Daouya M et al (2007) asesinas naturales humanas expandidas ex vivo a través
Generación basada en trogocitosis de células NK de la trogocitosis del receptor de quimiocinas CCR7.
supresoras. EMBO J 26:1423–1433 22. Miner CA, Giri Sangre 119:5164–5172
TK, Meyer CE et al (2015) 26. Cho FN, Chang TH, Shu CW y otros (2014)
La adquisición del ligando del receptor de activación por Citotoxicidad mejorada de las células asesinas naturales
trogocitosis hace que las células NK sean hiposensibles. después de la adquisición de receptores de antígenos
J Immunol 194:1945–1953 quiméricos a través de la trogocitosis. PLoS One 9, e109352
capitulo 22
Electroporación de siRNA para silenciar la expresión

génica en células NK primarias
Prasad V. Phatarpekar, Dean A. Lee , y Srinivas S. Somanchi
Resumen
El silenciamiento de genes a través de siRNA es una herramienta experimental eficaz para desentrañar los mecanismos moleculares
implicados en los procesos celulares. Aquí describimos un método para silenciar la expresión génica en células asesinas naturales
(NK) humanas primarias mediante la transfección de ARNip de grupo SMART ON-TARGETplus mediante un método basado en
electroporación llamado Nucleofection ®. La técnica produce un silenciamiento efectivo del gen objetivo sin ningún efecto fuera del
objetivo.
Palabras clave Célula NK primaria humana, siARN , nucleofección , Electroporación , EN EL OBJETIVO más ,
,
Conjunto de ARNip SMART silenciamiento de genes
1. Introducción
Las células asesinas naturales juegan un papel crucial en la respuesta inmune

innata contra infecciones virales y tumores. Aunque estos linfocitos se
identificaron a principios de la década de 1970 [ 1, 2], hemos obtenido
conocimientos significativos sobre su complejidad y regulación durante la última década.
Las células NK expresan una gama de receptores activadores e inhibidores
que les permiten distinguir las células sanas de las células estresadas,
infectadas o transformadas. Estos receptores codificados en la línea germinal
permiten que las células NK generen una respuesta inmunitaria efectora
rápida sin necesidad de una sensibilización antigénica previa [ 2, 3]. Además
de matar las células diana, las células NK secretan las citoquinas IFN-ÿ y TNF-
ÿ, que ayudan a promover las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas
[ 4]. Las células NK desempeñan un papel fundamental en la respuesta
inmunitaria, en particular contra los tumores, por lo que han sido objeto de
una considerable investigación para comprender la compleja señalización que
gobierna su función efectora.
La eliminación de genes es una poderosa herramienta para estudiar el
papel de las proteínas individuales en la función celular. Los dos enfoques
estándar para la desactivación de genes son la transducción estable con ARN
de horquilla corta (ARNsh) y la transfección transitoria utilizando pequeños
267
268 Prasad V. Phatarpekar et al.
ARN (siRNA). Numerosos genes involucrados en la función de las células NK han

sido examinados mediante experimentos de eliminación de genes utilizando la
tecnología shRNA [ 5 - 8], incluidos STAT3 [ 9] y PRDMI [ 10], en el contexto de
las neoplasias malignas de las células NK. La mayoría de estos estudios se
realizaron en líneas de células NK para facilitar la manipulación genética porque
las células NK humanas primarias son relativamente difíciles de modificar de forma
estable. Por lo tanto, siRNA, siendo una molécula pequeña (ARN de doble cadena)
de aproximadamente 20-25 pares de bases de longitud, se ha utilizado de manera
efectiva para eliminar transitoriamente la expresión génica en células NK primarias,
así como en líneas celulares NK [ 11 - 18]. El siRNA suprime la expresión génica a
nivel postranscripcional ya sea induciendo la degradación del mRNA o bloqueando
su traducción a proteína. Una vez dentro de la célula, el ARNsi se asocia con el
complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que con la ayuda de la hebra
antisentido se dirige al ARNm deseado. Tras la unión de la hebra antisentido al
ARNm complementario, RISC silencia su expresión ya sea escindiendo el ARNm
o bloqueando su traducción [ 19]. El efecto de siRNA es transitorio debido al
número limitado de moléculas introducidas en la célula durante la transfección (o
electroporación), la dilución de siRNA durante la división celular y la degradación
por nucleasas [ 20 En este capítulo, describimos un método para siRNA mediado
por eliminación de la expresión génica, usando STAT3 como modelo, en células
, 21usando
NK primarias ]. ON-TARGET más SMART pool siRNA.
ON-
TARGET plus es una técnica patentada desarrollada por Dharmacon (ahora GE
Dharmacon) para modificar químicamente las cadenas sentido y antisentido de
siRNA, reduciendo así significativamente los efectos no deseados [ 22]. Un
conjunto inteligente es una combinación de cuatro ON-TARGET más siRNA
diferentes que se dirigen a diferentes regiones del mismo mRNA para garantizar
el silenciamiento efectivo del objetivo previsto [ 23 ].
Los ARNip de ON-TARGET plus se introducen en las células NK primarias
mediante electroporación. En nuestro laboratorio, este procedimiento produjo el
silenciamiento de la expresión del gen objetivo en células NK humanas primarias
sin ningún efecto fuera del objetivo.
2 materiales
2.1 Aislamiento 1. Capa leucocitaria (Banco de Sangre

de células NK Regional). Frasco estéril de 2.250 ml.
Tubos cónicos de 3,50 ml y 15 ml.
4. Medio completo RPMI: RPMI 1640 complementado con FBS al 10 %, 1 × Pen/

Strep, 1 × GlutaMAX.
5. Medio de células NK: RPMI 1640, 10 % FBS, 1x Pen/Strep, 1x GlutaMAX y
recién complementado con 50 UI/ml de IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and
Diagnostics Inc) cada vez justo antes de su uso.
Silenciamiento génico mediado por ARNip de células NK 269
6.Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences).

7. Tampón de lavado PBS: Preparar suero bovino fetal (FBS) recién preparado al 2 %.
en PBS.
8. Cóctel de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep™ (Stem

Cell Technologies).
9. Tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma Aldrich).
2.2 ARNsi 1. SMARTpool ON-TARGET más ARNip STAT3 (GE Dharmacon).

electroporación
2. Grupo de control ON-TARGET más Non-target (control negativo) (GE
Dharmacon). Tampón siRNA 3,5x (GE Dharmacon). 4. Solución madre de
ARNsi: Diluya el tampón de ARNip 5x a 1x usando agua libre de ARNasa;
girar el tubo que contiene siRNA en centrífuga de sobremesa a máxima
velocidad durante 30 s; prepare una solución madre de siRNA de
concentración conveniente (100x stock basada en la concentración más
alta que se utilizará, si es posible) agregando 1x tampón de siRNA al tubo
de siRNA; y pipetee suavemente el tampón hacia arriba y hacia abajo de
tres a cinco veces sin crear burbujas. Coloque el tubo en un agitador
durante 30 minutos a temperatura ambiente para disolver el siRNA en el
tampón. Girar en una centrífuga de sobremesa durante 30 s. Alícuota del
siRNA en volúmenes apropiados en tubos eppendorf estériles. Almacene
las alícuotas a ÿ20 °C en un congelador de descongelación manual o sin
ciclos o, alternativamente, en un congelador de ÿ80 °C ( consulte la Nota
1).
5. Agua libre de ARNasa de grado molecular.

6. Tubos eppendorf estériles.
7. Medio sin suero: preparar RPMI 1640 complementado con
1 × glutamax.
8. 2x Medio: RPMI 1640 complementado con 20 % FBS, 2x Pen/Strep y 1x

GlutaMAX. Placa de cultivo celular de 9,6 pocillos.
10.Humidifi cado a 37 °C/5 % CO 2

incubadora.
11.Dispositivo Amaxa Nucleofector™ (Lonza).

12. Kit Nucleofector™ para células asesinas naturales humanas (almacenar a 4
°C) (Lonza).
2.3 RT-PCR 1.Mini kit RNeasy plus (Qiagen).

2. Kit OneStep RT-PCR (Qiagen).
3. Termociclador PCR.
4. Tubos PCR.
5.Agarosa.
6.GelRojo (10 000×).
7. Fuente de alimentación de electroforesis.
8.Bandeja de gel.
9. Peines de gel.
Escalera de ADN de 10.100 pb.
11.Sistema de Documentación de Gel Digital.
3 métodos
Según el objetivo del estudio, se pueden usar células NK primarias o activadas/expandidas

para el silenciamiento génico mediante siRNA ( consulte la Nota 2). En este método,
describimos el silenciamiento génico mediado por ARNip de STAT3 en células NK primarias.
3.1 Aislamiento Este protocolo describe el aislamiento de células NK primarias de PBMC de sangre periférica
de células NK primarias mediante el método RosetteSep™. Este es un método de selección negativa, en el que las
células no NK de las PBMC se unen a los glóbulos rojos y se eliminan de las células NK
mediante centrifugación con Ficoll-Paque, a través de complejos de anticuerpos tetraméricos
(TAC) biespecíficos. Tenga en cuenta que hay varios otros métodos disponibles para la
selección negativa de células NK de diferentes fuentes; el protocolo descrito aquí se basa en
la práctica habitual en nuestro laboratorio.
1. Transfiera la muestra de la capa leucocitaria a un frasco estéril de 250 ml y agregue PBS

para diluir la muestra de sangre a 140 ml ( consulte la Nota 3).
2.Añadir 15 ml de Ficoll-Paque a cuatro tubos cónicos de 50 ml.
3. Cubra con cuidado 35 ml de muestra de capa leucocitaria diluida sobre la

Capa de Ficoll-Paque en cada tubo.
4. Con cuidado, transfiera los tubos a una centrífuga y centrifugue las celdas a 400 × g
durante 20 min a temperatura ambiente, sin frenos.
5. Deseche los 20–25 ml superiores de plasma mediante aspiración.
6. Recoja la capa de PBMC en la interfaz de Ficoll-Paque y el plasma y transfiérala a un tubo

cónico de 50 ml nuevo. No deseche los tubos que contienen glóbulos rojos ( ver Nota 4).
7. Agregue PBS hasta la marca de 50 ml y haga girar el tubo a 400 × g durante 10 min.
8. Deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado dos más

veces.
9. Vuelva a suspender el sedimento de células de PBMC en 50 ml de medio completo RPMI

y cuente el número de células y la viabilidad en un hemocitómetro usando azul de tripano.
10. Recuperar alrededor de 5 × 10 6 PBMC para el análisis de fenotipo. Utilice las PBMC
restantes para recuperar las células NK mediante el método RosetteSep™.
11. Para aislar las células NK mediante el método RosetteSep™, combine las PBMC con los
RBC en una proporción de 1:100 (100 veces el exceso de RBC) en un recipiente de 50 ml.
tubo cónico. Girar el tubo a 400 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
12. Vuelva a suspender la mezcla de células PBMC:RBC en tampón de lavado PBS a

una densidad celular de 50 × 10 6 PBMC por 1 ml.
13. Por cada 1 × 10 6 PBMC en la mezcla, agregue 1 ÿl de Cóctel de enriquecimiento de

células NK humanas RosetteSep™.
14. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incube a temperatura ambiente.
peratura durante 20 min.
15. Mezcle el contenido para resuspender uniformemente las células cada 5 min.
16. Después de la incubación, agregue un volumen igual de tampón de lavado PBS y mezcle.
17. Coloque las células en capas sobre 15 ml de Ficoll-Paque en un tubo cónico de 50 ml y

centrifugue a 400 × g durante 20 min sin frenos.
18. Aspire los 20–25 ml superiores del sobrenadante y transfiera con cuidado la capa de
células NK desde la interfase Ficoll-Paque a un tubo cónico de 15 ml.
19. Para lavar, agregue 10 ml de tampón de lavado PBS a las células NK, mezcle
bien, y girar a 400 × g durante 5 min.
20. Aspirar el sobrenadante y repetir el paso de lavado dos más

veces.
21. Opcional: si los glóbulos rojos contaminan la preparación de células NK, realice una lisis
de glóbulos rojos. Lisis de RBC: Resuspender las células en 10 ml de tampón de lisis de
RBC e incubar en hielo durante 10 min, lavar tres veces con PBS como antes.
22. Vuelva a suspender el sedimento de células NK en 10 ml de medio de células NK y evalúe

los recuentos de células y la viabilidad por exclusión con azul de tripán.
23. Reserve 1 × 10 6 células NK para evaluar la pureza mediante citometría de flujo ( consulte
Nota 5).
24. Siembre las células NK restantes en un matraz T75 y agregue más medio de células NK
para ajustar la densidad celular a 0,5 × 10 6 células/ml.
25. Incubar las células NK en CO al 5 % incubadora a 37 °C durante la
2
noche, antes de la electroporación con siRNA .
3.2 Electroporación Este protocolo describe la eliminación de la expresión de ARNm de STAT3 mediante la
de células NK con siRNA nucleofectación de STAT3 ON-TARGET más ARNip de grupo SMART (GE Dharmacon) en
células NK humanas primarias ( consulte la Nota 2). Las células se nucleofectaron utilizando
el dispositivo Amaxa Nucleofector™ 2b, que maneja una muestra por ejecución. Los
consumibles específi cos para el dispositivo, cubetas y pipetas de plástico, están incluidos en
el Amaxa ®
Kit Nucleofector® de Células NK Humanas .
1. Calentar medio sin suero y medio 2× hasta 37 °C ( ver

Nota 6).
2. Agregue 1,9 ml de medio sin suero por pocillo (por condición de electroporación) en una
placa de 6 pocillos y colóquelo en la incubadora humidificada a 37 °C/5 % CO. Este
medio precalentado se2 utilizará máslatarde
( consulte Nota para
7). mantener las células NK nucleofectadas
3. Cuente las células NK viables utilizando el método de exclusión con azul de tripano y
recupere 4 millones de células NK viables por condición de electroporación en un
tubo cónico y centrifugue a 100 × g durante 10 min ( véanse las Notas 8 y 9).
4. Deseche el sobrenadante por aspiración, vuelva a suspender el sedimento celular en

medio sin suero precalentado y centrifugue las células a 100 × g durante 10 min
5. Mientras se centrifugan las células, lleve la solución NK Cell Nucleofector ® Solution y

el suplemento provisto con el NK Cell Nucleofector ® Kit a temperatura ambiente.
Agregue el suplemento a la Solución Nucleofector® . Retire también la alícuota de
siRNA de -20 ° C y colóquela en hielo para descongelar.
6. Después de la centrifugación, deseche completamente el sobrenadante sin perturbar

el sedimento NK. Resuspender el precipitado en 99 ÿl de solución Nucleofector® de
trabajo ( ver Nota 11). Si no se pudo preparar una reserva de trabajo 100X del siRNA,
entonces resuspenda el sedimento de células NK en el volumen apropiado de
Nucleofector® .
Solución para alcanzar un volumen fi nal de 100 ÿl (por condición de electroporación)
después de la adición de siRNA en el siguiente paso ( ver Nota 12).
7. Combine las células NK resuspendidas en el Nucleofector ® de trabajo

Solución con siRNA (1 l de stock 100X), mezcle suavemente (evite las burbujas) y
transfiera a la cubeta de electroporación. Transfiera el volumen de reacción
suavemente a lo largo del costado de la cubeta para evitar burbujas y tape la cubeta.
8. Coloque la cubeta en el dispositivo Nucleofector, encienda el programa X-01 y pulse

las células.
9. Transfiera con cuidado las células NK de la cubeta al medio sin suero precalentado
( consulte la Nota 13) en la placa de 6 pocillos (del paso 2) utilizando el aspirador de
plástico incluido en el kit. Enjuague la cubeta a fondo pero suavemente con los
medios del mismo pocillo para recuperar las células restantes y transferirlas de nuevo
al pocillo.
10. Incubar las células en ambiente húmedo a 37 °C/5 % CO incubadora para

2
2 horas
11.Después de la incubación, agregue 2 ml de medio 2X.
12. Añada también 200 UI de IL2 a cada pocillo (para una concentración final de 50 UI de
IL2/ml). Incube en una incubadora humidifi cada a 37 °C/5 % de CO. 2
13. Después de 48 h, evalúe el silenciamiento génico mediante PCR de transcripción

inversa (RT-PCR) ( consulte la Nota 14).
3.3 Evaluación Evaluamos la expresión de ARNm en células NK primarias electroporadas con control y
de silenciamiento de genes ARNsi STAT3 mediante RT-PCR. El ARN se aisló usando el mini kit RNeasy plus (Qiagen)
según el protocolo del fabricante ( ver Nota 15).
1. Mida la concentración de ARN con NanoDrop.
2. Prepare soluciones madre con la misma concentración de ARN para todos los
tratamientos experimentales y utilícelas inmediatamente para configurar la RT-PCR
o alícuotas y guárdelas a -80 °C para su uso posterior.
3. Configure RT-PCR para todos los tratamientos experimentales con cebadores

específi cos de genes (Tabla 1) con la misma cantidad de ARN (50–100 ng)
utilizando el kit OneStep RT-PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante
( consulte la Nota 16) .
4. Prepare un gel de agarosa al 1,2 % que contenga 1x GelRed.
5. De 50 ÿl de reacción de RT-PCR, use alrededor de 10 a 15 ÿl (la misma cantidad

para todos los tratamientos experimentales) para la electroforesis en gel de agarosa.
6. Obtenga una imagen del gel de agarosa utilizando un sistema de documentación de

gel digital (Fig. 1 ) ( consulte la Nota 17).
tabla 1
Lista de cebadores de RT-PCR
Gene Secuencia de cebadores (5ÿ - 3ÿ)
STAT3 Delantero GGAGCTGGCTGACTGGAAGAG
Reverso CTCGATGCTCAGTCCTCGCTTG
STAT1 Delantero TCAGGCTCAGTCGGGGAATA
Reverso ATCACTTTTGTGTGCGTGCC
GAPDH Delantero GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTG
Reverso CTTCTGGGTGGCAGTGATGGC
STAT3
STAT1
GAPDH
0,1 0,25 0,5 1 0,1 0,25 0,5 1 mM
ARNip con ARNip STAT3
Fig. 1 Imagen de gel de agarosa representativa del silenciamiento de STAT3 mediado por ARNsi.
STAT3 ON-TARGET más SMART pool siARN electroporado en células NK humanas primarias
utilizando Amaxa Nucleofector™ mediada por una disminución incremental en la expresión de ARNm
de STAT3 con una concentración creciente de siARN. No hay efecto fuera del objetivo como se
demostró usando STAT1 como control; GAPDH sirve como el gen de limpieza
4 notas
1. Abra las botellas de agua sin ARNasa y tampón siRNA 5x y el tubo siRNA en
una campana de cultivo celular. La preparación y la adición de tampón al tubo,
el pipeteo del tampón y la división en alícuotas de siRNA deben llevarse a cabo
en la campana de cultivo celular.
Según las necesidades experimentales, prepare alícuotas en el menor volumen
posible, preferiblemente en tubos eppendorf de 0,5 ml, que se descongelan
rápidamente en hielo. Es probable que se consuman alícuotas pequeñas de
tamaño adecuado una vez descongeladas, evitando así ciclos repetidos de
congelación y descongelación. El uso de alícuotas recién descongeladas
también garantiza la consistencia en la calidad del siRNA en los experimentos
realizados en diferentes momentos.
2. Eliminamos la expresión de STAT3 en células NK humanas primarias para

investigar el papel de STAT3 en las funciones de las células NK humanas.
STAT3, un factor de transcripción, modula la expresión de proteínas a través
de la regulación transcripcional de sus genes diana. Por lo tanto, STAT3 media
sus funciones indirectamente a través de otras proteínas. Para estudiar el papel
de STAT3 en las funciones celulares, se debe silenciar su expresión antes de
estimular su actividad transcripcional. Por esta razón, decidimos utilizar células
NK primarias, en las que es más probable que STAT3 esté en estado latente,
en lugar de células NK activadas o expandidas con STAT3 ya activado. Las
propiedades funcionales de la proteína de interés dictan la elección entre células
NK primarias y expandidas o activadas.
3. Para muestras de capa leucocitaria de hasta 70 ml de volumen, agregue PBS

para diluir la muestra a 140 ml. Si el volumen de la capa leucocitaria es superior
a 70 ml, agregue un volumen igual de PBS para diluir la muestra.
4. En este punto, prepare los glóbulos rojos para la purificación de células NK

mediante el método RosetteSep™, retire el Ficoll-Paque de los tubos y combine
los glóbulos rojos en dos tubos de 50 ml y luego agregue PBS hasta la marca
de 50 ml en cada tubo. Haga girar los glóbulos rojos a 400 × g durante 10 min
junto con las PBMC (Subtítulo 3.1 paso 7). Deseche el sobrenadante. Tenga
en cuenta que el gránulo de glóbulos rojos es fluido; por lo tanto, para minimizar
la pérdida de glóbulos rojos, aspire el sobrenadante con cuidado a medida que
se acerca al sedimento de glóbulos rojos. Repita los pasos de lavado dos veces más.
Resuspender los glóbulos rojos de cada tubo en 50 ml de PBS que contenga
FBS al 2 %. Alícuota de 10 l de glóbulos rojos y diluir a 10 ml (dilución de
10.000 veces) y contar los glóbulos rojos usando un hemocitómetro.
5. Teñir las PBMC (del Subtítulo 3.1, paso 10) y las células NK con un cóctel de
anticuerpos que comprende CD3 (PeCy7), CD56 (FITC), CD16 (PE) y analizar
mediante citometría de flujo para determinar la pureza de las células NK
después de la separación con RosetteSep™. .
6. Estos medios pueden fabricarse a granel, dividirse en alícuotas en un volumen

apropiado y almacenarse a 4 °C.
7. El medio se usa para resuspender las células NK después de la electroporación.

El volumen del medio se ajusta a 1,9 ml de modo que después de la adición
de 100 ÿl de volumen de reacción, el volumen total sea de 2 ml. Esto se estima
para 4 × 10 6 células por reacción y para lograr una densidad celular de 2 × 10
6/ml durante el período de incubación de 2 h después de la electroporación
( consulte los pasos 10 y 11 en el Subtítulo 3). El volumen se puede ajustar en
función del número de celdas utilizadas por electroporación. Además, para
volúmenes más bajos, se pueden utilizar placas de 12 o 24 pocillos.
8. Por lo general, para la sedimentación, las células NK se centrifugan a 400 × g

durante 5 min. Sin embargo, para minimizar el estrés en las células antes de
, centrifugamos a 100 × g .
someterse a la Nucleofección
9. Hemos electroporado de 1 a 4 millones de células NK por electropora

ción en nuestro laboratorio.
10. Las células se lavaron con medio sin suero para eliminar el suero y los
antibióticos residuales. Las RNasas presentes en el suero degradan el siRNA
[ 24] y la electroporación hace que las células sean sensibles a los antibióticos,
lo que puede afectar la viabilidad celular.
11. Trate de minimizar el tiempo que las células NK permanecen suspendidas en la

solución de trabajo Nucleofector ® (no exceda los 20 min) ya que un
almacenamiento prolongado en esta solución reduce la viabilidad celular y la
eficiencia de la electroporación.
12. Para lograr una concentración de siRNA de 100 nM en 100 ÿl de reacción de

Nucleofection® , se deben agregar
suspensión 10 ÿl Por
celular. de solución
lo tanto, madre de siRNA
las células deben1 ÿM a la
resuspenderse en 90 ÿl de la solución de trabajo Nucleofector ® para que,
después de la adición de siRNA, el volumen de reacción final sea de 100 ÿl.
13. Inmediatamente después de la electroporación, las células se incuban en suero

y medios libres de antibióticos para evitar la degradación del siRNA por las
RNasas presentes en el suero y para evitar cualquier efecto adverso de los
antibióticos en las células recién electroporadas, que son sensibles a los
antibióticos.
14. El silenciamiento de la expresión del ARNm podría evaluarse tan pronto como
24 h o incluso antes (12-16 h).
15. El ARN aislado de 0,5 × 10 6 células NK primarias proporciona suficiente
ARN para configurar múltiples reacciones de RT-PCR.
16. Junto con las reacciones con cebadores específicos de STAT3, también se
prepararon reacciones con cebadores específicos para GAPDH (gen de
limpieza) y STAT1, otro miembro de la familia de proteínas STAT a la que
pertenece STAT3, para evaluar los efectos fuera del objetivo.
17. Estimar la extensión de la caída usando el software ImageJ normalizando la

expresión en el grupo de control al 100 %.
Alternativamente, realice una PCR en tiempo real para obtener una evaluación
cuantitativa de la caída del gen. Para cuantificar el impacto
de la eliminación mediada por ARNsi en la expresión de proteínas, evalúe

el nivel de proteína mediante transferencia Western o citometría de flujo
según la localización de la proteína (proteína citosólica o de la superficie
celular, respectivamente).
Referencias
1. Rosenberg EB, Herberman RB, Levine PH et al (1972) células asesinas naturales a células cancerosas a través
Reacciones de citotoxicidad de linfocitos a antígenos de la activación del receptor de muerte 3. Immunology
asociados con leucemia en gemelos idénticos. Int J Cancer 135:63–72 14. Rajasekaran K, Kumar P, Schuldt KM et al (2013)
9:648–658 2. Kiessling R, Klein E, Pross H et al (1975) Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10- MAP3K7
signalosome exclu regula significativamente la producción
Células asesinas “naturales” en el ratón. de citocinas inflamatorias en las células NK. Nat Immunol
II. Células citotóxicas con especificidad para células de 14:1127–1136 15. Mukherjee S, Kim J, Mooren OL et al
leucemia de Moloney de ratón. Características de la célula (2015)
asesina. Eur J Immunol 5:117–121 3. Orr MT, Lanier LL
(2010) Educación y tolerancia de las células asesinas naturales. Papel del homólogo de cortactina HS1 en la migración
Cell 142:847–856 4. Vivier E, Tomasello E, Baratin M et al transendotelial de células asesinas naturales. PLoS Uno
(2008) 10, e0118153
Funciones de las células asesinas naturales. Nat Immunol 16. Liu D, Peterson ME, Long EO (2012) La proteína adaptadora
9: 503–510 Crk controla la activación e inhibición de las células
5. Purdy AK, Campbell KS (2009) La expresión de SHP-2 asesinas naturales. Inmunidad 36:600–611
regula negativamente la función de las células NK.
J Immunol 183:7234–7243 6. 17. Carlin LM, Evans R, Milewicz H y otros (2011)
Mahmood S, Kanwar N, Tran J et al (2012) Una pantalla de siRNA dirigida identifica los reguladores
La fosfatasa SHP-1 es un regulador fundamental para de la actividad de Cdc42 en la sinapsis inmunológica de
prevenir la autodestrucción de las células asesinas las células asesinas naturales. Sci Signal 4:81 18. Liu X,
naturales. PLoS One 7, e44244 Cui X, Shan N et al (2013)
7. Meinke S, Watzl C (2013) La citotoxicidad de las células NK La regulación a la baja del gen H-2Kd por siRNA afecta la
mediada por 2B4 y NTB-A depende de que SAP actúe citotoxicidad de las células LAK murinas.
Célula cancerosa Int 13:112
aguas abajo de la fosforilación del receptor. Front Immunol
4:3 8. Lee SH, Yun S, Lee J et al (2009) RasGRP1 es 19. Carthew RW, Sontheimer EJ (2009) Orígenes y mecanismos
de miRNA y siRNA. Celda 136: 642–655
necesario para la función de las células NK humanas.
J Immunol 183:7931–7938 9. Kucuk 20. Bartlett DW, Davis ME (2006) Información sobre la cinética
C, Jiang B, Hu X et al (2015) Mutaciones activadoras de del silenciamiento génico mediado por ARNip a partir de
imágenes bioluminiscentes de células vivas y animales
STAT5B y STAT3 en linfomas derivados de células
gammadelta-T o NK. vivos. Nucleic Acids Res 34:322–333 21. Mocellin S,
Nat Comun 6:6025 Provenzano M (2004) Interferencia de ARN: aprendizaje de
10. Kucuk C, Iqbal J, Hu X et al (2011) PRDM1 es un gen eliminación de genes a partir de la fisiología celular. J
supresor de tumores en las neoplasias malignas de células Transl Med 2:39 22. Jackson AL, Burchard J, Leake D et al
asesinas naturales. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 108:20119– (2006)
20124 La modificación química específica de la posición de los NA
11. Lai HC, Chang CJ, Yang CH y otros (2012) siR reduce el silenciamiento de la transcripción "fuera del objetivo".
RNA 12:1197–1205 23.
Activación de la citotoxicidad de las células NK por el
compuesto natural 2,3-butanodiol. J Leukoc Biol 92: 807– Hannus M, Beitzinger M, Engelmann JC et al (2014) siPools: los
814 grupos de siRNA altamente complejos pero definidos con
12. Khurana D, Arneson LN, Schoon RA et al (2007) Regulación precisión eliminan los efectos fuera del objetivo. Nucleic
Acids Res 42:8049–8061 24. Hickerson RP, Vlassov AV,
diferencial de la citotoxicidad mediada por células NK
humanas por la tirosina quinasa Itk. J Immunol 178:3575– Wang Q et al (2008) Estudio de estabilidad de siRNA no
3582 modificado y relevancia para el uso clínico. Oligonucleótidos
13. Park MH, Song MJ, Cho MC y otros (2012) 18:345–354
La interleucina-32 aumenta el efecto citotóxico de
capitulo 23
Modelo de xenoinjerto de ratón para la administración

intraperitoneal de inmunoterapia con células NK para el cáncer de ovario
, laura bendzick, y Dan S. Kaufman

David L Hermanson
Resumen
Las células asesinas naturales (NK) son una población celular atractiva para la inmunoterapia. La transferencia
adoptiva de células NK se ha probado en múltiples ensayos clínicos, incluida la leucemia mieloide aguda (LMA) y el
cáncer de ovario, aunque existen limitaciones, especialmente para el tratamiento de tumores sólidos. Para superar
estas limitaciones, se necesitan modelos de xenoinjerto de ratón para la evaluación de diversas poblaciones de células
NK, así como las rutas de administración de células NK. Aquí, describimos los métodos utilizados para el
establecimiento de un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer de ovario intraperitoneal (ip) con administración ip de
células NK. Este modelo se ha empleado con éxito con múltiples líneas celulares de ovario y podría aplicarse a otros
modelos de tumores donde la ubicación principal del tumor está en la cavidad peritoneal. También es compatible con
múltiples vías de administración de células NK. Las imágenes bioluminiscentes para monitorear la formación y
respuesta de tumores permiten una fácil visualización de la inhibición de tumores de células NK. Este modelo de
xenoinjerto es superior a otros modelos porque el tumor se implanta en el mismo espacio fisiológico donde se
encuentra el cáncer de ovario, lo que permite imitar mejor la enfermedad real.
Palabras clave Células asesinas naturales, Xenoinjerto de ratón , Inmunoterapia , imágenes bioluminiscentes, ovárico
cáncer
1. Introducción
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos conocidos por
desempeñar un papel importante en el control de infecciones virales y
diversas neoplasias malignas [ 1]. La transferencia adoptiva de células NK
haploidénticas aisladas de sangre periférica (PB-NK) puede mediar efectos
antitumorales dramáticos contra las neoplasias malignas hematológicas,
especialmente en el caso de la leucemia mieloide aguda (LMA) [ 2]. Además,
la administración intravenosa (iv) de células PB-NK también se ha evaluado
para el tratamiento del cáncer de ovario y otros tumores sólidos [ 3 ].
Además, la línea de células NK, NK-92, se ha utilizado en ensayos clínicos
para el carcinoma de células renales avanzado y la LMA [ 4, 5]. Estos
estudios respaldan el uso de células NK transferidas de forma adoptiva para
la inmunoterapia contra el cáncer.
277
278 David L. Hermanson et al.
En la actualidad, las células NK utilizadas para la inmunoterapia se aíslan

de un producto de aféresis seguido de depleción de CD3 y CD19 para la
eliminación de células T y células B, respectivamente [ 2]. Este procedimiento
da como resultado una población celular heterogénea que típicamente consta
de solo aproximadamente un 30 % de células NK [ 6]. Recientemente, se han
definido nuevas técnicas para la expansión y activación ex vivo de células PB-
NK [ 7, 8]. Además, también se han desarrollado métodos para la generación
de células NK a partir de células madre embrionarias humanas (hESC) o
células madre pluripotentes inducidas (iPSC) [ 9 - 12]. Estos métodos permiten
la producción de una población de células NK puras >97 % que tiene el
potencial de convertirse en un producto de inmunoterapia estandarizado y listo
para usar basado en células NK.
Con el fin de comparar las diversas fuentes de células NK y vías de
administración, hemos desarrollado un modelo de xenoinjerto de ratón
utilizando imágenes bioluminiscentes para monitorear el crecimiento tumoral (Fig. 1) [ 13 ].
Dado que el cáncer de ovario está restringido a la cavidad peritoneal, hemos
utilizado este modelo para estudiar la entrega intraperitoneal (ip) de células
NK en lugar de la dosificación iv [ 13]. Este capítulo describirá los métodos
utilizados para el establecimiento de este modelo de ratón para el estudio del
cáncer de ovario, así como los métodos utilizados para monitorear la
persistencia de las células NK.
Fig. 1 Diagrama esquemático del modelo de ratón con xenoinjerto intraperitoneal. ( a ) Descripción general del esquema
experimental que incluye inyección de células tumorales positivas para luciferasa (luc + ), radiación de ratones portadores de
tumores con 225 cGy, inyección de células NK y administración de citoquinas. ( b ) Cronología del cronograma de inyecciones
para células y citocinas, así como el cronograma de imágenes
Modelo de xenoinjerto de ratón para administración IP de células NK 279
2 materiales
2.1 Líneas celulares 1. MA148/GFP: células Luc. Las células MA-148 fueron proporcionadas
amablemente por Sundaram Ramakrishnan (Universidad de Minnesota). La
inserción de la construcción GFP:Luc se ha informado anteriormente [ 13].
Estas células se mantienen en RPMI-1640 más L - glutamina, 10 % de FBS
y 1 % de penicilina/estreptomicina.
2. Células PB-NK. Las células se mantuvieron en RPMI-1640, 10 % de FBS, 2
. de
mM de L-glutamina, 1 % de P/S y 50 U/mL de IL-2. Células presentadoras
antígenos especiales (aAPC) semanalmente, como se informó anteriormente
[8
, 9 ].
2.2 Ratones Los ratones 1.NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1wjl/ SzJ , comúnmente conocidos
como ratones NOD scid gamma-c o NSG, se obtuvieron de The Jackson
Laboratory. Estos ratones carecen de células T y células B maduras, no
tienen células NK funcionales y tienen una función defectuosa de las células
inmunitarias mieloides [ 14 ].
2.3 Inyección de 1. Tripsina-EDTA al 0,05 % para la recolección de células tumorales (Invitrogen).

tumor en ratones
2. Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) como portador de
células tumorales (HyClone).
Jeringa de Insulina 3.1 cc U-100 28G1/2.
2.4 Imágenes de animales 1. D-Luciferina (Biotecnología del Oro). Resuspender 1 g de D - Luciferina en 40

ml de DPBS y almacenar a -80 °C en alícuotas de 0,5 a 1 ml. A esta
concentración, se inyectan 100 ÿL en cada ratón.
2.Espectro IVIS (Perkin-Elmer).
3.Living Image 4.0 para análisis de imágenes (Perkin-Elmer).
4.Irradiador biológico X-Rad 320 (Rayos X de precisión).
2.5 Citoquinas 1. Interleucina-2 (Proleukin (aldesleukin), Prometheus). Suspender 22 millones

de unidades de IL-2 en 53 mL de DPBS. Conservar a -20 °C.
2.6 Análisis de la 1.Heparina (1000 U/mL).

supervivencia de las células NK
2. Tampón de lisis de cloruro de amonio (ACK).
3. Suero bloqueador: DPBS suplementado con suero humano al 5 %
y 5 % de FBS y filtrado estéril.
4. Tampón FACS: azida sódica al 0,1 % y FBS al 2 % en DPBS.
3 métodos
3.1 Establecimiento 1. Pase las células tumorales para que no tengan más del 70-80 % de confluencia
de IP Tumor el día de uso. Por lo general, intentamos pasar las células 2 días antes de la
e Imágenes inyección.
2. Cuatro días antes de la administración de células NK, coseche 2 × 10 5 células

MA148 que expresan luciferasa por ratón ( consulte la Nota 1 ) utilizando tripsina
al 0,05 % durante 5 min a 37 °C.
3. Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min y resuspender en DPBS a una

concentración de 1 × 10 6 células/mL en un tubo tapado.
4. Inyecte ratones hembra NSG de 10 a 12 semanas de edad ( consulte la Nota 2 ) con

2 × 10 5 ( consulte la Nota 1 ) células tumorales que expresan luciferasa (200 ÿL).
Las inyecciones deben administrarse ip con una jeringa de insulina U-100 de 1 cc

28G1/2 ( ver Nota 3 ).
5. Inyección 72 horas después del tumor (1 día antes del tratamiento con células NK).
Imagen de los ratones utilizando el IVIS Spectrum. Inyecte ratones ip con 100 ÿL
de D-Luciferin a una concentración de 25 mg/mL. Anestesie a los ratones usando
isoflurano (configuración del vaporizador al 2,5 % y una velocidad de flujo de 2,0
para anestesiar a los ratones y 0,5 l/min de plataforma O ing y adquiera imágenes
con preajustes delaintervalo
durante medio, exposición
toma de imágenes). deratones
Coloque los 30 s y en
parada F dedel
la imagen 1 espectro
( Figura IVIS
2)
2
( Nota 4 ).
Recopile los datos en Radiance. Adquirir imágenes de 3 a 5 min después de

administrar D -Luciferin.
6. Analice los datos utilizando Imagen viva dibujando una región de interés idéntica
(aproximadamente 3,6 cm de ancho y 4 cm de alto) para cada ratón para medir el
resplandor ( consulte la Nota 5 ).
7. Use el flujo total (fotones/s) para comparar ratones y asigne en grupos de manera
que cada grupo tenga ratones con mediciones de flujo total similares ( vea la Nota
6 ).
8. Inmediatamente después de la obtención de imágenes, los ratones se irradian con

un irradiador biológico X-Rad 320 ajustado a 12,5 mA y 320 KV para administrar
2,25 cGy (225 rads) por animal a una altura de 50 cm ( consulte la Nota 7 ).
9. Las imágenes se continúan cada 7 días para monitorear el crecimiento del tumor
y eficacia del tratamiento con células NK.
3.2 Administración de 1. El día que se vayan a administrar las células NK, cuente y determine la viabilidad
células NK e inyecciones celular ( ver Nota 8 ).
de citoquinas Centrifugar (300 × g durante 5 min) suficientes células NK para una dosis de
20 × 10 6 células/ratón y lavar
resuspender lasuna vez a
células con DPBS.
66,6 × 10 Centrifugar
6 células/mLnuevamente
en DPBS y ycolocar
en un tubo tapado.
2. Inyecte 300 ÿL (20 × 10 6 células) ip en cada ratón usando una jeringa de insulina
U-100 de 1 cc.
28G1/2. Asegúrese de utilizar una pipeta para mezclar las células
inmediatamente antes de cargar cada jeringa ( consulte la Nota 3 ).
3. El día siguiente a la dosificación de células NK, comience la administración de

inyecciones de citocinas ( consulte la Nota 9 ). Damos IL-2 a 5 ÿg/ratón/día (83.000
U/ratón/día) inyectando 200 ÿL de solución madre preparada como en el Subtítulo 2
.
Fig. 2 Imágenes de bioluminiscencia de luciferasa + ratones portadores de tumores. A los ratones se les inyectó ip cantidades
variables de MA148/GFP:Luc + células de cáncer de ovario el día 4. Se tomaron imágenes de los ratones a partir del día 1 y
semanalmente a partir de entonces para controlar la formación y el crecimiento del tumor a fin de determinar el número óptimo de
células para la formación del tumor. . Dos ratones de cada grupo recibieron irradiación (IRR) (225 cGy) el día 1, mientras que dos
ratones no recibieron tratamiento
4. Administre la dosis de citoquinas de la siguiente manera: todos los días

durante 7 días seguidos de tres veces por semana (lunes, miércoles y
viernes) durante 3 semanas adicionales (4 semanas en total).
3.3 Supervisión del 1. Extraiga sangre de ratones a los 7 y 21 días después de administrarles
injerto y la supervivencia células NK ( consulte la Nota 10 ). Recoja ~ 100 ÿL de sangre a través
de las células NK en la sangre de la vena facial sangrando en tubos Eppendorf de 1,5 mL que contengan
50 ÿL de heparina para evitar la coagulación.
2. Lyse glóbulos rojos (RBC) utilizando tampón de lisis ACK. Añadir 800 l de
ACK a la sangre e incubar en hielo durante 5 min.
3. Centrifugar a 300 × g durante 4 min y eliminar el sobrenadante.
4.Repita los pasos 2 y 3 una vez más.
5.Agregue 1 ml de suero bloqueador e incube en hielo durante 20 min.
6. Centrifugar a 300 × g durante 4 min y eliminar el sobrenadante.
7. Lavar una vez con tampón FACS y teñir con huCD45 y huCD56 durante 20 min
en hielo. Si se desea, se pueden usar otros marcadores de células NK tales
como KIR o marcadores de células NK NKp44 o NKp46.
3.4 Lavados 1. También se puede evaluar la persistencia de células NK dentro de la cavidad

intraperitoneales a medida peritoneal ( ver Nota 11 ). Eutanasia al ratón y separe cuidadosamente la piel
Persistencia de células NK de la pared peritoneal.
2. Una vez separada la piel, haga un pequeño orificio para permitir el acceso a la
cavidad peritoneal. Esto se hace mejor sujetando el peritoneo con pinzas
mientras se hace un pequeño corte con unas tijeras.
3. Use una pipeta de vidrio con un bulbo de pipeta y enjuague cuidadosamente la

cavidad con DPBS. Tenga cuidado de no perforar el hígado con la pipeta para
evitar un exceso de glóbulos rojos en el lavado.
4. Repetir los lavados con hasta 10 mL de DPBS intentando enjuagar toda la

cavidad.
5. Mantenga las celdas en hielo hasta que se recolecten todas las muestras y se
luego centrifugar las células (300 × g durante 4 min).
6. Los lavados deben ser claros a menos que haya ascitis en la cavidad. Si hay
glóbulos rojos presentes, realice una lisis de glóbulos rojos como en el Subtítulo
3.3 .
7. Teñir las células con anti-huCD45 y anti-huCD56 para identificar las células NK.
Se pueden usar otros anticuerpos según se desee, como se describe en el
Subtítulo 3.3 .
4 notas
1. Realizamos esto con tres líneas celulares de ovario diferentes, células MA148,
A1847 y A2780 y, en cada caso, 2 × 10 5 células dieron como resultado un
injerto constante en 4 días (Fig. 2). Si se va a utilizar una línea celular diferente,
recomendamos hacer una prueba de respuesta a la dosis inyectando diferentes
números de células y tomando imágenes 3 días y 10 días después para
garantizar que se produzca el injerto.
El número ideal de células es la menor cantidad de células que proporcionen
un injerto confiable. Una carga tumoral demasiado alta al principio puede
conducir a un crecimiento tumoral más rápido de lo que puede ser efectiva la
actividad mediada por células NK.
2. Lo mejor es usar ratones de 10 a 12 semanas de edad, pero hemos tenido éxito

usando ratones de 8 semanas y de 14 semanas.
Además, hemos descubierto que es prudente inyectar 5 ratones adicionales al
comienzo de los estudios, ya que a menudo hay algunos ratones en los que el
tumor no se injerta.
3. Inmediatamente antes de cargar la jeringa e inyectar a los ratones, asegúrese

de pipetear suavemente las células tumorales para asegurarse de que estén
bien mezcladas. Cada jeringa se puede utilizar para inyectar 5 ratones.
No precargue todas las jeringas antes de la inyección, cargue una a la vez e
inyecte en los ratones inmediatamente. Hemos descubierto que una aguja de
calibre más ancho puede provocar tumores en el tracto subcutáneo e interferir
con los resultados.
4. Estos ajustes se recomiendan como punto de partida. Si las imágenes se

saturan, disminuya el tiempo de exposición. Reportamos nuestra
bioluminiscencia en flujo total, que es independiente del tiempo. A medida que
el tumor crece, las imágenes permanecerán saturadas incluso con una
exposición de 1 s, por lo tanto, aumente la parada F en los días posteriores.
Además, si toma imágenes de varios ratones a la vez, coloque tarjetas
divisorias negras entre los ratones para evitar que el resplandor de un ratón
se extienda a los ratones cercanos. Esto no será evidente de inmediato, así
que no asuma que las tarjetas no son necesarias.
5. Asegúrese de dibujar el cuadro lo suficientemente grande la primera vez para

medir toda el área abdominal para que, a medida que los tumores crezcan, se
mida toda el área positiva de luciferasa.
6. Los controles negativos normalmente son alrededor de 3–5 × 10 5 de flujo total.

Los ratones con flujo total medido inferior a 1 × 10 6 normalmente se descartan
y se retiran del experimento. Luego, los ratones restantes se clasifican de
mayor a menor flujo total y a cada grupo se le asignan ratones en orden.
7. Este bajo nivel de irradiación no afectará significativamente al tumor

carga.
8. Si usa un sistema de expansión de APC, intente cronometrar la administración

de células NK para que todas las aAPC hayan tenido tiempo de eliminarse del
cultivo para evitar afectar los recuentos de células.
Por lo general, estimulamos nuestras células NK los viernes y dosificamos a
los ratones el miércoles después de cambiar los medios el martes.
9. La administración de citoquinas promueve el injerto de células NK y la

supervivencia in vivo. Hemos descubierto que la IL-2 es igualmente eficaz que
la IL-15 en nuestro modelo, pero los informes sugieren que la IL-15 puede ser
mejor en otros modelos [ 15 ].
10. Se realizaron extracciones de sangre los días 7 y 14, pero notamos que tiende
a ser bastante difícil para los ratones en combinación con la administración de
IL-2, por lo que pasamos a la extracción de sangre los días 7 y 21.
11. Las células NK se pueden encontrar en la cavidad peritoneal hasta por 28

días.
Referencias
1. Vivier E, Raulet DH, Moretta A y otros (2011) a partir de células madre pluripotentes humanas para la
¿Inmunidad innata o adaptativa? El ejemplo de las terapia del cáncer. Stem Cells Transl Med 2:274–283 10.
células asesinas naturales. Science 331:44–49 2. Miller
Ni Z, Knorr DA, Kaufman DS (2013)
JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A et al (2005) Desarrollo de células hematopoyéticas y asesinas
Transferencia adoptiva exitosa y expansión in vivo de naturales a partir de células madre pluripotentes humanas.
células NK haploidénticas humanas en pacientes con Métodos Mol Biol 1029:33–41 11. Woll
cáncer. Sangre 105: 3051–3057 PS, Martin CH, Miller JS, Kaufman DS (2005) Células madre
embrionarias humanas: las células NK derivadas
3. Geller MA, Cooley S, Judson PL y otros (2011) adquieren receptores funcionales y actividad citolítica. J
Un estudio de fase II de terapia alogénica con células Immunol 175:5095–5103 12. Woll PS, Grzywacz B, Tian
asesinas naturales para tratar pacientes con cáncer de X et al (2009)
ovario y de mama recurrente. Citoterapia 13:98–107 4. Las células madre embrionarias humanas se diferencian
Cheng M, Chen Y, Xiao W, Sun R, Tian Z (2013) en una población homogénea de células asesinas
Inmunoterapia basada en células NK para enfermedades naturales con una potente actividad antitumoral in vivo.
malignas. Célula Mol Immunol 10: 230–252 Sangre 113:6094–6101
13. Geller MA, Knorr DA, Hermanson DA et al (2013) Entrega
5. Tonn T, Schwabe D, Klingemann HG et al (2013) intraperitoneal de células asesinas naturales humanas
Tratamiento de pacientes con cáncer avanzado con la para el tratamiento del cáncer de ovario en un modelo
línea de células asesinas naturales NK-92. de xenoinjerto de ratón. Cytotherapy 15:1297–1306 14.
Citoterapia 15:1563–1570 6. Shultz LD, Lyons BL, Burzenski LM et al (2005) Desarrollo
Koepsell SA, Miller JS, McKenna DH (2013) de células linfoides y mieloides humanas en ratones NOD/
Células asesinas naturales: una revisión de la fabricación LtSz-scid IL2R gamma injertados con células madre
y la utilidad clínica. Transfusion 53:404–410 7. Fujisaki hematopoyéticas humanas movilizadas.
H, Kakuda H, Shimasaki N et al (2009) Expansión de células
asesinas naturales humanas altamente citotóxicas para J Immunol
174:6477–6489 15. Miller JS, Rooney CM, Curtsinger J
la terapia de células cancerosas.
Cáncer Res. 69:4010–4017 et al (2014) La expansión y el alojamiento de células asesinas
8. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012) La naturales humanas transferidas adoptivamente en
ratones inmunodeficientes varía con la preparación del
IL-21 unida a la membrana promueve la proliferación ex
vivo sostenida de células asesinas naturales humanas. producto y la administración de citoquinas in vivo:
PLoS One 7, e30264 9. Knorr DA, Ni Z, Hermanson D et implicaciones para terapia clínica. Biol Trasplante de
Médula Sanguínea 20:1252–1257
al (2013)
Derivación a escala clínica de células asesinas naturales
capitulo 24
Administración de aerosol de interleucina-2 en

combinación con transferencia adoptiva de células
asesinas naturales para el tratamiento de metástasis
pulmonar: metodología y efecto
Simin Kiany y Nancy Gordon
Resumen
Las células asesinas naturales (NK) son un subtipo de linfocitos con un papel importante como mecanismo de defensa del
huésped contra las células tumorales. La terapia de células NK alogénicas se está utilizando como una terapia alternativa
prometedora para muchos tipos de cáncer diferentes. La interleucina-2 (IL-2) es una citocina crítica para la proliferación,
supervivencia y funciones efectoras de las células NK. El apoyo de citoquinas es esencial para activar, expandir y aumentar
la vida útil de las células NK. La administración de aerosol de IL-2 en combinación con la transferencia adoptiva de células
NK ofrece un enfoque razonable para el tratamiento de metástasis pulmonares, ya que evita los efectos secundarios nocivos
de la IL-2 sistémica. Usando un modelo de ratón con sistema operativo humano, demostramos la eficacia de este enfoque.
La terapia combinada de IL-2 en aerosol con células NK resultó en un mejor efecto terapéutico contra las metástasis
pulmonares del OS en comparación con cada terapia sola. Aerosol IL-2 aumentó selectivamente la infiltración, retención y
proliferación de células NK infundidas en el pulmón, y no hubo inflamación local ni toxicidad en los pulmones ni en ningún
otro órgano. Nuestros resultados demuestran que la administración de IL-2 a través de la ruta del aerosol ofrece un enfoque
factible e innovador para mejorar el efecto inmunoterapéutico de las células NK contra las metástasis pulmonares. En el
siguiente capítulo, describimos la metodología y el efecto de este enfoque terapéutico innovador.
Palabras clave Célula asesina natural, interleucina-2 , Osteosarcoma
1. Introducción
Las células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) son un subconjunto de linfocitos que
sirven como mecanismo de defensa inmunitario de primera línea contra las células tumorales. La
respuesta de las células NK se produce sin una sensibilización previa inicial a las células tumorales.
La activación de las células NK por parte de las células tumorales desencadena la liberación de
perforina y granzima que conducen a la lisis de las células tumorales. En muchos tipos de cáncer,
se ha informado que un mayor número de células NK intratumorales se correlaciona con un mejor
pronóstico [ 1 - 3]. Por lo tanto, la terapia de células NK adoptivas es muy atractiva como
tratamiento eficaz para muchos tipos de cáncer [ 4 ].
, 5 ].
285
286 Simin Kiany y Nancy Gordon
En nuestros estudios anteriores, utilizando un modelo de ratón de

osteosarcoma humano (OS), demostramos la eficacia de la terapia combinada,
células NK más interleucina-2 humana en aerosol (IL-2) para el tratamiento de
metástasis pulmonares de OS [ 6, 7]. Es bien sabido que la IL-2 promueve la
proliferación, la supervivencia y mejora las funciones efectoras de las células NK.
Las células NK activadas ex vivo tienen una vida útil corta y muestran una escasa
infiltración tumoral in vivo sin el apoyo de citoquinas [ 8 ] . Este
problema se puede sortear combinando la terapia con células NK con infusiones
de IL-2 exógena. Sin embargo, la administración sistémica de IL-2 induce efectos
secundarios potencialmente mortales, como el síndrome de fuga capilar, hipotensión
y oliguria. Estos efectos secundarios son limitaciones identificadas [ 9, 10]. Como
se demostró previamente después de la quimioterapia en aerosol [ 11], la
administración directa de IL-2 a los pulmones por inhalación ofrece varias ventajas
sobre la administración sistémica. Estos incluyen la administración local
directamente a los pulmones y las vías respiratorias, la administración de una dosis
más baja con menos efectos secundarios potenciales y el uso de un sistema de
administración no invasivo ideal para la administración repetida.
Usando células NK expandidas en células K562 modificadas genéticamente
como se describió anteriormente [ 12, 13], probamos la eficacia del aerosol IL-2
solo, la terapia con células NK sola y la combinación de aerosol IL-2 + células NK
en un modelo de ratón humanOS y demostramos que el aerosol IL-2 aumentó
selectivamente la infiltración, retención y proliferación de células NK infundidas en
el pulmón sin ninguna toxicidad. Además, la IL-2 en aerosol mejoró la eficacia de
la terapia con células NK, quizás debido en parte a la mayor concentración local
de IL-2 en los pulmones [ 11, 14]. También demostramos que la combinación de
IL-2 en aerosol con la terapia con células NK resultó en una mayor reducción de la
carga tumoral en comparación con la terapia con células NK sola, la IL-2 en aerosol
sola o el grupo de PBS en aerosol (Figs. 1 y 2). . La IL-2 en aerosol inhalada ofrece
una forma efectiva y factible de administrar una citoquina específica a los pulmones
y proporciona la base para futuras terapias combinadas, en particular, para aquellos
tumores con predilección metastásica al pulmón.
En este capítulo, proporcionamos una descripción de un modelo de ratón OS

[ 15] y describimos los diferentes métodos y programas para las células NK y la
administración de IL2 en aerosol como metodología para estudios preclínicos de
inmunoterapia adoptiva cuyo objetivo principal son los tumores metastásicos en el
pulmón.
2 materiales
1.Línea celular de osteosarcoma LM7 humano metastásico ( ver Nota 1).
2. Capas leucocitarias de sangre de donantes sanos.
3. K562 irradiado (irradiación gamma a 100 Gy).
4. Medio de cultivo celular completo: Modifi cación de Dulbecco de Eagle's Medium

(DMEM) complementado con no esencial
Terapia combinada de células NK e IL-2 en aerosol para la metástasis pulmonar del osteosarcoma 287
Aerosoles PBS
Aerosoles IL-2
Aerosoles PBS+
célula NK
Aerosoles IL-2+
célula NK
b C
25
150
p=0,01
20 p=0,05
100
15
metastásicos
tumorales
Nódulos
medios
(#)
metastásica
(mm2)
media
Área
total
10
50
5
0 0
Aerosol PBS+ Célula NK Aerosol IL-2+ Célula NK Aerosol PBS+ Célula NK Aerosol IL-2+ Célula NK
Fig. 1 La terapia de combinación con IL-2 en aerosol y células NK reduce significativamente la metástasis pulmonar del
osteosarcoma en ratones. A los ratones desnudos se les inyectaron por vía intravenosa 3 × 10 6 células LM7. Los ratones se
trataron con PBS en aerosol, IL-2 en aerosol, PBS en aerosol más células NK o IL-2 en aerosol más células NK. Los ratones se
sacrificaron después de 5 semanas de tratamiento. ( a ) Imágenes representativas de los pulmones de los diferentes grupos.
Los asteriscos representan "no hay nódulos visibles". ( b ) y ( c ) El número medio de nódulos pulmonares y el área metastásica
total demuestran una mayor eficacia terapéutica de la terapia de combinación de IL-2 + células NK en aerosol (p = 0,01 yp =
0,05 respectivamente). Reproducido parcialmente de Pediatric Blood and Cancer “Guma, SR, Lee, DA, Yu, L., Gordon, N.,
Hughes, D., Stewart, J., Wang, WL y Kleinerman, ES (2014), Natural killer cell terapia e interleucina-2 en aerosol para el
tratamiento de la metástasis pulmonar del osteosarcoma. pediatra Cáncer de sangre, 61: 618–626. doi: 10.1002/pbc.24801”.
(Copyright© 1999-2015 John Wiley and Sons, Inc. Todos los derechos reservados)
aminoácidos, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mmol/L y suero

fetal bovino (FBS) al 10 %.
5. Medio de células NK: medio RPMI 1640 (Cellgro/Mediatech)
suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Intergen), glutamina
2 mmol/l y piruvato de sodio 1 mmol/l. Solución salina tamponada
con fosfato (PBS) 6,1x.
7. IL-2 humana recombinante ( ver Nota 2).
8.Ficoll-Paque (GE Healthcare Ciencias de la vida).
Fig. 2 Aerosol IL-2 aumentó el número de células NK en el pulmón. Se tiñeron secciones

congeladas de pulmones para demostrar la infiltración de células NK en los pulmones. Se
utilizaron NKG2D antihumano (rojo) y Hoechst 33258 (azul) para identificar las células NK y
los núcleos celulares, respectivamente. La fluorescencia positiva media en cinco campos
aleatorios por sección se calculó mediante el software SimplePCI y se consideró significativa una P < 0,05.
Reproducido de Pediatric Blood and Cancer “Guma, SR, Lee, DA, Yu, L., Gordon, N., Hughes,
D., Stewart, J., Wang, WL y Kleinerman, ES (2014), Terapia de células asesinas naturales y
aerosol de interleucina-2 para el tratamiento de la metástasis pulmonar del coma osteosar.
pediatra Cáncer de sangre, 61: 618–626. doi: 10.1002/ pbc.24801”. (Copyright© 1999-2015
John Wiley and Sons, Inc. Todos los derechos reservados)
9. Cóctel de enriquecimiento de células RosetteSep HumanNK (Stem Cell

Technologies).
10. OCT: Compuesto de temperatura de corte óptimo (VWR Life
Ciencia, Seradigma).
11. Tinte CellTracker™ CM-Dil (Molecular Probes): prepare una solución madre
de CM-Dil en DMSO a una concentración de 1 mg/ml.
Acetato de formalina tamponada al 12,10 % (Fisher Scientifi c).

13. Suero de caballo (Sigma).
14. Suero de cabra (Sigma).
15.NKG2D antihumano de ratón (eBioscience).
16. Anti-ratón de cabra Alexa Fluor 546 (Molecular Probes).
17. Hoechst 33342 (sondas moleculares).
18. Medio de montaje acuoso Fluoromount™ (Sigma).
19. Kit ELISA IL-2 (eBioscience).
20. Animal: Se usaron ratones nu/nu de 4 semanas de edad (adquiridos del NCI)
y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en una sala de flujo
de aire laminar.
21.Nebulizador AeroTechII (CIS-EE. UU.).

22. Microbatidora Bird 3800 (Palm Springs).
23.Fluido, Absorbente, Fyrite CO2 ( Bacharach, Inc.).
3 métodos
3.1 Células NK Células NK humanas se aislaron de la capa leucocitaria de donantes sanos y luego
Activación se expandieron in vitro durante 3 a 4 semanas usando IL-2 humana recombinante y
y Expansión K562 modificado genéticamente como se describió anteriormente, [ 12,
metodología
13 ]. La breve
es
la siguiente: ,
1. Agregue 4 ÿL de RosetteSep HumanNK Cell Enrichment Cocktail a cada 15 mL

de capa leucocitaria, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 20
min.
2. Diluir la capa leucocitaria con PBS+ FBS al 2 % en una proporción de 1:1 y cubrir
con 15 ml de Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 × g durante 20 min a temperatura
ambiente sin freno.
3. Retire las células NK de la interfaz y lávelas con PBS+

2 % FBS dos veces.
4. Sembrar células NK aisladas con K562 irradiado en una proporción de 1:2 en

RPMI completo y agregar 50 UI/mL de IL-2 humana recombinante ( consulte la
Nota 3). Sembrar 15 × 10 6 células NK con 30 × 10 6 K562 irradiado en 40 ml
de RPMI.
5. En los días tres y cinco, reemplace la mitad de los medios de cultivo con RPMI
completo nuevo y agregue 50 UI/ml de IL-2 humana recombinante a todo el
medio. Mantenga el número de células igual a 1,5 × 10 6 células NK/mL de
medio.
6. El día siete, vuelva a estimular las células NK con K562 irradiado en una
proporción de 1:1 y vuelva a suspender en RPMI completo fresco más 50 UI/mL
de IL-2 humana recombinante a 1,3 × 10 6 células NK/mL.
7. Tres o cuatro semanas después de la expansión, congele las células NK en un

medio de congelación (FBS+ 10 % de dimetilsulfóxido, DMSO) a una
concentración de 5 × 10 7 células/vial
posterior ( yver
manténgalas
Nota 4). a ÿ80 °C para su uso
3.2 Desarrollo de 1. Inyecte 3 × 10 6 células LM7 suspendidas en 0,2 ml de solución de PBS a ratones
osteosarcoma nu/nu de 4 semanas de edad por vía intravenosa (iv) ( consulte la Nota 5).
modelo tumoral 2. Confirme la presencia de micrometástasis aproximadamente a las 5–6 semanas
mediante la evaluación microscópica de portaobjetos de pulmones teñidos con
hematoxilina-eosina (H&E) antes de comenzar el tratamiento.
3. Considere 8–10 ratones en cada grupo de tratamiento de la siguiente manera: (1)

Aerosol PBS, (2) Aerosol IL-2, (3) Aerosol PBS más células NK expandidas ex
vivo y (4) Aerosol IL-2 más células NK expandidas ex vivo ( ver Nota 6).
3.3 Célula NK y 1. Inyecte 5 × 10 7 células NK diluidas en 0,2 ml de PBS a cada ratón por vía
Aerosol IL2 intravenosa dos veces por semana ( consulte la Fig. 3) durante 5 semanas,
Tratamiento comenzando 1 día después del primer tratamiento con aerosol IL-2 o PBS ( consulte la Nota 7) .
2. Realice el tratamiento con aerosol en días alternos durante 5 semanas de la

siguiente manera: agregue 10 ml de PBS con o sin recombinante humano
Día de tratamiento de células NK – martes y jueves
Mar Jue
continuar por 4 semanas más

5-6
semanas Lun Casarse Vie
Día de tratamiento con aerosol IL-2: lunes, miércoles y viernes
Fig. 3 Combinación de aerosol IL-2 + esquema de tratamiento de células NK
IL-2 (2000 U) a un nebulizador AeroTechII y exponer a los ratones a un

tratamiento con aerosol en una jaula de plástico sellada durante una hora cada
vez ( ver Nota 8). El nebulizador AeroTech II debe aerosolizar IL-2 a una
velocidad de flujo de 10 L de aire por minuto. Las partículas de aerosol deben
crearse mezclando aire y CO 2 (5 %) en un aparato mezclador. Calibre
sistema con el
una firita
fluida para determinar con precisión la cantidad exacta de CO 2 en la mezcla.
3. Sacrificar los ratones después de 5 semanas de tratamiento. Expandir los

pulmones con OCT diluido con PBS en una proporción de 1:1 y luego resecarlos.
4. Cuantificar y medir el número de nódulos tumorales. Prepare muestras congeladas

frescas de los pulmones resecados y manténgalas a -80 °C para su uso posterior.
3.4 Detección de células A continuación, describimos la metodología para detectar la presencia de células NK
NK en el pulmón tras el en los pulmones después de la administración de aerosol IL-2. Sin embargo, dado
tratamiento con IL-2 en que cada tumor difiere en su comportamiento, se recomienda probar esta metodología
aerosol en animales sin tumores para garantizar la confianza de los investigadores en la
técnica y tener en cuenta cualquier discrepancia entre los animales sin tumor y los
animales con metástasis pulmonar. .
3.4.1 Detección de células 1. El día 0: exponga los ratones nu/nu al aerosol IL-2 (2000 U) o PBS utilizando el
NK en los pulmones de nebulizador AeroTechII, como se describe anteriormente, 24 h antes de la
animales sin tumores inyección de células NK.
pulmonares tras el tratamiento
2. El día 1: prepare las células NK marcadas con CM-Dil de la siguiente
con IL-2 en aerosol
manera: 3. Diluya la solución madre de colorante CM-Dil en PBS a una
concentración de 1 ÿM.
4. Vuelva a suspender las células NK en la solución de trabajo a 1 × 10 7 células/

mL e incube las células durante 5 min a 37 °C y luego durante 15 min a 4 °C
5. Lave las células agregando 8–10 ml de PBS y centrifugue a 400 × g durante 5

min.
6.Repita el paso de lavado una vez más.

7. Retire el PBS y vuelva a suspender el sedimento de células NK marcado en el

volumen adecuado de PBS para obtener una concentración final de 5 × 10 7 células/
0,2 ml de PBS por ratón.
8. Inyecte 5 × 10 7 células NK marcadas con CM-Dil iv por ratón.
9. Exponga los ratones a IL-2 en aerosol el día de la inyección de células NK y en días

alternos durante 1 semana.
10. Uno, tres y siete días después de la inyección de células NK, sacrifique los ratones y
extraiga los pulmones, los riñones, el corazón, el hígado y el bazo ( consulte la Nota
10).
11. Preparar secciones congeladas de 5 ÿm de los pulmones, el bazo, el hígado, los

intestinos, los riñones y el corazón, fijar con acetona durante 10 min.
12. Enjuague el portaobjetos con 1× PBS 3 min × 3.
13. Realice la tinción nuclear con la tinción de ácido nucleico Hoechst 33342 a una
dilución de 1:50 000 (1 ÿL por 50 mL de PBS) durante 5 a 10 min.
14. Enjuague el portaobjetos con 1×PBS 3 min × 3.
15. Antes de que la sección de tejido se seque por completo, monte los portaobjetos
agregando dos o tres gotas de medio de montaje en la sección de tejido y coloque
suavemente un cubreobjetos.
16. Los tejidos de ratones que no han recibido células NK marcadas con CM-Dil servirán
como control.
17. Analice los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia.
18. Elija de 3 a 5 campos aleatorios por portaobjetos para un mínimo de tres portaobjetos
por tejido por grupo y cuantifique el número de células NK en los pulmones y otros
órganos utilizando un software SimplePCI.
19. Calcule el número medio de células NK por órgano por grupo y represente los valores
en un gráfico de barras o de puntos.
3.4.2 Detección de NK
Para investigar si el tratamiento con IL-2 en aerosol aumentó el número de células NK
Células en los pulmones de en los nódulos pulmonares del OS, se deben seguir los siguientes pasos:
Animales con tumores pulmonares
Sobre Aerosol IL-2

Tratamiento 1. Reseccionar los pulmones de los diferentes grupos experimentales descritos en el
Subtítulo 3.2.
2.Prepare secciones congeladas de 5 ÿm.
3. Fijar cortes de pulmón congelados en acetona durante 10 min e incubar con bloque
proteico (suero de cabra al 1 % y suero de caballo al 5 % diluido en 10 ml de PBS)
durante 30 min.
4. Enjuague el portaobjetos con 1 × PBS 3 min × 3.
5. Incube con el anticuerpo anti-NKG2D humano a -4 °C durante la noche ( consulte la

Nota 11).
7.Incubar con bloque de proteínas durante 30 min.

9. Incube con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con Alexa Fluor
546 diluido a 1–10 ÿg/mL en PBS durante 45 minutos a una hora.
11. Teñir los núcleos con Hoechst 33342 diluido a 1:50 000 en PBS durante 5 a 10
min.
13. Monte las muestras agregando dos o tres gotas de medio de montaje en la sección
de tejido y coloque suavemente un cubreobjetos; lea los portaobjetos bajo un
microscopio de fluorescencia con aumentos de 10×, 20× y 40×.
14. Cuantifique el número de células NK en los pulmones y otros órganos utilizando el

software SimplePCI.
3.5 Metodología para El efecto sistémico de la IL-2 en aerosol se evaluó en ratones Balb/c desnudos e
evaluar los efectos inmunocompetentes.
sistémicos de la IL-2 en aerosol
1. Trate a los ratones con IL-2 en aerosol (2000 U) o PBS en aerosol, cada
otro día durante 1 semana y 1 mes.
2. Sacrificar los ratones al final del tratamiento.
3. Retire los pulmones, los riñones, el bazo, el hígado, los intestinos y el corazón y
fije con formalina los tejidos en formalina al 10 % para el examen histológico. Los
portaobjetos H & E de todos los tejidos incluidos en parafina deben analizarse en
busca de signos de toxicidad debido a la terapia con IL-2.
4. Extraer muestras de sangre de ratones mediante sangrado retroorbitario o

mediante extracción de sangre intracardíaca en el momento del sacrificio, para
hemograma completo (CBC) y análisis de enzimas hepáticas (ALT, AST, LDH)
para evaluar los posibles efectos sistémicos. causada por la inhalación de IL-2.
Realice pruebas de enzimas hepáticas utilizando un kit específi co y siga el
protocolo del fabricante ( ver Nota 12).
3.6 Detección de Para confirmar los efectos de toxicidad sistémica bajos o nulos de la IL-2 en aerosol
Niveles séricos de IL-2 en comparación con los efectos sistémicos de la IL-2 administrada por vía intraperitoneal
Después de Aerosoles y (ip), los niveles séricos de IL-2 se miden mediante un ensayo ELISA ( consulte la Nota
Suministro sistémico de IL-2 13) como sigue:
1. Recoger suero de ratones tratados con aerosol IL-2 (2000 U), aerosol PBS e IL-2
(20 000 U) ip dos veces por semana durante 2 y 5 semanas mediante sangrado
retroorbital.
2. Mida los niveles séricos de IL-2 utilizando un kit ELISA para IL-2.
Agregue 10 ÿL de cada muestra de suero, en pocillos duplicados, a la placa
ELISA e incube a temperatura ambiente durante 3 h.
3. Lave la placa tres veces con Wash Buffer (suministrado en el

equipo ELISA).
4. Agregue 100 ÿL de solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB)

(provista en el kit ELISA) a todos los pocillos e incube la placa a
temperatura ambiente durante 10 min.
5. Detenga la reacción colorimétrica agregando 100 ÿL de solución de
parada (provista en el kit ELISA) en cada pozo y mida los valores de
absorbancia a 450 nm usando un espectrofotómetro.
4 notas
1. Utilizamos la línea de células de osteosarcoma LM7, que metastatiza

exclusivamente a pulmón. No divida las células más de tres o cuatro
veces antes de inyectarlas en ratones. La línea celular debe controlarse
para asegurarse de que sea negativa para Mycoplasma. Cualquier otra
línea celular metastásica de pulmón puede sustituir las células LM7 en
estudios similares.
2. Usamos IL-2 humana recombinante para la administración de IL-2 en
aerosol de TECINTM Teceleukin, Bulk Ro 23-6019, Instituto Nacional del
Cáncer, Frederick, MD. La IL-2 se disolvió y diluyó en PBS para lograr la
concentración deseada de 2000 U en 10 ml de solución de PBS. Se usó
IL-2 humana de Proleukin, Novartis, Inc., Basel, CH para la expansión
de células NK in vitro
.
3. Reconstituya y diluya la IL-2 liofilizada según las instrucciones del

fabricante. La solución madre de IL-2 debe congelarse en altas
concentraciones para evitar la descomposición. Evite los ciclos repetidos
de congelación y descongelación.
4. Para tener en cuenta las variaciones en la citotoxicidad y la actividad de
las células NK, se recomienda examinar las células NK expandidas antes
de la conservación criogénica para determinar la expresión de receptores
de superficie como NKG2D, CD16 y NKp46 mediante citometría de flujo.
La citotoxicidad celular puede evaluarse mediante un ensayo de liberación
de calceína [ 12]. Brevemente, marque 10 6 células
de calceína objetivodurante
AM. Incubar con 1–2 ÿM
1h
en incubadora de cultivo celular. Lave las células objetivo en medios
RPMI dos veces. Divida las células diana en tres grupos: (1) células
diana marcadas con calceína, que reflejarán una medida de la liberación
espontánea; (2) células diana marcadas con calceína tratadas con tween
20 al 2 %, que representarán la liberación máxima; y (3) células diana
cocultivadas con células NK efectoras.
Sembrar las células en un volumen total de 200 l por triplicado, en placas
con fondo en U de 96 pocillos en una proporción de 0,3125:1–1:10
efector a células diana e incubar durante 4 h. Transfiera 100 ÿL de los
medios a una placa inferior plana de 96 pocillos y mida la liberación de
calceína utilizando un espectrofotómetro a longitudes de onda de
excitación y emisión de 485 nm y 530 nm, respectivamente. Calcular el
porcentaje de lisis específica según la fórmula [(liberación de prueba ÿ
liberación espontánea)/(liberación máxima ÿ liberación espontánea)] × 100.
5. Utilizamos la línea celular metastásica humanLM7 OS. Para evitar la reacción

antigénica provocada por las células humanOS, se eligieron ratones desnudos
para estos estudios. Cualquier otra línea celular metastásica de pulmón es
adecuada para estos estudios si se utiliza con el modelo de ratón adecuado.
6. Los investigadores pueden determinar el número de ratones por grupo

basado en consideraciones estadísticas.
7. Cultive las células NK recién descongeladas en RPMI+50 UI/mL de IL-2 humana

fresca durante 1 o 2 días para permitir la recuperación y activación de las
células NK antes de los experimentos de terapia in vivo.
8. Después de completar la administración del aerosol a los animales, se debe

abrir la jaula de plástico sellada y dejarla dentro de la campana hasta que se
disipen todos los vapores para disminuir la contaminación ambiental.
9. Para este experimento, considere un mínimo de tres ratones por grupo y tiñe 5
× 10 7 células NK para inyección/ratón.
10. La elección del momento en el que se sacrificarán los ratones puede ser
determinada por el investigador y varía según el tipo de estudio y el modelo
animal.
11. Se recomienda titular el anticuerpo en consecuencia.
12. Nuestros resultados no mostraron evidencia de inflamación o toxicidad en el

bazo, el hígado, el corazón, los intestinos o los riñones 1 semana o 1 mes
después del tratamiento con IL-2 en aerosol. Las enzimas hepáticas y las
pruebas de CBC también fueron normales [ 6 ].
13. La dosis de IL-2 en aerosol que usamos en nuestros estudios con animales fue
de 2000 U administrada dos veces por semana durante 2 y 5 semanas. La
dosis de aerosol fue diez veces menor que la dosis sistémica de IL-2 de 20.000
U que se administró por vía intraperitoneal (ip). Dos y cinco semanas después
de la administración de IL-2 en aerosol, los niveles séricos de IL-2 aumentaron
significativamente en comparación con el grupo de tratamiento con PBS en
aerosol. Sin embargo, estos niveles seguían siendo significativamente más
bajos que los del grupo de tratamiento con IL-2 ip después de la administración
de una sola dosis ip [ 6 ].
Expresiones de gratitud
Este capítulo se basa en datos proporcionados por el Dr. Sergei Guma. Los autores
quisieran extenderle su gratitud.
Referencias
1. Coca S, Pérez-Piqueras J, Martínez D et al (1997) El 2. Villegas FR, Coca S, Villarrubia VG et al (2002)

significado pronóstico de las células asesinas Importancia pronóstica del subconjunto CD57 de
naturales intratumorales en pacientes con carcinoma células asesinas naturales que infiltran tumores en
colorrectal. Cáncer 79(12): 2320–2328 pacientes con cáncer de pulmón de células
escamosas. Cáncer de pulmón 35(1):23–28
3. Sznurkowski JJ, Zawrocki A, Biernat W (2014) 9. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM et al (1987) Un
Los subtipos de linfocitos citotóxicos y células informe de progreso sobre el tratamiento de 157
asesinas naturales que infiltran nidos de cáncer se pacientes con cáncer avanzado utilizando células
correlacionan con el pronóstico en pacientes con asesinas activadas por linfocina e interleu kin-2 o
carcinoma de células escamosas de vulva. Cancer interleucina-2 en dosis altas solas. N Engl J Med
Immunol Immunother 63(3):297–303 4. Miller JS, 316(15):889–897
Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A et al (2005) 10. Pockaj BA, Yang JC, Lotze MT et al (1994) Un ensayo
Transferencia adoptiva exitosa y expansión in vivo aleatorio prospectivo que evalúa la reanimación con
de células NK haploidénticas humanas en pacientes coloides versus cristaloides en el tratamiento del
con cáncer. Sangre 105(8): 3051–3057 síndrome de fuga vascular asociado con la terapia
con interleucina-2. J Immunother Énfasis Tumor
5. Cho D, Shook DR, Shimasaki N et al (2010) Immunol 15(1):22–28 11. Gagnadoux F, Hureaux J,
Citotoxicidad de células asesinas naturales activadas Vecellio L et al (2008) Quimioterapia en aerosol. J
contra tumores sólidos pediátricos. Clin Cancer Res Aerosol Med Pulm Drug Deliv 21(1):61–70 12.
16(15):3901–3909 6. Guma SR, Lee DA, Yu L, Somanchi SS, Senyukov VV, Denman CJ et al
Gordon N, Hughes D, Stewart J et al (2014) Terapia de (2011) Expansión, purificación y evaluación funcional de
células asesinas naturales e interleucina-2 en células NK de sangre periférica humana. Exp J Vis
aerosol para el tratamiento del osteosarcoma 48:2540
metástasis pulmonar. Pediatr Blood Cancer
61(4):618–626 7. Guma SR, Lee DA, Ling Y et al 13. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012)
(2014) La interleucina-2 en aerosol induce la proliferación La IL-21 unida a la membrana promueve la
de células asesinas naturales en el pulmón y la proliferación ex vivo sostenida de células asesinas
terapia combinada mejora la supervivencia de naturales humanas. PLoS One 7(1), e30264 14.
ratones con coma osteosar metástasis pulmonar. Minchinton AI, Tannock IF (2006) Penetración de
Pediatr Blood Cancer 61(8):1362–1368 8. Basse fármacos en tumores sólidos. Nat Rev Cancer
PH, Goldfarb RH, Herberman RB et al (1994) 6(8):583–592 15. Jia SF, Worth LL, Kleinerman ES
Acumulación de células A-NK transferidas adoptivamente (1999) Un modelo de ratón desnudo de metástasis de
en metástasis murinas: cinética y función de la pulmón de osteosarcoma humano para evaluar
interleucina-2. En Vivo 8(1):17–24
nuevas estrategias terapéuticas. Clin Exp Metástasis
17(6):501–506
capitulo 25
Imágenes no invasivas de células asesinas naturales mediadas

Apoptosis en un modelo de tumor de ratón
Thoudam Debraj Singh,Jaetae Lee, y Yong Hyun Jeon
Resumen
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos que inducen la apoptosis en células cancerosas infectadas con virus y bacterias
a través de una vía dependiente de caspasa-3. La inmunoterapia eficaz basada en células NK requiere herramientas de imagen altamente
sensibles para el control in vivo de los eventos dinámicos implicados en la apoptosis. Aquí, describimos un enfoque de imágenes de
bioluminiscencia no invasivo para determinar los efectos antitumorales de la terapia basada en células NK mediante imágenes en serie de
la apoptosis dependiente de caspasa-3 en un modelo de ratón de glioma humano.
Palabras clave Células asesinas naturales, Biosensor Caspasa-3 , Apoptosis , Inmunoterapia , Gen reportero ,
Renilla luciferasa
1. Introducción
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos que son los
efectores críticos de la inmunidad innata [ 1, 2]. El efecto letal de las células
NK está regulado por receptores activadores que identifican ligandos en
células cancerosas diana o por receptores inhibidores que reconocen
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I en células
cancerosas. Las células NK inducen la apoptosis dependiente de caspasa-3
de las células cancerosas por exocitosis de gránulos citotóxicos que contienen
perforinas y granzimas y por agregación de proteínas que pertenecen a la
superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) (FasL/TNF) y sus
correspondientes ligandos (Fas/TNFR) [ 3 – 5 ].
El efecto terapéutico de la inmunoterapia basada en células NK depende
de la capacidad de estas células para mantener un equilibrio entre sus
receptores activadores e inhibidores y su susceptibilidad a las células
cancerosas [ 5–7 ]. Aunque muchos estudios han examinado la eficacia de
las células NK en inmunoterapia han
tumoral,
sido demostrados
sus distintosdebido
beneficios
a varios
clínicos
factores
no
como la alteración de sus funciones y microambientes tumorales desfavorables
[ 8]. Otro problema es la falta de herramientas fiables para el seguimiento in
vivo de la apoptosis inducida por la terapia con células NK en un modelo de
cáncer. Por lo tanto,
297
298 Thoudam Debraj Singh et al.
Se requieren herramientas de imágenes efectivas, prácticas y no invasivas

para evaluar la eficacia de la terapia basada en células NK, monitorear con
precisión el progreso de la apoptosis en los tumores y comprender los
mecanismos que subyacen al fracaso de la terapia con células NK.
Un sistema de imagen molecular especializado que pueda demostrar
los procesos dinámicos implicados en la apoptosis proporcionará una
comprensión completa de las cascadas bioquímicas relacionadas con la apoptosis.
Este sistema también facilitará la evaluación de varios factores importantes
para la terapia basada en células NK, como la dosis, la frecuencia y la vía
de inyección. En un estudio reciente, la apoptosis inducida en un modelo de
glioma humano por fármacos quimioterapéuticos se controló con éxito
mediante la realización de imágenes no invasivas con un reportero de
proteólisis de caspasa-3 [ 9]. Este biosensor de apoptosis contenía dominios
de luciferasa divididos fusionados con péptidos pepA y pepB que interactúan
y un motivo de escisión de caspasa-3 intermedio DEVD. Tras la inducción
de la apoptosis, este biosensor fue escindido proteolíticamente por la
caspasa-3 en el motivo DEVD. La escisión indujo la reconstitución de la
actividad de luciferasa a través de una interacción entre NLuc y CLuc (Fig.
1). Este sistema permitió monitorear en tiempo real la progresión de la
apoptosis en sujetos vivos de manera repetitiva y no invasiva. Estas ventajas
del biosensor de apoptosis sugieren que se puede utilizar para controlar la
actividad destructora de las células NK tanto in vitro como in vivo.
En este capítulo, hemos enfatizado la aplicación de este biosensor de

caspasa-3 para monitorear los efectos de la inmunoterapia basada en
células NK in vivo. Para ello, establecimos células de glioma humano que
expresan los biosensores de caspasa-3 como marcador sustituto de la
activación de caspasa-3 y luciferasa de Renilla (Rluc) como marcador
sustituto de la viabilidad celular. Se utilizaron células NK92 humanas como
células efectoras para la inmunoterapia con La activación
células NK.
de la apoptosis por la
terapia con células NK se controló en serie en un modelo de glioma utilizando
el biosensor caspasa-3, yRluc.
sus resultados terapéuticos se evaluaron utilizando
Fig. 1 Representación esquemática de ( a ) Sensor de caspasa-3 ( b ) Células D54 de cáncer de glioma estable que coexpresan
, y genes mCherry
el sensor de caspasa-3, R luc
Imágenes no invasivas de la apoptosis mediada por NK 299
2 materiales
2.1 Líneas celulares 1. Línea de células NK92 dependientes de IL-2 humana (ATCC).
y medio de cultivo
2. Línea de células tumorales de elección: para los fines de este capítulo, estamos
describiendo el método que usa la línea celular de glioma humano D54
(proporcionada por el Dr. Alnawaz Rehemtulla, Universidad de Michigan).
3. Medio de cultivo de células NK: Medio esencial mínimo alfa sin ribonucleósidos y
desoxirribonucleósidos (HyClone), L-glutamina 2 mM (Sigma), bicarbonato de sodio
1,5 g/L (Sigma), inositol 0,2 mM (Sigma), 2- mercaptoetanol (Invitrogen), ácido
fólico 0,02 mM (Sigma), suero de caballo al 12,5 % (HyClone), suero bovino fetal
al 12,5 % (HyClone), antibióticos al 1 % (penicilina/estreptomicina; Gibco), IL-2
1000 UI/mL ( Roche).
4. Medio comercial de células NK (opcional): (ALyS505NK-EX) suplementado con

suero humano al 10 %, 1000 UI/ml de IL-2 y penicilina/estreptomicina al 1 % (este ,
medio también puede utilizarse en lugar del medio de cultivo de células NK
,
Subpartida 2.1 5 Medio de cultivo de células D54: medio RPMI 1640 (HyClone),
artículo 3 ).
FBS al 10 % (HyClone), penicilina/estreptomicina 1x (Gibco), GlutaMAX 1x (Gibco).
Placas negras de 6,96 pocillos con fondo transparente (Corning).
7. Matraces T-75 (BD Falcon).
Placas de 8,6 pocillos (Corning).
2.2 Establecimiento 1. Geneticina (G418; Gibco).

de Caspasa-3 2. Puromicina (Sigma).
Biosensor y Rluc
3.Reactivo de transfección X-tremeGENE 9 (Roche).
Línea celular
4. Genes que coexpresan vectores lentivirales que codifican Rluc, mCherry y puromicina
bajo el control del promotor CMV (GeneCopoeia).
5. El plásmido Caspase-3 Biosensor [ 9] fue proporcionado por el Dr. Alnawaz

Rehemtulla (Universidad de Michigan). Este sensor de caspasa-3 se construye en
el vector de pEF que incluye el gen de resistencia a la neomicina. Por lo tanto, se
puede seleccionar con neomicina (G418) después de la transfección del biosensor
de caspasa-3 .
6.FACSAria II (BD Biosciences).
2.3 En vivo 1. Ratones desnudos BALB/c hembra libres de patógenos de seis semanas de edad.
Experimentos: ratones, 2. D-luciferina (DV Medical Research Innovations): Prepare una solución madre nueva
Reactivos de imagen de 30 mg/mL de D-luciferina en DPBS. Filtrar la solución con un fi ltro de 0,2 ÿm.
e instrumentos
3. Coelenterazine h: Para el experimento in vitro, diluya el RediJect Coelenterazine h

comercial (concentración madre de 120 ÿg/mL; PerkinElmer) en los medios de
cultivo respectivos a 1 ÿg/mL. Para experimentos in vivo, diluya Coelenterazine h
comercial (NanoLight Technology) en etanol absoluto (Sigma) para preparar una
solución madre de 2 mg/mL.
4. Reactivo GloSensor™ (Promega): Prepare el tampón HEPES (10 mM) en agua

desionizada; pH ajustado a 7,5 utilizando KOH. Agregue 817 ÿL de tampón HEPES
a un vial de reactivo que contenga 25 mg de reactivo GloSensor™.
5.Isoflurano: Conservar a temperatura ambiente, protegido de la luz.
6.IVIS Lumina III (PerkinElmer).
3 métodos
3.1 Cultivo de células NK92 1. Sembrar células NK92 a una densidad de 1 × 10 5 células/mL y cultivar en
un frasco T-75 que contiene medio de células NK.
2. Para pasar las células NK92, recolecte una colonia grande y saludable de células
(observadas al microscopio), transfiéralas a un tubo cónico y resuspéndalas en 5–
10 mL de medio de células NK fresco para obtener una suspensión de células
individuales ( consulte la Nota 1).
3.Centrifugar las células a 300 × g ( ver Nota 2).
4. Vuelva a sembrar las células en un matraz T-75 en medio de células NK a una

densidad de 1 × 10 5 células/mL para el subcultivo.
3.2 Expresión del Se pueden transfectar diferentes líneas de células cancerosas con la construcción del
biosensor de sensor de caspasa-3 utilizando el reactivo de transfección X-tremeGENE 9, y se pueden
caspasa-3, Rluc , seleccionar clones estables con geneticina (Gibco) como se describe a continuación. Las
mCherry en células líneas celulares estables establecidas que expresan el sensor de caspasa-3 deben
tumorales transducirse con el vector lenti-Rluc-mCherry y seleccionarse para clones estables
mediante clasificación FACS para obtener células tumorales que presionen el sensor de
caspasa-3, Rluc-mCherry. Pero para los propósitos de este capítulo, estamos describiendo
este método utilizando la línea celular D54. Cabe señalar que el biosensor Caspase-3
también puede aplicarse a otras líneas celulares de cáncer humano. En nuestras
experiencias, monitoreamos completamente con éxito la activación de caspasa-3 en
células de cáncer de tiroides, cáncer de colon y cáncer de mama con biosensor de
caspasa-3 después del tratamiento de células asesinas naturales como NK92
(independiente de IL-2), NK92MI (independiente de IL-2) y células NK humanas primarias
derivadas de sangre periférica.
1. Transfecte 5 × 10 5 células de glioma D54 en una placa de 6 pocillos con el

biosensorconstruct de caspasa-3 utilizando el reactivo de transfección X-tremeGENE
9 según el protocolo del fabricante ( consulte la Nota 3).
2. Cultive las células D54 transfectadas en medio completo RPMI

complementado con geneticina durante 2 semanas para seleccionar la
expresión estable del biosensor de caspasa-3 ( consulte la Nota 4).
3. Transducir (5 MOI) el vector lentiviral que coexpresa los genes Rluc,
mCherry y puromicina a 1 × 10 6 células D54 caspasa-3
biosensorestables en presencia de 10 ÿg/mL de polibreno.
Reemplazar con medios completos RPMI después de 24 h que contienen purom
4. Cultive las células transducidas en medio de cultivo RPMI suplementado
con puromicina durante 2 semanas para seleccionar la expresión
estable de los genes Rluc y mCherry ( consulte la Nota 5).
5. Clasificación del clasificador de células FACSAria II para aislar una
población pura de células que coexpresan Rluc y mCherry ( ver Nota 6).
6. Mantener una línea celular establecida que coexprese de forma estable la caspasa-3
biosensor ,y Rluc ,
mCherry (etiquetado en este caso como D54/CR) en
cultivo bajo selección de geneticina y puromicina (Fig. 1 ).
3.3 Imágenes
Para validar las células indicadoras modificadas como un biosensor de
de bioluminiscencia sor , caspasa-3, es esencial realizar un ensayo in vitro en células vivas (sin
in vitro lisis celular) para detectar la activación y la viabilidad de la caspasa-3 tras
el tratamiento de células NK92. Este ensayo proporcionará una lectura de
un aumento dependiente del tiempo y de la dosis en la actividad de
bioluminiscencia del biosensor, víade
apoptótica
caspasa-3enque
las células
indicarátumorales
la activación
después
de la
de la lisis mediada por células NK.
1. Siembre la línea de células tumorales modificadas genéticamente (D54/CR) con

una densidad de 1 × 10 4 células en 100 ÿl/pocillo en una placa negra de 96
pocillos con un fondo transparente.
2. Después de 24 h, reemplace el medio de cultivo antiguo con 100 ÿL de

medio de células NK complementado con GloSensor™ al 1 % y equilibre
durante al menos 1 a 2 h hasta que se obtenga una señal de bioluminiscencia
basal de estado estacionario a 37 °C en unla5 actividad
%. atmósfera de CO2 .basal
de luciferasa Mida
en células D54/CR utilizando IVIS Lumina III ( consulte la Nota 7).
3. Agregue 10 ÿL de células NK92 en diferentes proporciones objetivo

a efector (1:1, 1:2.5, 1:5 y 1:10) en 100 ÿL de medio de células NK
(99 ÿL) suplementado con 1 % GloSensor™ (1 ÿL) e incubados a
37 °C en una atmósfera con 5bioluminiscente
% de CO 2 , y medir la actividad
del biosensor de
caspasa-3 después de 2, 4 y 6 h de incubación, utilizando IVIS
Lumina III (Fig. 2) ( ver Nota 8).
4. Mida la actividad de luciferasa de Rluc añadiendo 1 ÿg/ml de
coelenterazina h y determine la viabilidad de las células tumorales
(células D54/CR) utilizando IVIS Lumina III.
Relación T/E
Objetivo: D54/CR
Efector: NK92
2.0
60
PBS
2 horas
1:2.5
1.5
1:5
40
1:10
1.0 x106
actividad
Caspasa
(Fold)
3
4 horas
20
0.5
0
6 horas
2 4 6
Horas
Fig. 2 Monitoreo in vitro de la actividad de caspasa-3 después del tratamiento con NK92 en células D54/CR
3.4 No invasivo El estudio de imágenes in vivo se describe para demostrar la viabilidad del biosensor de
Imágenes in caspasa-3 para la evaluación del evento de apoptosis dependiente de caspasa-3 de
vivo de caspasa-3 forma no invasiva y repetitiva en ratones vivos con tumor D54/CR. Las dosis de células
Activación NK que se utilizarán en el modelo de ratón deben titularse cuando se utiliza una línea
celular diferente.
1. Inyecte 5 × 10 6 células D54/CR por vía subcutánea en la región del flanco posterior
derecho de los ratones ( n = 30 ratones) ( consulte la Nota 9).
2. Supervisar la formación de tumores en los ratones mediante inspección y palpación.

Normalmente, los tumores son detectables dentro de 2 a 3 semanas ( ver Nota 10).
3. Determinar la actividad de bioluminiscencia basal del biosensor de caspasa-3 y los

tumores Rluc D54/CR después de 3 semanas.
4. Aleatorizados en tres grupos ( n = 10 ratones/grupo) con un valor medio de

bioluminiscencia Rluc equivalente.
5. Grupo 1: Administrar 100 ÿL de PBS (grupo de control) a través de la vena de la cola.
6. Grupo 2: Administrar 2 × 10 6 células NK92 resuspendidas en 100 ÿL de PBS a través

de la vena de la cola ( ver Nota 11).
7. Grupo 3: Administrar 1 × 10 7 células NK92 resuspendidas en 100 ÿL

de PBS a través de la vena de la cola.
8. Para BLI in vivo, administre a cada ratón con tumor una dosis única del sustrato de
cada proteína informadora de la siguiente manera: (1) Para determinar la viabilidad
de las células tumorales a través de la actividad de luciferasa de Rluc: Anestesie a
los ratones y luego inyecte 2 mg. /kg de Coelenterazina h inyectada cuidadosamente
a través de la vena de la cola.
Coloque los ratones en la cámara de imágenes de IVIS Lumina III

inmediatamente después de inyectar los sustratos y adquiera imágenes
bioluminiscentes. (2) Para determinar la actividad de bioluminiscencia del
biosensor de caspasa-3: inyecte 150 mg/kg de D-luciferina por vía
intraperitoneal y anestesie a los ratones con una mezcla de isoflurano/aire
al 1 %–2 % en los 5 minutos posteriores a la inyección de D-luciferina.
Obtenga imágenes bioluminiscentes de ratones usando IVIS Lumina III.
9. Se realizó BLI con el biosensor de caspasa-3 y Rluc utilizando IVIS Lumina

III en puntos de tiempo designados (12, 24 y 48 h) después del tratamiento
con células NK92 ( consulte la Nota 12).
10. Adquiera las imágenes de activación de caspasa-3 utilizando el modo de
adquisición de imágenes de secuencia (Fig. 3a, flecha negra) y cambiando
los parámetros respectivos, como el campo de visión (FOV), el tiempo de
adquisición de imágenes (de segundo a minuto) y tiempo de retardo.
Se debe usar el mismo FOV en cada momento de captura de imágenes ,
( flecha azul de la figura 4) porque no se pueden usar diferentes FOV
para comparar los cambios en la actividad de bioluminiscencia en
diferentes momentos ( consulte la Nota 13). Analice la Región de interés
(ROI) en las imágenes de ratones para determinar la actividad máxima
del biosensor de caspasa-3 y Rluc, utilizando el software Living Image.
Representante
b C
1.4 2.00E+08 ROI 1 ROI 4
1.2
1.50E+08
1.0
fotones
Flujo
total
de
1.00E+08
0.8x101 _
0.6 5.00E+07
0.4 0.00E+00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
0.2 Número de adquisición de imágenes
Fig. 3 ( a ) Imagen esquemática para la visualización de la activación de caspasa-3 mediante el modo de adquisición de imágenes
secuenciales, ( b ) Datos representativos de la adquisición de imágenes secuenciales y ( c ) Análisis de ROI
Fig. 4 Plantilla que muestra los parámetros de adquisición de imágenes secuenciales
tabla 1
Ejemplo representativo de cálculo de la actividad relativa de caspasa-3
Día 0 Día 1 Día 2 Día 3
Actividad de caspasa-3 (flujo de fotones) 6,84 × 10 7 2.08 × 10 8 3,62 × 10 8 2,33 × 10 8
Actividad Rluc (flujo de fotones) 1.07 × 10 8 9.07 × 10 7 8.05 × 10 7 6.08 × 10 7
Actividad relativa de Caspasa-3 0.638 2.294 4.495 3.837

(Actividad Caspasa-3/ Actividad Rluc)
,
las imágenes secuenciales obtenidas para el biosensor de caspasa-3 y
un gráfico que representa 2 ROI de estas imágenes secuenciales se
muestran en la Fig. 3b,. c
11. Por último, calcule el aumento relativo de la actividad de
bioluminiscencia del biosensor de caspasa-3 dividiendo la
actividad de bioluminiscencia del biosensor de caspasa-3
(apoptosis celular) por la actividad de bioluminiscencia de Rluc
(viabilidad celular) en cada punto de tiempo ( consulte la Tabla 1 ).
4 notas
1. Se examinó cuidadosamente el estado de las células NK92. Si una colonia

era pequeña, las células se incubaban durante un día adicional para
obtener colonias más grandes.
2. La viabilidad de las células fue >80 % (determinada mediante la prueba de

exclusión con colorante azul tripano). Después de la centrifugación, el medio
acondicionado de células NK92 se retuvo y se usó para cultivar células NK92
frescas para mejorar su proliferación.
3. Prepare el complejo de transfección incubando 2 ÿg de ADN plasmídico y 6 ÿL

de reactivo de transfección en 100 ÿL de medio opti-MEM durante 15 min a
temperatura ambiente. Transfecte las células D54 agregando 100 ÿL de
complejo de transfección en cada pocillo que contenga 2 mL de medio
completo. Reemplace los medios después de 24 h. Sin embargo, la titulación
del ADN y el reactivo de transfección es necesaria para obtener la máxima
eficiencia de transfección en diferentes líneas celulares.
4. La concentración mínima óptima (curva de muerte) de geneticina para matar el

100 % de las células no transfectadas se determinó tratando células D54
sembradas en placas de 6 pocillos con diferentes concentraciones de
geneticina que oscilan entre 100 y 1000 ÿg/mL. Usamos 200–400 ÿg/mL de
geneticina para seleccionar clones estables que expresan el biosensor 5 de
. mínima óptima (curva de muerte) de puromicina
caspasa-3. La concentración
para matar el 100 % de las células no transfectadas se determinó tratando las

células D54 sembradas en placas de 6 pocillos con diferentes concentraciones
de puromicina que van desde 1 a 10 ng/mL. Usamos puromicina 6 ng/mL para
seleccionar clones estables.
6. El vector lentiviral usado en este estudio contiene el sitio interno de entrada al

ribosoma (IRES) flanqueado por dos sitios de clonación múltiples bajo el
promotor de CMV (citomegalovirus) de control.
Genes Rluc y mCherry ubicados aguas arriba y aguas abajo de IRES,
respectivamente. Por lo tanto, la proteína fluorescente mCherry se puede usar
como sustituto de Rlucgenes y podemos esperar que todas las células
positivas para mCherry también sean células positivas para Rluc, ya que Rluc
y mCherry se expresan en una sola construcción. Medimos la Rlucactividad
de células vivas sembradas en placa negra de 96 pocillos con fondo
transparente en presencia de su sustrato sin lisis celular utilizando un
luminómetro o una máquina IVIS.
7. El uso del reactivo GloSensor™ al 1 % permitió el monitoreo en serie de

eventos de apoptosis en células intactas que expresan el biosensor caspasa-3
durante al menos 7 días sin agregar D -luciferina en cada punto de tiempo.
8. Para el control negativo, agregue 5 ÿL de PBS en 100 ÿL de medio de células

NK (99 ÿL) complementado con 1 % de GloSensor™ (1 ÿL) en la primera
columna de células D54/CR.
9. El número de ratones que se utilizará en el estudio debe determinarse en

función de consideraciones estadísticas para cada experimento.
10. Dado que la duración de la formación del tumor puede variar para diferentes
líneas celulares, es necesario monitorear el crecimiento del tumor durante al
menos dos veces por semana usando imágenes ópticas o palpación e inspección.
11. Se inyectó cuidadosamente PBS o suspensión celular que contenía 5 × 10 6

células NK92 en la vena de la cola de ratones con tumores (100 o 200 ÿL de
suspensión de células NK se usan generalmente para terapia in vivo. Tenga
en cuenta que las células NK deben debe inyectarse lentamente porque la
inyección rápida de células NK puede provocar la muerte de los ratones).
12. Rlucsignal disminuyó rápidamente dentro de 1 minuto después de inyectar su
sustrato. Por lo tanto, BLI mediante el uso de Rluc debe llevarse a cabo antes
. imágenes
de realizar BLI para el biosensor de caspasa-3 13. Se capturaron
secuenciales de BLI del biosensor de caspasa-3 con 5 o 10 s (tiempo de
adquisición de imágenes) durante 30-40 min a intervalos de 1 min. (tiempo
de retardo). La actividad de bioluminiscencia del biosensor de caspasa-3
alcanzó su punto máximo dentro de los 30 minutos posteriores a la inyección
de su sustrato y permaneció en ese nivel durante aproximadamente 0,5 a 1 h.
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de

Investigación (NRF) de Corea financiada por el gobierno coreano (MEST,
2009-0078234); el Programa Nacional de I+D Nuclear de la NRF financiado por el
Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (Nº 2012M2A2A7014020); una
subvención del Proyecto de I+D de Tecnología Sanitaria de Corea, Ministerio de
Salud y Bienestar, República de Corea (A111345); una subvención (RTI04-01-01)
del Programa Regional de Innovación Tecnológica del Ministerio de Economía del
Conocimiento y el Fondo de Investigación de la Universidad Nacional Kyungpook
(2013); una subvención del Proyecto de Apoyo a la I+D del Clúster Médico de la
Fundación de Innovación Médica Daegu-Gyeongbuk, República de Corea; y una
subvención de la NRF de Corea financiada por el Gobierno de Corea (MSIP,
2014R1A1A1003323).
Referencias
1. Cerwenka A, Lanier LL (2001) Células asesinas 6. McQueen KL, Parham P (2002) Receptores variables
naturales, virus y cáncer. Nat Rev Immunol 1:41–49 2. que controlan la activación e inhibición de las células
Lanier LL (2008) Luchas evolutivas entre las células NK y NK. Curr Opin Immunol 14:615–621 7. Shi J, Tricot
los virus. Nat Rev Immunol 8: 259–268 GJ, Garg TK et al (2008)
3. Rosen D, Li JH, Keidar S et al (2000) Inmunidad tumoral Bortezomib regula a la baja la expresión de la superficie
en ratones deficientes en perforina: un papel para celular de HLA clase I y mejora la lisis del mieloma
CD95 (Fas/APO-1). J Immunol 164:3229–3235 4. mediada por células asesinas naturales. Sangre
111:1309–1317
Trapani JA, Smyth MJ (2002) Significado funcional de la
vía de muerte celular de perforina/granzima. Nat Rev 8. Zamai L, Ponti C, Mirandola P et al (2007) Células NK y
Immunol 2:735–747 5. Screpanti V, Wallin RP, cáncer. J Immunol 178:4011–4016 9. Coppola JM,
Grandien A et al (2005) Ross BD, Rehemtulla A (2008)
Impacto de la apoptosis inducida por FASL en la Imágenes no invasivas de la apoptosis y su aplicación
eliminación de células tumorales por células NK. Mol en la terapéutica del cáncer. Clin Cancer Res 14:2492–
Inmunol 42:495–499 2501
capitulo 26
Imágenes de fluorescencia in vivo no invasivas de

células NK en modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva
Srinivas S. Somanchi
Resumen
Los modelos animales preclínicos desempeñan un papel vital en el desarrollo de nuevas inmunoterapias adoptivas para el cáncer.
En estos modelos in vivo, es esencial realizar un seguimiento de las células transferidas de forma adoptiva para comprender su
localización tisular (biodistribución) a fin de correlacionarlas con los resultados terapéuticos observados, así como para desarrollar
enfoques novedosos para promover la localización de tumores u órganos de interés. Este capítulo describe un método simple y rápido
para el marcaje de fluorescencia y la obtención de imágenes in vivo de células NK transferidas adoptivamente en modelos animales
pequeños.
Palabras clave Células NK, Inmunoterapia adoptiva , imágenes de fluorescencia, tinte infrarrojo cercano, DiR
1. Introducción
Los modelos preclínicos de tumores animales juegan un papel importante en la

evaluación de la inmunoterapia adoptiva para el cáncer. Las imágenes de
bioluminiscencia no invasivas de xenoinjertos tumorales in vivo, utilizando células
tumorales modificadas genéticamente para expresar firefl y o Renilla luciferasegene,
han permitido dramáticamente el seguimiento de la progresión y regresión del
tumor en respuesta a la terapia en tiempo real. Del mismo modo, la obtención de
imágenes no invasivas de las células NK transferidas de forma adoptiva es esencial
para comprender su biodistribución, persistencia y ubicación específica en los
órganos o tumores diana, de modo que se puedan desarrollar estrategias
novedosas para promover la localización de las células transferidas de forma
adoptiva en el tumor o en los órganos de interés. —sitios de metástasis tumoral.
Aunque desarrollar un enfoque similar para las células NK diseñándolas para que
expresen proteínas de fluorescencia, para complementar la imagen del tumor por
bioluminiscencia es una opción atractiva, la mayoría de los métodos de transferencia
de genes producen una baja eficiencia en la modificación del gen de las células
NK. Además, las proteínas de fluorescencia actualmente disponibles carecen de
suficiente intensidad de señal de fluorescencia para una detección eficaz in vivo.
Por lo tanto, los colorantes fluorescentes han surgido como alternativas atractivas,
ya que ofrecen un medio conveniente y rápido para marcar las células para la obtención de imáge
307
308 Srinivas S. Somanchi
después de la transferencia adoptiva, particularmente los tintes que son fluorescentes

en el espectro infrarrojo cercano (NIF), ya que tienen poca interferencia de la
autofluorescencia del tejido o la piel de los animales.
Aunque la obtención de imágenes de células marcadas con fluorescencia no es una
opción clínicamente viable, se ha demostrado que es una opción excelente para
modelos de animales pequeños.
Los tintes citoplásmicos y lipofílicos han sido ampliamente reportados en la
literatura para la obtención de imágenes de células in vivo [ 1]. Los tintes citoplásmicos
son potencialmente más tóxicos para las células como se muestra con CFSE, [ 2 ] y
aunque CFSE es un excelente candidato para la evaluación de la división celular ex
vivo basada en citometría de flujo, su fluorescencia se superpone con la
autofluorescencia del tejido y hace que la señal específica débil sobre la profundidad
del tejido para imágenes in vivo. Por el contrario, los colorantes lipofílicos
como el PKH26 se han utilizado ampliamente para rastrear linfocitos [ 3] y células
madre y progenitoras hematopoyéticas [ 4]. Sin embargo, los tintes lipofílicos de
carbocianina más nuevos, como DiIC18(7) o yoduro de 1,1ÿ-dioctadeciltetrametil
indotricarbocianina (DiR) tienen propiedades mejoradas para la obtención de imágenes
in vivo. El espectro de emisión
de infrarrojo cercano de tintes como DiR (780 nm) es una clara ventaja, ya que hay
poca interferencia de fluorescencia debido a la autofluorescencia del tejido o el pelaje
de los animales y la longitud de onda del infrarrojo cercano tiene una alta penetración
tisular [ 5]. DiRdye se ha utilizado ampliamente en diversas aplicaciones de imágenes
in vivo, como el seguimiento de células madre hematopoyéticas [ 6], inmunoterapia
adoptiva de células T [ 7], células madre embrionarias murinas [ 8], macrófagos
murinos [ 9], para estudiar células madre pluripotentes inducibles. células madre
neurales derivadas como vehículos de administración para la terapia génica del
cáncer [ 10], células supresoras derivadas de mieloide murino (MDSC) [ 11],
localización y captación de nanovectores (GNV de nanovectores derivados de pomelo)
por células tumorales para la administración de fármacos/genes [ 12] y el tráfico de
linfocitos T citotóxicos y células asesinas activadas por citoquinas en el modelo de
inmunoterapia adoptiva del carcinoma gástrico [ 13]. Además, DiRdye es altamente
fotoestable y fotoconvertible, lo que lo hace apto para el seguimiento de células
individuales mediante microscopía intravital, como se muestra con las células
hematopoyéticas [ 14].
Sin embargo, es importante evaluar los méritos de cualquier método para una
aplicación determinada. Por ejemplo, DiRdye puede ser una excelente opción para
monitorear el tráfico de células NK infundidas durante períodos cortos de tiempo, pero
puede no ser adecuado para obtener imágenes a largo plazo de la persistencia de las
células NK porque, en primer lugar, cuando las células NK infundidas se dividen el
tinte incorporado en la membrana se diluirá progresivamente, lo que resultará en una
disminución de la señal de fluorescencia con el tiempo; en segundo lugar, el tinte
persistirá en las membranas de las células muertas, lo que dará como resultado una
señal de DiRf uorescence continua que no se correlaciona con la presencia de células
NK viables y en tercer lugar existe un potencial de "contaminación del microambiente"
de DiRdye como se informa en la literatura [ 15]. Por lo tanto, los datos de imágenes
de fluorescencia in vivo deben corroborarse con el análisis de citometría de flujo de
Imágenes de fluorescencia in vivo de células NK 309
células aisladas o con inmunohistoquímica de secciones de tejido utilizando marcadores

de células NK. Además, la migración de células NK a órganos principales o masas
tumorales más grandes puede ser más fácil de visualizar de una manera no invasiva,
pero la localización en regiones localizadas más pequeñas, como ganglios linfáticos [ 16]
o micrometástasis tumorales, puede requerir imágenes del tejido resecado. En este
capítulo, se describen los métodos para teñir células NK humanas expandidas con
DiRdye y la obtención de imágenes in vivo no invasivas de células NK marcadas.
2 materiales
1. Células NK humanas (células NK primarias, células NK activadas/expandidas)

células o líneas de células NK).
2.Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences). Tubos cónicos de

3,50 ml.
4. Matraz de cultivo T75.
5. Medio de células NK: RPMI 1640, 10 % FBS, 1x GlutaMAX (2 mM) y 1x Pen/Strep.

Agregue 50 UI/ml de IL2 al medio justo antes de usar.
6. DiIC18(7) o yoduro de 1,1ÿ-dioctadeciltetrametil indotricarbocianina ( DiR )

(PerkinElmer): preparar una solución madre de 50 mg/ml en etanol (disolviendo 25
mg del colorante en 500 ÿl de etanol) y almacenar a temperatura ambiente. 4 °C. 7.
Medio de tinción 2X DiRS: Justo antes de teñir las células NK, agregue la solución
DiRstock al medio de células NK a una dilución de 1:500 para preparar medio de tinción
2X DiR (100 ÿg/ml).
8. Filtro de células de 70 µm.
9. Ratones (cepa de elección) ( ver Nota 1).
10. Dieta libre de alfalfa o dieta purifi cada [ 17 ].

11.Isoflurano.
Jeringas de 12,1 cc con aguja de calibre 28–30.
13. Imágenes: sistemas de imágenes preclínicas in vivo IVIS Spectrum (Caliper Life
Sciences): con 710 nm (excitación): 760 nm (emisión) conjunto de filtros; vaporizador
de isoflurano y suministro de oxígeno.
14.Software de imagen viva (PerkinElmer).
3 métodos
La metodología descrita en este capítulo está optimizada para células NK de sangre

periférica humana, ampliada durante 3 semanas en K562 mbIL21 .
Este método se puede adoptar para su uso con células NK humanas primarias, líneas
de células NK humanas, células NK activadas por citoquinas u otras
plataformas de expansión, así como células NK de fuentes animales (como primates

no humanos y ratones), pero puede ser esencial optimizar la concentración de tinte y
la densidad de células NK para lograr la máxima tinción sin afectar la viabilidad de las
células NK.
3.1 Tinción de células 1. Para utilizar stock congelado de células NK para este protocolo, descongele y
NK con DiR coloque células NK en cultivo a una densidad celular de 1 × 10 6/ml en un matraz
T75 (hasta 40 ml, vertical) en medio de células NK, el día antes de teñir con
colorante DiR.
2. Cuente y evalúe la viabilidad de las células NK con azul de tripano

exclusión.
3. Si la viabilidad de las células NK es superior al 85 %, transfiera el número deseado

de células NK ( consulte la Nota 2), para la tinción con DiRdye, a un tubo cónico
de 50 ml y centrifugue a 400 × g durante 5 min (si la viabilidad de las células NK
células está por debajo del 85 %, véase la Nota 3).
4. Vuelva a suspender suavemente el sedimento de células NK a 4 × 10 6 células/ml

utilizando medio de células NK (densidad celular 2 ×). A las células NK
resuspendidas, agregue un volumen igual de medio de tinción DiR 2x para lograr
una densidad celular final de 2 × 10 6de
células/ml
50 ÿg/mly( una concentración
consulte la Nota 4).de colorante
5. I ncube las células a 37 °C durante 20 min. Mezclar el contenido cada

5 min invirtiendo suavemente el tubo.
6. Girar las células a 200 × g durante 10 min ( ver Nota 5).
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular en 50 ml

de medio de células NK y centrifugar a 200 × g durante 10 min.
8.Repita el paso de lavado una vez más.
9. Vuelva a suspender las células NK en 50 ml de medio de células NK y páselas a

través de un filtro de células de 70 ÿm y cuente las células en un hemocitómetro
y evalúe la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano ( consulte la Nota 6).
10. Se puede usar una alícuota de células de cada lote de tinción para evaluar el
impacto de la tinción DiR en la función citolítica de las células NK en comparación
con las células NK no teñidas usando el ensayo de citotoxicidad de elección
( consulte la Nota 7) (Fig. 1 ).
11. Gire la cantidad de células NK necesarias para el experimento de transferencia

adoptiva en un tubo cónico nuevo a 400 × g durante 5 min y vuelva a suspender
en el volumen deseado de medio para inyectar en ratones (no más de 200 ÿl por
vía iv por ratón) ( consulte la nota 8).
3.2 Infusión de células Para los experimentos de transferencia adoptiva, determine la elección de la cepa de
NK teñidas con DiR ratón según las necesidades experimentales. Tenga en cuenta que el colorante DiR
emite fluorescencia en el espectro infrarrojo cercano y, por lo tanto, existe una
autofluorescencia mínima de los órganos o el pelaje de los ratones que podría interferir
con la señal de fluorescencia específica. Sin embargo, para evitar la interferencia de la
fluorescencia debido a la dieta (en el intestino), se recomienda
100
80
60
específica
lisis
de
%
40
20 NK 250405 -DiR
NK 250405 +DiR
0
10:1 5:1 2,5:1 1,25:1 0,6:1 0,3:1
Relación E:T
Fig. 1 Evaluación del impacto del marcaje con DiR en la función citolítica de las células NK. La citotoxicidad
de las células NK expandidas con y sin marcaje con DiR se compara con la línea celular K562 mediante
un ensayo de liberación de calceína. Tenga en cuenta que el procedimiento de etiquetado optimizado
descrito en los métodos no tiene un impacto significativo en la función citolítica de las células NK.
para alimentar al animal con una dieta libre de alfalfa o una dieta purificada [ 17] comenzando
al menos 1 semana antes de los experimentos de imagen.
1. Diseñe los experimentos con ratones con el número adecuado de grupos en función de
las necesidades experimentales ( consulte la Nota 9). Determine el número de ratones
por grupo con base en consideraciones estadísticas para un experimento dado.
2. Inyecte células NK teñidas con DiR en ratones a través de la vía de administración

preferida (p. ej., intravenosa o intraperitoneal) en función de las necesidades del
experimento ( consulte la Nota 8).
3. Obtenga imágenes de los ratones para evaluar la biodistribución y el alojamiento de las

células NK transferidas adoptivamente inmediatamente después de la administración
de células NK y todos los días (o según se desee, hasta 1 semana, consulte la Nota 10).
3.3 Fluorescencia El siguiente método describe imágenes de animales completos para visualizar células NK
Imágenes en vivo marcadas con DiR in vivo. Sin embargo, para evaluar la ubicación de las células NK en
regiones localizadas más pequeñas, como ganglios linfáticos o masas tumorales más
pequeñas, puede ser esencial sacrificar los ratones y resecar el tejido de elección para
obtener imágenes mediante IVIS Spectrum o mediante otros métodos, como la citometría de
flujo. células aisladas o inmunohistoquímica de las secciones de tejido. En tales casos, realice
la eutanasia y la resección del tejido según las normas institucionales.
,
1 primero encienda el sistema de imágenes IVIS Spectrum y abra el software de imagen
Living. Haga clic en el icono 'Inicializar' para preparar la imagen.
2. Mientras el instrumento se está inicializando, anestesie a los ratones con isoflurano

usando un vaporizador de isoflurano: llene el vaporizador con iso
flurano, cierre la cámara y encienda el suministro de gas y el flujómetro. Ajuste

el caudal de oxígeno entre 500 y 1000 ml por minuto y el isoflurano entre el 3 y
el 5 %. Luego coloque los ratones en la cámara de anestesia (inducción) ( ver
Nota 11).
3. Una vez que los ratones estén inmóviles, apague el suministro de gas a la
cámara de inducción y encienda el suministro de gas (O 2 : mezclaisoflurano)
de a
la etapa de imágenes de IVIS Spectrum y transfiera los ratones a la etapa de
imágenes. Coloque los ratones en conos nasales conectados al suministro de
gas.
4. En el panel de control de adquisición IVIS del software Living Image, marque las
casillas junto a fotografía y fluorescencia y seleccione exposición automática
( consulte la Nota 12) (alternativamente, ajuste manualmente el binning, el f-
stop y la duración de la exposición por prueba, evitando la saturación de la
señal ( ver Nota 13)).
5.Seleccione el juego de fi ltros de 710 nm y 760 nm (excitación-emisión).
6. Seleccione el campo de visión de A a D según el número de ratones en la

plataforma de imágenes.
7. Adquirir imágenes y guardar archivos en formato Living Image. La fotografía y

las imágenes de fluorescencia se guardan juntas y se pueden mostrar como
una imagen superpuesta.
8. Analice las imágenes importándolas al software de análisis Living Image.

Analice e informe los datos como Flujo (fotones/segundo) por región de interés
(ROI), que compensa las diferencias entre los ajustes de adquisición de
imágenes individuales (como binning, f-stop y duración de la exposición) en
varios puntos de tiempo del experimento ( Figuras 2 y 3 ).
4 notas
1. Las imágenes de fluorescencia in vivo con DiR se pueden realizar con la mayoría
de las cepas de ratones. La cepa de ratón debe elegirse en función de la
necesidad experimental y, dado que DiRdye presenta fluorescencia en el
espectro infrarrojo cercano (748 nm Ex–780 nm Em), la autofluorescencia del
tejido o del pelaje de los ratones es insignificante.
2. El número de células NK a teñir con DiR dependerá de la necesidad experimental.

Normalmente inyectamos 10 × 10 6 células NK por ratón en nuestros
experimentos de transferencia adoptiva.
3. Si la viabilidad de las células NK es baja, es esencial realizar una centrifugación

de densidad Ficoll-Paque para eliminar las células no viables y los desechos.
Coloque las células NK en 15 ml de Ficoll-Paque en un tubo cónico de 50 ml y
centrifugue a 400 × g durante 20 min sin frenos. Recupere las células NK
viables de la interfaz de Ficoll Paque y el medio y transfiéralas a un tubo cónico
de 15 ml nuevo.
Para lavar las células, agregue medio de células NK fresco para llenar el tubo y
b
100
80
x106 60
40
20
Barra de color
Mín = 6e+06
Máx = 1e+08
Fig. 2 Imágenes de fluorescencia in vivo de células NK marcadas con DiR después de la transferencia adoptiva en ratones.
( a ) Abra los archivos de imagen como un grupo en el software Living Image y cambie la salida a "Fotones" (flecha azul),
seleccione el "rango de color agregado" (escala) a Manual (cuadro rojo) e ingrese el mínimo y valores máximos de la “barra de
color” para mostrar el nivel deseado de color sin saturación (si las imágenes se analizan individualmente, ingrese los mismos
valores mínimo y máximo para todas las imágenes, para mostrarlas en la misma escala). ( b ) Las imágenes de fluorescencia
se adquirieron 24 h después de la infusión de células NK. La imagen in vivo no invasiva es una fusión de la fotografía adquirida
y las imágenes de fluorescencia y muestra una señal de fluorescencia predominantemente en el hígado ( c ) Las imágenes de
los órganos extirpados muestran que la fluorescencia DiR está presente en los pulmones, el hígado y el bazo, lo que indica
migración de células NK a estos órganos
DÍA 1 DIA 2 DÍA 3

160
140
120
x106 100
80
60
40
Barra de color
Mín = 3e+07
Máx = 2e+08
bkg sub
de campo plano
160
140
120
x106 100
80
60
40
Barra de color
Mín = 3e+07
Máx = 2e+08
bkg sub
de campo plano
DÍA 4 DÍA 7 DÍA 8

Fig. 3 Después de la transferencia adoptiva de 10 × 10 6 células NK humanas expandidas marcadas con DiR, se tomaron imágenes de los ratones
diariamente durante 8 días. Las imágenes de todo el cuerpo muestran un aumento de la fluorescencia observada en las extremidades traseras a lo
largo del tiempo, lo que indica un posible alojamiento en la médula ósea de las células NK transferidas adoptivamente.
girar a 400 × g durante 5 min. Repita el paso de lavado por segunda vez.
Resuspender las células NK en medio de células NK y contar las células y probar
la viabilidad por exclusión con azul de tripano.
4. Anticipar la muerte de algunas células durante la tinción. Así que tiñe más células
(alrededor de 1,5x) de las necesarias para el experimento.
5. Después de teñir con DiRdye, el sedimento de células NK aparecerá azul.
6. Aunque después de la tinción con DiR, el sedimento celular aparece azul, las
células vivas no aparecen azules bajo el microscopio de campo brillante.
Por lo tanto, es posible distinguir las células positivas de azul de tripano y evaluar
la viabilidad mediante el método de exclusión de azul de tripano.
7. Hay varios métodos disponibles para determinar la citotoxicidad de las células NK,
como el ensayo de liberación de cromo-51 ("estándar de oro"), el tinte de
fluorescencia verde no radiactivo: ensayos basados en citometría de flujo de
Rutinariamente
liberación
realizamos
de calceína
un yensayo
el ensayo
de liberación
de imágenes
de calceína
de bioluminiscencia,
para determinar
ing. el
potencial citolítico de las células NK expandidas (Fig. 1 ) [ 18 ].
8. Rutinariamente inyectamos 10 × 10 6 células por ratón en 100–200 ÿl de volumen

de inyección. La dosis y el volumen de la célula se pueden modificar en función de
las necesidades experimentales individuales. Las células se pueden resuspender
en medio de cultivo sin suero o en PBS/solución salina. Cuando resuspenda en
PBS/solución salina, asegúrese de que las células estén sanas y en suspensión
(sin agregados visibles) antes de la administración iv.
9. Además de los grupos de prueba, incluya un grupo de control sin tratar y un grupo
de control portador (PBS o control medio).
10. Este método es ideal para obtener imágenes a corto plazo, en lugar de evaluar la
persistencia a largo plazo de las células transferidas adoptivamente porque (1) el
tinte puede diluirse con la división celular, lo que conduce a una menor intensidad
de la señal y/o (2) las membranas de las células muertas Las células NK seguirán
proporcionando una señal fluorescente.
11. Los procedimientos operativos estándar para anestesiar ratones y usar IVIS
Spectrum estarían disponibles en núcleos de viveros institucionales y la
capacitación formal sería esencial antes de que se pueda realizar el trabajo
experimental.
12. Si se van a obtener imágenes de ratones para detectar células NK transferidas

adoptivamente (fluorescentes) junto con xenoinjerto tumoral bioluminiscente,
marque la casilla "luminiscencia".
13. En nuestra experiencia, un f-stop de 2, un binning pequeño y un tiempo de

El fabricante
exposición de 1 a 5 s son suficientes para adquirir una imagen fluorescente.
proporciona un manual paso a paso detallado para navegar por el software de
adquisición.
Referencias
1. Progatzky F, Dallman MJ, Lo Celso C (2013) 7. Youniss FM, Sundaresan G, Graham LJ et al (2014)
De ver a creer: estrategias de etiquetado para Imágenes de infrarrojo cercano de la terapia de células
experimentos de seguimiento celular in vivo. Enfoque inmunitarias adoptivas en el modelo de cáncer de mama
de interfaz 3:20130001 2. Last'ovicka J, Budinsky V, mediante el etiquetado de la membrana celular. PLoS
One 9, e109162
Spisek R et al (2009)
Evaluación de la proliferación de linfocitos: CFSE mata 8. Ruan J, Song H, Li C et al (2012) Células madre
las células en división y modula la expresión de los embrionarias marcadas con DiR para imágenes dirigidas
marcadores de activación. Cell Immunol 256:79–85 3. de células de cáncer gástrico in vivo. Teranóstica 2: 618–
628
Parish CR (1999) Tintes fluorescentes para estudios de
migración y proliferación de linfocitos. 9. Eisenblatter M, Ehrchen J, Varga G et al (2009) Imágenes
Immunol Cell Biol 77:499–508 ópticas in vivo de la respuesta inflamatoria celular en la
4. Hendrikx PJ, Martens CM, Hagenbeek A et al (1996) formación de granulomas utilizando macrófagos
Homing de células madre hematopoyéticas murinas marcados con fluorescencia.
marcadas con fluorescencia. Exp Hematol 24: 129–140 J Nucl Med 50:1676–1682 10.
Yang J, Lam DH, Goh SS et al (2012) Tropismo tumoral de
5. Escobedo JO, Rusin O, Lim S et al (2010) células madre neurales derivadas de células madre
Colorantes NIR para aplicaciones de bioimagen. Curr pluripotentes inducidas por humanos inyectadas por vía
Opin Chem Biol 14:64–70 6. Kalchenko V, Shivtiel S, intravenosa y su aplicación de terapia génica en un
modelo de cáncer de mama metastásico. Células madre
Malina V et al (2006)
30:1021–1029
Uso de colorantes lipofílicos en el infrarrojo cercano en
imágenes ópticas de todo el cuerpo para la localización de 11. Ilkovitch D, Lopez DM (2009) El hígado es un sitio para
células hematopoyéticas. J Opción biomédica 11:050507 el desarrollo de mieloides inducidos por tumores.
acumulación de células supresoras e inmunosupresión. inducido por tintes lipofílicos fluorescentes utilizados para
Cancer Res 69:5514–5521 12. Wang Q, Zhuang X, Mu el seguimiento celular no invasivo in vitro e in vivo.
Sangre 115:5347–5354
J et al (2013) Entrega de agentes terapéuticos mediante
nanopartículas hechas de lípidos derivados del pomelo. 16. Somanchi SS, Somanchi A, Cooper LJ et al (2012)
Nat Commun 4:1867 13. Du X, Wang X, Ning N et al Ingeniería de localización de ganglios linfáticos de células
(2012) Seguimiento dinámico de células inmunitarias en un asesinas naturales humanas expandidas ex vivo a través
modelo de ratón de carcinoma gástrico ortotópico de la trogocitosis del receptor de quimiocinas CCR7.
Sangre 119:5164–5172
utilizando imágenes en vivo de fluorescencia de infrarrojo
cercano. Exp Ther Med 4:221–225 14. Carlson AL, 17. Inoue Y, Izawa K, Kiryu S et al (2008) Dieta y
Fujisaki J, Wu J et al (2013) autofluorescencia abdominal detectadas mediante
imágenes de fluorescencia in vivo de ratones vivos.
Seguimiento de células individuales en animales vivos Mol Imaging 7:21–27 18.
utilizando una etiqueta de membrana celular Somanchi SS, Senyukov VV, Denman CJ et al (2011)
fotoconvertible en el infrarrojo cercano. PLoS One 8, Expansión, purificación y evaluación funcional de células
e69257 15. Lassailly F, Griessinger E, Bonnet D (2010) NK de sangre periférica humana. J Vis Exp 48, e2540.
“Contaminaciones microambientales” doi:10.3791/2540
capitulo 27
Imagen de resonancia magnética in vivo 19F de Adoptively

Células NK transferidas
Srinivas S. Somanchi, Bridget A. Kennis, Vidya

Gopalakrishnan, Dean A. Lee y James A. Bankson
Resumen
Para evaluar la biodistribución, la localización y la persistencia de las inmunoterapias de células asesinas naturales (NK)
transferidas de forma adoptiva, existe la necesidad de una metodología de imagen adecuada para su uso en estudios
preclínicos con relevancia para la traducción clínica. Entre los enfoques disponibles, 19F-MRI es muy atractivo para la
obtención de imágenes in vivo debido a la ausencia de señal de fondo, lo que permite una detección clara de células marcadas
con 19F in vivo. Aquí describimos una metodología para la obtención de imágenes in vivo de células NK transferidas
adoptivamente etiquetadas con nanoemulsión 19F , utilizando tecnología traducible clínicamente de resonancia magnética 19F/1H .
Palabras clave Células NK, Inmunoterapia adoptiva, Imagen in vivo, 19F, Imagen por resonancia magnética
1. Introducción
El desarrollo preclínico y clínico de tratamientos farmacológicos contra el

cáncer generalmente requiere medidas in vivo de biodistribución y
farmacocinética/dinámica. Para la inmunoterapia del cáncer con células
efectoras transferidas adoptivamente, los parámetros de persistencia,
localización, tráfico y proliferación constituyen las medidas análogas de la
inmunocinética. El muestreo de sangre con cuantificación de células por
citometría de flujo es el método más utilizado para evaluar la persistencia y
la proliferación, pero ignora la localización del tejido y puede subestimar o
sobrerepresentar lo que realmente está ocurriendo en el sitio del tumor. Esto
es particularmente cierto para los tumores que no son fácilmente accesibles
para el muestreo repetido de tejidos, como los tumores cerebrales.
Desarrollamos un sistema sólido para expandir las células NK de la
sangre periférica utilizando una célula alimentadora modificada genéticamente
K562 Cl9.mbIL21 [1, 2], y ahora estamos utilizando este enfoque para
generar células NK para ensayos clínicos de inmunoterapia adoptiva en
leucemias, tumores sólidos, y tumores cerebrales. Los métodos radiológicos
para localizar y cuantificar las células infundidas in vivo incluyen métodos no clínicos como
317
318 Srinivas S. Somanchi et al.
proteínas fluorescentes [3] o etiquetas de moléculas pequeñas [4–7] y bioluminiscencia (p.

ej., luciferasa/luciferina de luciérnaga) [8], y métodos clínicamente aplicables, como el
marcaje radiactivo para imágenes PET usando 111 indio [9–11], 18FDG [ 12, 13] o timidina
cinasa y 18F-FEAU [14], y resonancia magnética nuclear (RMN) con óxido de hierro [15–
18]. Para obtener imágenes de las células NK durante la inmunoterapia adoptiva de células
NK, los enfoques PET son tóxicos para las células NK (indio 111) o requieren una
modificación genética (timidina quinasa) que ha resultado difícil en estas células, y la
dificultad para cargar nanopartículas de óxido de hierro puede producir un contraste
insuficiente -a-ruido para obtener imágenes de una concentración baja de estas células
pequeñas usando resonancia magnética tradicional. Idealmente, se necesitan métodos que
puedan adaptarse tanto para estudios preclínicos como clínicos.
Con un impulso para desarrollar imágenes de punto de acceso con agente de contraste de
MRI heteronuclear, 19F se ha convertido en un objetivo de imagen prometedor.
Aunque las imágenes de 19F/ 1H se describieron por primera vez en 1977 [19], este método
ha ganado atención para el seguimiento y la obtención de imágenes de células en los
últimos años [20-24]. La principal ventaja del 19F como agente de contraste para la
resonancia magnética es la ausencia de señal de fondo (ruido) en el tejido, lo que permite
una visualización clara de las células marcadas. Las nanoemulsiones de perfluorocarbono
19F se han utilizado para el seguimiento in vivo de células inmunitarias como las DC [22,
25] y las células T [26, 27]. La principal innovación de la nanoemulsión, además de mejorar
la sensibilidad de las imágenes, es que elimina la necesidad de transfección para marcar
las células [28] a favor de una simple coincubación. Esto hace que el método sea
significativamente más atractivo para las aplicaciones de células NK.
Aquí describimos la metodología preclínica de prueba de principio para el etiquetado

19F y la obtención de imágenes in vivo de células NK expandidas mediante resonancia
magnética 19F en un modelo de ratón de inmunoterapia adoptiva de células NK intracraneales.
Para los métodos descritos aquí, establecimos un modelo ortotópico de tumor cerebral en
ratones, utilizando un tornillo guía craneal. El método del tornillo guía craneal se ha utilizado
con eficacia para establecer modelos de xenoinjerto para varios tipos de tumores cerebrales
[29–31]. Para obtener orientación visual adicional sobre el método del tornillo guía para
xenoinjertos intracraneales, consulte el artículo de video en el Journal of Visual Experiments
[32].
2 materiales
1. Células NK (ver Nota 1).
2. Medio de células NK: RPMI 1640, 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x Pen/Strep. Agregue 50
UI/ml de IL2 al medio justo antes de usarlo para el cultivo de células NK.
3. Frascos de cultivo de tejidos (T25, T75).
4. Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Ciencias de la vida).
5. DAOY (línea celular de meduloblastoma) ATCC.
6. Medio completo MEM: Complemente el medio MEM con FBS al 10 %, 2x l-glutamina,

bicarbonato de sodio al 0,075 %, piruvato de sodio 1 mM, 1x antibiótico-antimicótico
y 1x aminoácidos no esenciales de MEM.
Imagen de resonancia magnética 19F de células NK 319
7. Reactivo Cell Sense 19F : CS-ATM-DM Green (Celsense Inc) (ver Nota 2).
8. Tampón de lisis 2x: Triton X-100 al 2 % en D2O (óxido de deuterio;
Sigma).
9. Patrón de referencia: 0,1 % TFA (ácido trifluoroacético; Sigma) en
D2O.
10. Óxido de deuterio (Sigma). 11.

Tubos de RMN de 5 mm (Sigma).
12. Espectrómetro Bruker 300 MHz DPX NMR. 13. Tubos
cónicos estériles de 15 ml y 50 ml.
14. Línea celular K562 (ATCC).

15. Medio de cultivo completo: RPMI 1640, 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x Pen/
Strep.
16. Calceína-AM (1 mg/ml stock) (Life Technologies).
17. Triton X-100 al 2 %: Preparar una solución de Triton X-100 al 2 % en medio
de cultivo completo y almacenar a 4 °C. 18. Ratones NOD scid gamma
(NSG) de 4–8 semanas de edad (Jackson Laboratories).
19. Destornillador SD-80—Pieza: 26030 (Plastics One, Inc).

20. Adhesivo tisular 3 M® .
21. Broca n.° 56 (acero de alta velocidad)—Pieza: D n.° 56 (Plastics One, Inc).
22. DH-1 Pin Vise Starrett (0.030–0.062)—Parte: 50600 (Plásticos
Uno, Inc.).
23. Tornillo guía SU1 W-orificio de 0,5 mm; Nailon—Pieza: C212GN
(Plásticos Uno, Inc).
24. Dummy (estilete) 0,018 in-0,45 mm; Nailon—Parte: C212SDN
(Plásticos Uno, Inc).
25. 7T Biospec Small Animal MRI system con gradientes BG6 y una bobina de
volumen de 1H MRI con 35 mm de diámetro interior (DI)
(Bruker Biospin Corp., Billerica, MA).
26. Bobina de volumen de cuadratura 19F con DI de 35 mm (Rapid MR
International LLC, Columbus, OH).
27. Lámpara de RMN esférica (529-A, Wilmad-Labglass, Vineland, NJ).
3 métodos
3.1 Establecimiento 1. El número de ratones que se utilizará para cualquier experimento debe
del modelo de tumor determinarse en función de criterios estadísticos.
intracraneal murino
2. Anestesie a los ratones con isoflurano inhalado al 3-4 % (consulte la Nota 3).
3.1.1 Colocación de 3. Afeite el cuero cabelludo de los ratones desde la nuca hasta entre los ojos
tornillos guía en el cráneo con una rasuradora eléctrica, limpie el área quirúrgica una vez con un
hisopo estéril con betadine y luego frote una vez con una gasa estéril con
alcohol isopropílico al 70 %.
4. Con un bisturí estéril, haga una incisión de aproximadamente 0,5 pulgadas en

dirección caudal a craneal, sobre el sitio de colocación del tornillo guía (consulte la
Nota 4).
5. Perfore con cuidado un orificio en el cráneo en el lugar de colocación del tornillo

guía con el taladro manual DH-1 Pin Vise Starrett y la broca.
6. Fije el tornillo guía de nailon con un destornillador hasta que quede al ras con la
superficie del cráneo. Es importante dejar de girar el destornillador una vez que el
tornillo haya encontrado la resistencia de la superficie del cráneo para evitar que se
rompa o colapse el orificio de la trepanación.
7. Luego, coloque el estilete en el eje del tornillo guía para cerrar la abertura.
8. Cierre la incisión con unas pinzas y selle la herida con adhesivo tisular 3 M® ,
cubriendo el tornillo guía con el cuero cabelludo.
9. Permita que los animales descansen durante 7 días después de la cirugía.
3.1.2 Intracraneal Cultive y mantenga la línea de células tumorales de elección en un medio de cultivo
Inyección de células tumorales apropiado en condiciones de cultivo estériles y realice pruebas periódicas para detectar
micoplasmas. Utilice líneas de células tumorales que expresen marcadores de
bioluminiscencia o fluorescencia para facilitar la obtención de imágenes del tumor durante
los experimentos. El protocolo se describe aquí para la línea celular de loblastoma
medular DAOY. Si se utiliza una línea celular diferente, se recomienda una titulación
inicial de la dosis de células tumorales para establecer el modelo tumoral, ya que las
diferentes líneas celulares tienen diferentes cinéticas de crecimiento in vivo.
1. Cultivar y mantener las células DAOY en medio completo MEM.

Pase las células al 80% de confluencia en una proporción de división de 1:6.
2. El día de la inyección (día 7 después de la colocación del tornillo guía), trate con
tripsina las células tumorales y lávelas dos veces con PBS. Resuspender las células
en PBS y pasar a través de una malla de nailon de 70 ÿm para eliminar los
agregados celulares y realizar el recuento de células.
3. Recupere el número deseado de células para inyección en ratones en un tubo nuevo

(consulte la Nota 5), centrifugue a 400 × g durante 5 min y resuspenda el precipitado
a 10 × 106 células/ml en PBS para que 5 ÿl contengan 50 000 Células para
inyección intracraneal.
4. Para inyectar las células tumorales, anestesiar y preparar los ratones para la cirugía
como se describe en el Subtítulo 3.1.1, paso 2.
5. Use un bisturí estéril para hacer una incisión directamente sobre el tornillo guía de
longitud suficiente para exponer el tornillo guía.
6. Retire el estilete.
7. Use una jeringa Hamilton de punta roma y un dispositivo estereotáctico para inyectar
hasta 5 ÿL de volumen total de células tumorales a una velocidad constante de 0,5
ÿL/min. Es importante que las células inyectadas se coloquen al menos un milímetro
más allá del extremo del tornillo guía.
8. Una vez que se haya administrado todo el volumen, deje la jeringa en posición
durante 1 minuto antes de retirarla para permitir que se asienten todas las células
inyectadas.
9. Retire la jeringa Hamilton y reemplace el estilete. Cierre la incisión con unas pinzas
y selle la herida con adhesivo tisular 3 M® , cubriendo el tornillo guía con el cuero
cabelludo.
10. Permita que el tumor se establezca durante aproximadamente 7 días (consulte la

Nota 6) y separe aleatoriamente los ratones en grupos de control y tratamiento.
3.2 Infusión in vivo de 1. Un día antes de la infusión de células NK a los ratones, descongele un vial de
células NK marcadas con 19F células NK expandidas en un baño de agua a 37 °C y transfiera las células a un
tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de medio de células NK precalentado.
3.2.1 Etiquetado de células NK con 19F
Haga girar las células a 400 × g durante 5 min. (Si usa células NK que están en
cultivo, comience el proceso desde el paso 5).
2. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de medio de células NK.

Cuente y verifique la viabilidad de las células NK utilizando el método de exclusión
con azul de tripano.
3. Transfiera las células NK a un matraz de cultivo adecuado (consulte la Nota 7) y

agregue medio de células NK para ajustar la densidad celular a 1 × 106/ml
(consulte la Nota 8).
4. Incube las células durante la noche en una incubadora de CO2 a 37 °C.
5. Al día siguiente, antes del etiquetado 19F , cuente las células NK y verifique
para la viabilidad por el método del azul tripán.
6. Si la viabilidad de las células NK es superior al 90 %, continúe con el paso 14.
7. Si la viabilidad de las células NK es inferior al 90 %, realice una centrifugación de

densidad Ficoll-Paque para eliminar las células no viables y los desechos.
8. En un tubo cónico de 50 ml, agregue 15 ml de Ficoll-Paque y cubra con cuidado

hasta 35 ml de células NK en la capa de Ficoll-Paque (para volúmenes de cultivo
de células NK más pequeños, use un tubo cónico de 15 ml para maximizar la
recuperación).
9. Girar a 400×g durante 20 min sin frenos.

10. Recuperar las células NK de la interfaz Ficoll-medio y
transferir a un tubo cónico fresco de 15 ml.
11. Para lavar las células, agregue PBS para llenar el tubo y centrifugue a 400 × g durante 5 min.
12. Repita el lavado dos veces más.
13. Resuspender las células NK en medio de células NK, contar y comprobar mediante
bilidad por exclusión de azul de tripán.
14. Recuperar el número deseado de células NK (ver Nota 9) para marcar con 19F,
centrifugar a 400×g durante 5 min.
15. Desechar el sobrenadante y resuspender a 3x106/ml usando medio de células NK

(ver Nota 10).
16. Células de semillas en una placa de cultivo adecuada en función del volumen celular
(ver Nota 11).
17. Agregue el reactivo Cell Sense 19F (CS-ATM DM Green) a las células a 5 mg/ml
(consulte la Nota 12) y mezcle suave y completamente con una pipeta P-1000.
18. Incube las células durante la noche (16–18 h) a 37 °C en un CO2

incubadora.
19. El día de la infusión, mezcle y transfiera las células NK a un tubo cónico de 15 ml,
enjuague bien los pocillos con medio de células NK y transfiéralo a un tubo cónico
para recuperar completamente las células NK.
20. Para lavar el exceso de 19F, llene el tubo con medio de células NK y centrifugue a
400xg durante 5 min.
21. Repita el paso de lavado 2 veces más.
22. Se puede utilizar una alícuota de las células NK marcadas con 19F para determinar
el número de átomos de flúor incorporados por célula mediante RMN (consulte el
apartado 3.4) y para determinar el efecto del marcado con 19F en la función citolítica
de las células NK (consulte el apartado 3.5).
3.2.2 Célula NK intracraneal 1. Vuelva a suspender el sedimento de células NK marcadas con 19F a 1 × 106 células/
Infusión 3 ÿl de PBS para inyección intracraneal en ratones.
2. Afeite el cuero cabelludo de los ratones y limpie el cuero cabelludo con un hisopo de
betadine estéril seguido de alcohol isopropílico al 70 %.
3. Realice una incisión con bisturí estéril para exponer el tornillo guía.
4. Infundir intratumoralmente células NK marcadas con 19F siguiendo los pasos 5 a 8

descritos en el Subtítulo 3.1.2.
5. Descanse los ratones durante 2 h para recuperarse de la cirugía.
6. Imagen de ratones para detectar las células NK marcadas con 19F infundidas mediante resonancia magnética.
3.3 Imágenes de resonancia La resonancia magnética nuclear (RMN) es una modalidad diagnóstica bien conocida
magnética in vivo de células NK que proporciona una buena resolución de imagen y un contraste exquisito de los tejidos
marcadas con 19F blandos. La resonancia magnética se basa en la medición de la distribución espacial de
los núcleos de hidrógeno. La sensibilidad es alta porque el 1H es el núcleo más abundante
in vivo y porque la fuerza de su señal de resonancia magnética nuclear (RMN) es la más
alta de todos los isótopos estables.
19F tiene la segunda fuerza de señal de RMN relativa más alta, y la baja abundancia en
el tejido normal asegura una señal de fondo pequeña contra la cual deben detectarse las
células marcadas con 19F. Este procedimiento describe un método que se puede utilizar
para obtener imágenes corregistradas de células marcadas con referencia anatómica
mediante resonancia magnética tradicional.
1. Anestesie al ratón del que se va a obtener la imagen (consulte la Nota 13) y colóquelo
en un trineo de imágenes que incluya un método para administrar anestesia (si se
usa un anestésico inhalable) mientras se mantiene la temperatura corporal.
2. Conecte sensores para el control remoto del estado fisiológico (consulte la Nota 14).
Asegúrese de que la región del cuerpo que se escaneará esté inmovilizada para
minimizar los artefactos de resonancia magnética que son
causado por el movimiento. Coloque una referencia externa que contenga una
pequeña cantidad de 19F (reactivo Cell Sense) cerca del sitio de imagen de
destino, en un pequeño bulbo de RMN.
3. Coloque el ratón en el isocentro dentro del imán de MRI, en el centro de los

gradientes de imágenes y dentro de las bobinas de RF (consulte la Nota 15).
4. Obtenga exploraciones de localización para confirmar que el animal está en la

posición correcta. Una secuencia de eco de espín rápido (FSE) de 3 planos
(TEeff=46 ms, TR=2 s, ETL=8, matriz de imagen de 128×128 sobre un campo
de visión de 45 mm×45 mm), por ejemplo, permite la visualización de posición
del animal después; ver figura 1). Ajuste según sea necesario para centrar la
anatomía de destino dentro del sistema de imágenes.
5. Una vez confirmada la posición, asegúrese de que la bobina de RF esté

sintonizada y emparejada. Luego, ajuste la frecuencia central, las cuñas y calibre
la potencia de excitación de RF para el escáner de resonancia magnética. Muchas
de estas optimizaciones se realizan automáticamente durante el preescaneado.
6. Adquiera imágenes anatómicas de referencia mediante resonancia magnética 1 H

tradicional. La configuración exacta de las secuencias que resaltan la anatomía
objetivo dependerá de la región anatómica de interés y la intensidad del campo
del escáner. Para visualizar las células NK dentro del cerebro murino, una única
secuencia de imágenes de eco de espín rápido ponderada en T2 en 3D (TEeff =
72 ms, TR = 1500 ms, ETL = 16, matriz de imágenes de 128 × 128 × 32 que
cubre una matriz de imágenes de 3 cm × 3 cm ×3 cm de campo de visión)
proporcionó un contexto anatómico excelente con un tiempo de exploración de
aproximadamente 6,5 min.
7. Sin mover al animal, deslice la bobina 1H MRI RF fuera del imán y reemplácela
con la bobina de volumen 19F . Cambie la frecuencia de referencia del escáner
de resonancia magnética para que se corresponda con 19F y confirme que la
bobina esté sintonizada y emparejada. Establezca la calibración de excitación
(consulte la Nota 16). Ajuste con precisión la frecuencia de referencia de 19F
mediante la ejecución de una secuencia de espectroscopia de adquisición de
pulso rápida (excitación 90, TR = 1000 ms, lectura de 2048 puntos
Fig. 1 Exploraciones representativas del localizador. Las imágenes intercaladas (a) axial, (b) sagital y (c) coronal muestran que la
anatomía objetivo (cerebro) está colocada correctamente dentro del sistema de imágenes
Fig. 2 Superposición representativa de imágenes 19F en referencias anatómicas ponderadas en T2. La imagen de la izquierda muestra la
señal intracraneal después de la inyección de células NK marcadas con 19F. A la derecha, la concordancia entre las imágenes de protones y
19F en la referencia externa demuestra un buen registro conjunto
con un ancho de banda de más de 25 kHz, aproximadamente 10 promedios para

garantizar una relación señal-ruido suficiente para medir la frecuencia de resonancia
del reactivo en el tejido y/o dentro del bulbo de RMN externo).
8. Adquiera imágenes de 19F que estén co-registradas con imágenes de referencia

anatómicas utilizando la secuencia de eco de espín rápido 3D, adaptada para 19F
(TEeff=71,5 ms, TR=700 ms, ETL=24, 80 promedios de señal, 32×32 tamaño de
matriz ×32 que cubre un campo de visión de 3 cm × 3 cm × 3 cm) (ver Nota 17).
Asegúrese de que la prescripción de corte y la geometría de imagen coincidan con
las referencias anatómicas.
9. Superponga las imágenes 19F (paso 8) sobre las imágenes anatómicas de

referencia (paso 6) utilizando un software de procesamiento de imágenes como
Matlab (Mathworks) o Photoshop (Adobe Systems Inc.), consulte la Fig. 2.
3.4 Determinación del Las células NK marcadas con el reactivo de imagen de modo dual CS-ATM DM Green
etiquetado 19F de células NK descrito en el Subtítulo 3.2.1 pueden evaluarse cualitativamente mediante citometría de
flujo y cuantitativamente mediante resonancia magnética nuclear (RMN) para el marcado
19F.
1. Para evaluar cualitativamente el etiquetado mediante citometría de flujo, recupere

aproximadamente 5 × 105 células NK sin marcar (como control) y células NK
marcadas con 19F en medio de células NK en tubos FACS separados. Analice las
muestras en un citómetro de flujo en el canal FITC (consulte la Nota 18) (Fig. 3a).
2. Para determinar el número de átomos de flúor incorporados por célula mediante

RMN, recolecte 3 × 106 células NK marcadas con 19F en un tubo cónico de 15 ml
y agregue PBS para llenar el tubo.
3. Girar las células a 400 × g durante 5 min.

a b
100 sin mancha 6 1010
Teñido con 19F 5 1010

80
4 1010
máx.
de
%
60
3 1010
40 Promedio
Celda
19F/
2 1010
20
1 1010
0 0
100 101 102 103 104 2,5 mg/ml 5 mg/ml 7,5 mg/ml
CS-ATM DM Verde (FL1) Concentración de reactivo 19F
Fig. 3 Determinación del marcaje con 19F de células NK. ( a ) Evaluación cualitativa del marcado CS-ATM DM green (19F) de células
NK mediante citometría de flujo en comparación con células NK de control sin teñir. ( b ) Análisis cuantitativo del etiquetado 19F de
células NK, que muestra la cantidad de átomos de flúor / célula NK después de la incubación durante la noche con CS-ATM DM Green
4. Aspire el sobrenadante y repita el paso de lavado cuatro veces más para un total de
cinco lavados.
5. Aspire el PBS lo más completamente posible teniendo cuidado de no perder células

NK.
6. Al sedimento de células NK agregue 100 ÿl de tampón de lisis 2X y mezcle bien con

una pipeta P-200 para promover la lisis completa de las células.
7. Al lisado, agregue 200 ÿl de D2O.
8. Antes de analizar la muestra en RMN, agregue 200 ÿl de TFA al 0,1 % como estándar
de referencia interno para el flúor y mezcle completamente con una pipeta P-200.
9. Transfiera la muestra a tubos de RMN de 5 mm y adquiera el espectro de RMN de

19F (consulte la Nota 19).
10. Calcular el número de átomos de flúor por celda utilizando la siguiente fórmula: (Fig.
3b).
19Fatomas/celda
= 3I MNI
s
/N
real academia de bellas artes rc
Is = área integrada del pico principal del sedimento celular Mr =

moles de TFA de referencia (1,75 × 10-6 moles para 200 ÿl de TFA al 0,1 %)
Na = número de Avogadro Ir =
área integrada bajo el pico de referencia de TFA Nc = número
de células en el sedimento
3.5 Efecto de 19F Es esencial comprender el efecto del marcaje con 19F en la función citolítica de las
Etiquetado en células NK células NK, ya que esto podría afectar su potencial terapéutico.
Función Se pueden utilizar numerosos métodos para determinar la citotoxicidad de las células NK
como el ensayo de liberación de cromo-51, el ensayo de liberación de LDH, la

liberación de europio no radioactivo y los métodos basados en citometría de flujo,
por nombrar algunos. Este protocolo describe el ensayo de liberación de calceína
para cuantificar la citotoxicidad de las células NK con y sin marcaje con 19F utilizando
K562 como línea celular tumoral diana.
1. Mantenga la línea celular K562 en medio de cultivo completo y pase a una

proporción de división de 1:6 cuando la densidad celular supere las 0,6 × 106
células/ml.
2. Para teñir K562 con calceína, cuente y transfiera 2 × 106 células K562 (consulte
la Nota 20) a un tubo cónico de 15 ml y centrifugue a 400 × g durante 5 min.
Resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de cultivo completo fresco
(densidad celular de 1x106/ml).
3. Añadir calceína madre (1 mg/ml) a las células a una dilución de 1:333 veces (3
ÿl/ml). Incubar durante 30 min a 37 oC en una incubadora de CO2 y agitar las
células cada 5 min.
4. Lavar las células tres veces con 10 ml de medio de cultivo completo para eliminar
el exceso de calceína-AM, centrifugar a 400 xg durante 5 min. Vuelva a
suspender la calceína marcada con K562 en 10 ml de medio y transfiérala a un
tubo cónico de 50 ml, realice un recuento de células y agregue medio para
ajustar la densidad celular a 1 × 105 células/ml.
5. Contar y resuspender las células NK con y sin marcaje con 19F en medio de
cultivo completo a 1x106 células/ml (ver Nota 21).
6. Sembrar 200 ÿl de células NK por pocillo en 3 pocillos, en una placa de 96

pocillos con fondo en "U" (p. ej., células NK sin marcar en A1, B1, C1 y células
NK marcadas con 19F en A7, B7, C7).
7. Añada 100 ÿl de medio de cultivo completo a los pocillos A2–C6 y

A8–C12.
8. Realice una dilución en serie doble de las células NK (transfiriendo 100 ÿl de

células NK en serie a través de las columnas) (consulte la Nota 22).
9. Agregue 100 ÿl de medio de cultivo completo a 6 pocillos (p. ej., E1–

E6) para el control de liberación espontánea.
10. Agregue 100 ÿl de Triton X -100 al 2 % a 6 pocillos (p. ej., G1–G6) para obtener
el máximo control de liberación (consulte la Nota 23).
11. Añada 100 ÿl de K562 cargado con calceína a los pocillos que contienen células
NK y a los pocillos de control espontáneo y control de liberación máxima. Mezcla
suavemente.
12. Girar la placa a 100×g durante 1 min.
13. Incube la placa durante 4 h a 37 °C en una incubadora de CO2.
14. Después de 4 h, retire la placa, mezcle suavemente el contenido de cada pocillo

para distribuir uniformemente la calceína liberada con una pipeta P-200 y gire la
placa a 400 × g durante 1 min.
15. Aspire con cuidado 100 ÿl del sobrenadante con una pipeta P-200 y transfiéralo
a una placa transparente de 96 pocillos de fondo plano (consulte la Nota 23).
100
80
60
específica
lisis
%
40
20
0
10:1 5:1 2,5:1 1,25:1
Relación E:T
Fig. 4 Ensayo de citotoxicidad de células NK representativo. Citotoxicidad de las células NK

marcadas con 7,5 mg/ml de 19F, tenga en cuenta que las células NK continúan siendo altamente
citotóxicas contra la línea celular K562 después de marcarlas con el reactivo 19F (CS-ATM DM Green)
16. Lea la intensidad de la fluorescencia usando un espectrofotómetro de fluorescencia (filtro

de excitación 485 nm: filtro de emisión 530 nm).
17. Calcular el porcentaje de lisis específica de las células NK usando la fórmula [(Liberación de
prueba—Liberación espontánea)/(Liberación máxima—Liberación espontánea)]×100 (ver
Nota 24) (Fig. 4).
4 notas
1. Para este estudio se pueden utilizar líneas de células NK, células NK humanas primarias o
expandidas, según el interés del usuario o el objetivo de la investigación. El protocolo
descrito aquí es para células NK expandidas. Si se utilizan células NK primarias o líneas
de células NK para experimentos, optimice el etiquetado 19F como se indica en la Nota 10.
2. Para este protocolo se utiliza el reactivo óptico/RM de modo dual.

Este reactivo contiene 19F y fluoresceína dentro de la emulsión para facilitar la evaluación
cualitativa del marcaje celular mediante citometría de flujo, así como la evaluación
cuantitativa del marcaje 19F (número de átomos de flúor por célula) mediante resonancia
magnética nuclear (RMN) de flúor.
3. Los animales deben ser monitoreados continuamente para determinar la profundidad de la

anestesia con pinzas en los dedos de los pies o en la cola durante la duración de la
anestesia y los procedimientos quirúrgicos.
4. Coordenadas quirúrgicas utilizadas para varias ubicaciones en el ratón.

cerebro:
Cerebelo: 2 mm posterior a la sutura lambdoidea, 2 mm lateral a la línea media, 2–3 mm

por debajo de la superficie del cráneo
Cerebro: 2 mm anterior a la sutura lambdoidea, 2 mm lateral a la línea media, 2–3 mm por

debajo de la superficie del cráneo
Cuarto ventrículo: 1,5 mm posterior a la sutura lambdoidea, 0,5 mm lateral a la

línea media, 4 mm por debajo de la superficie del cráneo Tronco encefálico/
Puente: 1,5 mm posterior a la sutura lambdoidea, 0,5 mm lateral a la línea media,

5 mm por debajo de la superficie del cráneo
5. Se sugiere enfáticamente que se establezca una curva de crecimiento tumoral

antes de cualquier experimento terapéutico para cada línea celular separada y
con varios números de células inyectadas. Esto ayudará a determinar el número
de células que se inyectarán para la línea de tiempo del experimento calculada y
la carga tumoral.
Para el experimento detallado en este capítulo, se inyectaron 50 000 células
de meduloblastoma DAOY porque estas células establecen tumores y progresan
extremadamente rápido. Sin embargo, en las líneas celulares que tardan mucho
más en establecer tumores, el número de células será mucho mayor según las
curvas de crecimiento establecidas.
6. Los criterios para el establecimiento del tumor se pueden medir de varias maneras.
Si las células tumorales inyectadas no están marcadas para imágenes de
fluorescencia o luminiscencia (p. ej., luciferasa de luciérnaga), se pueden usar
imágenes de resonancia magnética para monitorear el establecimiento del tumor.
Sin embargo, ya sea que se realicen o no imágenes para observar el
establecimiento del tumor, los ratones deben ser monitoreados para detectar
efectos neurológicos, conductuales y de salud general de la carga tumoral. Se
permite que los tumores crezcan hasta que la carga tumoral sea clínicamente
visible. Luego, los ratones se sacrifican y el cerebro se puede recolectar para
análisis histopatológicos.
7. Use un matraz T25 para un volumen de cultivo de 5 a 10 ml, y para un volumen

entre 10 y 40 ml, use un matraz T75. Para más de 40 ml de volumen de cultivo,
utilice varios matraces. Incube los matraces en posición vertical en la incubadora
de CO2.
8. Expandimos las células NK en presencia de 50 UI/ml de IL2; por lo tanto,

complementamos el medio con 50 UI/ml de IL2 para proporcionar el soporte de
citocinas a las células NK después de la descongelación. Si se usó una cantidad
diferente de IL2 para activar o expandir las células NK antes de congelarlas,
entonces use la misma concentración de IL2 en el medio después de descongelarlo.
9. Siempre tiñe más células de las absolutamente necesarias para la inyección/

experimentos, ya que se espera una pérdida de células durante los pasos de
lavado o debido a la pérdida de viabilidad en el cultivo.
10. Probamos varias densidades de células y concentraciones de reactivos para

optimizar el marcaje con 19F de las células en el mínimo volumen posible (que no
afectó la viabilidad de las células NK ni la eficacia del marcaje). Si se utilizan
células NK primarias o líneas de células NK, recomendamos optimizar el marcaje
con 19F inicialmente con números de células que van desde 1 × 106/ml a 5 × 106/
ml.
11. Para teñir las células NK con el reactivo 19F , normalmente sembramos hasta 1 ml
de células/pocillo de una placa de 24 pocillos; 2 ml de células/pocillo de placa de
12 pocillos; y 3 ml/pocillo de placa de 6 pocillos. Para un volumen superior a 3 ml,
utilice varios pocillos de una placa de 6 pocillos.
12. Realizamos la optimización del etiquetado (a 3 × 106 células/ml) utilizando

19F en concentraciones de 0, 2,5, 5 y 7,5 mg/ml para células NK expandidas
en la plataforma de células alimentadoras K562 Cl9.mbIL21. El marcaje con
19F de estas células se saturó a 5 mg/ml según se analizó mediante RMN,
utilizando este protocolo. Se debe realizar una optimización similar si se
utilizan células NK primarias, células NK activadas y expandidas por otros
métodos o líneas de células NK para estudios de marcaje con 19F .
13. Los anestésicos inhalables como el isoflurano son convenientes porque
permiten el ajuste a distancia, sin tener que interrumpir el protocolo de
imagen ni mover al animal. Desafortunadamente, el isoflurano contiene 19F,
que se concentrará en el tejido para dar una señal competitiva. Los
anestésicos inyectables no agregan una señal de 19F , pero la dosificación
debe administrarse con cuidado para garantizar que el animal esté sedado
el tiempo suficiente para la medición de imágenes.
14. Los sensores pueden incluir fuelles para monitorear la frecuencia respiratoria,
electrocardiograma (ECG) para monitorear la frecuencia cardíaca y/o un
termopar para monitorear la temperatura corporal. Todos estos deben ser
compatibles con MRI. Los sistemas de monitoreo fisiológico para modelos
animales están disponibles comercialmente, como el sistema de monitoreo
y sincronización modelo 1030 de Small Animal Instruments, Inc.
15. La sensibilidad de los escaneos 19F debe mejorarse tanto como sea posible
mediante el uso de bobinas de buena calidad para la excitación y detección
de señales. Existe una amplia gama de posibles configuraciones de bobinas,
incluido el uso de bobinas de gran "volumen" que brindan una sensibilidad
relativamente uniforme, bobinas de "superficie" pequeñas que brindan una
alta sensibilidad en una región pequeña y conjuntos de bobinas de superficie
que brindan una buena sensibilidad. sobre un rango extendido. Las
mediciones multinucleares pueden ser particularmente complejas, ya que se
necesitan bobinas que sean sensibles a las frecuencias de resonancia tanto
de 1H, para referencia anatómica mediante resonancia magnética tradicional,
como de 19F para el seguimiento celular. El enfoque descrito en este trabajo
utiliza bobinas de volumen para ambos objetivos nucleares. Las dos bobinas
de volumen tienen las mismas dimensiones y simplemente se intercambian
para cambiar entre objetivos de imágenes.
16. La señal 19F generalmente no es lo suficientemente fuerte como para permitir
el uso de ajustes automáticos de exploración previa para la calibración de la
potencia de excitación. Las mediciones de calibración se pueden realizar
antes de la obtención de imágenes utilizando un maniquí 19F o, si hay un
estándar de referencia presente durante la medición de imágenes, la señal
puede ser lo suficientemente fuerte para la calibración manual. Para este fin,
se puede utilizar una secuencia de espectroscopia de RM de adquisición de
pulso simple. El tiempo de repetición de la secuencia debe establecerse en
más de varias veces el tiempo de relajación característico de la red de espín
(T1) del agente 19F a la intensidad de campo para el sistema de resonancia
magnética. Entonces, la potencia de excitación para la secuencia de
adquisición de pulso puede establecerse muy baja y luego aumentarse hasta
que la señal observada alcance un máximo, lo que corresponde a una
excitación de 90°. Un enfoque un poco más preciso implicaría varias mediciones
que van desde baja potencia hasta aproximadamente 180 ° de excitación

(cuando la señal desaparece) y ajustando las observaciones a la curva de
respuesta de señal sinusoidal esperada. Es posible que sea necesario
ajustar la calibración si la carga de la bobina cambia sustancialmente entre
las condiciones de medición.
17. Las características de relajación del agente 19F deben medirse antes de la
obtención de imágenes. Los tiempos de relajación spin-lattice (T1) y spin-
spin (T2) variarán con la intensidad del campo del imán de resonancia
magnética. Hay una serie de métodos que se pueden utilizar para realizar
estas mediciones. Utilizamos una secuencia de imágenes de recuperación
de saturación para medir el T1 de CelSense a 7 T, y una secuencia de eco
de espín de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) para medir el T2. Con
T1ÿ550 ms y T2ÿ240 ms, las secuencias eficientes con un tren de eco largo
y tiempos de repetición (TR) relativamente cortos se pueden utilizar para
obtener imágenes con buena sensibilidad.
18. Seleccione la población de células vivas en el gráfico de dispersión frontal y

lateral y visualice esta población en el canal FITC del citómetro de flujo.
El método de fluorescencia es estrictamente una evaluación cualitativa del
marcaje y no reemplaza la estimación cuantitativa del marcaje 19F por
análisis de RMN, que puede proporcionar el número de átomos de flúor
incorporados por célula, que posteriormente podría usarse para calcular el
número de células NK en un ubicación determinada basada en la intensidad
de la señal 19F in vivo.
19. Dado que la mayoría de las instituciones ofrecen RMN como un servicio
principal, para adquirir y analizar el espectro 19F por RMN, recomendamos
a los usuarios consultar sus recursos principales institucionales. El NMR
debe estar equipado con una sonda para observar 19F.
20. El número recomendado de células K562 es para un ensayo completo de
citotoxicidad en placa de 96 pocillos. Dado que se siembran 10 000 células
diana por pocillo, se necesita un mínimo de 1 × 106 células para una placa
completa de 96 pocillos, incluidos +4 para errores de pipeteo; sin embargo,
aquí se recomiendan 2 × 106 células como un exceso doble para acomodar
la pérdida de células durante los pasos de lavado y para acomodar el
pipeteo multicanal de células diana de un recipiente de medios.
21. Tenga en cuenta que las células diana se resuspenden a 1 × 105 células/ml
y las células NK se resuspenden a 1 × 106 células/ml, esta recomendación
es para configurar el ensayo de citotoxicidad en proporciones de efector a
diana (E:T) a partir de a las 10:1. Si se utilizan células NK primarias o líneas
de células NK, la relación E:T se puede cambiar según se desee, lo que
dictará la densidad para resuspender las células NK (p. ej., 2 × 106 células
NK/ml para una relación E:T de 20:1). relación). Para el ensayo
recomendado, se utilizarán 600 000 células NK por condición de
citotoxicidad; por lo tanto, se necesitarán alrededor de 650 000 células NK
por condición para adaptarse a los errores.
22. Después de la dilución en serie, los pozos A6, B6, C6 y A12, B12, C12 tendrán
200 ÿl de células. Deseche 100 l de células de estos pocillos.
23. Se recomienda una fila en blanco entre la prueba y los controles para evitar
derrames accidentales durante la configuración y el sangrado de fluorescencia
durante la lectura de la placa.
24. Un etiquetado 19F bien optimizado de las células NK debe tener suficientes
átomos de flúor para proporcionar una señal fuerte en la IRM para obtener
imágenes in vivo de las células NK, con un impacto mínimo en la función
citolítica de las células NK.
Este trabajo fue financiado en parte por la financiación de Addis Faith Foundation a
VG, la financiación de CURE Childhood Cancer a DAL y por la subvención principal
del MD Anderson Cancer Center (P30-CA016672).
Referencias
1. Somanchi SS, Senyukov VV, Denman CJ et al (2011) 8. Olson JA, Zeiser R, Beilhack A y otros (2009)
Expansión, purificación y evaluación funcional de células Homing específico de tejido y expansión de células NK de
NK de sangre periférica humana. J Vis Exp 48, e2540. donante en trasplante alogénico de médula ósea. J Immunol
doi:10.3791/2540 2. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi 183:3219–3228 9. Meller B, Frohn C, Brand JM et al (2004)
SS et al (2012) La IL-21 unida a la membrana promueve la
proliferación ex vivo sostenida de células asesinas naturales Seguimiento de un nuevo enfoque de inmunoterapia con
humanas. PLoS One 7, e30264 3. Edinger M, Cao YA, células NK alogénicas marcadas con (111) In en pacientes
Verneris MR et al (2003) con carcinoma de células renales. Eur J Nucl Med Mol
Imaging 31:403–407 10. Matera L, Galetto A, Bello M et al
Revelando el crecimiento del linfoma y la eficacia de las (2006) Migración in vivo de células asesinas naturales autólogas
terapias con células inmunitarias utilizando imágenes de marcadas a metástasis hepáticas en pacientes con
bioluminiscencia in vivo. Blood 101:640–648 4. Tavri S, carcinoma de colon. J Transl Med 4:49 11. Wagstaff J,
Jha P, Meier R et al (2009) Imágenes ópticas de inmunoterapia Gibson C, Thatcher N et al (1982)
celular contra el cáncer de próstata. Mol Imaging 8:15–26
5. Leung K (2009) Células zeta NK-92-scFv(MOC31) Un método para estudiar la dinámica de la migración
dirigidas anti-EpCAM marcadas con DiD. primaria de linfocitos humanos utilizando el marcaje de
células con oxina de indio-iii. Avanzado Exp Med Biol 149:
153–160
28 de agosto de 2009 [Actualizado el 30 de septiembre de
2009]. En: Base de datos de imágenes moleculares y 12. Meier R, Piert M, Piontek G y otros (2008)
agentes de contraste (MICAD) [Internet]. Centro Nacional Seguimiento de células asesinas naturales marcadas con
de Información Biotecnológica (EE. UU.), Bethesda; 2004– [18F]FDG hasta tumores positivos para HER2/neu. Nucl
2013. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23559/ 6. Lim Med Biol 35:579–588
YT, Cho MY, Noh YW et al (2009) Nanocristales 13. Melder RJ, Elmaleh D, Brownell AL et al (1994) Un método
fluorescentes emisores de infrarrojo cercano etiquetados como para marcar células para estudios de tomografía por
células asesinas naturales como tecnología de plataforma emisión de positrones (PET). J Immunol Methods 175:79–
para la obtención de imágenes ópticas de la terapia 87 14. Dotti G, Tian M, Savoldo B et al (2009)
inmunoterapéutica del cáncer basada en células.
Nanotecnología 20:475102 Monitoreo no invasivo repetitivo de células T que expresan
HSV1-tk infundidas por vía intravenosa en primates no
7. Youniss FM, Sundaresan G, Graham LJ et al (2014) humanos mediante tomografía por emisión de positrones y
Imágenes de infrarrojo cercano de la terapia de células tomografía computarizada con 18F-FEAU. Mol Imaging
inmunitarias adoptivas en el modelo de cáncer de mama 8:230–237
mediante el etiquetado de la membrana celular. PLoS One 9, e109162
15. Sheu AY, Zhang Z, Omary RA y otros (2013) 24. Srinivas M, Heerschap A, Ahrens ET et al (2010) (19)F
Entrega intraarterial transcatéter monitoreada por MRI para seguimiento celular cuantitativo in vivo.
resonancia magnética de células asesinas naturales Trends Biotechnol 28:363–370 25. Helfer BM,
marcadas con SPIO al carcinoma hepatocelular: Balducci A, Nelson AD et al (2010) Evaluación funcional
estudios preclínicos en un modelo de roedor. Invest
de las células dendríticas humanas etiquetadas para
Radiol 48: 492–499
el rastreo de células con imágenes de resonancia
16. Mallett CL, McFadden C, Chen Y y otros (2012) magnética in vivo (19)F. Citoterapia 12:238–250
Migración de células asesinas naturales KHYG-1
marcadas con hierro a tumores subcutáneos en
26. Srinivas M, Morel PA, Ernst LA y otros (2007)
ratones atímicos, detectada por resonancia magnética. IRM con flúor-19 para la visualización y cuantificación
Cytotherapy 14:743–751 17. Daldrup-Link HE, Meier de la migración celular en un modelo de diabetes.
R, Rudelius M et al (2005) Seguimiento in vivo de células Magn Reson Med 58:725–734 27.
asesinas naturales dirigidas anti-HER2/neu Kadayakkara DK, Beatty PL, Turner MS et al (2010) La
modificadas genéticamente para tumores mamarios inflamación impulsada por la sobreexpresión de la
positivos para HER2/neu con resonancia magnética mucina anormal hipoglucosilada 1 (MUC1) vincula la
formación de imágenes Eur Radiol 15:4–13 18. Meier enfermedad inflamatoria intestinal y la pancreatitis.
R, Golovko D, Tavri S et al (2011)
Pancreas 39:510–515 28. Janjic JM, Srinivas M,
Kadayakkara DK et al (2008) Nanoemulsiones
Representación de la inmunoterapia adoptiva para autoadministrables para resonancia magnética dual
el cáncer de próstata en un modelo animal con con flúor-19 y detección de fluorescencia.
imágenes de resonancia magnética. Magn Reson J Am Chem Soc 130:2832–2841 29.
Med 65: 756–763
Aoki Y, Hashizume R, Ozawa T et al (2012)
19. Holland GN, Bottomley PA, Hinshaw WS (1977) Un modelo de ratón con xenoinjerto experimental de
Imágenes por resonancia magnética 19F. glioma pontino difuso diseñado para pruebas
J Magn Reson 28:133–136 20. terapéuticas. J Neurooncol 108:29–35 30. Brockmann
Partlow KC, Chen J, Brant JA et al (2007) Imágenes de MA, Westphal M, Lamszus K (2003) Método mejorado
resonancia magnética 19F para el seguimiento de para el injerto intracerebral de células tumorales y
células madre/progenitoras con múltiples nanobalizas tratamiento intratumoral utilizando un sistema de
de perfluorocarbono únicas. FASEB J 21:1647–1654 tornillo guía en ratones.
21. Boehm-Sturm P, Mengler L, Wecker S et al (2011) Acta Neurochir (Wien) 145:777–781 31.
Seguimiento in vivo de células madre neurales Lal S, Lacroix M, Tofilon P et al (2000) Un sistema de
humanas con imágenes de resonancia magnética 19F. tornillo guía implantable para estudios de tumores
PLoS One 6, e29040 cerebrales en animales pequeños. J Neurocirugía
22. Ahrens ET, Flores R, Xu H et al (2005) Plataforma de 92:326–333
imágenes in vivo para el seguimiento de células 32. Donoghue JF, Bogler O, Johns TG (2011) Un método
inmunoterapéuticas. Nat Biotechnol 23:983–987 23. de tornillo guía simple para estudios de xenoinjertos
Bulte JW (2005) La resonancia magnética de punto intracraneales en ratones. J Vis Exp 55, e3157.
caliente emerge del fondo. Nat Biotechnol 23:945–946 doi:10.3791/3157
capitulo 28
Generación de BiKEs y TriKEs para Mejorar

Orientación de células tumorales mediada por células NK
Martín Felices , Todd R. Lenvik, Zachary B. Davis, Jeffrey S. Miller

,
y Daniel A. Vallera
Resumen
Las inmunoterapias contra el cáncer han cobrado un impulso significativo durante la última década, particularmente con la
llegada de los inhibidores de puntos de control y las células T con CAR. Si bien la última inmunoterapia dirigida personalizada ha
revolucionado el campo, sigue existiendo la necesidad de terapias listas para usar. La capacidad de las células NK para lisar
rápidamente tumores recubiertos de anticuerpos y secretar potentes citocinas sin cebado previo ha convertido a las células NK
en candidatas ideales para la inmunoterapia específica de antígeno. Las células NK se han dirigido a los tumores a través de
dos estrategias principales: anticuerpos monoespecíficos y anticuerpos bi/triespecíficos. Los anticuerpos monoespecíficos
impulsan la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos de células NK (ADCC) de las células tumorales. Los
anticuerpos bi/triespecíficos impulsan la lisis redirigida de las células tumorales mediante la unión de un antígeno tumoral y la
unión directa y el entrecruzamiento del receptor CD16 en las células NK, evitando así la necesidad de unión de la porción Fc de
los anticuerpos monoespecíficos. . Este capítulo se centra en la generación de agentes asesinos biespecíficos y triespecíficos
(BiKE y TriKE) destinados a dirigir las células NK hacia los tumores. BiKEs y TriKEs son moléculas más pequeñas compuestas
de 2 o 3 porciones variables de anticuerpos con diferentes especificaciones, y representan una estrategia novedosa y más
versátil en comparación con las plataformas tradicionales de anticuerpos biespecíficos y triespecíficos.
Palabras clave BICICLETA, Triciclo , Biespecífico , Triespecífico , Inmunoterapia dirigida , NK , Asesino natural,
ADCC , Lisis redirigida
1. Información general
Las inmunoterapias dirigidas contra el cáncer son actualmente un tema de

gran interés clínico y potencial [ 1]. Si bien recientemente se ha puesto
mucho interés en la generación de células T que expresan receptores de
antígenos quiméricos (CAR) a partir de anticuerpos monoclonales que se
ha demostrado que se dirigen a tumores malignos humanos [ 2], e incluso
más recientemente en la generación de células asesinas naturales (NK) que
expresan CAR [ 3, 4], estos enfoques requieren un enfoque personalizado
que es costoso, requiere mucho tiempo y es difícil de aplicar a gran escala. hay un claro
El autor contribuyó igualmente con todos los demás contribuyentes.
333
334 Martín Felices et al.
a b Asesinato mediado por bicicletas y trikes
VH
VL
Enlazador
CD16xCD19
Bicicleta CD19+
CD22+
Tumor de células B
Anticuerpo anti-CD16 Tumor de células B
VH
VL Redirigido
lisis Célula NK
Enlazador
CD16xCD19xCD22 CD19+
Enlazador CD16
Triciclo Tumor de células B
Anticuerpo anti-CD19
VH
VL CD19+/CD22+
Tumor de células B
Anticuerpo anti-CD22
Fig. 1 Estructura y función de BiKEs y TriKEs. ( a ) BiKEs y TriKEs se construyen a partir de una sola cadena pesada (V H ) y
y V mediante
ligera (V L ) de la región variable de cada anticuerpo de interés. Los dominios V seHunen L corto yun
flexible
conector
parapolipeptídico
evitar la
disociación. Aquí se muestra un BiKE construido a partir de las regiones variables de anti-CD16 y anti-CD19 y un TriKE
construido a partir de las regiones variables de anti-CD16, anti-CD19 y anti CD22. ( b ) La unión de BiKE y TriKE a las células
NK y sus dianas da como resultado la formación de una sinapsis inmunológica y desencadena la destrucción por NK de la
célula diana a través de la activación del receptor Fc de baja afinidad, CD16, en las células NK. El CD16 × CD19 × CD22 TriKE
puede reconocer objetivos que expresan CD19 (receptores verdes), CD22 (receptores rojos) o ambos receptores
simultáneamente, lo que permite un reconocimiento de objetivos más versátil que el CD16 × CD19 BiKE.
necesidad de terapias comerciales específicas que aumenten el enfoque

actual de anticuerpos monoclonales. Este capítulo se centra en la generación
de activadores biespecíficos y triespecíficos (BiKE y TriKE) destinados a
dirigir las células NK a la sinapsis del tumor e inducir su activación en ese
sitio (Fig. 1). A diferencia de los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos de
longitud completa, los BiKE y TriKE son moléculas pequeñas que contienen
dos (BiKE) o tres (TriKE) fragmentos variables de cadena única (scFv) de
anticuerpos de diferente especificidad.
1.1 Mediación de la Las células NK son candidatas ideales para las terapias dirigidas a las
función de las células células inmunitarias porque no requieren una sensibilización previa para lisar
NK a través de CD16 y ADCC los objetivos tumorales y liberar citocinas proinflamatorias, no están
restringidas por HLA y pueden mediar en la relación injerto contra leucemia
(o tumor) sin inducir la enfermedad de injerto contra huésped [ 5, 6]. Aunque
las células NK poseen una variedad de receptores activadores y pueden mediar
Dirigir las células NK a los tumores 335
funcionan de varias maneras diferentes, su papel en la citotoxicidad mediada por

células dependiente de anticuerpos (ADCC) es de particular relevancia en este
capítulo. La ADCC está mediada por CD16 (FcÿRIII), el receptor de baja afinidad por
IgG Fc [ 7]. Existen dos isoformas de CD16 en humanos, CD16A y CD16B [ 8].
CD16A se expresa en células NK, macrófagos y trofoblastos placentarios como una
proteína transmembrana anclada a polipéptidos, mientras que CD16B se expresa en
neutrófilos en forma anclada a GPI [ 9 - 12]. Aunque la porción extracelular de CD16A
y CD16B comparte un alto nivel de homología (95–97 %), CD16A puede desencadenar
la muerte de objetivos tumorales y la producción de citoquinas, mientras que CD16B
no puede [ 9 En las células NK humanas, CD16 se expresa principalmente en el
,
subconjunto CD56dim, aunque se han observado13-15 ]._
poblaciones de células NK
CD56bright CD16+ después del trasplante [ 16, 17]. La participación de CD16 a
través del encuentro con la porción Fc de los anticuerpos o la reticulación directa por
el anticuerpo anti-CD16 da como resultado señales a través del motivo de activación
basado en tirosina del inmunorreceptor (ITAM) de las subunidades de la cadena
FcÿRIÿ y CD3ÿ asociadas, lo que lleva a respuestas de citoquinas y citotóxicas [ 18 ].
– 20]. A diferencia de otros receptores activadores presentes en las células NK
humanas, el CD16 puede mediar de forma sólida en la activación sin necesidad de la
participación conjunta de otros receptores [ 21]. Estas propiedades de señalización
permiten la orientación mediada por NK CD16 de células recubiertas de anticuerpos
en entornos naturales de infección viral, autoinmunidad y la aparición de algunas
formas de tumores [ 22 - 24]. Este último se ha aprovechado en la clínica mediante la
generación de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a antígenos tumorales
específicos para impulsar la ADCC contra esos tumores [ 25 - 29 ].
1.2 Potencial Conducir ADCC a través de mAbs ha resultado en un éxito clínico significativo. La
Ventajas de BiKEs y orientación específica de tumores con BiKE y TriKE tiene el potencial de aprovechar
TriKEs sobre este éxito y mejorar la eficacia.
Convencional La afinidad de unión parece ser un componente importante de la ADCC. Esta
anticuerpos impresión está respaldada por el aumento de la citotoxicidad impulsada por rituximab
de los tumores de células B mediados por células NK que contienen los alotipos
CD16A-158VV o VF que, en comparación con el alotipo CD16A-158FF, muestran una
menor afinidad por las porciones Fc de los anticuerpos [ 30]. Por lo tanto, BiKEs y
TriKEs podrían mejorar la función de las células NK al generar una interacción más
fuerte a través de la unión con anti-CD16 que la producida por la unión de CD16 a la
porción Fc natural de los anticuerpos. Este aumento en la afinidad y la citotoxicidad
se demostró en un estudio que comparó la unión natural de CD16 a la porción Fc de
un anticuerpo anti-HER2 frente a la unión de CD16 a través de un anticuerpo
biespecífico anti-HER2 x anti-CD16. Los datos mostraron un aumento de 3,4 veces en
la afinidad del anticuerpo biespecífico frente a la unión del Fc anti-HER2 nativo [ 31].
La eficacia de los mAbs terapéuticos in vivo, en contraste con su alta eficacia de
ADCC in vitro, se atenúa aún más por la presencia de niveles fisiológicos de IgG en
suero en plasma. En el entorno in vivo, la potencia de ADCC disminuye por la
saturación de los receptores CD16,
compitiendo así por la unión con el mAb terapéutico [ 32]. Tal competencia
por la unión de la porción Fc de los anticuerpos terapéuticos requiere
que se mantengan niveles séricos altos del mAb durante varios meses
de tratamiento para lograr la eficacia in vivo [ 33 , 34]. BiKEs y TriKEs ,
evitan este obstáculo al unirse directamente al receptor CD16. Un
beneficio adicional que BiKEs y TriKEs pueden tener sobre mAb es una
biodistribución superior como consecuencia de su tamaño más pequeño,
particularmente en el tratamiento de tumores sólidos [ 35 - 37]. Además
de estas ventajas, los BiKE y los TriKE no son inmunogénicos, tienen
propiedades de eliminación rápida y pueden diseñarse rápidamente para
atacar antígenos tumorales conocidos. Estos atributos los convierten en
una plataforma farmacéutica ideal para inmunoterapias basadas en
células NK potenciadas.
1.3 Bi y Durante las últimas dos décadas, se han utilizado anticuerpos

Reactivos triespecíficos multivalentes y, más recientemente, BiKE y TriKE para atacar antígenos
Apuntar a las células NK y tumorales y CD16 en células NK [ 38]. Si bien los enfoques para el
tumores ensamblaje de anticuerpos multivalentes y la metodología actual para la
ingeniería de BiKE y TriKE han evolucionado, la función de estos
reactivos permanece sin cambios. Se han generado reactivos
biespecíficos y triespecíficos para acoplar CD16 en la célula NK y los
siguientes antígenos tumorales: CD20 y CD19 en linfomas no Hodgkin
de células B [ 39–47 ], CD19 y CD33 en leucemia de linaje mixto [ 48],
CD33 o CD33 y CD123 en leucemia mielógena aguda (LMA) [ 49 – 51],
HLA Clase II en linfoma [ 52], CD30 en enfermedad de Hodgkin [ 53–
62], EGF-R en tumores EGF-R+ [ 63, 64], HER2/neu en el cáncer de
mama metastático y otros tumores que expresan HER2 [ 31, 65 - 71], y
MOV19 en el cáncer de ovario [ 72]. Nuestro grupo ha contribuido al
campo a través de la generación y prueba de BiKE y TriKE que se
dirigen a CD16 y CD19/CD22 en linfomas no Hodgkin de células B [ 73],
CD33 en AML [ 74] y MDS/MDSC [ 75], y EpCAM en carcinomas de
próstata, mama, colon, cabeza y cuello [ 76].
La activación a través de BiKEs y TriKEs provocó una potente
citotoxicidad y secreción de citoquinas. En el caso del CD16 × CD19 ×
CD22 TriKE, la respuesta de CD107a a la LLC y la LLA primaria superó
la del rituximab. El CD16 × CD33 BiKE fue capaz de superar la inhibición
mediada por HLA con blastos de AML refractarios primarios y restaurar
la función de las células NK de pacientes con SMD. Alentados por su
potencial traslacional, actualmente estamos produciendo algunas
versiones de estos reactivos para uso clínico. Los métodos básicos de
producción de reactivos se describen en la siguiente sección.
2. Metodología
2.1 Selección de El diseño de BiKE es un proceso complejo. Esta sección proporciona

Fragmento variable una visión general de toda la metodología (resumida en la Fig. 2). Una
Fuente y enlazadores vez que se ha definido un objetivo de interés, el primer paso en el diseño
de BiKEs requiere la selección de una fuente para los fragmentos variables.
Diseño y Ingeniería de plásmidos de expresión

Construcción BiKE y TriKE
Procariotas, Mamífero transitorio, por

por ejemplo, vectores pET ejemplo, pcDNA3.1 o pTT5
montaje Gibson o montaje Gibson o

Clonación de RE Clonación de RE
E.Coli: Rosetta
Células CHO: FDA
Células de suspensión:
preferida pero menor
Sistemas de expresión 2(DE3) células competentes HEK293 estilo libre o
eficiencia de
HEK293-6E
transfección
Aislamiento de
Exportado a medios como BiKE o
cuerpos de inclusión
TriKE funcional
y replegamiento de proteínas
Aislamiento y
Purificación
Cromatografía de afinidad: p. ej.,

Cromatografía de
marcador de histidina con IMAC
exclusión por tamaño
Pruebas
Ensayo de citotoxicidad Ensayo de especificidad de

por liberación de cromo unión basado en citometría de flujo
Fig. 2 Flujo de trabajo para la generación de BiKEs y TriKEs. A la izquierda (verde) están los cuatro pasos necesarios para
la generación y validación de las construcciones BiKE/TriKE. A la derecha (amarillo) están las opciones posibles para cada
uno de los pasos. CHO: células de ovario de hámster chino. IMAC: cromatografía de afinidad con metales inmovilizados.
ES: enzima de restricción
Las secuencias para fragmentos relevantes se pueden obtener a partir de trabajos

publicados, hibridomas, células B de animales inmunizados, presentación en
fagos y otras tecnologías de presentación similares. Para los sistemas de
expresión bacterianos, la presentación en fagos es ideal porque las construcciones
se seleccionan en bacterias, esencialmente evaluando previamente su función en
el sistema de expresión. El siguiente paso implica la selección de un enlazador adecuado.
Los BiKE combinan dos sitios de unión a antígeno diferentes con un conector fl
exible corto. Los dominios de unión a antígeno son fragmentos variables de
cadena única (scFv), que consisten en variables pesadas y ligeras -enlazador-V
también fusionados con un enlazador fl exible ( el diseñoL)del
[ 35].
enlazador
Los dominios,
principal
VH es importante para la función de BiKE, ya que permite la separación de los
dominios funcionales y proporciona fl exibilidad para unir los dos (o tres en el caso
de TriKE). ) epítopos en las diferentes células diana [ 77]. El enlazador (SGGG)4
es uno de los primeros enlazadores flexibles utilizados en la construcción de
fragmentos variables de cadena única (scFv) [ 78]. Otro enlazador de uso común,
el 218s (GSTSGSGKPGSGEGSTKG), mejora la estabilidad proteolítica y reduce
la agregación [ 79].Para reducir la inmunogenicidad, nuestro grupo utilizó un
enlazador HMA (PSGQAGAAASESLFVSNHAY) entre el antiCD16 y el antígeno
tumoral scFv [ 76 ].
2.2 Selección de Una vez que se han determinado los componentes de BiKE, sigue la selección de
Vector y Sistema de un vector apropiado para la expresión. Nosotros y otros investigadores nos
Expresión centramos en los sistemas de expresión de plásmidos en bacterias y células de
mamíferos para crear BiKE, pero existen otros sistemas de expresión menos
utilizados, como los lentivirus o la bella durmiente, que no se analizarán en esta
sección. Para los sistemas de expresión bacterianos, el vector pET es el sistema
más utilizado junto con las células huésped Rosetta 2 (DE3) (Novagen). Las
células Rosetta 2(DE3) contienen una polimerasa de ARN T7 inducible por IPTG,
que es compatible con los vectores pET. Otra característica de esta cepa es que
ha sido diseñada para expresar un conjunto "universal" de ARN de transferencia
como una forma de mitigar la necesidad de optimización de codones. Para los
sistemas de expresión transitoria en mamíferos, el vector pTT5 se puede utilizar
junto con las células en suspensión HEK293-E6 o el sistema pcDNA3.1 se puede
utilizar con las células HEK293 Freestyle (Invitrogen). Los rendimientos informados
han sido mayores en el sistema HEK293-E6 [ 80]. Estas células expresan una
variante truncada del virus de Epstein Barr (EBV) para el cual el vector pTT5
contiene el oriP corto de EBV para la replicación episomal. Estos dos sistemas
muestran ventajas en rendimiento y facilidad de uso, pero también se pueden
aplicar otros sistemas que utilizan diferentes vectores [ 80, 81].
2.3 Clonación de los Tras la selección de un vector, uno puede comenzar a clonar los componentes
componentes BiKE/ de BiKE en la columna vertebral del vector. Se han hecho avances significativos
en la técnica de recombinación. Si bien hay varias formas de clonar fragmentos
TriKE en el vector de expresión
de ADN en la columna vertebral del vector, nosotros y otros
prefieren el montaje de Gibson porque es rentable y eficiente en tiempo [ 82 ].

El ensamblaje de Gibson utiliza la recombinación homóloga in vitro a través
de la inserción de un fragmento de ADN en un vector, donde la inserción está
dirigida por regiones homólogas que están presentes al final del inserto de
ADN y el vector de ADN linealizado [ 83]. Una ventaja del ensamblaje de
Gibson sobre la clonación de restricción estándar es que requiere poca o
ninguna utilización de enzimas de restricción y se pueden clonar múltiples
piezas en una sola reacción. Con la llegada de este método, junto con el
acceso reciente a ADN sintético de alta fidelidad económico, ahora es posible
construir plásmidos de expresión de BiKE en unos pocos días de trabajo.
2.4 Expresión y Después de la preparación, el vector de expresión de BiKE se puede transducir

Aislamiento de las BiKEs/ químicamente en E. coli o transfectar en células de mamífero a través de
triciclos medios químicos o de lípidos y, en menor medida, a través de electroporación.
La ventaja de E. coli frente al sistema de
mamíferos es que permite una expresión rápida, fácil, robusta y económica
de las BiKE [ 84]. Una diferencia importante entre los sistemas bacteriano y
de mamífero es que en el sistema de mamífero se secretan proteínas
completamente funcionales y se pueden recolectar del sobrenadante. Una
desventaja de las bacterias es que la mayoría de las proteínas recombinantes
se encuentran en una forma insoluble, denominada cuerpo de inclusión [ 85].
Para resolver este problema, se requiere la lisis de las bacterias y el aislamiento
de los cuerpos de inclusión mediante centrifugación seguida de solubilización
con reactivos desnaturalizantes fuertes.
A continuación, la proteína debe replegarse. El replegamiento se lleva a cabo
a bajas concentraciones de proteína. Deben optimizarse las condiciones para
el replegamiento de la proteína recombinante (es decir, pH, fuerza iónica,
temperatura y entorno redox). A continuación, la proteína se puede aislar
mediante cromatografía de exclusión por tamaño o mediante el uso de una
etiqueta de afinidad, como etiquetas de histidina [ 85, 86]. Como se discutió,
ambos sistemas tienen ventajas y desventajas. Mientras que el sistema
bacteriano es rápido, fácil y robusto, el sistema de los mamíferos no requiere
replegamiento y se puede utilizar para generar cantidades más pequeñas de
proteína funcional rápidamente para la selección inicial. Otra consideración
que posiblemente favorece el enfoque de los mamíferos es que la mayoría de
las proteínas recombinantes terapéuticas que obtienen la aprobación de la
FDA se fabrican en células de ovario de hámster chino (CHO) [ 87 ].
2.5 Probando las BiKEs y La citometría de flujo se usa para evaluar la unión de las construcciones a sus
TriKEs respectivos objetivos. Antes de la incorporación a las construcciones
biespecíficas o triespecíficas completas que contienen la porción variable anti-
CD16 y el enlazador/es, las porciones variables individuales que contienen
una etiqueta His o una etiqueta pequeña similar se incuban con células que
expresan el antígeno de interés o células que expresan un antígeno irrelevante,
para evaluar la unión no específi ca. A continuación, se utiliza un anticuerpo
anti-His biotinilado para reconocer la etiqueta de His en la porción variable,
seguido de la adición de estreptavidina marcada con fluorescencia para lograr la fluorescenc
conjugación. Para garantizar que el fragmento variable se une al antígeno

deseado, la unión se compara con anticuerpos comerciales marcados con
fluorescencia contra el antígeno de elección. Alternativamente, la porción
variable se puede biotinilar o marcar directamente con fluorescencia. Sin
embargo, este enfoque puede aumentar el riesgo de alterar la unión al
antígeno. Si la construcción variable se diseña a partir de un anticuerpo
conocido para el que ya existen formas marcadas con fluorescencia, la
construcción se puede analizar en un ensayo de competición. En dichos
ensayos, se unen concentraciones crecientes de construcción a las células
que expresan el antígeno específico antes de la adición del anticuerpo
marcado con fluorescencia conocido. A continuación, la unión específica se
mide por una disminución en la unión de la forma de anticuerpo completa
marcada con fluorescencia, lo que indica la unión del fragmento variable al antígeno.
Una vez que se ha confirmado la unión específica, la parte variable se
incorpora a una construcción BiKE o TriKE completa y la actividad funcional
de la construcción se evalúa mediante dos métodos diferentes. En primer
lugar, se evalúa la capacidad de las células NK para desgranular en respuesta
a dianas recubiertas en la construcción mediante un ensayo de lisis redirigido.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o las células NK
purificadas se cocultivan con dianas en un rango de proporciones efector a
diana (E:T) (1:1 a 20:1) en presencia o ausencia de una concentración de
saturación de la BiKE/TriKE de interés. Se requieren proporciones más altas
para las PMBC en comparación con las células NK purificadas. Los efectores,
objetivos y construcciones se incuban juntos durante varias horas
(generalmente 4) y luego se evalúan LAMP-1 (CD107a) de superficie, que
se usa para evaluar la desgranulación, y se evalúan el IFN-ÿ y el TNF-ÿ
intracelulares, que se usan para evaluar la secreción de citoquinas. en las
controlcélulas
negativo
NKenporeste
citoma
ensayo,
de flujo
etrySe
. mientras
utilizan dianas
que losirrelevantes
anticuerposcomo
completos
que dirigen la ADCC hacia el antígeno elegido se utilizan como control
positivo/comparativo.
Si bien este ensayo determina el nivel al que se activan las células NK,
no refleja el nivel de destrucción de células diana en respuesta a la activación
de las células NK. Para evaluar la destrucción
. ensayo de células
de citotoxicidad, comodiana, se realiza
un ensayo de un
liberación de cromo. . En este ensayo, las células diana se marcan con
cromo-51 radiactivo ( 51Cr) antes del cocultivo con PBMC o células NK
purificadas y BiKE/TriKE. Las relaciones E:T en este ensayo oscilan entre
20:1 y 0,625:1. Los pocillos que contienen dianas sin células NK se colocan
en placas para su uso como grupos de liberación máxima (10 % de lisis
mediada por SDS) y mínima (sin tratamiento). Estos grupos se utilizan para
el cálculo del porcentaje de objetivos asesinados. Durante la incubación, a
medida que las células diana mueren, liberan 51Cr en el sobrenadante,
mientras que las dianas que permanecen vivas mantienen el 51Cr secuestrado
dentro de la célula. Luego se evalúa la liberación de 51Cr en un contador
gamma y se calcula el porcentaje de objetivos muertos.
También se incluyen controles similares a los mencionados en el ensayo
basado en flujo. Una vez que se ha determinado la especificidad y la eficacia
de los BiKE/TriKE, las construcciones ahora se pueden probar con muestras
clínicas y/o en ensayos de destrucción in vivo más complejos utilizando
ratones NSG, tumores xenogénicos injertados y células NK humanas transferidas.
3 direcciones futuras
Aunque las construcciones actuales de BiKE y TriKE muestran un gran

potencial de traducción, actualmente se están realizando esfuerzos para
mejorar aún más su eficacia. Un obstáculo que podría limitar la eficacia de
BiKEs y TriKEs, así como todas las demás terapias con anticuerpos
mediadas por células NK, es la expresión de CD16. La ADCC mediada por
células NK por anticuerpos terapéuticos depende de la ligadura de CD16,
en la célula NK, con la porción Fc del anticuerpo [ 88]. BiKEs y TriKEs, así
como otros formatos de anticuerpos biespecíficos y triespecíficos, median la
lisis redirigida del objetivo y la función de las células NK a través de la unión
directa y el entrecruzamiento del receptor CD16. Esto tiene relevancia
porque el CD16 se recorta rápidamente de la superficie de las células NK
activadas a través de CD16 por metaloproteinasas de matriz (MMP), en
particular ADAM-17 [ 89 - 92]. La activación a través de citoquinas también
puede resultar en el recorte de CD16 [ 93]. La pérdida de expresión de CD16
en la superficie de NK activada probablemente da como resultado una
capacidad disminuida para mediar rondas posteriores de ADCC. Para
abordar esta preocupación, nosotros y otros estamos evaluando inhibidores
específicos de MMP como un medio para prevenir el recorte de CD16 ,
durante la activación de las células NK [ 94 95 ]. Hemos demostrado que la
inhibición de ADAM-17 da como resultado una función superior después del
entrecruzamiento de CD16 y puede potenciar las respuestas mediadas por
rituximab in vitro. También hemos demostrado que la inhibición de ADAM-17
puede mejorar la destrucción mediada por BiKE contra objetivos mieloides
in vitro [ 74]. Estos resultados indican que el tratamiento conjunto con el
inhibidor de ADAM-17 puede ser una buena estrategia para mejorar la función BiKE/TriKE
Un enfoque diferente para eludir el problema de CD16 es apuntar a
otros receptores en las células NK con BiKE y TriKE.
CD16 se seleccionó originalmente debido a su capacidad para activar de
forma potente las células NK y superar la señalización inhibidora [ 21]. Esto
se destacó en el sistema BiKE que muestra que CD16 × CD33 BiKE podría
superar la inhibición mediada por HLA en los blastos primarios de AML y
podría restaurar la función de las células NK de los pacientes con SMD,
cuya citotoxicidad natural se cree que está alterada [ 74, 75 ].
Sin embargo, se ha demostrado que la participación conjunta de otros
receptores, particularmente NKG2D y 2B4, induce una activación similar a
la proporcionada por CD16 solo [ 21]. También existe la posibilidad de que
los TriKE se involucren con CD16, un antígeno tumoral y otro receptor
activador o coestimulador de células NK. Por ejemplo, se demostró que el
compromiso conjunto de CD16 con DNAM-1, CD2 o 2B4 potencia la función
en las células NK de pacientes con SMD [ 75]. La coadministración de
citocinas también puede mejorar la función de las células NK mediada por
BiKE. Varias citocinas, incluidas IL-15, IL-2, IL-21 e IL-12, tienen funciones
destacadas en el desarrollo, la proliferación, la supervivencia y/o la activación
de las células NK. Alentadosen
para implementarlos porlaestos atributos,
clínica se están
[ 96]. Además de realizando ensayos
lo mencionado
atributos, se ha demostrado que algunas de estas citocinas también

potencian la ADCC, lo que las convierte en un enfoque coterapéutico interesante.
Si bien las terapias personalizadas con células CAR-T han disfrutado
recientemente de un gran éxito clínico [ 2 ], sigue existiendo una clara
necesidad de reactivos listos para usar que mejoren la orientación del
sistema inmunitario a los antígenos tumorales. Dirigir el objetivo de las
células NK es un enfoque terapéutico convincente sobre la base de su
capacidad para matar rápidamente los tumores y secretar citocinas sin
cebado previo [ 5]. BiKEs y TriKEs son un conducto importante para lograr
esto, ya que son relativamente fáciles de producir, impulsan la activación
potente de las células NK a través del entrecruzamiento de CD16 y se
pueden utilizar para atacar casi cualquier antígeno tumoral para el que se
haya diseñado un anticuerpo. Esto es cierto independientemente de si el
anticuerpo muestra propiedades de activación porque la activación se
realiza a través del CD16 scFv. Hasta la fecha, nuestro grupo se ha
centrado principalmente en el linfoma no Hodgkin (a través de CD19 y
CD22), AML y SMD (a través de CD33) y carcinomas de mama, colon y
pulmón (a través de EpCAM) [ 73 - 76]. En particular, hay una gran cantidad
de antígenos tumorales prometedores para los que se han diseñado
anticuerpos terapéuticos que podrían incorporarse en las plataformas BiKE
y TriKE [ 37]. Estos incluyen CD30 (linfoma de Hodgkin), CD52 (LLC), CEA
(mama, colon y pulmón), gpA33 (colorrectal), CAIX (células renales), Mucins
(mama, colon, pulmón y ovario), PSMA (próstata) , VEGFR (tumores sólidos
derivados del epitelio), VEGF e integrinas ÿVÿ3 y ÿ5ÿ1 (vasculatura tumoral),
EGFR (mama, pulmón, colon, glioma y cabeza y cuello) y ERBB2 y ERBB3
(mama, pulmón, colon, ovario y próstata). Esta lista, de ninguna manera
exhaustiva, enumera varios tumores sólidos y hematológicos importantes
que podrían ser atacados a través de la poderosa plataforma BiKE.
Referencias
1. Masters GA, Krilov L, Bailey HH y otros (2015) 6. Velardi A (2012) Aloreactividad de células asesinas
Clinical cancer advances 2015: Informe anual sobre naturales 10 años después. Curr Opin Hematol 19:
el progreso contra el cáncer de la Sociedad 421–426
Estadounidense de Oncología Clínica. J. Clin Oncol 7. Anegon I, Cuturi MC, Trinchieri G et al (1988) La
33:786–809
interacción de los ligandos del receptor Fc (CD16)
2. Caruana I, Diaconu I, Dotti G (2014) De anticuerpos induce la transcripción del receptor de interleucina 2
monoclonales a receptores de antígenos quiméricos (CD25) y los genes de linfocina y la expresión de sus
para el tratamiento de malignidades humanas. Semin productos en células asesinas naturales humanas. J
Oncol 41: 661–666 Exp Med 167:452–472 8. Ravetch JV, Bolland S
3. Hermanson DL, Kaufman DS (2015) Utilización de (2001) Receptores IgG Fc. Annu Rev Immunol 19:275–
receptores de antígenos quiméricos para dirigir la 290 9. Selvaraj P, Carpen O, Hibbs ML et al (1989)
actividad de las células asesinas naturales. Front
Immunol 6:195 4. Glienke W, Esser R, Priesner C et al (2015) Las células asesinas naturales y el receptor Fc gamma
Ventajas y aplicaciones de las células asesinas III de granulocitos (CD16) difieren en el anclaje a la
naturales que expresan CAR. Frente Pharmacol 6:21 membrana y la transducción de señales. J Immunol
143:3283–3288
5. Vivier E, Raulet DH, Moretta A y otros (2011)
¿Inmunidad innata o adaptativa? El ejemplo de las 10. Perussia B, Ravetch JV (1991) Fc gamma RIII (CD16)
células asesinas naturales. Ciencia 331: 44–49 en macrófagos humanos es un funcional
producto del gen Fc gamma RIII-2. Eur J Inmunol 21: reacción y una prueba de sensibilidad a esteroides in
425–429 vitro de linfocitos periféricos en niños con enfermedades
11. Klaassen RJ, Ouwehand WH, Huizinga TW et al (1990) hematológicas y autoinmunes malignas. Acta Paediatr
El receptor Fc III de monocitos humanos cultivados. Hung 27:23–29 24. Natsume A, Niwa R, Satoh M
Similitud estructural con FcRIII de células asesinas (2009)
naturales y papel en la lisis extracelular de eritrocitos Mejora de las funciones efectoras de los anticuerpos
sensibilizados. para el tratamiento del cáncer: mejora de ADCC y
J Immunol 144: 599–606 CDC. Drug Des Devel Ther 3:7–16 25. Albertini MR,
12. Nishikiori N, Koyama M, Kikuchi T et al (1993) Isoforma Hank JA, Sondel PM (2005)
III del receptor gamma Fc que abarca la membrana Tratamiento del melanoma con anticuerpos
expresada en trofoblastos placentarios humanos. Am monoclonales anti disialogangliósido nativos y
J Reprod Immunol 29:17–25 modificados genéticamente. Cancer Chemother Biol
Response Modif 22:789–797 26. Garcia-Foncillas J,
13. Ravetch JV, Perussia B (1989) Formas de membrana Diaz-Rubio E (2010)
alternativas de Fc gamma RIII (CD16) en células Progreso en el cáncer colorrectal metastásico: papel
asesinas naturales humanas y neutrófilos. Expresión creciente de cetuximab para optimizar el resultado
específica de tipo celular de dos genes que difieren en clínico. Clin Trans Oncol 12: 533–542
sustituciones de un solo nucleótido. J Exp Med 170: 27. Garnock-Jones KP, Keating GM, Scott LJ (2010)
481–497
Trastuzumab: una revisión de su uso como tratamiento
14. Lanier LL, Ruitenberg JJ, Phillips JH (1988) adyuvante en el cáncer de mama temprano positivo
Análisis funcional y bioquímico del antígeno CD16 en para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico
células asesinas naturales y granulocitos. humano (HER2). Drogas 70:215–239 28. Navid F,
J Immunol 141:3478–3485 15. Santana VM, Barfield RC (2010)
Wirthmueller U, Kurosaki T, Murakami MS et al (1992) La Terapia con anticuerpos anti-GD2 para tumores que
transducción de señales por Fc gamma RIII (CD16) expresan GD2. Curr Cancer Drug Targets 10:200–209
está mediada por la cadena gamma. J Exp Med 29. Winter MC, Hancock BW (2009) Diez años de
175:1381–1390 16. Cooper MA, Fehniger TA, Caligiuri rituximab en NHL. Expert Opin Drug Saf 8:223–235 30.
MA (2001) La biología de los subconjuntos de células Congy-Jolivet N, Bolzec A, Ternant D et al (2008) La
asesinas naturales humanas. Tendencias Immunol expresión de Fc gamma RIIIa no aumenta en las
22:633–640 17. Beziat V, Duffy D, Quoc SN et al (2011)
células asesinas naturales que expresan el alotipo Fc
gamma RIIIa-158V. Cancer Res 68:976–980 31. Moore
Células NK CD56brightCD16+: una etapa intermedia GL, Bautista C, Pong E et al (2011) Un nuevo formato
funcional de la diferenciación de células NK. de anticuerpo biespecífico permite la participación
J Immunol 186:6753–6761 18. conjunta bivalente y monovalente simultánea de
Vivier E, Nunes JA, Vely F (2004) Vías de señalización de distintos antígenos diana. MAbs 3:546–557 32. Preithner S,
células asesinas naturales. Science 306:1517–1519 Elm S, Lippold S et al (2006)
19. Vivier E, Morin P, O'Brien C et al (1991)
Fosforilación de tirosina del complejo Fc gamma RIII

(CD16): zeta en células asesinas naturales humanas.
Inducción por citotoxicidad dependiente de anticuerpos Se necesitan altas concentraciones de anticuerpos
pero no por destrucción natural. IgG1 terapéuticos para compensar la inhibición de la
J Immunol 146:206–210 citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos por el
20. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Los receptores exceso de inmunoglobulina G endógena. Mol Immunol
43:1183–1193
Fcgamma como reguladores de las respuestas inmunitarias.
Nat Rev Immunol 8:34–47 33. Baselga J, Albanell J (2001) Mecanismo de acción de
los anticuerpos monoclonales anti-HER2.
21. Bryceson YT, Ljunggren HG, Long EO (2009)
Requisito mínimo para la inducción de citotoxicidad Ann Oncol 12(Suppl 1):S35–S41 34.
natural e intersección de señales de activación por Berinstein NL, Grillo-Lopez AJ, White CA et al (1998)
receptores inhibidores. Blood 114:2657–2666 22. Asociación de la concentración sérica de Rituximab
Shore SL, Nahmias AJ, Starr SE et al (1974) (IDEC-C2B8) y la respuesta antitumoral en el
tratamiento de la enfermedad recurrente de bajo grado
Detección de anticuerpos citotóxicos dependientes de o linfoma no Hodgkin folicular.
Ann Oncol 9:995–1001
células contra células infectadas con el virus del herpes simple.
Nature 251:350–352 23. 35. Holliger P, Hudson PJ (2005) Fragmentos de anticuerpos
Laszlo A, Petri I, Ilyes M (1986) Citotoxicidad celular modificados y el aumento de dominios únicos. Nat
Biotechnol 23:1126–1136
dependiente de anticuerpos (ADCC)-
36. Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E et al (2009) unión a células positivas dobles de antígeno mediante
Anticuerpos terapéuticos: éxitos, limitaciones y doble direccionamiento. MAbs 4:45–56 48. Schubert
esperanzas para el futuro. Br J Pharmacol 157:220– I, Kellner C, Stein C et al (2011) Un cuerpo triple de una
233
sola cadena con especificidad para CD19 y CD33
37. Scott AM, Wolchok JD, Old LJ (2012) media la lisis eficaz de células de leucemia de linaje
Terapia con anticuerpos del cáncer. Rev. Nat. Cáncer mixto mediante doble orientación.
12:278–287 MAb 3:21–30
38. Ferrini S, Cambiaggi A, Cantoni C et al (1992) 49. Silla LM, Chen J, Zhong RK y otros (1995)
Direccionamiento de linfocitos T o NK contra células Potenciación de la lisis de células leucémicas por un
tumorales por anticuerpos monoclonales biespecíficos: anticuerpo biespecífico contra CD33 y CD16 (Fc
papel de diferentes moléculas desencadenantes. Int gamma RIII) expresado por células asesinas naturales
J Cancer 7:15–18 39. Glorius P, Baerenwaldt A, (NK) humanas. Br J Haematol 89:712–718 50. Singer
Kellner C et al (2013) El nuevo tricuerpo [(CD20)(2)xCD16] H, Kellner C, Lanig H et al (2010)
desencadena eficientemente la lisis mediada por Eliminación eficaz de células de leucemia mieloide
células efectoras de células B malignas. Leukemia aguda mediante derivados de anticuerpos biespecíficos
27:190–201 40. Kipriyanov SM, Cochlovius B, Schafer recombinantes dirigidos contra CD33 y CD16.
HJ et al (2002) Efecto antitumoral sinérgico de diabod ies J Immunother 33:599–608 51.
biespecíficos CD19 x CD3 y CD19 x CD16 en un Kugler M, Stein C, Kellner C et al (2010) Un derivado de
modelo preclínico de linfoma no Hodgkin. J Immunol Fv monocatenario triespecífico recombinante dirigido
169:137–144 41. Kellner C, Bruenke J, Stieglmaier J contra CD123 y CD33 media la eliminación eficaz de
et al (2008) las células de leucemia mieloide aguda mediante
doble orientación. Hermano J Haematol 150: 574–586
Un nuevo derivado de anticuerpo biespecífico
recombinante dirigido por CD19 con funciones 52. Bruenke J, Fischer B, Barbin K et al (2004) Un
inmunoefectoras mejoradas para células leucémicas humanas.anticuerpo Fv monocatenario biespecífico recombinante
J Immunother 31:871–884 42. contra HLA clase II y FcgammaRIII (CD16)
Kellner C, Bruenke J, Horner H et al (2011) desencadena la lisis eficaz de las células de linfoma.
Los derivados de anticuerpos biespecíficos Br J Haematol 125:167–179 53. Hombach A, Jung
heterodiméricos contra CD19 y CD16 inducen una W, Pohl C et al (1993) Un anticuerpo monoclonal
citotoxicidad celular eficaz dependiente de
contra
anticuerpos
las biespecífico CD16/CD30 induce la lisis de las células
células tumorales linfoides B. Cáncer Lett 303: 128– de Hodgkin por células asesinas naturales no
139 estimuladas in vitro e in vivo. Int J Cancer 55:830–
43. Portner LM, Schonberg K, Hejazi M et al (2012) Las 836 54. Renner C, Pfreundschuh M (1995) Tratamiento
células T y NK de pacientes con LNH de células B de tumores de Hodgkin heterotrasplantados en ratones
ejercen citotoxicidad contra las células de linfoma SCID mediante una combinación de células NK o T
después de la unión del anticuerpo tetravalente humanas y anticuerpos biespecíficos. J Hematother
biespecífico CD19 x CD3 o CD19 x CD16. Cancer 4:447–451 55. Sahin U, Kraft-Bauer S, Ohnesorge S
Immunol Immunother 61:1869–1875 et al (1996) La interleucina-12 aumenta la citotoxicidad
44. Bruenke J, Barbin K, Kunert S y otros (2005) de células asesinas naturales mediada por anticuerpos
Lisis eficaz de células de linfoma con un anticuerpo biespecíficos contra tumores humanos. Cancer
Fv monocatenario biespecífico estabilizado contra Immunol Immunother 42:9–14 56. Renner C, Hartmann
CD19 y FcgammaRIII (CD16). Hno. J Haematol F, Pfreundschuh M (1997) Tratamiento de la
130:218–228 enfermedad de Hodgkin refractaria con un anticuerpo
45. Johnson S, Burke S, Huang L y otros (2010) biespecífico anti-CD16/CD30. Cancer Immunol Immunother
El reclutamiento de células efectoras con la nueva 45:184–186 57. Hartmann F, Renner C, Jung W et al
proteína de redireccionamiento de doble afinidad (1997)
basada en Fv conduce a una potente citólisis tumoral
y al agotamiento de las células B in vivo. J Mol Biol
399:436–449 46. Schlenzka J, Moehler TM, Kipriyanov
SM et al (2004) Efecto combinado del diacuerpo Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin refractaria
CD19 x CD16 recombinante y la talidomida en un con un anticuerpo biespecífico anti-CD16/CD30.
modelo preclínico de linfoma de células B humanas. Sangre 89:2042–2047
Anticancer Drugs 15:915–919 47. 58. Hartmann F, Renner C, Jung W et al (1998)
Schubert I, Kellner C, Stein C et al (2012) Un cuerpo triple Anticuerpos biespecíficos anti-CD16/CD30 como
recombinante con especificidad para CD19 y HLA-DR posible tratamiento para la enfermedad de Hodgkin
media preferencial refractaria. Linfoma de leucocitos 31:385–392
59. da Costa L, Renner C, Hartmann F et al (2000) con un anticuerpo monoclonal biespecífico dirigido a c-
Reclutamiento inmunológico por anticuerpos biespecíficos erbB-2 y CD16. Cancer Res 53:94–100 71. Weiner LM,
para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin. Holmes M, Richeson A et al (1993) Características de
farmacológico Chemother cáncer
unión y citotoxicidad del anticuerpo monoclonal murino
46 (suplemento): S33–S36 60. biespecífico 2B1. J Immunol 151:2877–2886 72. Ferrini
Renner C, Hartmann F, Jung W et al (2000) S, Prigione I, Miotti S et al (1991)
Iniciación de respuestas inmunes humorales y celulares
en pacientes con enfermedad de Hodgkin refractaria
mediante tratamiento con un anticuerpo biespecífico Los anticuerpos monoclonales biespecíficos dirigidos a
anti-CD16/CD30. Cancer Immunol Immunother 49:173– CD16 ya un antígeno asociado a un tumor inducen la
180
lisis de las células diana por parte de las células NK en
61. Reiners KS, Kessler J, Sauer M et al (2013) reposo y por un subconjunto de clones de NK. Int J
Rescate de actividad alterada de células NK en linfoma Cancer 48:227–233 73. Gleason MK, Verneris MR,
de Hodgkin con anticuerpos biespecíficos in vitro y en Todhunter DA et al (2012) Los activadores de células
pacientes. Mol Ther 21:895–903 62. Arndt MA, Krauss asesinas biespecíficas y triespecíficas activan
J, Kipriyanov SM et al (1999) Un diacuerpo biespecífico que directamente las células NK humanas a través de la
media la citotoxicidad de las células asesinas naturales señalización de CD16 e inducen citotoxicidad y
contra los tumores de Hodgkin humanos producción de citoquinas. Mol Cáncer Ther 11: 2674–
xenotrasplantados. Sangre 94:2562–2568 2684
74. Wiernik A, Foley B, Zhang B y otros (2013)
63. Ferrini S, Cambiaggi A, Sforzini S et al (1993) Dirigirse a las células asesinas naturales para la
Uso de anticuerpos monoclonales biespecíficos anti- leucemia mieloide aguda in vitro con un activador de
CD3 y anti-CD16 para el direccionamiento de células T células asesinas biespecíficas CD16 x 33 e inhibición de ADAM17.
y NK contra células tumorales. Cancer Detect Prev Clin Cancer Res 19:3844–3855 75.
17:295–300 64. Elsasser D, Stadick H, Stark S et al
Gleason MK, Ross JA, Warlick ED et al (2014)
(1999) El acoplador de células asesinas biespecíficas
Estudios preclínicos que combinan anticuerpos CD16xCD33 (BiKE) activa las células NK contra
biespecíficos con células efectoras estimuladas por objetivos primarios de MDS y MDSC CD33+. Sangre
citocinas para la inmunoterapia del carcinoma de células renales. 123:3016–3026 76. Vallera DA, Zhang B, Gleason MK
Contra el cáncer Res. 19:1525–1528
et al (2013)
65. Weiner LM, Clark JI, Davey M et al (1995) Los anticuerpos heterodiméricos biespecíficos de
Ensayo de fase I de 2B1, un anticuerpo monoclonal cadena única de fragmentos variables contra EpCAM y
biespecífico dirigido a c-erbB-2 y Fc gamma RIII. Cancer CD16 inducen una citotoxicidad celular dependiente de
Res 55:4586–4593 66. Weiner LM, Clark JI, Ring DB et anticuerpos eficaz contra células de carcinoma humano.
Cancer Biother Radiopharm 28(4):274–282 77. Chen X,
al (1995)
Desarrollo clínico de 2B1, un anticuerpo monoclonal Zaro JL, Shen WC (2013) Fusion protein linkers:
murino biespecífico dirigido a c-erbB-2 y Fc gamma RIII. property, design and function ality. Adv Drug Deliv Rev
J Hematother 4:453–456 67. Shahied LS, Tang Y, 65:1357–1369 78. Huston JS, Levinson D, Mudgett-
Alpaugh RK et al (2004) Hunter M et al (1988) Ingeniería de proteínas de los
sitios de unión de anticuerpos: recuperación de la actividad
Los minicuerpos biespecíficos dirigidos a HER2/neu y específi ca en un análogo de Fv monocatenario
CD16 exhiben una lisis tumoral mejorada cuando se antidigoxina producido en Escherichia coli. Proc Natl
colocan en un formato de unión a antígeno tumoral Acad Sci EE. UU. 85: 5879–5883
divalente. J Biol Chem 279:53907–53914 68. Xie Z, Shi
M, Feng J et al (2003) Un anticuerpo trivalente anti-erbB2/
anti-CD16 biespecífico que redirecciona células NK 79. Whitlow M, Bell BA, Feng SL et al (1993) Un enlazador
contra células de cáncer de mama humano. Biochem mejorado para Fv monocatenario con agregación
Biophys Res Comun 311: 307–312 reducida y estabilidad proteolítica mejorada. Protein Eng
6:989–995 80. Jager V, Bussow K, Wagner A et al (2013)
69. Stockmeyer B, Valerius T, Repp R y otros (1997)
Estudios preclínicos con anticuerpos biespecíficos Producción transitoria de alto nivel de anticuerpos
Fc(gamma)R y neutrófilos cebados con factor estimulante recombinantes y proteínas de fusión de anticuerpos en
de colonias de granulocitos como células efectoras células HEK293. BMC Biotecnología 13:52
contra el cáncer de mama que sobreexpresa HER-2/ 81. Sorensen HP, Mortensen KK (2005) Estrategias genéticas
neu. Cancer Res 57:696–701 70. Weiner LM, Holmes
avanzadas para la expresión de proteínas recombinantes
M, Adams GP et al (1993) en Escherichia coli. J Biotecnología 115:113–128
Un modelo de terapia de xenoinjerto de tumor humano
82. Nakayama H, Shimamoto N (2014) Construcción inducida por mAb anti-CD16 es independiente de la
moderna y simple de plásmido: ahorro de tiempo y proteína tirosina quinasa y la proteína quinasa C. Cell
costo. J Microbiol 52:891–897 Immunol 158:208–217 91. Grzywacz B, Kataria N,
83. Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C et al Verneris MR (2007)
(2008) Síntesis química completa, ensamblaje y Las células NK CD56(dim)CD16(+) regulan a la baja
clonación de un genoma de Mycoplasma genita lium. CD16 después de la activación de las metaloproteinasas
Science 319:1215–1220 84. Gopal GJ, Kumar A de la matriz inducida por las células diana. Leukemia
(2013) Estrategias para la producción de proteína 21:356–359, respuesta del autor 359 92. Liu Q, Sun
recombinante en Escherichia coli. Proteína J 32:419– Y, Rihn S et al (2009) Los inhibidores de la metaloproteasa
425 de matriz restauran la citotoxicidad celular dependiente
85. Burgess RR (2009) Replegamiento de proteínas de de anticuerpos mediada por células NK alterada en la
cuerpos de inclusión solubilizados. Métodos Enzymol infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
463:259–282 tipo 1. J Virol 83:8705–8712 93. Edsparr K, Speetjens
86. Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD y otros (2005) FM, Mulder-Stapel A et al (2010) Efectos de IL-2 en la
Comparación de etiquetas de afinidad para la expresión de MMP en células NK humanas recién
purificación de proteínas. Protein Expr Purif 41:98– aisladas y la línea celular NK independiente de IL-2
YT . J Inmunotro 33:475–481
105 87. Kim JY, Kim YG, Lee GM (2012) Células CHO en
biotecnología para la producción de proteínas
recombinantes: estado actual y potencial adicional. 94. Romee R, Foley B, Lenvik T et al (2013) La expresión
Appl Microbiol Biotechnol 93:917–930 88. Reff ME, y función de la superficie CD16 de las células NK está
regulada por una desintegrina y metaloproteasa-17
Carner K, Chambers KS et al (1994)
(ADAM17). Blood 121:3599–3608 95. Zhou Q, Gil-
Depleción de células B in vivo por un anticuerpo
monoclonal humano de ratón quimérico contra CD20. Krzewska A, Peruzzi G et al (2013) La inhibición de las
Sangre 83:435–445 metaloproteinasas de la matriz promueve la
polifuncionalidad de las células asesinas naturales
89. Harrison D, Phillips JH, Lanier LL (1991)
humanas en la inmunoterapia antitumoral basada en
Participación de una metaloproteasa en la liberación
anticuerpos terapéuticos. Clin Exp Inmunol 173:131–
espontánea e inducida por éster de forbol de Fc
139
gamma RIII (CD16-II) asociado a células asesinas
naturales. J Immunol 147:3459–3465 90. Borrego F, 96. Romee R, Leong JW, Fehniger TA (2014)
Utilización de citocinas para habilitar la función de las
Lopez-Beltran A, Pena J et al (1994) Downregulation of Fc
células NK humanas para la inmunoterapia del cáncer.
gamma receptor IIIA alpha (CD16-II) on natural killer
Scientific (Cairo) 2014:205796
cells
capitulo 29
Consideraciones regulatorias para las células NK utilizadas en humanos

Aplicaciones de inmunoterapia
Decano A. Lee
Resumen
Traducir la terapia celular del laboratorio a la clínica es un proceso complicado que implica la ampliación de los
procedimientos para generar números de células clínicamente relevantes, la adaptación a reactivos y equipos que están
calificados para uso humano, el establecimiento de parámetros de seguridad para reactivos y equipos que son aún no
calificado para uso humano, codificar estos procesos en estándares de práctica y reglas de conducta, y obtener la
aprobación de los organismos reguladores en base a esos estándares y reglas codificados. Dado que las leyes y
reglamentaciones que se aplican a la terapia celular variarán según el tiempo y la geografía, este capítulo revisa algunos
principios clave comunes para la fabricación de células NK para uso humano que deberán tenerse en cuenta dentro de las
limitaciones de las políticas y reglamentaciones locales.
Palabras clave Inmunoterapia adoptiva de células NK , Ensayos clínicos, Criterios de liberación, Buena fabricación
de análisis,Certificado de práctica
1. Introducción
La aplicación clínica de las terapias celulares ha sido casi exclusivamente

dominio de las instituciones académicas de investigación. Las compañías
farmacéuticas rara vez, hasta hace poco, han actuado sobre el potencial
comercial de estas terapias porque difieren mucho y son más complejas
que la experiencia de la industria en fabricación, empaque, distribución y
entrega. Además, las terapias celulares generalmente no se ajustan a los
modelos estándar de ensayos de fase inicial para determinar la
farmacocinética, la farmacodinámica y la toxicidad y la eficacia
dependientes de la dosis. Las medidas de garantía de calidad y control de
calidad (QA/QC) también difieren mucho con respecto a la evaluación de
la pureza y la potencia de los lotes de productos individuales.
No obstante, los principios básicos de la fabricación de productos de
alta calidad, pureza y potencia aún se aplican para mantener una seguridad
y una potencia reproducibles para el uso humano. La Administración de
Alimentos y Medicamentos (FDA) [ 1] y la Agencia Europea de
Medicamentos (EMA) [ 2] proporcionan regulaciones para la buena fabricación actual
347
348 Decano A. Lee
(cGMP) que se aplican a los productos de EE. UU. y Europa, respectivamente,

y pueden diferir en puntos importantes como se describe a continuación.
Las normas de la FDA que rigen las GMP están codificadas como normas
federales en la Sección 21 (es decir, 21 CFR 211). La EMA armoniza las
reglamentaciones de GMP según las pautas (por ejemplo, la Parte I de la
Guía de GMP de la UE) que respaldan los procesos que cumplen con los
estándares armonizados (por ejemplo, ISO 9001), que luego pueden ser
adoptados como ley por cada país. Todavía existen diferencias importantes
en las dos directrices, y se están realizando esfuerzos para armonizarlas aún
más. La Organización Mundial de la Salud (OMS) también ha publicado sus
propios requisitos de GMP [ 3].
Para los ensayos de fase I, la solicitud de nuevo fármaco en investigación
(IND) que se envía a la FDA debe contener información suficiente sobre las
instalaciones, los procesos, el equipo y los reactivos utilizados en el proceso
de fabricación para garantizar la seguridad, la identidad, la concentración y la
calidad. y la pureza del producto en investigación. Como se establece en la
Guía para la industria: CGMP para medicamentos en investigación de fase 1,
“La adherencia a las CGMP durante la fabricación de medicamentos en
investigación de fase 1 ocurre principalmente a través de procedimientos bien
definidos y escritos, equipo y ambiente de fabricación adecuadamente
controlados, y registros precisos y consistentes. datos de fabricación (incluidas
las pruebas)”. [ 4] Estos elementos están codificados en la aplicación IND [ 5]
a través de un documento detallado de Química, Fabricación y Control (CMC)
que describe en detalle cómo se fabricará el producto para cumplir con las
regulaciones descritas anteriormente. Este capítulo analizará los elementos
específi cos en la fabricación de células NK de grado clínico en relación con
estas pautas, con énfasis en las regulaciones y orientación de la FDA. Una
lista completa de documentos que brindan orientación de la FDA sobre
productos de terapia celular y génica está disponible en http://www.fda.gov/
BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
a Guidances/CellularandGeneTherapy/default.htm.
2 Química, Fabricación y Control (CMC)
El documento CMC enumera todos los reactivos, procesos y equipos que se

utilizarán para fabricar el producto de células NK y describe la ubicación y las
calificaciones del laboratorio en el que se realiza la fabricación. Los procesos
deben describirse con suficiente detalle para convencer al revisor normativo
de que se está fabricando un producto de identificación, calidad, pureza y
resistencia adecuadas. El contenido requerido en un CMC varía según el
ensayo, pero el CMC para un ensayo de Fase I se evaluará principalmente
desde el punto de riesgo para el paciente.
Los elementos de la CMC para la fabricación de células NK deben incluir

[ 5 – 7 ]:
Consideraciones sobre la terapia con células NK humanas 349
1. Fuente y método de adquisición del material de partida para NK

células
2. Pruebas de donantes para establecer la seguridad de enfermedades
infecciosas 3. Procedimientos de procesamiento y aislamiento celular 4.
Reactivos utilizados 5. Formulación final
6. Pruebas a realizar 7. Criterios de
liberación a cumplir (Certifi cado de Análisis)
8.Etiquetado y seguimiento del producto 9.Plan
de control de la estabilidad 10.Detalles de las
instalaciones de fabricación
3 Procedimientos operativos estándar (POE)
Los procedimientos operativos estándar brindan información detallada sobre todos los aspectos
de la fabricación de células, suficiente para garantizar que los técnicos que realicen el
procedimiento de forma independiente experimenten el mismo resultado y, por lo tanto, los SOP
bien escritos son esenciales para garantizar la consistencia del producto. Cuando se necesiten
detalles adicionales para garantizar procedimientos estandarizados, el CMC puede hacer
referencia a los SOP, pero generalmente no se incluyen como parte de la solicitud de IND. Esto
permite una práctica uniforme para procedimientos que son comunes a múltiples productos
clínicos y permite modificar los procedimientos cuando sea necesario para mejorar los resultados
o la reproducibilidad sin tener que modificar el CMC de múltiples protocolos.
Certifi cado de Análisis (CofA)—El CofA defi ne claramente el

resultados de las pruebas del producto fi nal.
Criterios de liberación: los criterios de liberación son los criterios mínimos que deben
cumplirse en cada uno de los parámetros definidos por el CofA para que un producto sea liberado
para su uso en el ensayo clínico. .
4 problemas específi cos en la fabricación de células NK que afectan la seguridad del producto
4.1 El uso Es relativamente sencillo usar productos que ya están aprobados para su uso en humanos en la
de productos no fabricación de nuevos productos para su uso en humanos. Una copia del prospecto del producto
Aprobado para suele ser documentación suficiente para establecer la seguridad. Sin embargo, la fabricación de
uso en humanos células NK para ensayos clínicos seguramente empleará reactivos o equipos que no cuentan
con tales aprobaciones. Por ejemplo, las columnas CliniMACS y el reactivo CliniMACS CD34
cuentan con la aprobación de la FDA, pero las columnas XS para el agotamiento a pequeña
escala y el reactivo CD3 no la tienen. Los reactivos CliniMACS pueden incluirse en la CMC con
una descripción simple y una copia del producto
350 Decano A. Lee
inserte, pero las columnas XS y el reactivo CD3 requieren una carta de referencia
cruzada con el archivo maestro de medicamentos de la empresa. Algunos productos,
como los medios o las citoquinas, no están aprobados para uso humano, pero el
fabricante tiene disponible un CofA para cada lote de producción para demostrar la
seguridad de su uso como reactivo. Algunos reactivos no tendrán un archivo maestro o
CofA disponible. , como los reactivos "de cosecha propia", que requieren una explicación
adicional en el CMC y pruebas independientes para generar un CofA para cada lote del
reactivo producido durante el curso del estudio, que demuestre que cumple con los
criterios de liberación establecidos en el CMC.
4.1.1 Cualificación de En los EE. UU., las células de origen humano utilizadas para la terapia celular adoptiva
los leucocitos de origen
deben obtenerse de personas que cumplan con los criterios de donación establecidos
en 21 CFR 1271 subparte C. Deben establecerse medidas de detección y prueba para
garantizar la seguridad frente a enfermedades transmisibles relevantes. Cabe señalar
que, a diferencia de las células madre de la médula ósea o de la sangre periférica, las
pruebas de donantes deben realizarse dentro de los 7 días posteriores a la recolección
de células para linfocitos terapéuticos .
4.1.2 Cualificación Las líneas de células alimentadoras son un ejemplo de reactivos que requieren el
de líneas de células alimentadoras desarrollo de un CofA para las pruebas de liberación como parte del proceso de fabricación.
Muchos de los métodos actuales para la expansión o activación ex vivo de células NK
para uso clínico se basan en células alimentadoras, como líneas de células primarias
derivadas de sangre periférica [ 8] o del cordón umbilical [ 9 ], líneas de células
linfoblastoides inmortalizadas por EBV [ 10], líneas de células cancerosas [ 11, 12], o
líneas de células cancerosas modificadas genéticamente [ 13, 14]. Estas células
alimentadoras representan "reactivos" en el proceso de fabricación de células NK que
deben calificarse como seguras para uso humano [ 15]. Por ejemplo, la línea celular de
leucemia K562 fue modificada genéticamente con citocinas y moléculas coestimuladoras
para crear el Clon9. Línea celular mbIL21 utilizada en nuestros ensayos clínicos. La
modificación genética de esta línea celular se describió del
. estructura en el CMC con
plásmido respecto ya el
transposón la
contenido de endotoxinas, la longitud del fragmento de restricción, la secuencia de
elementos transponibles, la qPCR para el número de copias de integración, el cariotipo
y el STR. huellas dactilares para la identidad de la línea celular y la ausencia de
contaminación por bacterias, micoplasmas o virus (Fig. 1 ).
Los ensayos más difíciles y costosos para la cualificación de líneas celulares son
los necesarios para determinar la ausencia de contaminación viral.
Las organizaciones de investigación por contrato (CRO) que se especializan en estos
ensayos no solo realizan los ensayos a tarifas contratadas, sino que también pueden
proporcionar valiosos servicios de consulta para determinar qué ensayos realizar. Por
lo general, realizamos pruebas preliminares de bacterias y micoplasmas antes de
aceptar la línea celular en las instalaciones de GMP.
A continuación, se genera, crioconserva y pone en cuarentena un banco de células
maestras (MCB). Las pruebas preliminares de esterilidad se realizan de nuevo
internamente y, a continuación, el CRO envía alícuotas del MCB para realizar las
pruebas completas y finales. Se pueden derivar bancos de células de trabajo (WCB)
adicionales a partir del MCB completamente calificado y probarse con un CofA más
limitado [ 7 ].
Fig. 1 Certifi cado de análisis para la línea celular alimentadora K562 Clon9. mbIL21
352 Decano A. Lee
Figura 1 (continuación)
4.2 Cultivo celular Los medios de cultivo celular no están destinados al uso humano, por lo que debe
estar disponible un CofA para los medios que demuestre la esterilidad y el
4.2.1 Medios
contenido mínimo de endotoxinas. Si el medio contiene aditivos derivados de
animales, también debe estar disponible la prueba de micoplasma.
4.2.2 Suero vs. El suero bovino fetal (FBS) se usa comúnmente como complemento para los
Sin suero medios de cultivo celular, proporcionando una amplia gama de factores conocidos
y desconocidos esenciales para el crecimiento y la supervivencia celular. En 1997,
la OMS aconsejó evitar los aditivos de origen bovino en la fabricación de productos
farmacéuticos y en los productos administrados a los pacientes debido al riesgo de
encefalopatía espongiforme transmisible (EET) [ 16 ].
La EMA [ 17] y la FDA también han emitido una guía para evitar el uso de
productos animales para reducir el riesgo de EET. Sin embargo, debe tenerse en
cuenta que el suero bovino se incluye en la Categoría IV para EET (que no
contiene infectividad detectable), y el FBS para uso humano debe prepararse
adicionalmente a partir de regiones geográficas en las que el riesgo de EET es
bajo. Hasta la fecha, se ha confirmado un caso de encefalopatía en forma espongi
bovina (BSE) en los EE. UU., en 2003 [ 18 ].
FBS también conlleva el riesgo de reacciones inmunes xenogénicas [ 19], y otros
factores brindan una motivación adicional para encontrar alternativas a FBS en
cultivo celular para aplicaciones clínicas, como variaciones incontrolables en la
composición, disponibilidad limitada y costo.
El suero humano puede reemplazar el uso de FBS en algunas circunstancias,
particularmente cuando se dispone de suero autólogo. Para aplicaciones en las
que la necesidad es únicamente proporcionar proteínas para la estabilidad del
producto, se puede utilizar albúmina de suero humano purificada para reducir aún
más los riesgos descritos anteriormente. A pesar de estas preocupaciones, el uso
de FBS para expandir las células NK sigue siendo de uso común debido al respaldo
sin precedentes del crecimiento y la supervivencia. El FBS residual debe eliminarse
mediante un lavado minucioso de las células NK antes de la formulación del
producto de infusión final.
4.2.3 Antibióticos El uso de antibióticos debe evitarse tanto como sea posible durante todas las
fases de la fabricación de células NK. Los antibióticos pueden suprimir la
contaminación bacteriana naciente sin eliminar por completo la contaminación, lo
que da como resultado agentes infecciosos que pueden florecer después de la
infusión a pesar de pasar los criterios de liberación. El .uso
enmascara
de antibióticos
una técnica
aséptica deficiente y se ha asociado con una mayor contaminación por micoplasma
[ 20]. Si el producto no se puede fabricar sin el uso de antibióticos, se debe emplear
un sistema de eliminación validado antes de la formulación del producto final, y es
posible que se requiera un análisis del contenido residual como parte de la prueba
de liberación.
4.2.4 Sistemas cerrados La técnica aséptica y la contaminación cruzada mejoran mucho con el uso de
sistemas de cultivo cerrados. Si bien no es necesario, su uso en ensayos de fase
temprana proporcionará validación y experiencia para ensayos de fase posterior
en los que los volúmenes de cultivo y el número de células más grandes son
demasiado engorrosos y riesgosos para los sistemas abiertos. Los sistemas cerrados a menudo
354 Decano A. Lee
introducen mayores pérdidas en el proceso de fabricación, haciéndolos poco

prácticos para procedimientos que implican pequeños volúmenes y/o cantidades
de células, por ejemplo, el procesamiento inicial de extracciones de sangre
periférica de pequeño volumen.
4.2.5 Formulación Final La formulación final de un producto de células NK debe estar en una solución de
infusión aceptable para uso humano. Las soluciones salinas isotónicas tamponadas
neutras estériles, no pirógenas y tamponadas comúnmente utilizadas en entornos
clínicos que pueden adaptarse para este propósito incluyen Plasma-Lyte A,
solución de Ringer lactato (LR) y Buminate al 5 % [ 21]. Existe al menos una
solución salina tamponada con fosfato hecha expresamente para este propósito
(Miltenyi CliniMACS PBS-EDTA Buffer). Para evitar la aglomeración de células y
mejorar así la estabilidad, se puede incluir HSA al 0,5 % en el tampón de
suspensión celular.
4.2.6 Criopreservación Durante mucho tiempo se ha reconocido que la crioconservación tiene un efecto
adverso sobre la función de las células NK [ 22], y esto se ha confirmado en
ensayos clínicos recientes [ 21]. Los medios de crioconservación utilizados para
congelar sangre de cordón umbilical o células mononucleares de sangre periférica
para su uso futuro en el trasplante de células madre suelen utilizar HSA al 5 % en
lugar de suero para permitir la infusión directa del producto descongelado sin lavar.
La inclusión de suero en medios de crioconservación proporciona resultados
superiores en comparación con HSA, pero requiere lavar las células antes de la
infusión y esta manipulación adicional también conlleva un costo de pérdida de
células, tiempo y la necesidad de pruebas de esterilidad adicionales después del
procedimiento, además de la problemas de seguridad mencionados anteriormente.
El dimetilsulfóxido (DMSO) es el crioprotector más común utilizado en los
medios de congelación, normalmente en una concentración del 10 %.
El DMSO en cantidades limitadas se puede infundir directamente a los pacientes
después de la descongelación, evitando la necesidad de un lavado posterior a la
descongelación. Nuestras pautas de práctica institucional recomiendan limitar la
cantidad de DMSO infundido a 1 ml/kg. Una bolsa de infusión de 100 ml con DMSO
al 10 % se acercaría al límite recomendado para un niño que pese 10 kg. Puede
ser necesario ajustar el volumen de criopreservación o lavar el producto para
eliminar el DMSO antes de la infusión en ensayos clínicos que tratan a niños
pequeños o infunden grandes volúmenes de células criopreservadas.
4.3 Criterios de liberación Los criterios de liberación son los resultados de las pruebas finales del producto
que deben lograrse para permitir que el producto se libere para su uso en el
ensayo clínico.. Las pruebaspara
de calidad de liberación proporcionan
la seguridad la última
y eficacia del líneademostrando
producto, de garantía
que el cumplimiento de los procedimientos CMC y SOP dan como resultado un
producto que cumple con las especificaciones mínimas. Las pruebas específicas
utilizadas para los criterios de liberación deben garantizar un producto que sea lo
más seguro posible con las modalidades de prueba disponibles y en un marco de
tiempo que sea práctico para el entorno clínico ( consulte la Nota 1). Los criterios
deben ser tan estrictos como sea posible, pero no más estrictos de lo que se
puede lograr de forma rutinaria mediante el método de fabricación que se utiliza
( consulte la Nota 2, Fig. 2 ).
Fig. 2 Certifi cado de análisis para el producto final de células NK tal como se usa en el protocolo 2012-0079 (NCT01787474)
356 Decano A. Lee
Figura 2 (continuación)
4.3.1 Identidad/Pureza: Los ensayos para establecer la identidad y la pureza generalmente se realizan
Inclusión de Células Deseadas simultáneamente para los productos de células NK mediante citometría de flujo. La identidad
(p. ej., ¿son estas células realmente células NK?) y la pureza (p. ej., ¿cuántas de estas
células son células NK?) pueden establecerse mediante la identificación positiva del agente
previsto y/o la identificación de agentes contaminantes conocidos.
Las células NK se definen con mayor frecuencia como CD3 neg CD56 pos linfo, pero
pos. En algunas
también
circunstancias,
se pueden definir
puedecomo
ser deseable
CD3 neg exigir
CD16/56
quepos
un producto
o citos, CD3
contenga
neg NKp46
un
contenido mínimo de un subconjunto específico de células NK (p. ej., KIR2DL1 pos ).
4.3.2 Identidad/Pureza: Células T : muchos métodos de expansión de células NK también expanden las células T.
Exclusión En entornos autólogos, las células T contaminantes pueden ser beneficiosas y pueden no
de células indeseables causar daño, pero aun así aumentan la utilización de medios durante el cultivo celular,
disminuyen la pureza del producto y pueden disminuir la potencia del producto. Las células T
de origen donante también pueden conducir a una mayor toxicidad al causar la enfermedad
de injerto contra huésped (EICH). Nuestros criterios de liberación exigen <5 % de linfocitos
CD3+ para productos autólogos, pero especifican un máximo de 1 % y 10 5/kg para productos
alogénicos. Esto se basa en un umbral histórico de 10 5 / kg de células T para causar GvHD
en trasplantes haploidénticos e infusiones de linfocitos de donantes haploidénticos [ 23 ].
Células B: las células B de origen donante infundidas en pacientes inmunocomprometidos

pueden ser una fuente de enfermedad linfoproliferativa provocada por el EBV. El contenido
de células B puede controlarse mediante un procesamiento adicional para agotar las células
CD19+ [ 24 ].
Células alimentadoras : deben evaluarse las células alimentadoras contaminantes residuales,

especialmente cuando se utilizan líneas de células tumorales. Debe desarrollarse una firma
única que distinga las células tumorales de las células cultivadas. Los métodos basados en
citometría de flujo permiten la exclusión de células muertas del análisis, lo que puede
complicar la interpretación de los estudios basados en PCR. Para K562 modificado
genéticamente utilizado en la propagación de células NK (Células de activación y propagación
(AaPC)), evaluamos la expresión de superficie del gen endógeno CD32 y el transgén CD19
para distinguir AaPC de las células T y las células NK, ya que los monocitos del donante y
las células B no son que se encuentran en estas culturas.
Células muertas : la viabilidad es una medida indirecta de la calidad, estabilidad, pureza y

potencia del producto. La viabilidad de los productos frescos debe ser al menos del 95 %, a
menos que los productos hayan sido muy manipulados.
Las células NK crioconservadas a menudo demuestran una viabilidad de >90 %
inmediatamente después de la descongelación, pero las células continúan muriendo durante
las siguientes 12 a 24 h, a menudo disminuyendo al 70 % o menos. En la mayoría de los
casos, las células se preparan para la infusión lo antes posible después de la descongelación,
por lo que es probable que se sobrestimen las evaluaciones de viabilidad cuando se realizan
en estos momentos tempranos.
358 Decano A. Lee
4.3.3 Pruebas de esterilidad Viral: prueba viral de leucocitos de donantes, células alimentadoras y el suero es
,
descritas anteriormente. Dado que estas son las únicas fuentes de contaminación
viral, no se requieren más pruebas de contaminación viral del producto final.
Bacteriana/ Fúngica: la evaluación de la contaminación bacteriana o fúngica se

compone de ensayos cada vez más sensibles pero también más prolongados. La
inspección visual que demuestra medios turbios o descoloridos es inmediata y puede
usarse en cualquier momento. La tinción de Gram y la endotoxina se pueden realizar
en una hora o menos y son complementarias. La tinción de Gram puede revelar
organismos que no producen endotoxina, pero la endotoxina es una medida más
sensible cuando está presente. Los cultivos completos (típicamente 14 días) son los
más sensibles, pero debido al largo período de tiempo antes de que los resultados
finales estén disponibles, puede que no sea práctico en algunos entornos para su
uso como criterio de liberación ( consulte la Nota 1).
Mycoplasma y organismos relacionados: los cultivos celulares pueden contaminarse

con mollicutes comunes (bacterias que carecen de una pared celular que sobreviven
como parásitos intracelulares obligados) como Mycoplasma y Ureaplasma. Además
del riesgo de infección (particularmente para pacientes inmunocomprometidos),
hemos identificado la contaminación por micoplasma como una de las principales
causas de la proliferación deficiente de células NK durante la expansión ex vivo.
Los ensayos luminométricos se basan en enzimas
específicas de patógenos y detectarán la mayoría de los mollicutes excepto
Ureaplasma (p. ej., MycoAlert (Lonza), MycoProbe (R&D)).
Se pueden realizar rápidamente para obtener resultados de prueba el mismo día.
Los ensayos basados en PCR también detectarán géneros como Ureaplasma que
normalmente no se identifican mediante métodos basados en enzimas, pero que
generalmente tardan más tiempo en estar disponibles los resultados (p. ej.,
MycoSensor (Agilent), Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC)). Nuestro estándar
es proporcionar pruebas de liberación finales en todos los productos crioconservados
mediante el ensayo basado en PCR, con el ensayo luminométrico utilizado para las
pruebas de liberación de productos frescos o productos crioconservados que están
programados para administrarse antes de que los resultados del ensayo PCR estén disponibles.
4.3.4 Potencia La potencia se define como “la habilidad o capacidad específica del producto, según
lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o por datos clínicos adecuadamente
controlados obtenidos a través de la administración del producto en la forma prevista,
para lograr un resultado dado”. (21 CFR 600.3(s) [ 25]. Los ensayos de potencia
miden la función biológica relativa de un producto y, con mayor frecuencia, la función
biológica de relevancia para las células NK es la citotoxicidad. Se prefieren los
ensayos cuantitativos, pero también se pueden realizar ensayos biológicos cualitativos.
[ 7] Los ensayos deben elegirse por su facilidad de uso en el entorno GMP, la rápida
obtención de resultados y la precisión, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad.
Desafortunadamente, los ensayos biológicos más comunes utilizados para medir la

citotoxicidad de las células NK (liberación de cromo o calceína contra objetivos K562)
son relativamente específicos pero tampoco precisos (eliminación de
K562 puede estar incompleto [ 26] y es poco probable que prediga la muerte del
tumor del paciente), sensible (un aumento de diez veces en las células NK
normalmente se correlaciona con un aumento del 20 % en la muerte), ni
reproducible (variabilidad diaria alta).
Las medidas alternativas pueden proporcionar una evaluación más detallada
de la potencia de las células NK (p. ej., análisis de una sola célula [ 27]), pero
pueden ser demasiado complicadas para el entorno GMP. Otras alternativas
incluyen la medición de la desgranulación o la producción de citocinas en
respuesta a una señal de activación. Desarrollamos un ensayo rápido que
resuelve algunos de los problemas de precisión y reproducibilidad de los ensayos
de liberación de cromo y cacleína y es fácil de usar en el entorno GMP [ 26].
Además de una variedad de posibles lecturas de potencia, cada uno de

estos ensayos puede usarse con una variedad de fuentes de activación.
K562 y 721.221 se utilizan a menudo como dianas de líneas celulares específicas
para la función de células NK porque su falta de expresión de MHC no respalda
la activación de células T específicas de antígeno.
resultado
Sin embargo,
un sesgoesto
hacia
da los
como
efectos del ligando faltante, que pueden no estar presentes in vivo en el paciente.
Las alternativas incluyen objetivos específicos del paciente (aplicables
principalmente a las leucemias), pruebas en paneles de objetivos diseñados
[ 28] o enfoques independientes del objetivo, como ligandos unidos a placas o
activadores químicos (p. ej., PMA/ionomicina).
Afortunadamente, no se requiere una medida validada de la potencia del
producto para los ensayos de Fase I, pero debe estar en desarrollo durante los
ensayos de Fase II y se requiere para la Fase III. Se necesitará trabajo futuro
para identificar ensayos de potencia en los que la comunidad de células NK
pueda estar de acuerdo.
5 notas
1. El rigor de los criterios de liberación puede variar según la capacidad práctica
para completar la prueba. Por ejemplo, la prueba de micoplasma se puede
realizar con un ensayo enzimático rápido y menos sensible o con un ensayo
basado en PCR más lento y más sensible. Un producto crioconservado
puede almacenarse tanto tiempo como sea necesario para dar tiempo a
que se obtengan los resultados utilizando la mejor prueba disponible y, por
lo tanto, es apropiado especificar la prueba basada en PCR para los criterios
de liberación de estos productos. Sin embargo, cuando se realizan pruebas
de liberación para productos celulares frescos que a menudo deben
infundirse dentro de las horas posteriores a la preparación final para
mantener la potencia máxima, es posible que el personal de QA/QC no
pueda completar el ensayo basado en PCR en un marco de tiempo.
compatible con la administración del producto dentro de su vida útil. En
tales casos, los criterios de liberación pueden establecerse sobre la base
de una prueba de detección rápida, siempre que el protocolo incorpore un
plan de acción razonable para la seguridad del paciente a seguir en caso
de un resultado positivo de la prueba más definitiva (p. ej.,
360 Decano A. Lee
evaluar al paciente en busca de signos de infección e iniciar un antibiótico

macrólido). Esto también se aplica a la tinción de Gram y la endotoxina como
prueba bacteriana para los criterios de liberación mientras se esperan los
resultados finales del cultivo.
2. Cuanto más estrictos sean los criterios de liberación, más probable será que los
hallazgos del ensayo clínico se basen en la seguridad y la eficacia de las
células que se someten a prueba. Sin embargo, la rigurosidad alta puede no
ser alcanzable o puede tener un costo de fabricación que no es sostenible. Por
ejemplo, los primeros ensayos clínicos de células NK utilizaron productos de
leucoaféresis en estado estacionario de los que se eliminaron las células T
mediante selección negativa inmunomagnética de CD3. Esto dio como resultado
productos para los que la pureza de las células NK era relativamente baja, ~30
%. Se podría obtener una alta pureza instituyendo un segundo paso de
selección positiva inmunomagnética de CD56.
Sin embargo, esto aumentó el costo y dio como resultado grandes pérdidas de
células, de modo que a menudo no se lograron las dosis adecuadas. Debe
buscarse un equilibrio adecuado entre pureza y viabilidad.
Agradecimientos
El autor desea agradecer al personal de las instalaciones de GMP en el MD

Anderson Cancer Center por su excelente trabajo en la generación de SOP, CMC y
CofA para una gran cantidad de ensayos de células NK, y por compartir su gran
conocimiento en los aspectos regulatorios de Ensayos de terapia celular.
Referencias
1. Datos sobre las buenas prácticas de fabricación 5. Orientación para la industria: contenido y formato de
actuales (CGMP) (2005) Administración de Alimentos las solicitudes de investigación de nuevos
y Medicamentos de EE. UU. http://www.fda.gov/Drugs/ medicamentos (IND) para estudios de medicamentos
DevelopmentApprovalProcess/Manufactura/ de fase 1, incluidos productos bien caracterizados,
ucm169105.htm . Consultado el 4 de noviembre de terapéuticos, derivados de la biotecnología (1995)
2015 http://www.fda.gov/downloads/ drogas/
2. Cumplimiento de buenas prácticas de fabricación y guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/
buenas prácticas de distribución (2015) ucm071597.pdf 6. Guía para la industria: ensayos
Agencia Europea de Medicamentos. http://www. clínicos tempranos con productos bioterapéuticos vivos:
ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/regulation/ información sobre química, fabricación y control
document_listing/document_listing_000154.jsp. (2012) http://www.fda.gov/downloads/ B iologics B
Consultado el 4 de noviembre de 2015 3. Productos lood Va ccinesComplianceRegulatoryInformation/
/ G uidance -
biológicos: buenas prácticas de fabricación (2015) Guidances/General/UCM292704.pdf 7. Orientación
Organización Mundial de la Salud, http://www.who.int/ para revisores: instrucciones y plantilla para revisores
biologicals/vaccines/good_man ufacturing_practice/ de química, fabricación y control (CMC) de aplicaciones
en/ . Consultado el 4 de noviembre de 2015 4. de nuevos fármacos en investigación (IND) de terapia
Orientación para la industria: CGMP para medicamentos con células somáticas humanas (2003) http ://www.
en investigación de fase 1 (2008) http://www. fda.gov/ fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Guidance
downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/
guidances/ucm070273.pdf
ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ www.ema.europa.eu/docs/en_GB/docu ment_library/

Xenotransplantation/ucm074131.htm 8. Siegler U, Meyer- Scientifi c_guideline/2009/09/ WC500003700.pdf 18.
Monard S, Jorger S et al (2010) Buenas prácticas de fabricación: Encefalopatía espongiforme bovina (BSE)
clasificación celular compatible y expansión a gran escala
de células asesinas naturales humanas aloreactivas Preguntas y respuestas (2015) http://www. fda.gov/
positivas para KIR individuales para infusiones múltiples a BiologicsBloodVaccines/ SafetyAvailability/ucm111482.htm
pacientes con leucemia. Cytotherapy 12:750–763 9. Boissel 19. Sundin M, Ringden O, Sundberg B et al (2007) No hay
L, Tuncer HH, Betancur M et al (2008) Las células madre aloanticuerpos contra las células del estroma mesenquimal, pero
mesenquimales del cordón umbilical aumentan la expansión de hay presencia de anticuerpos anti-suero de ternera fetal,
las células asesinas naturales de la sangre del cordón. Biol después del trasplante en células hematopoyéticas
Blood Marrow Transplant 14:1031–1038 10. Berg M, alogénicas. receptores de células madre.
Lundqvist A, McCoy P Jr et al (2009)
Haematologica 92:1208–1215 20.
Coecke S, Balls M, Bowe G et al (2005)
Las células asesinas naturales humanas expandidas ex Orientación sobre buenas prácticas de cultivo celular. un
vivo de grado clínico regulan al alza los receptores de informe del segundo grupo de trabajo ECVAM sobre
activación y los ligandos de los receptores de muerte y buenas prácticas de cultivo celular. Laboratorio alternativo
tienen una actividad citolítica mejorada contra las células tumorales. Anim 33: 261–287
Citoterapia 11:341–355 11. 21. Lapteva N, Szmania SM, van Rhee F et al (2014) Purificación
North J, Bakhsh I, Marden C et al (2007) y expansión de grado clínico de células asesinas naturales.
Las células asesinas naturales humanas cebadas por tumores Crit Rev Oncog 19: 121–132
lisan los objetivos tumorales resistentes a NK: evidencia de un
proceso de dos etapas en la activación de células NK en reposo. 22. Martí F, Miralles A, Peiro M et al (1993)
J Immunol 178:85–94 Efecto diferencial de la crioconservación en las actividades
12. Harada H, Watanabe S, Saijo K et al (2004) Una línea celular de las células asesinas naturales y las células asesinas
de tumor de Wilms, HFWT, puede estimular en gran medida activadas por linfoquinas. Transfusión 33:651–655
la proliferación de células asesinas naturales humanas 23. Martelli MF, Aversa F, Bachar-Lustig E et al (2002) Trasplantes
CD56+ y sus nuevos precursores en células mononucleares a través de barreras de antígenos leucocitarios humanos.
sanguíneas. Exp Hematol 32: 614–621 Semin Hematol 39:48–56 24. Miller JS (2013) Aplicaciones
terapéuticas: células asesinas naturales en la clínica. Hematology
13. Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N et al (2009) Expansión Am Soc Hematol Educ Program 2013:247–253 25.
de células asesinas naturales humanas altamente Orientación para la industria: Pruebas de potencia para
citotóxicas para la terapia de células cancerosas. productos de terapia celular y génica (2011)
Cáncer Res. 69:4010–4017
14. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS et al (2012) La

IL-21 unida a la membrana promueve la proliferación ex (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU.,
vivo sostenida de células asesinas naturales humanas. Administración de Alimentos y Medicamentos, Centro de
PLoS One 7, e30264 15. Points to Consider in the Evaluación e Investigación Biológica (CBER), ed.)
Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993)
http://www.fda.gov/downloads/ biologicsbloodvaccines/ 26. Somanchi SS, McCulley KJ, Somanchi A et al (2015) Un
safetyavailability/ ucm162863.pdf 16. Productos medicinales método novedoso para la evaluación de la citotoxicidad de
y de otro tipo y humanos y encefalopatías espongiformes las células asesinas naturales mediante citometría de
transmisibles en animales: memorando de una reunión de imagen. PLoS One 10, e0141074 27. Romain G, Senyukov
la OMS (1997). Bull World Health Organ 75:505–513 17. Nota V, Rey-Villamizar N et al (2014) La ingeniería Fc de anticuerpos
orientativa sobre cómo minimizar el riesgo de transmisión mejora la frecuencia y promueve el refuerzo cinético de la
de agentes de la encefalopatía espongiforme animal a muerte en serie mediada por células NK. Sangre
través de medicamentos humanos y veterinarios (EMA/ 124(22):3241–3249 28. Hurton LV, Siddik RI, Singh H et al
410/01 rev.3) (2010)
Identificación de donantes de células NK alogénicas

candidatas para el trasplante de células madre
(2011) (Comisión Europea, ed), Diario Oficial de la Unión hematopoyéticas basado en el fenotipo funcional.
Europea http:// Leucemia 24:1059–1062
ÍNDICE
A Citotoxicidad.................................. v , 14, 19, 99, 102, 107–115,

, 167,
152178
142 ,168 , 173, , 186-191 , 215–218 ,
Células de activación y propagación (AaPC)...........179 , 357 223–224, 241, 246 , 248 , 250, 259 , 293 , 310, 311, 314,
28, 36, 37, 39, 40, 80, 117,
, 33
Activación.................................. ..........
325 , 327, 330, 335 , 336 , 340, 341, 358
118, 128, 131–133, 142–145, 147, 152, 168, 176, 199,
201, 204, 205 , 207–208 , 211, 212, 216 , 217, 241, 262, D
278 , 285 , 289 , 294, 298 , 300–304, 334–336, 340–342,
350, 359 Membranas resistentes a detergentes (DRM) ..................131–
137 Yoduro de 1,1-dioctadeciltetrametil indotricarbocianina
Terapia celular adoptiva .................................................. .204 ,
179, 187, (DIR) .................................................. .............308–314
350 Inmunoterapia adoptiva................................. 175 ,256
254, , 286 , 307–315 , 317, 318 mi
Citotoxicidad mediada por células dependiente de
, 15244, 167, 232, 334–335 , 340–342
anticuerpos (ADCC) .......... Electroporación..................................216 , 221–223 , 226 , 232–239 ,
Apoptosis..................................................167 , 204, 227, 297–306 267–276 , 339
Células presentadoras de antígenos artificiales Expansión.................................................. , 62, 71, 80, 142, 167–173,
(aAPC) ............................................................. .216 , 279 , 283 175–191, v 195–197, 199–201, 204, 205 , 209–212, 216 ,
217, 219–220, 226 , 227, 241, 250, 278 , 283 , 289 , 293 ,
B 310, 350, 357, 358
BICICLETAS .................................................. ...... 333–336, 338–342 Matriz extracelular (MEC) .............................................65, 101
Imágenes bioluminiscentes ..........................................278 , 303

F
, 335 , 336
biespecífico .................................................... ....... 270 Células
dendríticas derivadas de médula ósea..........................80–83 19 F................................................. ....................................329
FCGR2C.................................................. ....................43–52
C FCGR3A.................................................. ....................43–52
Células alimentadoras .................................62, 71, 167–173, 176, 195,
Flujo de Ca 2+ .............................................. ...... 118–125, 127–129
197–199, 201, 207, 208 , 210, 217, 219 , 226 , 232, 317,
Ensayo de liberación de calceína .......................108 , 176 , 187, 188,
329 , 350, 351, 357, 358
293 , 311, 314, 326
223 Citometría de flujo ....................................... 9–11 , 13, 21, 26, 30, 31,
Inmunología del cáncer .................................................
34, 35, 40, 57–63 , 88, 117–129, 171, 172 , 180–187, 198,
.222 , Biosensor de caspasa-3 ........................................... ......298–
200, 201, 206, 207, 210, 211, 216, 218 , 219, 222–223 ,
, 236 , 238 , 239 ,
306 CCR7......................................... .......232–234
225, 226, 233 , 238 , 243 , 255, 258 , 261, 271, 274, 276,
254, 255 , 257–260, 262
293 , 308, 311, 314, 317, 324–327, 339, 340, 357
Migración celular.................... 65–73 , 75–85 , 96 , 132, 232, 259
Flujo PESCADO................................................... ...................57–63
Motilidad celular.................. ..................................................76
Fluorescencia..................................vi, 13, 25 , 58 , 61, 63 , 68 , 70,
Visión de celómetro ............................................. 108– 110, 112
72, 80, 90, 94, 95, 98 , 99, 102–105, 108, 111–115, 124,
Inmunoterapia celular................................................215 , 231
128, 129, 146, 147, 159, 163, 223 , 224, 228 , 238 , 246 ,
Certificado de análisis (CofA)................... 349–351 Quimio- , 353 , 355
248 , 258 , 263 , 288 , 320, 327, 328 , 330, 331
repulsión....................... ..........................................85
Quimiotaxis...... .................................................. 79 ,85 80, 84, Imágenes de fluorescencia ....................................... 114, 307–315
Receptor de antígeno quimérico (CAR) ....................... 196 , 199, GRAMO
200, 211, 215–221, 223–228 , 241–250 , 254, 333

Ensayos clínicos..............216 , 241, 277, 317, 349 , 350, 354, 360 Silenciamiento de genes ............................................. ..........267–276
146, 149, 151 307 , 208 , 241,
Transferencia de genes ............................... ..204, 205
Microscopía confocal ..........................142–144 ,
, 54, 55 Modificación genética con vector retroviral...............196 ,
Variación del número de copias (CNV) ............ ...........
43–52 CyTOF.................................... ..........................................13–26 199–200, 203–210, 212
1441, DOI 10.1007/978-1-4939-3684-7, © Springer Science+Business Media Nueva York 2016
363
CÉLULAS ASESINAS NATURALES : MÉTODOS Y

PROTOCOLOS 364
Índice
Glucólisis.................................................. ........ 27–29 , 36–39 METRO
Buenas prácticas de fabricación (GMP) .................. 204 , 348 ,

350, 358 Resonancia magnética nuclear ....................... 317– , 325–330
G-Rex.................................................. ..........................195–201 323 Citometría de masas ........................... ......................................13–
®
26 Matrigel....................................................
mbIL21 ....... ..............................62..............66–69, 73
H , 176, 179, 181–183, 191,
226 , 255 , 309 , 317, 329 , 350, 351
Células madre hematopoyéticas (HSC) ........................... 176, 204, MCMV.................................................. ......................v, 1–12
241–250 , 308
Membrana IL-15................................14, 58 , 62, 173, 195, 201
Humano.................................. 1, 20, 39, 40, 46, 57, 58 , 62, 65–73 ,
Balsas de membrana .................................................. ........131, 132
85, 90, 117–129, 133, 135, 141, 168–170, 172, 195–201,
Memoria................................................. ...................1–12 , 27
203 , 208 , 216–218 , 233 , 234, 241–250, 254, 268 , 271,
Metabolismo.................................. ..........................................27–41
273 , 274, 278 , 279, 286–289, 291, 293 , 294, 298–300,
Microchip..................................88 , 90–91, 94–96 , 99, 101–104
309, 327, 333 , 335, 340, 347, 349–350, 353 , 354
Dispositivo de microfluidos......... ..........................................76–85
Células NK primarias humanas..........................................133 , 135
Migración.................................. 65–73 , 75–85 , 96 , 97, 99, 102,
yo
232–235 , 237–238 , 254, 258–261, 263 , 264, 309
Xenoinjerto de ratón ................................................. .......277–
Activación de IL-2 .................................................. ..............85 , 176 283 ARNm....................................215 –221, 223–228 , 231–239 ,
Análisis de imagen ................................................ ... , 147, 312 268 , 271–273 , 275
102 Citometría de imagen................................................ ...........107–
norte
115 Sinapsis inmunitarias.................................. ..........................160
Sinapsis inmunológicas (IS) ............ 141–149 334, 151–165, 1–41,
Células asesinas naturales (NK) .......................................... v, vi ,
Inmunosinapsis .................................................. ...............151 43–52 , 54, 55 , 57–63 , 65–73 , 75–85 , 87–115 ,
, 175, 215 , 216 , 231,
Inmunoterapia.................................... .168 232 117–129, 131–138, 141–149, 151–165, 167–173,
, 277–283 , 297, 298 , 308 , 317, 333 , 336 , 347–350, 175–191, 195–201, 203–210 , 212 , 215–221 ,
353 , 354, 357–359
223–228 , 231–239 , 241–250 , 253–264 , 267–283 ,
Imagenología in vivo ...........302–304 , 307–309 , 311–313 , 318 285–294 , 297–315 , 317–323 , 325–330 , 333–336 ,
Linfocitos innatos ........................... ..........................................1 338–342, 347–350 , 353 , 354, 357–359
, 173, 204, 217
Interferón-gamma.... ..........................71 , 107 Interleucina-2 312
Colorante infrarrojo cercano (NIF)..........................................308 ,
(IL-2) ............ .......................14 72 , 58 , 66 , 68 , 69,
Inmunoterapia adoptiva de células NK ............ 175 , 187, 286 ,
71, , 80, 82, 85 , 101, 103, 144, 168, 170, 173, 176,
307–315 , 317, 318
196, 198–200, 205 , 208–210, 217, 234, 235 , 279 ,
Expansión de células NK .................................................. ............210
280, 283 , 285–294, 299 , 300, 335 , 341
Diafonía NK-DC.................................. .............................75
Tinción de citocinas intracelulares....................................14 , 34 Nucleofección..................................................218, 220–223 , 227, 275
Ensayo de invasión.... .................................................... ...6669
, 68–
O
k
ÿ-Octilglucósido (ÿ-OG) .......................... 132 , 133, 135, 137
K562.................................................. v, 14, 58 , 62, 105, 108–110,
ON-TARGET plus ............ ....................... 268 , 269 , 271, 273
112, 114, 115, 167–173, 175–191, 195, 198, 200, 201,
Línea celular OP9 ...................... .............................................241
216 , 232, 233 , 254–264, 286 , 289 , 309, 311, 317, 319,
Osteosarcoma (OS) ............................................. 286– , 293
326 , 327, 329, 330, 350, 351, 357–359
, 336
289 Ovario cáncer ................................................. 277–283
Células alimentadoras K-562 ............ 167–173 , 195, 207, 208 , 210, 232
Fosforilación oxidativa (OXPHOS) ........... 27–29 , 36–39
L
PAGS
Expansión a gran escala .................................................. .195–201

Citometría de flujo policromática..........................................117
, 243 , 245 , 299 , 301,
Vectores lentivirales .......................242 305
Balsa de lípidos ............................................. ...........131–138 R
, 234, 257
Localización de ganglios linfáticos........................... .....232, 254 309 ,
Lisis redirigida .................................................. .........340 , 341
259 , 260, 262, , 311
Criterios de liberación.................................... ..... 349 , 350
353–359
,
Linfocitos.................................................. .60 , 65 , 75 , 107,
117, 118, 125, 126, 132, 151, 167, 168, 172, 175, 185, Luciferasa de renilla (Rluc) ..........................................298 –
186, 197, 203 , 215 , 253 , 258 , 267, 277, 285 , 297, 308 , 307 Gen informador .......................................... ,108 , 301, 302
298Vector
350, 357
retroviral ........................196 , 199–200, 203–210, 212
CÉLULAS ASESINAS NATURALES : MÉTODOS Y

PROTOCOLOS 365
Índice
S T
Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)........... 43–52 , 54, 55 Inmunoterapia dirigida ................................................. .215
, 87
Imágenes de una sola célula........................... ............................... Longitud de los telómeros ............................................... ......, 226
57–
v Transducción simple................ ..........................................204 63 TriKE ........................................... ............. 333–336, 338–342
ARNsi..... .................................................... ..........vi , 267–276 Tri-específico................................................... ............... 334 , 336 ,
SMART pool siRNA .......................................... 268 , 271 , 273 339 , 341
Gradiente de sacarosa ..... .........................................., 134, 137 Trogocitosis .................................................. ..... 232 , 253–264
132 Microscopía de superresolución... ..........................141–
tu
149 Bicapa lipídica soportada (SLB) ........ .......... 142, 152–155
158–163,
Ultracentrifugación................................................ 132–135, 137

Natural Killer Cells - Compressed Comprimido (201 372)

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Natural Killer Cells - Compressed Comprimido (201 372)

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Machine Translated by Google

188 Srinivas S. Somanchi y Dean A. Lee

Relación E:T Relación E:T

Relación E:T Relación E:T

2. Vuelva a suspender los sedimentos celulares a 1 × 10 6 células/mL de medio de cultivo

4. Incube durante 30 min a 37 °C en una incubadora de CO 2 y agite

células cada 10 min para promover la tinción uniforme.

Expansión de células NK usando K562 mbIL21 189

5. Lavar las células con 10 ml de medio completo RPMI para eliminar

6. Repita el paso de lavado dos veces más.

8. Realice el recuento de células y agregue medio completo RPMI para ajustar la

9. Contar y resuspender las células NK a 1 × 10 6/mL en medio completo RPMI ( ver

11. Agregue 100 ÿL de medio completo RPMI a las 5 columnas adyacentes

18. Incube la placa en CO 19. Después incubadora durante 4 h a 37 °C.

de la incubación, retire la placa y mezcle suavemente el contenido para promover una

20. Girar la placa a 400 g durante 1 min.

22. Lea la intensidad de la fluorescencia utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia

190 Srinivas S. Somanchi y Dean A. Lee

1. Una mayor dilución de la sangre en PBS mejorará la recuperación de las PBMC al

5. Si se recupera una gran cantidad de Ficoll-Paque junto con la interfaz de PBMC,

6. Mientras aspira el sobrenadante, raspe la capa de glóbulos rojos para eliminar la

8. El volumen del sedimento de células RBC-PBMC debe incluirse en el volumen de

9. El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep™ contiene

Expansión de células NK usando K562 mbIL21 191

11. El sistema de microesferas CD3 de Miltenyi está disponible como reactivo de

12. Si se utilizan menos de 300 millones de PBMC para el agotamiento de CD3,

15. Si se requieren grandes cantidades de células NK de la expansión, por

192 Srinivas S. Somanchi y Dean A. Lee

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación St.

4. Iliopoulou EG, Kountourakis P, Karamouzis MV et al 14. Meyer-Monard S, Passweg J, Siegler U et al (2009)

Expansión de células NK usando K562 mbIL21 193

Cultivo a gran escala y modificación genética de humanos

196 Natalia Lapteva et al.

Los cultivos en G-Rexes (óptimo 10 ml de medio por cm 2 de superficiede una

Estos métodos para la expansión de células NK y la transducción retroviral cumplen

1. Células de aféresis o PBMC criopreservadas o frescas.

2. La línea celular K562mbIL15-41BBL fue proporcionada amablemente por Dario

3. SCGM completo (C-SCGM): CellGro® Stem Cell Growth Media (CellGenix

4. Interleucina-2 (IL-2) (Proleukin, Prometheus Laboratories Inc.).

7. Matraz de cultivo G-Rex10 y G-Rex100 (Wilson Wolf Manufacturing). 8,1× PBS

10. Vectores gammaretrovirales que codifican un CAR para CD19 o GD2.

11. Placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejidos.

12. Solución de retronectina (Takara Bio Company).

2. Descongele un vial de 2 × 10 7 K562mbIL15-41BBL master cell bank (MCB) en

Expansión a gran escala y transducción retroviral de células NK 197

Número de % de células CD56 # de El numero total de

1 × 10 10 ~100 10 % 5 × 10 7 células de aféresis y 20 5 × 1,2 × 10 9

3. Transferir y resuspender las células descongeladas en 9 ml de agua tibia

4. Centrifugar las células a 400 × g durante 5 min, aspirar el sobrenadante.

5. Resuspender las células en 30 mL de C-SCGM y contar las células viables.

días en 30 ml de volumen total ( consulte la Nota 1).

7. En los días 3 y 4 de cultivo, extraiga 20 ml de sobrenadante de G-Rex10 y cuente las

8. Cuando los números de K562mbIL15-41BBL alcancen 15 × 10 6 celdas/G Rex10,

transfiera todas las celdas a un G-Rex100. Agregue medio C-SCGM a 400 ml de

9. Cuando el crecimiento de células K562mbIL15-41BBL en un frasco G-Rex100 alcance

cada 2 o 3 días ( consulte la Nota 2).

4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tres volúmenes

5. Superponga 30–40 mL de células en 15 mL de medio de separación de linfocitos (Ficoll-

198 Natalia Lapteva et al.

6. Recolectar la capa de células mononucleares en 2 volúmenes de medio de

7. Vuelva a suspender las células de aféresis en uno a cuatro volúmenes de C-SCGM y

9. Analice una alícuota de células por citometría de flujo para determinar la