REPORTE

VALIDAR EL MÉTODO DE RECUPERACIÓN DE

MICROORGANISMOS EN SUPERFICIES POR EL
MÉTODO DE CONTACTO

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

TÉCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO

QUÍMICA ÁREA INDUSTRIAL

PRESENTA:

ZAPATERO IBARRA DANA PAOLA

AUTORIZACIÓN DEL AUTORIZACIÓN DEL

ASESOR DE EMPRESA ASESOR DE LA UTSJR

SANDRA PÉREZ ROJAS ADRIANA SOLARES

SAN JUAN DEL RÍO, QRO.

AGOSTO DE 2022
2

2.2 AUTORIZACIÓN DE IMPRESIÓN

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2.3 DEDICATORIA
A mis padres por haberme mostrado el camino para el éxito en mis propios términos.
A mis abuelos paternos por mostrarme lo hermoso de la vida y como es ser una persona con
esencia única que marca vidas con amor.
Especialmente para ellos que incluso se desvivieron viéndome crecer y superándome.
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2.4 AGRADECIMIENTOS
Agradezco principalmente al universo por haberme puesto en el lugar correcto en el
momento pertinente y por darme las oportunidades que sólo yo tuve entre más personas.
Agradezco a mi familia que siempre me han brindado apoyo y amor cuando se trata de mi
vida. Específicamente mis padres y abuela paterna, que siempre mostraron las dos caras de
la moneda, que no se puede tener estabilidad sin haber recorrido un trayecto de
incomodidad y esfuerzo, no por obligación, sino por decisión y con mucho amor.

Finalmente, pero no menos importante, al equipo del área de microbiología en control de

calidad en Laboratorios Columbia S.A de C.V, que me dieron la atención y apoyo que
siempre necesité en el momento, no solo ámbito laboral y académico sino como las
personas con un gran corazón que pude encontrar, también gracias por las experiencias que
llevaré en mí el resto de mis días. Gracias por haber formado parte de mi camino en la recta
final.
5

2.5 ÍNIDICE

2.6 INTRODUCCIÓN.....................................................................................................7
3.1 CAPÍTULO I. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA..............................................7
3.1.2 Misión............................................................................................................................7
3.1.3 Visión.............................................................................................................................6
3.2 CAPÍTULO II. GENERALIDADES DEL PROYECTO............................................7
3.3 CAPÍTULO III. MARCO TEÓRICO........................................................................8
HVAC..................................................................................................................................10
Sanitizantes y limpiadores...................................................................................................11
Monitoreo ambiental de partículas viables..........................................................................11
Microorganismos usados......................................................................................................11
3.4 CAPÍTULO IV. DESARROLLO DEL PROYECTO Y SOLUCIONES
PROPUESTAS.............................................................................................................12
3.4.1 Introducción................................................................................................................12
3.4.2 Formulación del problema..........................................................................................12
3.4.2.1 Solución propuesta...................................................................................................13
3.4.3 Desarrollo del proyecto................................................................................................13
3.4.3.1.1 Etapa I: Resiembra...........................................................................................................13
3.4.3.1.2 Etapa II: Extracción..........................................................................................................14
3.4.3.1.3 Etapa III: Ajuste de transmitancia..................................................................................15
3.4.3.1.4 Etapa IV: Dilución.............................................................................................................15
3.4.3.1.5 Etapa V: Control positivo.................................................................................................16
3.4.3.1.6 Etapa VI: Inóculo de cupón..............................................................................................16
3.4.3.1.7 Etapa VII: Recuperación con el método de contacto......................................................18

3.5 PRUEBAS Y RESULTADOS..................................................................................19

3.5.1 Resultados de pruebas iniciales sin variables en experimentos...................................19
3.5.2 Resultados de pruebas con variables distintas.............................................................22
3.5.3 Resultados de las pruebas VII, VIII y X......................................................................27
CONCLUSIONES........................................................................................................28

ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Tabla 1. Principio para ajuste de transmitancia..............................................................................................18
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Tabla 2. Resultados de prueba I.......................................................................................................................23

Tabla 3. Resultados de prueba II......................................................................................................................23
Tabla 4. Resultados de prueba III....................................................................................................................24
Tabla 5. Resultados prueba V...........................................................................................................................25
Tabla 6. Resultados prueba VI.........................................................................................................................25
Tabla 7. Resultados de prueba VI.....................................................................................................................25
Tabla 8. Resultados prueba VI pt.2..................................................................................................................25
Tabla 9. Resultados de prueba VII pt.3............................................................................................................26
Tabla 10. Resultados prueba VIII....................................................................................................................26
Tabla 11. Resultados prueba X.........................................................................................................................27
Tabla 12. Resultados de prueba IX...................................................................................................................27
Tabla 13. Resultados prueba X.........................................................................................................................27
Tabla 14. Resultados prueba X.........................................................................................................................28
Tabla 15. Resultados prueba X.........................................................................................................................28
Tabla 16. Resultados prueba X.........................................................................................................................29
Tabla 17. Resultados prueba X.........................................................................................................................29
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2.6 INTRODUCCIÓN

3.1 CAPÍTULO I. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA

Historia de Laboratorios Columbia, S.A. de C.V.

En 1951 se fundó Laboratorios Columbia, una empresa farmacéutica dedicada a la
fabricación de medicamentos y productos farmacéuticos para uso humano; como
subsidiaria en México de un grupo español, propiedad del Marqués de Ruviralta. Para 1977,
la empresa contaba con aproximadamente 150 empleados. En noviembre de 1987, la
compañía fue adquirida por un grupo inversionista mexicano presidido por el Lic. Manuel
Martínez Domínguez, actual presidente de la organización. En 1988 Columbia mejoró su
posición en la industria químico-farmacéutica mexicana al pasar del lugar 54 al 33.
Buscando ampliar su mercado el 23 de febrero de 1989, Columbia adquiere Norwich Eaton
S.A. de C.V., la adquisición incluyo marcas, organización, una moderna planta y un
excelente terreno. Con esta fusión, Columbia alcanzo el lugar 24 dentro de la industria
químico-farmacéutica y este mismo año se adquiere también a Bio-chemie, una empresa
veterinaria para reforzar la línea veterinaria Norwich. En 1994 se adquiere la planta de
Tecnofarma y su línea de productos oncológicos, ese mismo año los establecimientos
mexicanos Colliere, compañía francesa con productor líderes como son Bengue y
Tamarine, así como una gran imagen y fuerza en el mercado de tiendas departamentales ya
que cuenta con una excelente línea de fragancias (Carolina Herrera, Hugo Boss Rochas,
etc.). Se crea también Columex, empresa inmobiliaria con un valor futuro de 170 millones
de dólares. En septiembre de 1994, Columbia se estableció en la ciudad de San Juan del
Río, ubicándose en la calle Oriente 10 No. 1, Nuevo Parque Industrial.
3.1.2 Misión
Contribuir a mejorar la salud de la sociedad en las áreas de farmacéuticos, cosméticos y
alimentos relacionados con la salud a través de:
 Productos actuales
 Productos del resultado de su investigación y desarrollo
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 Productos en licencia respetando la propiedad intelectual de patentes y marcas

 Personal altamente calificado

3.1.3 Visión
Ser reconocida por sus clientes, autoridades nacionales e internacionales, proveedores y
empleados como una de las mejores en:
 Desarrollo de tecnología
 Generador de empleos
 Contribuyente fiscal
 Empresa con sentido de responsabilidad social
 Excelente miembro de la sociedad
Giro

Químico-Farmacéutica

Área de desarrollo del proyecto

Microbiología en control de calidad

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3.2 CAPÍTULO II. GENERALIDADES DEL PROYECTO

Título

Validar el método de recuperación de microorganismos en superficies por el método de

contacto

Objetivo del proyecto

Determinar un procedimiento estandarizado que permita obtener resultados confiables en la

recuperación de microorganismos específicos para ser aplicable en el monitoreo ambiental
dentro de la empresa, además de conocer si el métodos seleccionado es eficaz para este
caso.

Justificación

Este proyecto establecido por la empresa y llevado a cabo por una sola persona del plantel,
tiene la finalidad de validar el método de contacto e hisopado dentro de la empresa
Columbia, con esto se busca establecer un procedimiento estandarizado que apoye al
momento de realizar monitoreos ambientales (es decir, la revisión de las áreas de trabajo)
en la planta de fabricación de fármacos.

La ejecución de este proyecto aportará a la experiencia individual del estudiante, que se

desarrolló durante el periodo de cuatro meses en el área de microbiología, una rama
disciplinaría que se deriva de la química por los métodos analíticos validados que se llevan
a cabo en los análisis de los medicamentos realizados en Columbia, esto para controlar la
calidad de los productos y evitar problemas al consumidor. De igual manera, este proyecto
e investigación aportará a la empresa que permitió ejercer en esta área.

Alcance
10

Como practicante se abarca el 50% de este proyecto, debido a que la documentación del
mismo se realiza en la empresa como un Procedimiento Normalizado Oficial (PNO).

3.3 CAPÍTULO III. MARCO TEÓRICO

En la industria farmacéutica es de suma importancia el poder brindar calidad en los
productos de consumo humano para la salud, por esto, existen los sistemas críticos en esta
industria. Los llamados sistemas críticos son esenciales en algunos procesos de
manufactura y facilitadores en otros, además, permiten el cuidado de los medicamentos
fabricados.

Sistemas críticos
Los que aplicados en Columbia son el agua, el aire comprimido y el HVAC
(Calentamiento, Ventilación y Aire acondicionado).

Agua potable
El agua potable es materia prima en la fabricación del producto y debe contar con los
parámetros establecidos en la NOM-127-SSA1-VIGENTE, Salud ambiental, Agua para
uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe
someterse el agua para su potabilización. (FARMACOPEA, Sistemas Críticos p.p 661
Agua para uso farmacéutico.)

Aire comprimido
El aire comprimido es otro sistema utilizado en la industria farmacéutica y de insumos para
la salud, entre sus principales usos están la operación del equipo, aire instrumental en áreas
peligrosas y como un procedimiento de enjuague para asegurar que la limpieza de los
frascos es adecuada. Éste es generado a partir del aire ambiental, el cual presenta,
normalmente, una serie de contaminantes que pueden representar variables negativas para
la calidad de los productos y para el desempeño del trabajo que se realiza con él. Por esto,
el sistema debe estar diseñado apropiadamente para el uso previsto. La ventaja de el uso de
11

aire comprimido es la reducción en el porcentaje de contaminación y requerimientos de

mantenimiento, además de requerimientos menores de energía y mejoramiento en la
productividad.

HVAC
El sistema de ventilación, calefacción y acondicionamiento de aire, es imprescindible para
contribuir al aseguramiento de la calidad y pureza del producto, así como favorecer las
actividades del personal que las lleva a cabo. Se requiere un ambiente controlado para las
áreas de fabricación en las que los medicamentos son fabricados o se encuentran expuestos,
esto se logra a través de medidas de segregación y control de aire que es suministrado,
permitiendo el control de las partículas viables y totales.
En el control ambiental el sistema HVAC es uno de los principales elementos, ya que
mediante la filtración, los caudales de aire y diferenciales de presión es posible establecer
una barrera a la contaminación física por partículas, microorganismos y evitar
contaminación cruzada.

Cada uno de estos sistemas críticos permiten obtener información acerca del estado de los
cuartos limpios, para el laboratorio de control de calidad microbiológico, en cada uno de
sus monitoreos ambientales, estos son ejecutados de manera mensual, según la NOM-059-
2015 en el Apéndice A Normativo. Áreas de fabricación. En el caso de Columbia, por
procedimiento, se hace también cuando hay mantenimiento de equipos y áreas, cuando se
realizan los paros eléctricos; que no son más que inactivación de energía eléctrica en toda
la planta y áreas separadas de la empresa, además se ejecutan estos monitoreos cuando hay
validaciones de nuevas máquinas y equipos que son importantes en producción. En cada
uno de estos, se hace el monitoreo de las áreas especificadas por el departamento que lo
requiera, dependiendo del caso; no hay límite para poder realizar el monitoreo de partículas
viables ni una condición especial, ya que como se menciona antes, el monitoreo es
solicitado por el departamento correspondiente.
12

En la industria farmacéutica es de suma importancia tener controladas las áreas de

producción y de análisis de fármacos en el área de control de calidad, por esto, es
fundamental realizar el monitoreo ambiental en la planta de trabajo. En esta sección se
abarcan las áreas con acero inoxidable y utensilios de este material usados en el proceso de
fabricación de medicamentos
Por tanto, una de las actividades fundamentales en el área de control de calidad, en el
departamento de microbiología, es determinar qué tan eficaces son las limpiezas en las
áreas de producción y sus respectivas herramientas de trabajo.

Debido a esto, el monitoreo ambiental es una herramienta para evaluar las condiciones y
tendencias ambientales, está diseñado para demostrar el control de partículas viables en un
área crítica, es decir, determinar el estado de los alrededores. El apartado 8.2.2.19 de la
NOM-059-SSA1-2015 (Buenas prácticas de fabricación de medicamentos), dice que la
empresa “Debe contar con un sistema de monitoreo de las variables críticas de acuerdo a la
FEUM a fin de cumplir con la clasificación del Apéndice A Normativo de la norma”. Este
procedimiento evalúa de forma cualitativa y cuantitativa la población microbiana de las
variables críticas, dicho de otra manera, brinda información acerca del ambiente de trabajo
para conocer desde raíz las fuentes de contaminación posibles.
13

muestra una tabla en la cual no se debe llegar a los límites permisibles, esto es para evitar
levantar desviaciones dentro de la empresa y por supuesto, hacer confiable la producción de
los medicamentos, haciendo saber que están en rangos confiables.

Para realizar el monitoreo ambiental, hay diferentes técnicas utilizadas, como:

 Sedimentación
 Volumétrico
 Contacto
 Hisopado

En la evaluación de la calidad microbiológica en monitoreo de superficies y áreas de difícil

acceso se hace mestreo con placa de contacto (tipo Rodac) e hisopado. Para este proyecto
se considera muestreo por contacto.

Muestreo con placa de contacto

El método de la placa de contacto se realiza con placas llenas de agar soya tripticaseína
sólido, con una superficie convexa que se presiona 10 segundos sobre la superficie a
evaluar. El método es utilizado para superficies planas. La desventaja de este método es que
no se utilizan para superficies irregulares, y si el medio es humedecido puede ocurrir la
concurrencia de microorganismos y el residuo del medio puede ser eliminado del sitio de la
muestra.

Los sistemas críticos en la industria farmacéutica se definen como los sistemas auxiliares
que tienen un impacto directo en el proceso y producto, en el caso de Columbia, son, el
agua, el HVAC y el aire comprimido.

En la industria de insumos para la salud, el agua es la sustancia más utilizada, esto

principalmente por ser la materia prima para fabricación del producto, incluso es
importante para el lavado de envases primarios, en la limpieza de áreas de fabricación y
equipos, en laboratorio de control de calidad, entre otras.
14

Las áreas de fabricación en donde los medicamentos o insumos para la salud están
expuestos requieren de un ambiente controlado, el cual se logra a través de medidas de
segregación y control de aire que es suministrado, permitiendo el control de partículas
totales y viables. El aire ambiental que se suministra a las áreas de fabricación, la
clasificación y cumplimiento de cada una de ellas depende directamente del sistema
HVAC.

HVAC
El acondicionamiento del aire se estructura en tres factores: ventilación, calefacción y
refrigeración, estos conceptos en inglés se traducen como Heating, Ventilating and Air
Conditioning, por sus siglas, HVAC.

Por consecuencia, la función esencial del sistema HVAC, es contribuir el aseguramiento de

calidad y pureza del producto, así como favorecer las actividades del personal que las lleva
a cabo.

Aire comprimido

Para producir medicamentos seguros, la planta completa debe ser considerada, ya que
puede representar un riesgo a la calidad del producto final.

Sanitizantes y limpiadores

Monitoreo ambiental de partículas viables

Microorganismos usados

Validación
15

Según …
Teniendo en cuenta lo anterior, la empresa cuenta con un procedimiento interno, este es el
monitoreo ambiental por el método de contacto e hisopado para superficies, sin embargo
este no se encuentra validado.
16

3.4 CAPÍTULO IV. DESARROLLO DEL PROYECTO Y

SOLUCIONES PROPUESTAS
3.4.1 Introducción

En esta sección se habla explícitamente del desarrollo del proyecto, se desarrollan las
propuestas para generar una solución a partir las pruebas experimentales y la prueba final,
también, cómo es que se lleva a cabo el procedimiento de solución.

En la sección anterior sólo se da el contexto y de qué trata el proyecto, por eso, se este
fragmento se encaminará a los resultados, no solo dando lugar a lo que se obtuvo sino lo
deseable, ventajas y desventajas que se tuvieron al inicio y fin de la experimentación y la
prueba final.

3.4.2 Formulación del problema

En la industria farmacéutica la limpieza de las áreas de fabricación es igual de importante

que los sistemas críticos que permiten tener un área de producción en óptimas condiciones,
por eso, se utilizan sanitizantes y limpiadores que garanticen un 99.99% de efectividad, ya
que así, se previene la contaminación del producto y el bienestar del consumidor.

Los medicamentos iniciales, semiterminados y terminados pueden estar contaminados con

microorganismos del ambiente o, específicamente, con los que se manejan en el cepario
interno del área de microbiología, no por contaminación cruzada con el laboratorio, sino
por condiciones propias de la materia prima, el pH, humedad y temperatura de la misma, el
almacén, las áreas de producción, el personal e incluso las condiciones que proporcionen
los materiales o recipientes para almacenamiento de los medicamentos.

Por esto, es importante poder aplicar el método de contacto en superficies de producción,

como son las paredes, el piso epóxico y acero que conforman a las máquinas que trabajan
con el medicamento y algunos recipientes de plástico o acrílico que almacenan a los
mismos.
17

Como parte del capítulo 3.4 se fundamenta la relación de este proyecto práctico
directamente con la empresa, con la variante en cuestión, de la aplicación a la planta de
fabricación de medicamento. En la práctica, se busca validar la técnica de recuperación de
microorganismos por el método de contacto a partir de un material específico, puesto que
conforma buena parte del equipo e inmobiliario en producción.

Esencialmente son tres materiales importantes que componen la planta de producción, los
cuales son: acero inoxidable, acrílico y piso epóxico. Este caso de estudio se limita solo a la
recuperación en acero.

3.4.2.1 Solución propuesta

3.4.3 Desarrollo del proyecto

Dentro del proyecto hay distintas etapas a llevar a cabo, estas son, resiembra del
microorganismo a partir del cepario mensual, extracción del microorganismo, ajuste de
transmitancia mediante el espectrofotómetro, dilución del microorganismo ajustado,
preparación del control positivo para la prueba, y finalmente, siembra del inóculo por
triplicado en los cupones y recuperación de microorganismo por el método de contacto.

3.4.3.1 Etapas de desarrollo del proyecto

A continuación, se describe detalladamente el desarrollo de cada una de las etapas
desarrolladas en el proyecto. Cabe mencionar que este procedimiento poseé ya los ajustes
que se realizaron a través de las pruebas experimentales, donde también se arrojaron las
características modificables para obtener un buen resultado.
3.4.3.1.1 Etapa I: Resiembra
El método de resiembra de microorganismos que se lleva a cabo en el área de
microbiología es en la superficie sólida del agar soya tripticaseína (o TSA por sus siglas en
inglés) ya que el medio provee los nutrientes para que crezcan los microorganismos
Escherichia coli y Staphilococus aureus.
18

La resiembra es una técnica que permite la supervivencia de los microorganismos en cortos

periodos de tiempo, los materiales que se usan son:
1. Mechero
2. Asas desechables
3. Tubo de ensaye con pico de flauta (dentro está el medio que será utilizado, su
nombre se debe a que en el tubo se agregan 20 mL de TSA y se coloca en un ángulo
de 20° para poder darle esa característica forma.
4. Cepa de los microorganismos, en este caso, E. coli y S. aureus.
5. Alcohol al 70%
6. Agua con cloro en un recipiente
El procedimiento para esto es principalmente limpiar el área donde se trabajará, con alcohol
al 70%, posteriormente prender el mechero para tener un área estéril y poder realizar la
resiembra sin contaminación. Teniendo el área estéril se puede proceder a raspar,
suavemente, con una asa desechable, de la cepa de trabajo el microorganismo, evitando que
se embarre en las paredes del tubo o que se derrame en el exterior y por último, se cierra del
tubo de la cepa de trabajo, posteriormente se destapa el tubo con pico de flauta y se
introduce la asa con el microorganismo y del fondo hasta arriba se unta el microorganismo
del asa, después esa línea se estría de izquierda a derecha desde abajo hacia arriba. Después
de esto, se tapa el tubo y se incuba de 30°C a 35°C en un periodo de 18 a 24 horas. máximo
para obtener crecimiento
3.4.3.1.2 Etapa II: Extracción
La extracción del microorganismo se realiza con los siguientes materiales:
1. Jeringa de 10 mL
2. Mechero
3. Tubo con solución transportadora BPO4
El procedimiento para extraer el microorganismo del tubo de resiembra consiste en obtener
el BPO4 con la jeringa, después de esto se harán enjuagues por medio de la presión que
ejerce el émbolo de esta jeringa, dicho de forma coloquial, arrastrar el microorganismo con
el líquido con ayuda de la jeringa. Finalmente cuando ya no hay restos de la resiembra en el
tubo pico de flauta, de nuevo se retira el líquido concentrado con el microorganismo y se
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vacía por completo en el tubo de BPO4 de nuevo. Este tubo es el concentrado que se debe
ajustar en el espectrofotómetro UV. Todo este proceso debe ser realizado con un área
estéril; el mechero brinda lo solicitado.
3.4.3.1.3 Etapa III: Ajuste de transmitancia
El equipo principal para esto es el espectrofotómetro UV-Vis. Además de:
1. Celda espectrofotométrica
2. Piseta con agua purificada
3. Concentrado del microorganismo
4. Jarra o recipiente con agua y cloro para realizar los enjuagues de celda necesarios
5. Micropipeta y puntas para micropipeta estériles de 100-1000 μL
Los enjuagues de la celda se realizan según la situación lo vaya requiriendo. En la siguiente
tabla se muestra el principio usado al momento de realizar esta actividad.

Tabla 1. Principio para ajuste de transmitancia

Es decir, que a menor concentración de microorganismo la transmitancia será mayor y por

tanto, se debe aumentar la cantidad de este, por otra parte, si la concentración es mayor,
habrá un porcentaje de transmitancia menor.

Se cuenta con un rango aceptable de 25 ± 2 %, es decir, el mínimo es 23% y el máximo

25%. Por esto se ajusta la transmitancia del microorganismo de acuerdo al criterio ya
mencionado anteriormente. Esto se hace con el fin de que, al momento de estriar el inóculo
de 20 μlde la dilución 106, haya menos de 100 Unidades formadoras de colonias (<100
UFC/ μL) o mejor dicho, que no hayan más de 100 colonias en la placa de agar soya
tripticaseína.
3.4.3.1.4 Etapa IV: Dilución
Esta etapa es más simple, que consiste en diluir más el ajuste del microorganismo. Los
materiales que se usan son:
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1. Tubo con microorganismo ajustado

2. Vórtex
3. Micropipeta y puntas para micropipeta estériles de 100-1000 μL
4. Tubos de 9 mL con BPO4
5. Jarra o recipiente con agua y cloro para desechar puntas de micropipeta usadas
La dilución del microorganismo es con el fin de que, la dilución 106 tenga menos de 100
UFC/ μL y obtener una cuenta viable de colonias, es decir, que sean contables las colonias
que puedan llegar a crecer en el medio de cultivo.
3.4.3.1.5 Etapa V: Control positivo
En esta sección se realiza el control que predetermina la cantidad de microorganismo que se
debe reguperar, esta se hace por duplicado para evitar errores o falsos resultados, también al
hacer esto se realiza un promedio para hacer el porcentaje de recuperación aceptable.

Los materiales necesarios son:

1. Dilución 106 del microorganismo
2. Micropipeta de 20 μL
3. Puntas para micropipeta estériles de 10-100 μL
4. Placas de agar soya tripticaseína
5. Asas desechables estériles
6. Mechero
7. Vórtex
8. Jarra o recipiente de agua con cloro
Lo que se realiza en esta etapa es inocular 20 μL de la dilución previamente agitada en el
vórtex, después, se deja reposar aproximadamente 30 segundos o un minuto el inóculo y
previamente se estría con un asa estéril desechable y se puede proceder a incubar a una
temperatura de 30-35 ºC.
3.4.3.1.6 Etapa VI: Inóculo de cupón
Los cupones selectos para el desarrollo del proyecto son de acero, por lo cual es necesario
sanitizar antes el material, para así poder recuperar el microorganismo sin presencia de
21

alguna bacteria u hongo genéralos por la contaminación del ambiente o propiamente de la

persona que manipula el material.
El material utilizado para esto es:
1. Cupones de acero (triplicado por prueba)
2. Whiper reutilizable estéril
3. Alcohol al 70%
4. Mechero
5. Dilución 106 del microorganismo
6. Micropipeta de 20 μL
7. Puntas para micropipeta estériles de 10-100 μL
8. Placas de contacto tipo Rodac (triplicado por prueba)
9. Asas desechables estériles
10. Mechero
11. Vórtex
12. Jarra o recipiente de agua con cloro
Esta etapa engloba la parte más importante, ya que, al momento de realizar el control
positivo se dará a conocer el promedio de microorganismos que se deben de recuperar en la
prueba.
Lo que se realiza dentro de la etapa es:
a. Empezar con la sanitización del cupón, se deja reposar 2 minutos el alcohol al 70%
sobre el cupón y después de este tiempo, se esparce en toda la superficie y
esperamos aproximadamente 3 o 4 minutos más para que actue el alcohol y aun así,
nos permita inocular el cupón sin tener contaminación externa.
b. Se agita la dilución 106 del microorganismo Staphilococcus aureus en el vórtex, en
un tiempo promedio de 5 a 10 segundos.
c. Después en la micropipeta ajustada a 20 μL se coloca la punta estéril y cerca del
área estéril (mechero) se retira la tapa que protege a la dilución y como consiguiente
se extraen los 20 μL del microorganismo.
d. Cuando se tiene la muestra se puede inocular finalmente sobre el cupón y estriar con
un asa desechable estéril.
22

e. Se puede repetir el estriado varias veces con la misma asa para evitar el eliminar
microorganismo por desechar el asa y usar una nueva.
3.4.3.1.7 Etapa VII: Recuperación con el método de contacto
La recuperación es por cupón, es decir, un cupón usa una placa de contacto, por lo tanto, se
realiza por triplicado para evitar el error intra experimental y también, no tener un sesgo de
agrupación en cada uno de los experimentos.
Cuando finalmente se haya impregnado el inoculo en el cupón de acero, dicho de otra
manera, se haya secado por completo la muestra sobre el cupón, se procede a muestrear con
la placa de contacto.
El muestreo conlleva evitar a toda costa contaminación por el analista o del medio
ambiente.
El método para recuperar el microorganismo es por contacto, se realiza de la siguiente
manera:
a. Destapar la placa de contacto, sin manipular la superficie cóncava del agar soya
tripticaseína (ATS por abreviatura).
b. Se recomienda muestrear desde el centro de la placa -se usa la superficie cóncava
del ATS para que haga contacto con el cupón- sin embargo, para evitar alguna
burbuja al momento del contacto es deseable, en este caso, empezar desde una de
las orillas de la placa e ir adhiriendo poco a poco el resto de la superficie del ATS.
c. Se ejerce un poco de presión con el dedo indice y medio, en el centro de la placa, así
se puede abarcar las orillas del agar y aprovechar toda la superficie estriada y no
perder rastro del microorganismo.
d. Finalmente, el tiempo de contacto de la placa y la superficie es de 30 segundos para
obtener mayor recuperación, a diferencia de los 10 segundos que se recomiendan.
Teniendo en cuenta todas estas consideraciones, es my factible poder obtener resultados
confiables y que se encuentren en un mismo rango, sin que se agrupen o haya falso
resultado.
 23

3.5 CAPÍTULO V. PRUEBAS Y RESULTADOS

Se realizan pruebas al inicio, con características distintas a las que se adaptó el proyecto
para obtener resultados en las pruebas finales.

Las primeras pruebas que se ejecutaron tienen las características siguientes:

I. Microorganismos S. aureus y E. coli

II. Cupones de acero
III. Inóculo de 10 μL
IV. Control positivo mediante la técnica de vaciado en paca
V. Dilución 106
VI. Sanitización de cupón e inoculación inmediata
VII. Estriado con asa por individual
VIII. Estriado de un área de 25c m2
IX. Pruebas individuales, evitando en masa

3.5.1 Resultados de pruebas iniciales sin variables en experimentos

Los resultados se muestran en tablas individuales, primero, mostrando el microorganismo y

los microlitros usados para realizar el ajuste de este en el espectrofotómetro, se incluye en
“C (+)” el conteo de Unidades Formadoras de Colonias por duplicado, de esto se hace un
promedio, después de esto se muestra un porcentaje, se establece que el 100% es deseado,
es decir, la media de C (+) es el 100% de recuperación. En la tabla siguiente se muestran
los cupones por triplicado y el número de UFC/ μL recuperados, posteriormente el
porcentaje al que equivale la recuperación.

Es importante mencionar que en estas pruebas aún no hay modificaciones o variables que
se consideren para obtener mejores resultados, ya que estos se consideran como pruebas
piloto del proyecto.
24
25

Las pruebas arrojaron los siguientes resultados:

PRUEBA I: En la primera prueba con

el microorganismo S. aureus se hace
la recuperación del 56% al 168% del
microorganismo, sin embargo, en la
repetición por triplicado no se
muestra una tendencia segura, que se
encuentre dentro de un rango
equiparable.

En cambio, con el microorganismo E.

coli no hay recuperación en absoluto
de microorganismo, lo cual demuestra
Tabla 2. Resultados de prueba I
un error en la técnica de contacto, por
lo que lo más acertado, es haber
muestreado fuera del área estriada de
25c m2 considerados en el cupón de
acero.
PRUEBA II: En la prueba II se
cambia la cantidad de inóculo, pasa
de 10 μL a 20 μL en ambos
microorganismos, por eso las medias
de C (+). La modificación es en
consecuencia de la recuperación de
los microorganismos en la prueba I.
La recuperación de S. aureus es
escasa a diferencia de la prueba I, se
determina que hay una variable a
Tabla 3. Resultados de prueba II
considerar en el procedimiento. En E.
26

coli hay una discrepancia desde la media de C (+), ya que no es posible obtener un conteo
mayor a 100 UFC/ μL, por tanto, lo que probablemente haya ocurrido es un mal ajuste de
transmitancia, dado que en ocasiones el microorganismo se llega a sedimentar y esto genera
un falso resultado desde el inicio de la prueba, en este caso, el control positivo. A pesar del
error, sigue existiendo recuperación mínima. Aún no se genera modificación alguna.

PRUEBA III: En la prueba III hay

buen conteo en la media de C (+),
por lo tanto, se consideran
aceptables.

Previo a la prueba se realiza una

investigación del tiempo que actua el
alcohol sobre superficies o utencilios
que se requieren estériles.

De nuevo es notable la pequeña

recuperación de microorganismo S.
aureus, a diferencia de E. coli que
muestra una recuperación mínima de
40% y una máxima de 86.15%.
Tabla 4. Resultados de prueba III
La diferencia notable de la recuperación en la prueba con E. coli es el tiempo posterior a
sanitización, es decir, el tiempo que se permite reposar al alcohol, a diferencia de sanitizar y
de inmediato inocular, se establece un tiempo de 4 o 5 minutos para que el alcohol actue,
esto demuestra que lo que se encontró por investigación acerca del alcohol es verdadero.
27

3.5.2 Resultados de pruebas con variables distintas

Al momento de desarrollar el proyecto a través de las pruebas iniciales, se presentaron

variaciones, que provocaron ciertos ajustes que al inicio no se consideraron, estos se
enumeran a continuación:

I. Cambio a un solo microorganismo

II. Vortexeo de la potencia
III. Inoculo en el cupón
IV. Proceso de sanitización del cupón, se modifica el tiempo de espera para inocular
V. Estriado de cupones
VI. Tiempo de recuperación de microorganismo (muestro por placa de contacto)
VII. Técnica para control positivo

Cada uno de estos ajustes se consideran para obtener una recuperación mayor a las
anteriores. Por lo tanto, estos sí influyen en los resultados, a continuación, se muestran los
resultados de estas pruebas.

Tabla 5. Resultados prueba IV

PRUEBA IV: El cambio en estos cupones es notable, se muestra una recuperación

ligeramente estándar, sin embargo sigue existiendo un cupón de los tres, en donde casi no
hay recuperación. En este caso es el tercer cupón de la primera ronda y el segundo y tercer
cupón de la segunda. La tercera ronda de la prueba V a pesar de que va del 32% al 59%
sigue sin poder pasar y ser contado como resultado satisfactorio.
28

Tabla 6. Prueba V ronda 2 y 3

PRUEBA V: La primera ronda de esta prueba fallo, ya que la recuperación es limitada y no

muestra mejora en el resto de los cupones. La segunda ronda no se encuentra en tendencia
ya que es necesario por lo menos un 60% de recuperación, es decir, pasaría si tuviera 60%
en lugar de 43.04%.

Tabla 7. Prueba V ronda 3

Se agrega la tercera prueba que también se ejecutó con las dos anteriores, sin embargo, se
aparta porque sí presenta una tendencia aceptable.

Tabla 8. Resultados de prueba VI

29

PRUEBA VI: Ambas rondas muestran buena recuperación, sin embargo, en el primer y
segundo cupón de la primera ronda y en el segundo de la segunda ronda no se encuentran
en un buen rango y, en consecuencia, no pasan los resultados.

Tabla 9. Resultados de prueba VI pt.2

Por otra parte, en la misma prueba, en la tercera ronda, se obtuvieron excelentes resultados.
Se ahonda más sobre ésta en las conclusiones.

Tabla 10. Resultados de prueba VI pt.3

La cuarta y quinta ronda también pertenecen a la prueba VI, por lo tanto, muestran una
recuperación buena, sin embargo, tampoco pasan las cualidades deseadas de los
porcentajes.
30

Tabla 11. Resultados prueba VII

PRUEBA VII: Ninguna ronda pasa los criterios, por lo cual esta prueba también es
descartada de lo que se desea obtener como resultado.

Tabla 12. Resultados prueba VIII

PRUEBA VIII: La recuperación sigue sin ser satisfactoria, hasta el momento se han
considerado las mismas características porque a pesar de no ser los resultados esperados,
hay mayor recuperación a comparación de las pruebas iniciales (PRUEBAS I-IV).
31

Tabla 13. Resultados prueba IX

pt. 2

Tabla 14. Resultados prueba IX

PRUEBA IX: Dentro de ésta se hicieron 15 rondas, por triplicado al igual que el resto, sin
embargo, se eliminan 11 rondas debido a que la recuperación es imperceptible, sí hay
mayor a diferencia de las primeras pruebas como ya se mencionó, pero no son tan
destacables como las cuatro que se apartaron para este caso.
32

3.5.3 Resultados de las pruebas VII, VIII y X

Las pruebas de limitantes se llevaron a cabo en diferentes días, por consiguiente, se

reportan las concentraciones de microorganismo a diferente transmitancia, además, se
agregan los resultados que se obtuvieron, a continuación, mostrados en una tabla:

Tabla 15. Resultados aceptables de pruebas

En esta última tabla lo que se presenta son los resultados satisfactorios de las pruebas VII,
VIII y X, por lo cual son separadas y descritas en una sección distinta, dado que a pesar de
las variables que se modificaron previamente, ninguna prueba había pasado las
características que se necesitaban.

Es notable que en los primeros dos resultados no es tan variable la media de C (+), y
aunque en la última sí cambia bastante, este no fue factor para obtener buena recuperación
con óptimos resultados, un buen rango, que no sea tan variante.
33

CONCLUSIONES

En consecuencia de lo expuesto en el reporte y las pruebas ejecutadas, el objetivo del

proyecto se cumple, ya que se obtienen resultados confiables a través de un procedimiento
estandarizado por tiempos, desde el ajuste de transmitancia, el tiempo de muestreo con
placa de contacto, la sanitización de los cupones, agitación de la dilución que se utiliza y el
tiempo y técnica de estriado.

Además, el método es eficaz para recuperación de microorganismos en el acero, en caso de

ser necesario, en la planta de producción.

El análisis por separado de las pruebas que no dieron resultados satisfactorios, dieron a
conocer que había algún problema directamente con la técnica, por esto, se implementaron
mejoras y cambios a lo largo de las pruebas.

Los cambios influyentes y por los cuales se separaron las pruebas, se presentan descritos a
continuación:

1. Tiempo en ajuste de transmitancia: Es importante que al momento de agitar la

muestra de microorganismo, el tiempo de pasar a la celda espectrofotométrica no se
exceda de 3 segundos, ya que esto influye en la sedimentación del microorganismo,
aunque S. aureus no se sedimente con rapidez, esto es de suma importancia.
2. Técnica de control positivo: Es recomendado hacerlo por estriado en placa, no hay
problema en hacer vaciado en placa, sin embargo, para la técnica de recuperación,
dado que se estría en el cupón, resulta más conveniente y los resultados pueden ser
equiparables.
3. Tiempo de sanitización: En las primeras pruebas no se dió tiempo de espera previo a
la limpieza de los cupones, luego de hacer una breve investigación se puso a prueba
si podría ser una amenaza para la recuperación de microorganismos y a partir de
esto, se determinó un tiempo de espera de tres minutos y máximo cinco para poder
inocular en el cupón. Puede ser un minuto o dos para dejar reposar el alcohol y
34

después de esto, esparcirlo sobre toda la supercie del cupón y esperar dos o tres
minutos más.
4. Técnica de estriado: Es necesario estriar con la misma asa desechable estéril hasta
que el inóculo sea consumido por el cupón, aparte de hacer el estriado suavemente
dentro del área específica de 25 cm2.
5. Tiempo de agitación de la dilución: El tiempo que sea agitada la dilución es
influyente, ya que al momento de pipetear, si está muy sedimentado aún el
microorganismo, no será posible extraer una cantidad suficiente y como
consecuencia no habrá recuperación satisfactoria, como ocurrió en las pruebas.
6. Técnica de muestreo y tiempo: Al momento de que se hace contacto directamente
de la parte cóncava de la placa de contacto y la superficie que tiene el inóculo del
microorganismo hay posibilidad de generar burbujas y no tener un buen porcentaje
de recuperación. Añadiendo a esto, el tiempo de muestreo recomendado en el
análisis de resultados, es de 30 segundos.

Retomando las recomendaciones anteriores, generadas a partir del análisis de cada una de
las pruebas ejecutadas, se asegura la confiabilidad de los resultados expuestos en la sección
3.5.3, ya que estas pruebas sí fueron ejecutadas con estas mejoras.