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10200 PLANCTON*
10200 A. Introducción
El plancton son formas de vida acuáticas microscópicas con poca o ninguna
capacidad para resistir el movimiento de las corrientes y, por lo tanto, viven flotando
libremente (suspendidas) en aguas naturales. Esta sección cubre tanto el
fitoplancton como el zooplancton. El fitoplancton son algas microscópicas que se
presentan en formas unicelulares, coloniales o filamentosas; la mayoría son
fotosintéticos y son consumidos por el zooplancton u otros organismos acuáticos
que se alimentan por filtración. El zooplancton de agua dulce consiste principalmente
en protozoos, rotíferos, cladóceros y copépodos; zooplancton de agua marina son
más diversos. Otros organismos acuáticos microscópicos planctónicos se tratan en
otros lugares donde: hongos zoospóricos en la Sección 9610F; cetos de hifomia
acuática en la Sección 9610G; y bacterias en la Parte 9000.
1. Importancia
El plancton, en particular el fitoplancton, se ha utilizado durante mucho tiempo
como indicador de la calidad del agua, tanto en términos de cultivos en pie como
de composición de especies.1–4biológicos
Influyen fuertemente
de la calidaden
delciertos aspectos
agua (p. ej., pH,no
color,
sabor, concentración de oxígeno, y olor). Algunas especies prosperan en aguas
altamente eutróficas o ácidas, mientras que otras son sensibles (es decir,
negativamente afectadas por) desechos orgánicos y/o químicos. Debido a las
estrechas tolerancias ambientales, ciertas especies son extremadamente útiles
para determinar la calidad histórica del agua y, por lo tanto, la futura dirección del
manejo.5 Además, la composición de una comunidad de fitoplancton indica la
calidad del alimento para el zooplancton, con implicaciones para las pesquerías.
Por lo tanto, las composiciones de las comunidades de fitoplancton y
zooplancton son componentes críticos de las evaluaciones de la calidad del agua.
Sin embargo, debido a su naturaleza transitoria y a su distribución irregular, la
utilidad de los tablones como indicadores de la calidad del agua es limitada.6–12
La información sobre el plancton
interpreta como
mejor en indicadores
el contexto de lafisicoquímicos
de datos calidad del agua se
y otros
datos biológicos recopilados simultáneamente. El plancton también se puede usar
para indicar la eficiencia relativa de las plantas de tratamiento de agua y la
probabilidad de que las fuentes de agua subterránea estén directamente
influenciadas por el agua superficial.13–18 Algunas especies de plancton desarrollan
floraciones nocivas que pueden disminuir la claridad, dañar las industrias recreativas
y acuícolas y crear sabores y olores desagradables en el agua potable.19 Las
floraciones de algas pueden incluso crear condiciones anóxicas o producir toxinas
que envenenan tanto a los organismos acuáticos como terrestres, lo que resulta en
enfermedades o la muerte de animales o humanos.20­29 Por lo tanto, las
floraciones de algas en ambientes marinos y de agua dulce preocupaciones
ecológicas, económicas y de salud pública.
Tanto las especies marinas como las de agua dulce de cianobacterias (comúnmente
denominadas algas verdeazuladas), dinoflagelados y diatomeas producen toxinas.
La mayoría de los incidentes marinos están asociados con dinoflagelados y
diatomeas, mientras que la mayoría de los incidentes en agua dulce son causados por
* Aprobado por el Comité de Métodos Estándar, 2011.
Grupo de trabajo conjunto: 22.ª edición: Ann L. St. Amand (presidenta), Katherine
T. Alben, Robert R. Bidigare, Marion G. Freeman, Jennifer L. Graham, Patrick K.
Jagessar, Stanford L. Loeb, Harold G. Marshall, Robert A. Sweeney, Kenneth J. Wagner.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
cianobacterias.26,30 Varias de estas toxinas se han encontrado en mariscos y
agua potable, y han producido enfermedades y muertes en humanos.31,32
Muestreo y orientación analítica para floraciones de algas y toxinas asociadas
actualmente no están incluidas en los métodos estándar (degustación). ­ y los
compuestos de olor se discuten en la Sección 6040); sin embargo, hay orientación
general disponible.33–37
2. Referencias
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1
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PLANCTON (10200)/Colección de muestras
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Método de consenso para la determinación de aguas subterráneas bajo la influencia
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SCHLOESSER Y DJ THORNBRUGH. 2009. Eutrófica
10200 B. Recolección de muestras
1. Consideraciones generales
El enfoque de muestreo y la selección del sitio dependerán de los objetivos
del estudio. La frecuencia de muestreo, la ubicación del sitio, la hora del día
en que se recolectan las muestras, el tipo de muestras recolectadas y cómo
se recolectan deben basarse en los objetivos del estudio.1,2 Coloque las
estaciones de muestreo lo más cerca posible de las estaciones de muestreo
químico y bacteriológico para garantizar la máxima correlación de los
resultados. Establecer suficientes estaciones en tantos lugares como sea
necesario para definir adecuadamente los tipos y cantidades de plancton
presentes en las aguas estudiadas. La naturaleza física del agua (estancada,
corriente o marea) influirá en gran medida en la elección de las estaciones de
muestreo. El uso de sitios de muestreo seleccionados por investigadores
anteriores generalmente asegura que los datos históricos estén disponibles,
lo que conducirá a una mejor comprensión de los resultados actuales y
brindará continuidad en el estudio de un área.
En el trabajo de arroyos y ríos, coloque estaciones de muestreo aguas
arriba y aguas abajo de las fuentes sospechosas de contaminación y de los
principales afluentes, así como a intervalos apropiados en todo el tramo bajo
investigación. Si es posible, coloque estaciones en ambos lados del río porque
es posible que el agua del río no se mezcle lateralmente en largas distancias
río abajo. Del mismo modo, investigue los afluentes que se sospeche que
estén contaminados, pero interprete con cuidado los datos de un pequeño
arroyo porque gran parte del plancton puede ser perífito, como resultado de la
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
ción de las aguas dulces de EE.UU.: análisis de los daños económicos potenciales.
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mares, pág. 257. Elsevier, Nueva York, Nueva York
fregado de sustratos naturales por corrientes de agua. Las contribuciones
de plancton de los lagos, embalses y áreas de remanso adyacentes, así
como los organismos del suelo arrastrados a la corriente por la escorrentía,
también pueden influir en la interpretación de los datos. Además, la
profundidad a la que se descarga el agua de los embalses estratificados
aguas arriba puede afectar al plancton.
Debido a que el agua de los ríos y arroyos por lo general está bien
mezclada verticalmente, el muestreo del subsuelo (es decir, el medidor
superior o una combinación de dos o más estratos) a menudo es adecuado
cuando se recolecta una muestra representativa. Puede haber problemas
causados por la estratificación debido a las descargas térmicas, la mezcla de
aguas más cálidas o más frías de los afluentes y embalses, la intrusión de sal
debido a la influencia de las mareas u otras circunstancias que favorecen las
picnoclinas bien definidas.3 Muestra en el cauce principal de un río y evite
lodazales, ensenadas o áreas de remanso a menos que uno de los objetivos
de la investigación sea caracterizar tales áreas. Las muestras recolectadas
en el canal principal de un río son las más representativas de las condiciones
generales, mientras que las áreas de lodazales, ensenadas y remansos son
más representativas de los hábitats localizados. En los ríos que se mezclan
vertical y horizontalmente, mida las poblaciones de plancton mediante el
examen de muestras periódicas recogidas en la mitad de la corriente entre
0,5 y 1 m por debajo de la superficie. Al configurar un programa de muestreo,
recuerde que los datos de muestras separadas siempre se pueden combinar,
2
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PLANCTON (10200)/Colección de muestras
pero los datos de compuestos no se pueden extrapolar a muestras discretas.
Si la distribución del plancton es uniforme, use un esquema de muestreo aleatorio para
acomodar las pruebas estadísticas. Incluya una selección aleatoria de sitios de muestreo y
transectos, así como una recolección aleatoria de muestras de cada sitio. Por otro lado, si la
distribución del plancton es variable o irregular, incluya más sitios de muestreo, recopile
muestras compuestas y aumente la repetición de muestras. Utilice las pruebas estadísticas
adecuadas para determinar la variabilidad de la población.
Al tomar muestras de un lago o embalse, utilice una red de cuadrículas o líneas
transversales en combinación con procedimientos aleatorios. Tome suficientes muestras para
que los datos sean significativos. Si bien no existe un procedimiento estándar inequívoco,
considere muestrear una cuenca lacustre circular en puntos estratégicos a lo largo de al
menos dos transectos perpendiculares que se extiendan de orilla a orilla, e incluya el punto
más profundo de la cuenca. Considere muestrear una cuenca larga y angosta en varios puntos
a lo largo de al menos tres transectos paralelos regularmente espaciados que sean
perpendiculares al eje largo de la cuenca, con el primero cerca de la entrada y el último cerca
de la salida. De manera similar, considere muestrear una bahía grande a lo largo de varios
transectos paralelos que sean perpendiculares al eje longitudinal de la bahía. Debido a que
se requieren muchas muestras para evaluar completamente el conjunto de plancton, puede
ser necesario restringir el muestreo a puntos estratégicos (p. ej., cerca de tomas y descargas
de agua, constricciones en el cuerpo de agua y bahías importantes que pueden influir en la
cuenca principal). Si solo se puede establecer un sitio de muestreo, una ubicación pelágica
de aguas abiertas cerca del punto más profundo de un lago o embalse generalmente se
considera la más representativa.
En lagos, embalses y estuarios donde las poblaciones de plancton pueden variar con la
profundidad, recopile muestras de todas las zonas de mayor profundidad o masas de agua,
concentrándose en la zona eufótica para el fitoplancton y la columna de agua completa para
el zooplancton. Las profundidades de muestreo se determinarán en función de la profundidad
del agua en la estación, la profundidad de una termoclina o picnoclina u otros factores. En
áreas poco profundas (2 a 3 m de profundidad), las muestras del subsuelo recolectadas a 0,5
a 1 m pueden ser adecuadas. En áreas más profundas, tome muestras a intervalos regulares
de profundidad. En los estuarios, muestree por encima y por debajo de la picnoclina. Los
intervalos de profundidad de muestreo varían para estuarios de diferentes tamaños y
profundidades, pero utilice profundidades representativas del rango vertical. A menudo se
utiliza el muestreo compuesto por encima y por debajo de la picnoclina. En el muestreo
marino, el alcance de la recolección de muestras dependerá de la intención del estudio y
alcance.
Pueden surgir circunstancias especiales sobre la plataforma continental, donde es
importante muestrear toda la gama vertical. Tome muestras en estaciones aproximadamente
equidistantes de la costa hacia el mar. En cada estación, tome una serie vertical de muestras
desde la superficie del agua hasta casi el fondo, agregando gradualmente más estaciones a
lo largo de la plataforma. Se pueden tomar muestras al azar del bentos para recolectar células
o quistes en reposo latentes. Más allá de la plataforma (en aguas pelágicas), muestree en la
zona fótica desde la superficie hasta la termoclina (para fitoplancton) o más profunda (para
zooplancton).
Las profundidades de muestreo varían, pero a menudo se realizan a intervalos de 10 a 25 m
por encima de la termoclina, a intervalos de 100 a 200 m desde la termoclina hasta los 1000
m de profundidad, y luego a intervalos de 500 a 1000 m en niveles más profundos.
Las muestras generalmente se denominan muestras de "superficie" o
"profundidad" (subsuperficial). Las muestras de profundidad se toman a cierta profundidad
establecida, mientras que las muestras de superficie se toman tan cerca de la superficie del agua como sea posible.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
posible. Una muestra “desnatada” de plancton superficial (neuston) puede ser reveladora; sin
embargo, normalmente no incluya una cantidad desproporcionada de película superficial en
una muestra de superficie porque el plancton neustónico4 a menudo queda atrapado en la
película superficial con polen, polvo y otros detritos. Es posible que se necesiten métodos
especiales para muestrear organismos de la superficie.5 La frecuencia de muestreo depende
de la intención del estudio, el rango de fluctuaciones estacionales, las condiciones
meteorológicas, la adecuación del equipo y la disponibilidad del personal. Seleccione una
frecuencia de muestreo en algún intervalo más corto que la tasa de rotación de la comunidad
de plancton. Esto requiere considerar la duración del ciclo de vida, la competencia, la
depredación, el lavado y el desplazamiento actual. El muestreo frecuente del plancton es
deseable debido a la variabilidad temporal normal y el carácter migratorio de la comunidad de
plancton, pero no siempre es práctico. Las migraciones verticales diarias ocurren en respuesta
a la luz solar, las concentraciones de nutrientes o los depredadores. Los vientos, las corrientes
cambiantes y las mareas producen migraciones horizontales aleatorias o derivas. Ambos tipos
de migraciones afectarán los datos del plancton. La caracterización ideal puede requerir un
muestreo diario o más frecuente a múltiples profundidades. Cuando esto sea imposible, el
muestreo semanal, quincenal, mensual o incluso trimestral puede seguir siendo útil para
determinar cambios importantes en la población.
En regiones de ríos, arroyos y estuarios sujetos a la influencia de las mareas, espere
fluctuaciones en la composición del plancton durante un ciclo de mareas. Un patrón de
muestreo típico en una estación de estuario incluye una serie vertical de muestras tomadas
desde la superficie, a través de la picnoclina, hasta cerca del fondo, recolectadas a intervalos
de 3 h durante al menos dos ciclos de marea completos. Una vez que se reconoce un patrón
característico, se puede modificar la rutina de muestreo. Si el enfoque del muestreo no
requiere una caracterización completa pero sí influencias limitantes, puede ser adecuada
cierta estandarización para hacer coincidir los ciclos de marea con cada conjunto de muestras.
Se ha publicado una serie útil de referencias sobre metodología oceanográfica y de agua
dulce.6–12 Además, se encuentran disponibles impresas
para
numerosas
el fitoplancton
referencias
marino,taxonómicas
estuarino
y de agua dulce.13–35 Además, hay disponibles varios recursos excelentes en Internet para
verificar taxonomía y autoridad fiscal onómica.36 –37
2. Procedimientos de muestreo y almacenamiento
Una vez que se hayan determinado las ubicaciones de muestreo, las profundidades y la
frecuencia, prepárese para el muestreo de campo. Utilice recipientes de muestra opacos
porque incluso una breve exposición a la luz durante el almacenamiento alterará los valores
de clorofila. Las botellas de almacenamiento de muestras deben estar hechas de polietileno o
vidrio para evitar la contaminación por iones metálicos, lo que puede generar errores
significativos al realizar ensayos de algas o mediciones de productividad. De manera similar,
en los programas de muestreo de múltiples analitos, almacene los pigmentos de algas en
botellas sin residuos ácidos.
Por ejemplo, no utilice botellas que contengan conservantes ácidos para nutrientes o solución
de Lugol cuando mida microscópicamente el fitoplancton: los conservantes ácidos impiden los
análisis de clorofila y otros pigmentos.
Para evitar confusiones o errores, etiquete cada contenedor con la fecha de muestreo,
número de crucero, estación de muestreo, área de estudio (p. ej., río, lago, embalse), tipo de
muestra y profundidad. Use etiquetas a prueba de agua y tinta a prueba de agua. Cuando sea
posible, encierre los recipientes de recolección en un recipiente protector para evitar roturas.
No agregue conservantes a los recipientes antes de tomar muestras para evitar posibles
3
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PLANCTON (10200)/Colección de muestras

botellas de muestra sobrellenadas, adiciones de conservantes incorrectas y

contaminación con conservantes potencialmente peligrosos. El tamaño de la muestra
depende del tipo y número de determinaciones a realizar; el número de repeticiones
depende del diseño estadístico del estudio y de los análisis estadísticos seleccionados
para la interpretación de los datos. Siempre diseñe un estudio en torno a un objetivo
con un enfoque estadístico predefinido en lugar de ajustar los análisis estadísticos a
los datos ya recopilados.

En un libro de registro de campo, anote la ubicación de la muestra, la profundidad,

el tipo, la hora, las condiciones meteorológicas, la turbidez, la temperatura del agua,
la salinidad, otras observaciones significativas y, si es posible, fotodocumente y
registre las coordenadas de la muestra utilizando un sistema de posicionamiento
global portátil (GPS). ). Los cuadernos de campo con papel impermeable son muy
adecuados. Los datos de campo son invaluables cuando se interpretan los resultados
analíticos y, a menudo, ayudan a explicar los cambios inusuales debido al carácter
variable del medio ambiente acuático. Recopile muestras coincidentes para análisis
químicos que ayuden a definir las variaciones ambientales que podrían afectar al
plancton.
una. Fitoplancton: 1)
Procedimientos de muestreo: si se espera que la densidad del fitoplancton sea
baja (p. ej., en aguas oligotróficas), tome una muestra de más de 1,0 L. En aguas
eutróficas más ricas, tome una muestra de 0,1 a 1,0 L. El tamaño de la muestra
puede afectar los resultados: sea consistente y aplique la experiencia con el cuerpo
de agua o las técnicas de análisis para obtener la cantidad correcta de muestra para
un análisis significativo.
Recoja muestras adicionales (de 0,5 a 1,0 l) si las muestras deben limpiarse con
ácido para eliminar las escamas de diatomeas/crisofitas o deben enviarse para su
verificación.
Las redes no son adecuadas para la mayoría de los muestreos cuantitativos de
fitoplancton. Teóricamente, las redes capturan algas más grandes que el tamaño de
la malla, mientras que las formas más pequeñas pasan, por lo que el nanoplancton
(2,0 a 20 m) y el picoplancton (0,2 a 2,0 um) pueden perderse por completo. En la
práctica, sin embargo, las redes a menudo capturan colonias y filamentos más
grandes, mientras que los taxones más pequeños fluyen a través de ellos. Además,
el paso de formas más grandes es bien conocido, aunque rara vez cuantificado. Las
pérdidas netas están influenciadas por la composición de la comunidad, la calidad y
el tamaño de la malla, la velocidad de muestreo, el volumen muestreado y la
obstrucción de la red. una caracterización poco fiable y no cuantitativa de la mayoría
de las comunidades de fitoplancton. Sin embargo, las redes siguen siendo una
poderosa herramienta de recopilación cualitativa, especialmente en aplicaciones de
enseñanza. Figura 10200:1. Características estructurales de los muestreadores de agua comunes,
Kem merer (izquierda) y Van Dorn (derecha).

Para evaluaciones cualitativas y cuantitativas, recopile muestras de agua enteras
(sin filtrar ni filtrar) con una botella de recolección que consiste en un tubo cilíndrico
con tapones en cada extremo y un dispositivo de cierre. Baje el muestreador abierto
a la profundidad deseada y active el mecanismo de cierre (esto puede implicar un
mensajero o tirar de la línea). Si es posible, obtenga muestras compuestas de varias
profundidades o agrupe muestras repetitivas de una profundidad. Los muestreadores
más utilizados que funcionan según este principio son los muestreadores Alpha,
Kemmerer,26 Niskin/Nansen y Van Dorn27 (Figura 10200:1).
Estos muestreadores recolectan todos los tamaños de fitoplancton, que
posteriormente pueden segregarse filtrando estas muestras de agua completas a
través de redes con varios tamaños de malla. (NOTA: Las partículas más grandes
pueden pasar a través de tamaños de malla más pequeños de lo que indicaría su eje
largo. Seleccione los tamaños de malla apropiados para concentrar cuidadosamente
los diversos tamaños de fitoplancton típicos del sistema acuático que se está
estudiando y prepárese para la superposición.28,38)
Van Dorn suele ser el muestreador preferido para cultivos en pie, productividad
primaria y otras determinaciones cuantitativas porque no inhibe el flujo libre de agua
a través del cilindro. En situaciones marinas y de aguas profundas, se prefiere la
botella Niskin/Nansen. El muestreador Niskin/Nansen tiene el mismo diseño que el
muestreador Van Dorn, excepto que se puede moldear en serie en una línea para
muestrear múltiples profundidades simultáneamente con el uso de mensajeros
auxiliares. Los dispositivos de activación de estos muestreadores son sensibles, así
que evite el manejo brusco. Baje siempre el muestreador al agua; no lo deje caer.
Los muestreadores Kemmerer y Van Dorn tienen capacidades de 0,5 L o más. Los
dispositivos de muestreo de polietileno o cloruro de polivinilo son preferibles a los de
metal porque estos últimos liberan iones metálicos que pueden contaminar la muestra.
En aguas poco profundas, utilice un muestreador de lodo de superficie Jenkins,39
un muestreador de botella modificado para que se sostenga horizontalmente,40 o un
muestreador bacteriológico adecuado.41

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PLANCTON (10200)/Colección de muestras
Para una mayor velocidad de recolección y para obtener grandes cantidades
de organismos medidas con precisión, use una bomba. Las bombas peristálticas
y de diafragma son menos dañinas para los organismos que las bombas
centrífugas.42 Los impulsores de las bombas centrífugas pueden dañar los
organismos, al igual que el paso a través de la manguera.43 Baje una manguera
con peso, conectada a una bomba de succión, a la profundidad deseada y bombee
agua hasta el nivel deseado. superficie. Las bombas pueden suministrar una
muestra homogénea desde una profundidad dada o una muestra integrada desde
la superficie hasta una profundidad particular. Si se usa una bomba centrífuga,
tome muestras de la línea antes de que lleguen al impulsor. Para que las muestras
se analicen en busca de compuestos organoclorados, utilice tubos de
tetrafluoroetileno (TFE).
2) Procedimientos de almacenamiento—Para examinar muestras vivas, llene
parcialmente los recipientes y guárdelos en un refrigerador o hielera en la
oscuridad (si no usa botellas opacas); examinar las muestras inmediatamente
después de la recolección.
Si no se puede examinar el material vivo o si se va a contar el fitoplancton más
tarde, conserve la muestra. Existen múltiples conservantes de fitoplacton. La
solución de Lugol y el glutaraldehído son los más utilizados; otros incluyen
formalina, merthiolate y fijador “M3”. Además, agregar algunos cristales de sulfato
de cobre a cualquier solución madre conservante ayuda a mantener el color de
las algas. PRECAUCIÓN: Todos los conservantes son un riesgo químico peligroso;
consulte las hojas de datos de seguridad (SDS) correspondientes antes de trabajar
con cualquier conservante. El glutaraldehído y la formalina, en particular, deben
usarse en un área bien ventilada o en una campana de flujo positivo.
a) Solución de Lugol: la solución de Lugol , que se puede usar para la mayoría
de las formas (p. ej., flagelados desnudos), tiñe los organismos que almacenan
almidón (especialmente las clorofitas y las criptofitas) y tiende a hacer que la
mayoría de las cianobacterias se asienten. Desafortunadamente, la solución ácida
de Lugol disuelve los cocolitos de los cocolitóforos (que son comunes en los
estuarios y las aguas marinas), tiende a causar la desintegración de las crisófitas
de agua dulce y algunas colonias de cianobacterias (especialmente Microcystis y
Aphanizomenon) , y debe ser enriquecida cada 6 a 12 meses porque de su
volatilidad. La solución de Lugol (y, en menor medida, la formalina) también
suprime la autofluorescencia.
Para conservar muestras con solución de Lugol, agregue 0,3 ml de solución
de Lugol a 100 ml de muestra y guárdela en la oscuridad. Para el almacenamiento
a largo plazo, agregue 0,7 ml de solución de Lugol por cada 100 ml de muestra.
La muestra debe verse como un té débil. Si la solución de Lugol no se puede
volver a agregar cada 6 a 12 meses, agregue formalina tamponada hasta una
concentración final mínima del 2,5 % después de 1 h (sin embargo, la formalina
tiende a distorsionar muchas células). Alternativamente, se puede agregar
glutaraldehído a una concentración final de 0,25 a 0,5 %, lo que da como resultado
una menor distorsión celular.
Prepare la solución de Lugol disolviendo 20 g de yoduro de potasio (KI) y 10 g
de cristales de yodo en 200 ml de agua destilada que contenga 20 ml de ácido
acético glacial.44 La modificación de Utermohl45 de la solución de Lugol da como
resultado una solución neutra o ligeramente alcalina.
Prepare la solución de Lugol modificada disolviendo 10 g de KI y 5 g de cristales
de yodo en 20 ml de agua destilada, luego agregue 50 ml de agua destilada en la
que se hayan disuelto 5 g de acetato de sodio anhidro. Esto preserva a los
cocolitóforos (que son más comunes en aguas marinas) pero sería menos efectivo
para otros flagelados. b) Glutaraldehído: el glutaraldehído pertenece a la misma
clase química que la formalina, pero se usa en una concentración mucho más
baja (0,25 a 0,5 % versus 3 a 4 % de concentración final). El glutaraldehído
también
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
causa una distorsión mínima, tiende a preservar la estructura de la colonia en la
mayoría de los grupos de algas, dura años en las muestras sin degradación (la
formalina puede formar cristales después de 15 años) y conserva la
autofluorescencia. Siempre que el porcentaje de conservante no exceda el 2%,
no se necesita ningún cálculo de compensación. Como resultado, el glutaraldehído
ha ganado prominencia en el trabajo de fitoplancton y perifiton de agua dulce.
Conserve las muestras agregando glutaraldehído neutralizado para obtener
una concentración final de 0,25 a 0,5 %. Si la muestra es excepcionalmente
densa, utilice una concentración máxima de glutaraldehído al 1 %. Los frascos
Nalgene o de vidrio son adecuados, y se prefieren los frascos de color ámbar u
opacos para poder utilizar la autofluorescencia en el análisis. Cuando una muestra
preservada ha sido agitada después de un tiempo de reacción apropiado (alrededor
de 1 h), la muestra debe desarrollar espuma temporal en la superficie. Una vez
conservado con glutaraldehído, la refrigeración es innecesaria y la sensibilidad a
la luz se reduce mucho; sin embargo, mantenga las muestras fuera de la luz solar
directa. PRECAUCIÓN: Mantenga gluteraldehído al 25 % en la campana extractora
y trabaje con él en un área bien ventilada.
c) Formalina: para conservar las muestras con formalina, agregue 40 mL de
formalina tamponada [20 g de borato de sodio (Na2B2O4) 1 L de formaldehído al
37 %] a 1 L de muestra inmediatamente después de la recolección.
PRECAUCIÓN: Al igual que con el glutaraldehído, mantenga el formaldehído
concentrado en la campana extractora de humos químicos y trabaje en un área
bien ventilada. En colecciones marinas y de estuarios, ajuste el pH a por lo menos
7,5 con borato de sodio para muestras que contengan colitóforos de Coc. d)
Mertiolato: para conservar muestras con mertiolato, agregue 36 ml de solución de
mertiolato a 1 litro de muestra y almacene en la oscuridad.
Prepare la solución de mertiolato disolviendo 1,0 g de mertiolato, 1,5 g de borato
de sodio y 1,0 ml de solución de Lugol en 1 litro de agua destilada. Las muestras
conservadas con mertiolato no son estériles, pero pueden conservarse de manera
efectiva durante 1 año, después del cual se debe agregar formalina o aldehído
glutárico.46
e) Fijador “M3”—Prepárelo disolviendo 5 g de KI, 10 g de yodo, 50 mL de ácido
acético glacial y 250 mL de formalina en 1 L de agua destilada (disuelva el yoduro
en una pequeña cantidad de agua para ayudar a la solución de yodo) . Agregue
20 mL de fijador a 1 L de muestra y guárdelo en la oscuridad.
La mayoría de los conservantes distorsionan y alteran ciertas células,47,48
especialmente aquellas con formas delicadas (p. ej., Euglena, Cryptomonas,
Synura, Chromulina y Mallamonas). La solución de glutaraldehído generalmente
es menos dañina para tales fitoflagelados, aunque todos los conservantes crean
algún nivel de artefacto de conservación. Para familiarizarse con los especímenes
vivos y las distorsiones causadas por la preservación, utilice material de colección
de referencia de casas de suministros biológicos, trabaje extensamente con
material vivo y consulte a compañeros de trabajo experimentados. La consistencia
taxonómica en proyectos a largo plazo es crítica. Documente cuidadosamente la
base para la identificación, asegurándose de que la variación morfológica se
describa claramente y que las referencias de identificación estén permanentemente
asociadas con los datos. b. Zooplancton: 1) Procedimientos de muestreo: la
elección del muestreador depende del tipo y tamaño de distribución del
zooplancton, el tipo de estudio (distribución, productividad, etc.) y el cuerpo de
agua que se investiga. Las poblaciones de zooplancton se distribuyen
invariablemente en forma de parches, lo que dificulta tanto el muestreo como la
interpretación de los datos.
Para recolectar microzooplancton (20 a 200 m), como protozoos, rotíferos y
microcrustáceos inmaduros, use la botella sam
5
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PLANCTON (10200)/Colección de muestras

TABLA 10200:I. CARACTERÍSTICAS DE LAS REDES DE PLANCTON DE USO COMÚN

APROXIMADO
SEDA TAMAÑO DE APERTURA ÁREA ABIERTA
NO. METRO % CLASIFICACIÓN

000 1024 58 Zooplancton e ictioplancton

más grandes
00 752 54 Zooplancton e ictioplancton
más grandes
0 569 50 Gran zooplancton e
ictioplancton
2 366 46 Grandes microcrustáceos
6 239 44 microcrustáceos
10 158 45 Microcrustáceos y la mayoría de
los rotíferos
20 76 45 Fito y zooplancton netos
25 64 33 nanoplancton

La trampa Juday49 funciona según el mismo principio que los muestreadores

de botellas de agua, pero generalmente es más grande (10 L) y, por lo tanto, más
adecuada para recolectar zooplancton, especialmente copépodos más grandes.
Sin embargo, es difícil de usar y su capacidad de 10 L es inadecuada para lagos
oligotróficos u otros cuerpos de agua con pocos zooplancton.
Además, está construido de metal y, por lo tanto, no es adecuado si se requieren
análisis de metales pesados.
La trampa Schindler­Patalas50 (Figura 10200:2) por lo general se prefiere a
la trampa Juday porque está construida con plástico acrílico transparente (es
decir, es transparente). Se puede sumergir en el agua con mínimas molestias y
es adecuado para recolectar tablones de zoológico más grandes. Hay disponibles
modelos de 10 a 12 L de capacidad, pero se prefiere el tamaño de 30 L. No tiene
un mecanismo de cierre mecánico, por lo que es conveniente para el muestreo
en climas fríos, cuando los dispositivos mecánicos tienden a fallar. Al igual que la
trampa Juday, puede equiparse con redes de varios tamaños de malla. [NOTA:
Los tamaños de malla de menos de 125 m (No. 120 y mayores) pueden obstruirse
rápidamente cuando abunda el fitoplancton filamentoso o colonial grande o hay
presencia de zooplancton con vainas (p. ej., holopedio) .]

Figura 10200:2. La trampa de plancton de Schindler­Patalas.
plers descritos para el fitoplancton. Los pequeños zooplancton suelen ser
suficientemente abundantes para producir muestras adecuadas en botellas de 5
a 10 L; sin embargo, se recomiendan muestras compuestas por profundidad y
tiempo. Los muestreadores de botellas de agua son adecuados especialmente
para muestras de profundidad discreta. Si se desean muestras integradas en
profundidad, use bombas o redes. Los microzooplancton más grandes y robustos
(p. ej., formas de loricatos y crustáceos) se pueden concentrar pasando toda el
agua a través de una red de malla de 20 m. Si se requieren estimaciones
cuantitativas de otras formas delicadas no loricadas, no realice la selección. Fijar
de 0,5 a 5 L de agua entera para enumerar estos
formularios
Los muestreadores de botella por lo general no son adecuados para recolectar
zooplancton más grande (p. ej., microcrustáceos maduros) que, a diferencia de
las formas más pequeñas, son mucho menos numerosos y lo suficientemente
ágiles como para evitar la captura. Si bien se puede usar una bomba para
muestrear volúmenes de agua comparativamente grandes y, en consecuencia,
un número adecuado de microcrustáceos, el hecho de que los zooplancton más
grandes y más ágiles la eviten en la cabeza de la bomba puede causar un error de muestreo.
retener los organismos deseados de manera efectiva y lo suficientemente grande
En consecuencia, los métodos de recolección preferidos son trampas o redes
más grandes.
Las redes de plancton son preferibles a las botellas y trampas de muestreo en
áreas donde los tablones son pocos, están distribuidos verticalmente o solo se
necesitan datos cualitativos o una gran biomasa para el análisis. Debido a que
originalmente se diseñaron para el muestreo cualitativo, se requieren
modificaciones para el trabajo cuantitativo y las redes siguen siendo una mala
elección para el trabajo cuantitativo de fitoplancton.
El tamaño de la malla, el tipo de material, el tamaño del orificio, la longitud, el
método de acarreo, el tipo de remolque y el volumen muestreado dependerán del
estudio.51,52 El tipo de red y el tamaño de la malla determinan la eficiencia de
filtración, las tendencias de obstrucción, la velocidad, el arrastre y condición de la
muestra después de la recolección. La seda, que solía ser el material de malla
común en las redes de plancton, no se recomienda porque las aberturas de la
malla se encogen y se pudren con el tiempo. Se prefiere la malla de monofilamento
de nailon debido a la precisión y durabilidad de su tamaño de malla. Los tamaños
de malla de red de nailon todavía están etiquetados por el sistema de clasificación
de seda. Las características de las redes de plancton de nailon comúnmente
utilizadas se enumeran en la Tabla 10200:I. Los tamaños de malla más finos se
obstruyen más fácilmente que los de malla más gruesa; al dimensionar la malla,
se debe hacer un compromiso entre una malla lo suficientemente pequeña para
para evitar un problema grave de obstrucción. Si se produce un atasco, hay
varias opciones, dependiendo de si es

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PLANCTON (10200)/Colección de muestras
Figura 10200:3. Ejemplos de redes de muestreo de plancton de uso común.
(A) Red de remolque cónica simple: A—aparejada para remolques
verticales; A1—para remolques oblicuos u horizontales; (B) Red de
remolque de Wisconsin (Birge) con cono truncado para mejorar la
eficiencia de filtración; (C) Red Bongo: se puede equipar con
medidores de flujo y mecanismos de apertura/cierre; (D) Red
Wisconsin equipada con un mecanismo de cierre activado por
mensajero: D— abierto, D1— cerrado; (E) Red de caída libre: E—abierta, E1 — luego levántela verticalmente a una velocidad uniforme de 0.5 m/s.
Relacionado con el fitoplancton o el zooplancton: reduzca la longitud del remolque,
aumente el tamaño de la malla, conserve un mayor volumen de agua o tome
muestras de agua completa.
El volumen máximo (VM) de agua que se puede filtrar a través de una red
durante un remolque vertical se puede estimar de la siguiente manera:
máquina virtual r2 d
donde:
r radio del orificio de la red y
d profundidad a la que se baja la red.
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Las redes tienen volúmenes máximos de filtración debido a que el fitoplancton
y otras partículas obstruyen la malla y, en el caso de las redes finas, incluso la
propia red puede hacer que parte del agua se desvíe del camino de la red.53,54
Mantenga la distancia de remolque de la red lo más corta posible para aliviar la
obstrucción. Si la red tiene un color verde o marrón pronunciado después de
remolcarla, probablemente esté obstruida.
Para estimar el volumen de muestreo (VA), monte un medidor de flujo calibrado
a mitad de camino entre los bordes de la red y el centro de la boca (el medidor se
monta descentrado para evitar la reducción de flujo asociada con
la brida de remolque).55 Equipe el medidor con mecanismos de bloqueo para
evitar que gire en reversa o mientras está en el aire. Registre las lecturas del
medidor de flujo antes y después de recolectar la muestra. Calcular la eficiencia
de filtración (E) de la siguiente manera:
Y VA/VM
Si E es inferior a aproximadamente 0,8, se ha producido una obstrucción
sustancial. Tome medidas para aumentar la eficiencia. La obstrucción no solo
disminuye el volumen filtrado, sino que también conduce a muestras sesgadas
debido a la eficiencia de filtración no uniforme durante el arrastre.52 La eficiencia
neta por especie se puede determinar para cada sistema, profundidad de arrastre
e intervalo de muestreo mediante el uso de un muestreador vertical para muestras
compuestas desde la profundidad de remolque hasta la superficie.
En la Figura 10200:3 se muestran varios tipos de redes de plancton. Las redes
cónicas simples se han utilizado durante muchos años con pocas modificaciones
en el diseño o mejoras en la precisión.
Su principal fuente de error es que las características de filtración de las redes
cónicas generalmente se desconocen. La eficiencia de filtración en redes de cono
de malla No. 20 varía de 40 a 77%. Para mejorar la eficiencia, coloque un collar
cilíndrico poroso o un cono truncado no poroso frente a la parte cónica de la red.
La red Juday es una red de uso común con un cono truncado. Para obtener
buenas características de filtración, la relación entre el área de filtración de la red
y el área del orificio debe ser de al menos 3:1. Las bridas que sujetan la red a la
línea de remolque también influyen negativamente en la eficiencia de filtración y
aumentan la turbulencia frente a la red, lo que aumenta la posibilidad de que los
zooplancton más grandes eviten la red. El diseño de red Bongo en tándem (Figura
10200:3C) reduce estas influencias y permite recolectar muestras duplicadas
simultáneamente.
Se utilizan tres tipos de remolques: vertical, horizontal y oblicuo. Se prefieren
los remolques verticales para obtener una muestra de columna de agua integrada.
Para hacer un remolque vertical, baje una red lastrada a una profundidad dada,
cerrada.
En cuerpos de agua pequeños, tire de la red mano sobre mano con un
movimiento constante y sin prisas a una velocidad aproximada de 0,5 m/s. En
cuerpos de agua grandes donde se esperan largos lances de red y deriva de
embarcaciones, use un pescante, una rueda medidora, un indicador de ángulo y un cabrestante.
Coloque un peso de 3 a 5 kg para sujetar la red. Determina la profundidad de la
red multiplicando la longitud del cable extendido por el coseno del ángulo del
cable con la dirección vertical. Mantenga el ángulo del cable lo más cerca posible
de la vertical controlando la velocidad nula de la embarcación contra la deriva del
viento o, cuando sea factible, realice lances verticales desde una embarcación
anclada.
Los remolques verticales y oblicuos recogen una muestra compuesta, y los
remolques horizontales recogen una muestra a una profundidad discreta.
Generalmente se prefieren los remolques oblicuos a los verticales en aguas poco
profundas o donde se requiera un remolque de red más largo. Para remolques oblicuos, baje
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PLANCTON (10200)/Colección de muestras
Figura 10200:4. Ejemplos de muestreadores de zooplancton de alta velocidad de uso
común. (A) Muestreador Clarke­Bumpus; (B) Muestreador Miller; (C)
indicador de plancton resistente; (D) registrador de plancton continuo
resistente; (E) Red de arrastre de media agua Issacs­Kidd; (F)
muestreador del Golfo V; (G) Red de arrastre Tucker: G1—vista
lateral, G2 —vista frontal abierta y cerrada.
la red o el muestreador hasta una profundidad predeterminada y luego levántelo a
una velocidad constante a medida que el bote avanza. Los remolques oblicuos no
necesariamente muestran un ángulo verdadero desde el fondo hasta la superficie.
En las mejores condiciones, el patrón es algo sigmoideo debido a la aceleración
del barco y la holgura en la línea de remolque.
Los arrastres horizontales generalmente se utilizan para obtener información
sobre la distribución de la profundidad del zooplancton. Aunque hay disponible
una variedad de muestreadores horizontales (consulte la Figura 10200:4), use el
muestreador Clarke­Bumpus56 para la recolección cuantitativa de zooplancton
debido a su medidor de flujo incorporado y su dispositivo de apertura y cierre.
Para remolques horizontales, utilice una embarcación equipada como se indicó anteriormente y
determine la profundidad del muestreador como se indicó anteriormente. Baje el muestreador a la
profundidad preseleccionada, ábralo, remolque a esa profundidad durante 5 a 10 minutos, luego
ciérrelo y levántelo.
Se puede utilizar una variedad de métodos de muestreo de zooplancton en
agua corriente. La elección depende en gran medida de la velocidad del flujo.
Las botellas, trampas, mangueras de bomba y redes con el peso adecuado se
pueden usar en aguas de flujo medio a lento. En aguas turbulentas y bien
mezcladas, recoja el agua superficial con un balde y fíltrela a través de una malla
del tamaño adecuado. Seleccione el tamaño de la muestra en función de la
concentración de zooplancton.
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Proporcione a las redes de plancton el cuidado y mantenimiento adecuados.
No deje que las partículas se sequen en la red porque pueden reducir
significativamente el tamaño de las aberturas de la malla y aumentar la frecuencia
de obstrucciones. Lave bien la red con agua después de cada uso y déjela secar
completamente antes de guardarla. Limpie periódicamente con una solución jabonosa tibia.
Debido a que la red de nailon es susceptible de deteriorarse por la abrasión y la
luz solar, protéjala contra el desgaste innecesario y guárdela en la oscuridad.
Las trampas y las redes no funcionan bien en áreas poco profundas con
vegetación acuática, así que use un tubo de goma o polietileno liviano con una red
estirada en un extremo y una cuerda atada al otro.57 Use un tubo de 5 a 10 cm
de diámetro y lo suficientemente largo para llegar desde la superficie hasta el
fondo. Fije la red con cinta adhesiva o bandas elásticas, de modo que permanezca
en su lugar en el agua pero se pueda quitar fácilmente después del muestreo.
Baje el extremo abierto de la tubería (el extremo con la cuerda unida) al agua
hasta que casi toque el fondo y luego use la cuerda para levantarlo nuevamente,
mientras mantiene el extremo cubierto por encima de la superficie del agua.
Cuando el extremo abierto emerge del agua, deja caer el extremo cubierto.
Introduzca el tubo en el bote, abra primero el extremo y deje que el agua del tubo
se drene a través de la red. Cuando el zooplancton se haya concentrado en un
volumen pequeño, justo encima de la red, retire la red sobre un recipiente y tome
la muestra concentrada. Lave la red y el extremo del tubo en el recipiente para
asegurarse de que se recolecte todo el zooplancton. Este método no se limita a
áreas con vegetación acuática. Es un método excelente para obtener una muestra
integrada de cualquier área poco profunda. En aguas estancadas, tome muestras
de estopa filtrando de 1 a 5 m3 de
agua.
2) Procedimientos de almacenamiento: las muestras de zooplancton
generalmente se conservan con etanol al 70 %58 o formalina tamponada al 5 %;
el aldehído glutárico o la solución de Lugol funcionarán, pero no tan bien. Se
prefiere el conservante de etanol para los materiales que se van a teñir en
montajes permanentes o almacenar. Se puede utilizar formalina durante las
primeras 48 h de conservación con posterior transferencia a etanol al 70%.
La formalina puede distorsionar formas pleomórficas, como protozoos y rotíferos.
Haga formalina en agua saturada de sacarosa para minimizar la distorsión del
caparazón y la pérdida de huevos en los crustáceos, especialmente en los
cladóceros . microzooplancton de cuerpo blando.60 Diluya el fijador de Bouin 1:19
con la muestra. Debido a que es necesaria una fijación rápida, vierta la muestra
sobre el fijador o inyecte el fijador rápidamente en la muestra.
Use un agente narcotizante (p. ej., agua carbonatada, agua saturada de
mentol o neosinefrina) para prevenir o reducir la contracción o distorsión de los
organismos, especialmente rotíferos, cladóceros y muchos invertebrados
marinos.61,62 Agregar unas gotas de detergente evita que se conserven los
organismos . de la aglomeración. Conserve las muestras tan pronto como haya
cesado el movimiento de la mayoría de los animales, generalmente dentro de la
media hora de la narcotización.
Para evitar la evaporación, agregue 5% de glicerina a la muestra concentrada. En
muestras turbias, diferencie material animal y detrítico agregando 0,04% de
colorante rosa de bengala, que tiñe intensamente el caparazón (caparazón) de los
zooplancton y es un buen colorante citoplasmático general. La consistencia
taxonómica en proyectos a largo plazo es crítica. Documente la base para la
identificación cuidadosamente, asegurándose de que la variación morfológica sea
8
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PLANCTON (10200)/Colección de muestras
claramente y las referencias de identificación están asociadas
permanentemente con los datos.
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tecnología Rep. Pescado. agua ciencia 976:87.
10200 C. Técnicas de Concentración
Los organismos en las muestras de agua a menudo deben concentrarse
en el laboratorio antes del análisis. En última instancia, al calcular una
concentración a partir de un recuento real, el factor de multiplicación debe
ser inferior a 25 (es decir, cada organismo o célula contada no debe
representar más de 25 organismos o células en la muestra natural). El factor
de multiplicación es una función de la concentración y el volumen de la
muestra concentrada. Tres técnicas para concentrar el fitoplancton son la
sedimentación, la filtración por membrana y la centrifugación. A continuación
también se describe una técnica especial para el zooplancton.
1. Sedimentación/Asentamiento
La sedimentación es el método de concentración preferido porque no es
selectiva (a diferencia de la filtración) ni destructiva (a diferencia de la
filtración o la centrifugación), aunque es posible que muchos picoplancton,
nanoplancton más pequeños y flagelados que nadan activamente (en
muestras sin conservantes) no se asienten por completo. Además, este
enfoque puede ser demasiado lento si se necesitan resultados rápidamente.
El volumen concentrado varía inversamente con la abundancia de organismos
y está relacionado con la turbidez de la muestra.
Permita 1 hora de sedimentación por milímetro de profundidad de columna.
Para una muestra preservada con solución de Lugol (2 a 4 ml/L), deje
sedimentar alrededor de 0,5 h/mm de profundidad.1 La muestra se puede
concentrar en una serie de pasos transfiriendo cuantitativamente el
concentrado desde el recipiente inicial a otros más pequeños secuencialmente.
(como en el tratamiento del agua) y mejora el uso de la autofluorescencia (preparación fina).
Utilice cámaras de sedimentación cilíndricas con fondos de vidrio transparente y delgado.
Aplique una relación de altura a diámetro no superior a 5:1 para evitar una
influencia excesiva de la pared de la cámara y corrientes en la cámara.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
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Oceanogr. Método. No. 4. Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la
Ciencia y la Cultura, París.
Llene las cámaras de sedimentación sin formar un vórtice, manténgalas
libres de vibraciones y muévalas con cuidado para evitar la distribución no
aleatoria de la materia sedimentada. Cuando extraiga el sobrenadante para
obtener el concentrado deseado (normalmente de 2 a 3 ml; 5 ml para
montajes de diatomeas), hágalo lentamente, no agite el agua y sostenga el
extremo del sifón o la pipeta directamente debajo de la superficie del agua.
Guarde la muestra concentrada en un recipiente cerrado y etiquetado
(recuerde que las muestras conservadas con solución de Lugol deberán
volver a enriquecerse cada 6 a 12 meses).
2. Filtración por membrana
El método de filtración permite el uso de gran aumento para enumerar
pequeños tablones (p. ej., flagelados y cianobacterias); esencialmente
concentra la muestra mientras proporciona una preparación contable. Esta
sección enfatiza la preparación para microscopía, aunque los filtros de fibra
de vidrio (GF/F) (y filtros de membrana) también se usan para aislar el
fitoplancton para el análisis de pigmentos (ver 10200H). Sin embargo, las
formas delicadas (p. ej., flagelados "desnudos") pueden distorsionarse
incluso con una filtración suave. Cuando las poblaciones son densas y el
contenido de detritos es alto, el filtro se obstruye rápidamente y el sedimento
puede aplastar a los organismos u ocultarlos de la vista. Sin embargo, la
sedimentación en circunstancias de alto contenido de partículas también
produce una muestra difícil. La filtración ofrece la oportunidad de realizar
montajes permanentes, permite la preparación rápida de muestras cuando
se necesitan resultados rápidos para respaldar las decisiones de gestión
Vierta un volumen medido de muestra bien mezclada en un embudo
equipado con un filtro de membrana (diámetro de filtro de 25 mm;
10
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PLANCTON (10200)/Técnicas de Concentración

tamaño de poro de 0,45 m). Aplique un vacío de 50 kPa (25 mm Hg) al filtro
hasta que quede aproximadamente 0,5 cm de muestra. Rompa el vacío,
luego aplique un vacío bajo (alrededor de 12 kPa, 2 a 3 mm Hg) para
eliminar el agua restante. No seque el filtro.
Para muestras con bajo contenido de fitoplancton y limo, este método
aumenta la probabilidad de observar formas menos abundantes.2 Las
muestras también pueden concentrarse en un filtro, invertirse en un
portaobjetos de microscopio y congelarse rápidamente para que el plancton
pueda transferirse del filtro la diapositiva. Como alternativa, se puede
agregar aceite para hacer que el filtro sea ligeramente translúcido.3,4 Tanto
el picoplancton autótrofo como el heterótrofo se pueden recolectar y
contar mediante filtración y microscopía de epifluorescencia posterior.5–7
Humedezca un filtro Nuclepore de respaldo de 0,45 m con agua destilada
y coloque filtro en el tallo. Coloque un filtro Nuclepore negro de 0,2 m sobre
el otro filtro. Con base en las concentraciones de las células, filtre
generalmente de 1 a 2 ml de muestra de agua a través del aparato de
filtración, usando una bomba manual que ejerza un vacío de 10 mm de
mercurio. Filtre la muestra hasta que el menisco desaparezca del filtro
Figura 10200:5. Embudo filtrante para concentrar zooplancton. Este dispositivo,
superior. Retire el filtro de 0,2 m y móntelo en aceite sobre un portaobjetos
originalmente diseñado para rotíferos, puede modificarse para otros
(consulte 10200D.2a).
zooplanctoneros cambiando las dimensiones y el tamaño de la malla.
(Después de Likens y Gilbert.8 )
3. Centrifugación
plástico acrílico u otro material adecuado.8 El volumen del aparato y el
El plancton se puede concentrar por lotes o por centrífuga continua. tamaño de la malla dependen del volumen de agua a filtrar y del tamaño de
ugación Centrifugar las muestras por lotes a 1000 g durante 20 min. La los organismos a retener. El tamaño de malla del embudo del filtro
centrífuga continua de Foerst ya no se recomienda como un dispositivo normalmente es el mismo que el de la red u otro dispositivo de muestreo
cuantitativo, pero los programas existentes pueden continuar utilizándola de campo.
para garantizar la continuidad con los datos recopilados previamente.
Aunque la centrifugación acelera la sedimentación, a menudo daña 6. Referencias
organismos frágiles y no es preferible para el análisis cuantitativo.
1. FURET, JE & K. BENSON­EVANS. 1982. Una evaluación del tiempo
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de la enumeración. británico Phycol. J. 17:253.
Este método usa arena para filtrar fitoplancton y luego usa un paso de 2. MCNABB, CD 1960. Enumeración de fitoplancton de agua dulce
retrolavado para eliminar las algas del medio filtrante. concentrado en el filtro de membrana. Limnol. Oceanogr. 5:57.
3. HEWES, CD & O. HOLM­HANSEN. 1983. Un método para recuperar
Aunque este método destruye muchas especies, especialmente formas
nanoplancton de filtros para identificación con el microscopio: La técnica
frágiles o grandes, y produce una recuperación diferencial de especies,
de congelación de transferencia de filtro (FTF). Limnol. Oceanogr. 28:389.
todavía se usa en algunas empresas de agua con recursos de laboratorio
limitados. Es el método de concentración menos preferible. 4. HEWES, CD, FMH REID Y O. HOLM­HANSEN. 1984. El análisis
cuantitativo de nanoplancton: Un estudio de métodos. J. plancton res.
5. Concentración de zooplancton 6:601.
5. MACISAAC, EA Y JG STOCKNER. 1993. Enumeración de picoplancton
Las muestras de zooplancton a menudo deben concentrarse en el fototrófico por microscopía de autofluorescencia. En PF Kemp, BF
campo, especialmente cuando se utilizan botellas de agua grandes o Sherr, EB Sherr y JJ Cole, eds. Manual de métodos en ecología microbiana
métodos de muestreo con bomba. Además, las muestras obtenidas a través acuática. Lewis Publ., Boca Ratón, Florida.
6. CARON, DA 1983. Técnica de enumeración de nanoplancton heterotrófico
de redes u otros métodos a veces necesitan concentrarse aún más para su
y fototrófico mediante microscopía de epifluorescencia y comparación con
almacenamiento o preparación para el examen. Cuando solo se necesiten
otros procedimientos. aplicación Reinar. Microbiol. 46:491.
pequeñas reducciones de volumen, vuelva a verter la muestra en el balde
de trampas o redes. Cuando procese grandes volúmenes de agua (como 7. MARSHALL, HG 2002. Picoplancton autotrófico: Su presencia y significado
en el muestreo con bomba), use baldes o embudos de plancton más en los ecosistemas marinos y de agua dulce. Virginia J. Ciencia. 53:13.
grandes con más retención de volumen de agua y área de superficie de filtración. construir un GE Y JJ GILBERT. 1970. Notas sobre muestreo cuantitativo de
8. LIKENS,
embudo de filtro similar al que se muestra en la Figura 10200: 5 de claro poblaciones naturales de rotíferos planctónicos. Limnol. Oceanogr. 15:816.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207 11
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PLANCTON (10200)/Preparación de montajes de diapositivas
10200 D. Preparación de montajes de diapositivas
Los métodos de conteo pueden usar celdas de conteo temporales, montajes de
portaobjetos semipermanentes o montajes de portaobjetos permanentes. La elección
de la cámara o montaje para el fitoplancton y el zooplancton dependerá de los
recursos disponibles, la línea de tiempo del análisis, el rango de tamaño del
organismo y las especificaciones del microscopio. También se incluye un método
para la limpieza con ácido y el montaje de diatomeas para la identificación de
especies y recuentos de válvulas. En general, utilice varias cámaras o montajes (a
menudo tres por muestra), independientemente del procedimiento de procesamiento,
para ayudar a tener en cuenta la variabilidad de la submuestra.1
1. Montajes de diapositivas húmedas temporales y semipermanentes de
fitoplancton
Agite el concentrado de muestra sedimentado el tiempo suficiente para garantizar
una mezcla completa (50 a 100 veces) y extraiga una submuestra con una pipeta
calibrada con precisión. Limpie bien la pipeta entre las muestras. Para preparar
montajes de portaobjetos húmedos, transfiera 0,1 ml a un portaobjetos de vidrio,
coloque un cubreobjetos sobre la muestra y cubra el cubreobjetos con un adhesivo
(p. ej., esmalte de uñas transparente) para evitar la evaporación. Para los
procedimientos sobre la preparación de cámaras de conteo temporales (Sedgwick–
Rafter, Palmer–Maloney, cámaras/células de nanoplancton y hemacitómetro),
consulte 10200F. Para montajes semipermanentes, agregue unas gotas de glicerina
al portaobjetos. A medida que la muestra envejece, el agua se evapora, dejando los
organismos incrustados en la glicerina. Si el cubreobjetos está cubierto con
adhesivo, el portaobjetos se puede conservar durante algunos años si se almacena
en la oscuridad.
2. Montajes de diapositivas permanentes de fitoplancton
una. Soportes de filtro de membrana, limpios de aceite: Los filtros de membrana
sugeridos incluyen filtros de éster mixto/éster de celulosa.* El método no funciona
bien con filtros no orgánicos (filtros de fibra de vidrio o filtros de policarbonato). No
se requiere una concentración previa con este método, pero primero debe
completarse un montaje de prueba para garantizar que la densidad de algas en el
filtro sea de 10 a 20 unidades naturales/campo con el aumento de conteo. Si el
volumen de la muestra es de 0,5 ml, suspenda en 10 ml de agua destilada filtrada
antes del montaje para fomentar una distribución aleatoria en el filtro. Coloque dos
gotas de aceite de inmersión en un portaobjetos etiquetado. Agite la muestra el
tiempo suficiente para asegurar una mezcla completa (50 a 100 veces) y extraiga
una submuestra con una pipeta calibrada con precisión. Limpie bien la pipeta entre
las muestras.
Inmediatamente después de filtrar (ver 10200C.2), coloque el filtro encima del
aceite con un par de pinzas y agregue dos gotas de aceite encima del filtro. El aceite
impregna el filtro haciéndolo transparente. La impregnación generalmente ocurre en
24 a 48 h, pero puede completarse en 1 a 2 h aplicando calor (70 °C). Una vez que
el filtro se haya limpiado, coloque unas gotas más de aceite sobre él y cúbralo con
un cubreobjetos.
El filtro montado ahora está listo para el examen microscópico.
Los filtros limpiados con aceite se nublarán después de varios meses. Como
alternativa, monte filtros de membrana en medio de montaje.† Sumerja los filtros en
1­propanol para desplazar el agua residual y transfiéralos a xilol durante varios
minutos para limpiar los filtros. Coloque una sección de filtro
* Millipore HA, Pall GN o equivalente. †
Permount, Fisher Scientific Co., Millipore HA, Pall GN o equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
o todo el filtro en un portaobjetos de microscopio con el medio de montaje, cubrir
con un cubreobjetos y secar a baja temperatura.1
b. Montajes de filtro de membrana, HPMA permanente: Los filtros de membrana
sugeridos son filtros de éster de celulosa mixtos (ver ¶ a arriba).
El método no funciona con filtros no orgánicos (filtros de fibra de vidrio o filtros de
policarbonato). El método de hexametilfosforamida (HPMA) para producir
portaobjetos de muestras de algas proporciona un fondo ópticamente claro mientras
infiltra y conserva permanentemente la muestra con fines de archivo.2,3 La
distorsión de montaje es mínima y se pueden usar aumentos de 100 a 1000 en la
misma muestra. Si las muestras se conservan en glutaraldehído (concentración final
de 0,25 a 0,50 %), se puede usar epifluorescencia en la muestra mientras se cuenta.
Agite la muestra el tiempo suficiente para garantizar una mezcla completa (50 a
100 veces) y extraiga una submuestra con una pipeta calibrada con precisión. Filtre
la submuestra como se describe en 10200C.2.
Inmediatamente después de filtrar, coloque con cuidado el filtro boca abajo sobre
un cubreobjetos de 25 mm (#1) con un par de pinzas y agregue de 2 a 3 gotas de
HPMA‡ prepolimerizado en la parte posterior del filtro. La resina limpia el filtro e
impregna las células de algas. Coloque los filtros con HPMA en un horno de secado
a 60°C durante 24 h. Una vez que el filtro se haya limpiado y polimerizado, coloque
unas gotas más de HPMA sobre él y adhiéralo a un portaobjetos de 25 mm 75 mm.
Volver a colocar en el horno de secado durante 24 a 72 h. La preparación es
permanente cuando el borde exterior del cubreobjetos está completamente
polimerizado. La parte interna de la preparación puede ser líquida, pero mientras el
borde exterior sea sólido, el deslizamiento es permanente (HPMA solo polimeriza
en presencia de oxígeno). El filtro montado se puede almacenar indefinidamente a
temperatura ambiente y ahora está listo para el examen microscópico.
C. Montajes de portaobjetos sedimentados: existe una técnica disponible para
hacer montajes de resina permanentes de fitoplancton natural depositado mediante
sedimentación en un portaobjetos de microscopio o cubreobjetos y deshidratado
mediante sustitución de vapor de etanol.4,5 Este método tarda varios días en
completarse; siga las pautas de duración de la sedimentación y no exceda una
relación de altura a profundidad de 5:1 para la torre de sedimentación (consulte
10200C.1).
3. Monturas de diatomeas
Las muestras concentradas para el análisis de diatomeas mediante
sedimentación o centrifugación pueden contener materiales disueltos (p. ej., sales
marinas, conservantes y detergentes) que dejarán residuos que interfieren. Lave
bien con agua destilada antes de preparar los portaobjetos. Transfiera varias gotas
de concentrado lavado a través de una pipeta desechable de gran calibre o un
cuentagotas de gran calibre a un cubreobjetos en una placa caliente lo
suficientemente caliente para aumentar la velocidad de evaporación pero sin causar
la ebullición (utilice una pipeta o un gotero de gran calibre para evitar la exclusión
accidental de formas más grandes o las que forman colonias o cadenas). Si el
material sin limpiar está muy concentrado, mejore la distribución de diatomeas
agregando las gotas a un cubreobjetos ya inundado con agua destilada. Redistribuir
en cubreobjetos, si es necesario (usando una pipeta), para producir una distribución
homogénea de frústulas. Evaporar a sequedad. Repita la adición y la evaporación
hasta que se haya transferido suficiente muestra a la tapa.
‡ HPMA, División de Suministros SPI de Structure Probe, Inc., PO Box 656, West
Chester, PA 19381­0656.
12
Machine Translated by Google
PLANCTON (10200)/Microscopios y Calibraciones
vidrio sin producir un residuo tan denso que los organismos no puedan ser
reconocidos. Si tiene dudas sobre la densidad, examine con un microscopio
compuesto. Después de la evaporación, incinere el residuo sobre el cubreobjetos
en una placa caliente de 300 a 500 °C; como alternativa, utilice un horno de mufla.
Esto generalmente requiere de 20 a 45 min. Monte como se describe a continuación.
Limpie químicamente las muestras para el análisis de diatomeas como se
describe en otra parte.6–8 Mezcle volúmenes iguales de ácido nítrico concentrado
(HNO3), ácido sulfúrico (H2SO4) o H2O2 al 50 % y muestree. PRECAUCIÓN:
Cuando trabaje con ácidos concentrados o cáusticos, use gafas de seguridad y un
delantal y guantes resistentes a los ácidos, y trabaje en una campana de extracción
de humos químicos. ¡Esta reacción será altamente exotérmica! Añadir unos granos
de dicromato de potasio (K2Cr2O7) para facilitar la digestión del filtro y la materia
5
orgánica celular. Agregue
amarillo más dicromato
a verde. si muestra
Coloque la el color de
enlaunsolución cambiay de
plato caliente hierva
hasta aproximadamente un tercio del volumen original. Este proceso destruye la
materia orgánica, dejando sólo conchas de diatomeas (frústulas). Alternativamente,
se puede omitir (o no) el bicromato y se puede dejar reposar la muestra tratada
durante la noche. Omitir la ebullición y el dicromato probablemente dejará las
células intactas, lo que es útil para identificar diatomeas heterovalvulares o
heteropolares. Enfriar, lavar con agua destilada y montar como se describe a
continuación. Transfiera los frutos secos limpios a un cubreobjetos y séquelos
como se describe a continuación.
Coloque una gota de medio de montaje en el centro de un portaobjetos
etiquetado. Utilice portaobjetos de 25 a 75 mm con extremos esmerilados. El uso
de un medio adecuado de montaje microscópico de alto índice de refracción (1,6)
garantiza montajes permanentes y fáciles de manejar para el examen bajo
inmersión en aceite. Calentar el portaobjetos a cerca de 90 °C durante 1 a 2 min.
antes de aplicar el cubreobjetos calentado con su residuo de muestra para acelerar
la evaporación del solvente en el medio de montaje. Retire el portaobjetos a una
superficie fría y, durante el enfriamiento (de 5 a 10 s), aplique una presión firme
pero suave para cubrir el vidrio con un instrumento ancho y plano.
Para evitar la cristalización de la resina, cubra el cubreobjetos con esmalte de
uñas transparente.
4. Montajes de zooplancton
Para análisis de zooplancton, extraiga una submuestra de 1 a 5 ml
del concentrado y diluir o concentrar más según sea necesario
sario Transfiera la muestra a una celda o cámara de recuento (consulte 10200G)
para su análisis como preparación húmeda. Use polivinil lactil fenol para preparar
montajes de zooplancton semipermanentes. Él
§ Naphrax, Brunel Microscopes, Unit 2, Vincients Road, Bumpers Farm Industrial
Estate, Chippenham, Wiltshire SN14 6NQ UK, o equivalente.
Especialistas biomédicos, Box 1687, Santa Monica, CA.
10200 E. Microscopios y Calibraciones
1. Microscopio compuesto
Utilice un microscopio compuesto estándar o invertido para identificar y
enumerar las algas. Equipe cualquiera de los dos con una etapa mecánica que
pueda mover todas las partes de una celda de conteo más allá de la lente del objetivo.
El equipo estándar es un conjunto de 10, 12,5 o 15 oculares y 10, 20,
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
las preparaciones son buenas durante aproximadamente un año, y luego el agente
de limpieza hace que los organismos se deterioren. Para el almacenamiento a
largo plazo, cubra el cubreobjetos con laca transparente (esmalte de uñas) para
retardar la cristalización del montante. Para el montaje permanente, se encuentran
disponibles otros montajes, y algunas tinciones no solo resaltan las características
sino que también aclaran parcialmente a los animales (p. ej., tinción doble de rosa
de lignina, Bio Quip).# Para la porción protozoaria del microzooplancton, un
procedimiento de tinción con protargol9 no solo proporciona un montaje
permanente sino que también revela los detalles citológicos a menudo necesarios
para la identificación.
Este procedimiento es cualitativo y especialmente importante en estudios
taxonómicos de protozoos ciliados.
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En JJ Lee, SH Hunter y EC Bovee, eds. Una guía ilustrada de los protozoos.
Soc. Protozoología, Lawrence, Kansas.
#CMC­10, Master's Chemical Co., PO Box 2382, Des Plaines, IL.; montaje Hydra,
especialistas biomédicos, Box 1687, Santa Monica, CA.; o equivalente.
40 y 100 objetivos. Use objetivos para proporcionar una distancia de trabajo
adecuada para la cámara de conteo. Los requisitos de ampliación varían según la
fracción de plancton que se investiga, el tipo de microscopio, la cámara de recuento
utilizada y la óptica. Con objetivos estándar, la cámara de Sedgwick­Rafter limita
el aumento a aproximadamente 200 y la celda de Palmer­Maloney limita el aumento
a
13
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PLANCTON (10200)/Microscopios y Calibraciones

La principal ventaja del microscopio invertido es que simplemente girando la

pieza de la nariz, se puede examinar (o contar) una muestra directamente en
la cámara de sedimentación con cualquier aumento deseado. Cuando se
utilizan con un aceite que es lo suficientemente viscoso como para que el
objetivo no se escurra, los objetivos de inmersión en aceite son útiles y tienen
una resolución excelente. No se requiere ninguna preparación o manipulación
que no sea el asentamiento. En general, examine una muestra conservada
cuando realice recuentos. Hay técnicas disponibles para muestras con
abundancia de organismos flotantes.6

4. Microscopio de epifluorescencia

Un microscopio de epifluorescencia puede ser estándar o invertido. Utiliza

Figura 10200:6. Regla del micrómetro ocular. Un micrómetro Whipple reti
cule se ilustra.
luz incidente para excitar electrones en compuestos intracelulares (p. ej.,
pigmentos o colorantes absorbidos), y la energía emitida durante el estado de
retorno de electrones al suelo se mide como luz fluorescente. La técnica se ha
aplicado a la identificación microscópica de clorofila a, ficoeritrina, células que
contienen ficocianina (autótrofos) y plancton heterótrofo no pigmentado. Las
tinciones fluorescentes (p. ej., primulina o proflavina) también se han utilizado
para diferenciar los productores primarios y secundarios de nanoplanctónicos.7–
9 Las longitudes de onda de excitación y emisión son únicas para cada
pigmento y tinción, y requieren distintas combinaciones de filtros de luz y
fuentes de luz.

Seleccione las combinaciones de filtros apropiadas para la aplicación en

alrededor de 500. El límite superior útil de aumento para cualquier objetivo es particular. Concentre las muestras mediante filtración por membrana (consulte
1000 veces la apertura numérica (NA). Por encima de esta ampliación, no se 10200C y 10200D, según la aplicación).
puede resolver ningún detalle mayor. Utilice combinaciones de oculares, lupas
intermedias y objetivos para obtener el mayor aumento sin exceder el límite útil
de aumento. Generalmente, el límite de aumento superior del microscopio
compuesto estándar o invertido es 1250. Cuando se excede el límite, se obtiene
un aumento vacío. La ampliación vacía es cuando la imagen es más grande
pero no más clara. Las ópticas que mejoran el contraste [p. ej., contraste de
fase, contraste de interferencia diferencial (Nomarski) o contraste de reflexión
de interferencia (IRC)1 ] son útiles y pueden ser esenciales para identificar el
fitoplancton con precisión.

2. Microscopio estereoscópico

Un microscopio estereoscópico es esencialmente dos microscopios

completos ensamblados en un instrumento binocular para brindar una vista
estereoscópica y una imagen erecta en lugar de invertida. Utilice este
microscopio para estudiar y contar tablones grandes (p. ej., microcrustáceos
maduros). Combine de 10 a 15 oculares emparejados con 1 a 8 objetivos; esto
cierra la brecha entre la lupa y el microscopio compuesto, proporcionando un
aumento de 10 a 120. Como alternativa, utilice un buen instrumento de tipo
zoom con un aumento comparable.

3. Microscopio compuesto invertido

Muchos laboratorios utilizan habitualmente un microscopio compuesto

invertido para el recuento de plancton.2–5 En este instrumento, los objetivos
están debajo de una plataforma móvil y la iluminación proviene de arriba, de
modo que los analistas pueden ver los organismos que se han asentado en el
fondo de una cámara. Coloque las muestras en una cámara de sedimentación
cilíndrica con un fondo de vidrio transparente y delgado. Hay cámaras de varias
capacidades disponibles; el tamaño apropiado depende de la densidad del
organismo. Después de un período de sedimentación adecuado (consulte Figura 10200:7. Calibración de Whipple Square, visto con 10 ocular y
10200C.1), cuente los organismos en la cámara de sedimentación. 43 objetivos (aproximadamente 430 aumentos totales).

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207 14
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PLANCTON (10200)/Técnicas de conteo de fitoplancton
La microscopía de epifluorescencia es particularmente útil para enumerar las
poblaciones de picoplancton y flagelados heterótrofos comunes a la mayoría de
los sistemas acuáticos, o para diferenciar divisiones de algas morfológicamente
similares, especialmente en muestras con alto contenido de partículas, porque
la composición diferencial de los pigmentos crea diferentes patrones fluorescentes.
Utilice la microscopía de epifluorescencia como un procedimiento complementario
a las técnicas estándar de recuento de microscopio óptico.
5. Calibración del microscopio
La calibración del microscopio es esencial. El equipo de calibración habitual
es un micrómetro ocular (rejilla, retícula o retícula de Whipple) colocado en el
ocular del microscopio y un micrómetro de platina con una escala estandarizada
y reglada con precisión sobre un portaobjetos de vidrio. Hay varios diseños
disponibles tanto para fitoplancton como para zooplancton.
El disco de Whipple (Figura 10200:6) tiene una cuadrícula reglada con precisión
subdividida en 100 cuadrados. Un cuadrado cerca del centro se subdivide en 25
cuadrados más pequeños. Las dimensiones exteriores de la rejilla son tales que,
con un objetivo de 10 y un ocular de 10, delimita un área de aproximadamente 1
mm2 en la platina del microscopio. Debido a que esta área puede diferir de un
microscopio a otro, calibre cuidadosamente el micrómetro ocular para cada
microscopio.
Con los micrómetros del ocular y del escenario paralelos y en parte
superpuestos, haga coincidir la línea en el borde izquierdo de la cuadrícula de
Whipple con la marca cero en la escala del micrómetro del escenario (Figura 10200:7).
Determine el ancho de la imagen de la cuadrícula de Whipple al 0,01 mm más
cercano a la escala micrométrica del escenario. Si el ancho es exactamente 1
mm (1000 m), los cuadrados más grandes tendrán 1/10 mm (100 m) de lado y
cada uno de los cuadrados más pequeños será 1/50 mm (20 m).
Cuando el microscopio se calibra a mayores aumentos, no se verá toda la
escala en el micrómetro de la platina; hacer
10200 F. Técnicas de Conteo de Fitoplancton
1. Unidades de conteo
Algunos fitoplancton son unicelulares, mientras que otros son multicelulares
(coloniales o filamentosos). A continuación se enumeran algunas sugerencias
para informar sobre la concentración o la densidad:
Método de enumeración Unidad de conteo Unidad de informes
Recuento total de células una celda Células/mL
Recuento de unidades naturales Un organismo (cualquier Unidades Naturales/mL
(recuento de grupos) organismo unicelular, colonia
natural o filamento) 400 m2
Unidad estándar de área Unidades/mL
contar*
* Área de unidad estándar de área de cuatro cuadrados pequeños en una cuadrícula de Whipple
con un aumento de 200, es específica del microscopio y es la unidad de informes menos preferida.
La variedad de configuraciones plantea un problema en la enumeración.
Por ejemplo, ¿debería informarse una colonia de cuatro células de Scenedesmus
(consulte la Sección 10900, Lámina 29, Figura B­40) como una colonia o cuatro
células individuales? En general, deben enumerarse tanto las células como las
unidades naturales. Una unidad natural es la unidad que aparece en
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
medidas al 0.001 mm más cercano. Hay detalles de calibración adicionales
disponibles.10
6. Referencias
1. SIVER, PA Y J. HINSCH. 2001. El uso de contraste de reflexión de interferencia en el examen
de válvulas de diatomeas. J. Phycol. 36(3):616.
2. LIKES DE WETZEL, RG Y GE . 1991. Análisis limnológicos, 2ª ed.
Springer­Verlag, Nueva York, NY
3. LUND, JWG, C. KIPLING Y ED LECREN. 1958. El método de microscopio invertido para
estimar el número de algas y la base estadística de las estimaciones por conteo. Hidrobiología
11:143.
4. SICKO­GOAD, L. Y EF STOERMER. 1984. La necesidad de una terminología uniforme sobre
las fracciones del tamaño de las células del fitoplancton y ejemplos de picoplancton de los
Grandes Lagos de Laurentian. J. Res. de los Grandes Lagos. 10:90.
5. HASLE, G. 1978. El método del microscopio invertido. En A. Sournia, ed. Manual de
Fitoplancton; Monografía. Oceanogr. Métodos No.
6. Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la Cultura, París.
6. REYNOLDS, CS Y GHM JAWORSKI. 1978. Enumeración de poblaciones naturales de
Microcystis . británico Phycol. J. 13:269.
7. DAVIS, PG y J. MCN. SIEBURTH. 1982. Diferenciación de poblaciones de nanoplancton
fototróficas y heterótrofas en aguas marinas mediante microscopía de epifluorescencia. Ana.
Inst. Oceanogr. 58: 249.
8. CARON, DA 1983. Técnicas de enumeración de nanoplancton heterotrófico y fototrófico,
mediante microscopía de epifluorescencia, y comparación con otros procedimientos.
aplicación Reinar. Microbiol. 46:491.
9. SHERR, EB Y BF SHERR. 1983. Técnicas de epifluorescencia de doble tinción para evaluar
la frecuencia de células en división y bacteriovario en poblaciones naturales de microprotozoos
heterótrofos. aplicación Reinar. Microbiol. 46:1388.
10. JACKSON, HW Y LG WILLIAMS. 1962. Calibración y uso de ciertos equipos de conteo de
plancton. Trans. Amer. microsc. Soc. 81:96.
el medio ambiente y que los organismos acuáticos encuentran. Hacer un recuento
total de células puede llevar mucho tiempo y ser tedioso, especialmente cuando
las colonias consisten en miles de células individuales; sin embargo, las células
por colonia/filamento se pueden estimar de cerca, si se hace con cuidado. La
unidad natural o grupo es el sistema más fácil de usar; sin embargo, no es
necesariamente el más preciso desde el punto de vista cuantitativo porque la
manipulación y conservación de muestras puede desprender células de la
periferia de la colonia (especialmente en Microcystis y otras cianobacterias con
vainas diluidas; esto puede ser un gran problema en las muestras conservadas
de Lugol). El método de célula/unidad natural tampoco refleja la abundancia de
biomasa o biovolumen sin
medición y cálculo adicional (ver 10200I).
Para la mayoría de las aplicaciones, se prefieren los datos de biomasa, y se
necesitan las dimensiones y la abundancia de las celdas para convertir los
recuentos de celdas en biomasa, suponiendo una gravedad específica de 1,0.
Mida suficientes celdas (generalmente de 10 a 30) para obtener un promedio o
rango confiable (correspondiente a las categorías de tamaño aplicadas a cada
especie). Si el enfoque está en unidades biológicamente significativas (p. ej.,
tamaños de partículas), entonces las unidades naturales con un promedio o
rango de dimensiones de tamaño son las más apropiadas. Los conteos más
útiles proporcionarán unidades naturales, tamaño de unidad natural promedio [mayor
15
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PLANCTON (10200)/Técnicas de conteo de fitoplancton
dimensión lineal axial (GALD)], celdas promedio por unidad y tamaño promedio
por celda, lo que permite una serie de cálculos pertinentes a varias aplicaciones
de los datos.
Nunca mezcle y combine unidades entre diferentes taxones dentro de un
conteo. Por ejemplo, no informe Merismopedia como "unidades" de 4 células,
Aphanizomenon como filamentos y Microcystis como células.
Esto dificultará la interpretación de los datos y hará imposibles las comparaciones
de conjuntos de datos a largo plazo porque las idiosincrasias entre los contadores
a lo largo de los años tienden a perderse. Independientemente del método
elegido, identifíquelo claramente al informar los resultados y comprenda las
implicaciones para el análisis de datos.1
Si la distribución de organismos es aleatoria y la población se ajusta a una
distribución de Poisson, se puede estimar el error de conteo.2 Por ejemplo, el
límite de confianza aproximado del 95 %, como porcentaje del número de
unidades naturales contadas (N), es igual a:
2 Sons, Nueva York, NY
100%
norte
Entonces, si se cuentan 100 unidades, el límite de confianza del 95 %
se aproxima al 20 %. Para un conteo de 400 unidades, el límite es de
alrededor del 10%. Se utilizan unidades naturales, no celdas, porque las
unidades naturales se encuentran estáticamente durante el conteo, no las celdas.
La mayoría de los conteos se realizan de 300 a 400 unidades naturales,
distribuidas entre varios portaobjetos o cámaras de conteo.
2. Procedimientos de conteo
Para enumerar el plancton, use una celda o cámara de conteo que limite el
volumen y el área para calcular rápidamente las densidades de población. No
se recomienda contar material vivo con taxones móviles porque a menudo
evitan el calor y la luz (o se sienten atraídos por la luz, según la especie) y se
mueven dentro y fuera del campo de visión.
Cuando cuente con una cuadrícula de Whipple, establezca una convención
para contar los organismos que se encuentran en una línea límite exterior. Por
ejemplo, al contar un "campo" (cuadrado de Whipple completo), designe los
límites superior e izquierdo como lados "sin contar" y los límites inferior y
derecho como lados "contables". Por lo tanto, cuente cada tablón que toque un
lado "contado" desde el interior o el exterior, pero ignore cualquiera que toque
un lado "no contado". Si un número significativo de filamentosos u otras formas
grandes cruzan dos o más límites de la cuadrícula, cuéntelos por separado con
un aumento menor e incluya su número en el conteo total.
Para identificar organismos, use referencias de banco estándar (consulte
10200B.1 y Sección 10900) y consulte la literatura actual.
Constantemente se publican nuevos recursos taxonómicos.
Para los hábitats acuáticos sujetos a monitoreo continuo, a menudo es útil
desarrollar una clave pictórica específica del hábitat o una colección de
comprobantes a partir de datos e imágenes acumulados. No cuente las células
muertas o los frústulas de diatomeas rotas. Cuente las diatomeas céntricas y
pennadas vacías por separado como "diatomeas céntricas muertas" o "diatomeas
pennadas muertas" para convertir el recuento proporcional de especies de
diatomeas en un recuento por mililitro, si esa metodología se aplica a su estudio.
Determinar qué células estaban muertas o vivas en el momento de la recolección
suele ser subjetivo; los resultados dependen de variables como el conservante
utilizado, la edad de las colecciones y el propósito del estudio. Esto se vuelve
especialmente
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
Figura 10200:8. Celda de conteo (Sedgwick­Rafter), que muestra el método de
llenado. FUENTE: WHIPPLE, GC, GM FAIR & MC
LATIGO. 1927. La microscopía del agua potable. John Wiley &
difícil con muchas de las diminutas diatomeas. Generalmente, si la pared celular
y al menos un plástido están intactos, la unidad natural se cuenta como viva.
La ampliación es importante en la identificación y enumeración del
fitoplancton. Aunque los aumentos de 100 a 200 son útiles para contar colonias
o organismos grandes, a menudo se requieren aumentos mucho mayores. Es
útil categorizar las técnicas de conteo de toneladas de fitoplank según la
magnificación porque esto afectará los cálculos de densidad.
una. Métodos de bajo aumento (hasta 200): una celda Sedgwick­Rafter (S­R)
se usa comúnmente para contar plancton porque es fácil de manipular y
proporciona datos razonablemente reproducibles cuando se usa con un
microscopio calibrado equipado con un dispositivo de medición ocular (p. ej. , la
cuadrícula de Whipple). La celda S­R mide aproximadamente 50 mm de largo,
20 mm de ancho y 1 mm de profundidad. Su área inferior total es de
aproximadamente 1000 mm2 y el volumen total es de aproximadamente 1000
mm3 (1 mL). Verifique cuidadosamente la longitud y profundidad exactas de la
celda con un micrómetro y calibradores antes de su uso.
La mayor desventaja de la celda es que no se pueden usar objetivos de gran
aumento. Como resultado, la celda S–R no es adecuada para examinar el
nanoplancton.
1) Llenado de la celda: primero, coloque el cubreobjetos en diagonal a través
de la celda y transfiera la muestra con una pipeta de gran calibre (Figura
10200:8). Colocar el cubreobjetos en diagonal a través de la celda ayuda a
evitar que se formen burbujas de aire en las esquinas de la celda. A menudo
girará lentamente y cubrirá la parte interna de la celda S–R durante el llenado.
No llene en exceso porque una profundidad de muestra superior a 1 mm
produciría un recuento no válido. Durante exámenes prolongados, no permita
que se desarrollen grandes espacios de aire (causados por la evaporación) en
la cámara. Para evitar que se formen tales espacios de aire, coloque de vez en
cuando una pequeña gota de agua destilada en el borde del cubreobjetos.
Antes de contar, deje reposar la celda S–R durante al menos 15 minutos
para sedimentar el plancton. Cuente el plancton en la parte inferior de la celda S–R.
Es posible que parte del fitoplancton, en particular algunas algas verdeazuladas
o flagelados móviles en muestras no conservadas, no se deposite sino que
suba a la parte inferior del cubreobjetos. Cuando esto ocurra, cuente estos
organismos por separado reenfocando y agregue al total de esos
dieciséis
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PLANCTON (10200)/Técnicas de conteo de fitoplancton
contados en el fondo de la celda para derivar el número total de organismos.
Cuente las algas en tiras o campos.
2) Recuento de tiras: en este contexto, una tira del largo de la celda S–R es un
volumen de aproximadamente 50 mm de largo, 1 mm de profundidad y el ancho de
la cuadrícula de Whipple total.
El número de tiras a contar es función de la precisión deseada y del número de
unidades (células, colonias o filamentos) por tira. Derive el número de plancton en
la celda S–R de la siguiente manera:
C 1000 mm3
N.°/mL
LDWS
donde:
C número de organismos contados, L
longitud de cada tira (longitud de celda S–R), mm, D
profundidad de una tira (profundidad de celda S–R),
mm, W ancho de una tira (ancho de imagen de cuadrícula de
Whipple), mm, y S número de tiras contadas.
Multiplique o divida el número de células por mililitro por un factor de corrección
para ajustar la dilución o concentración de la muestra. En última instancia, el
factor por el cual se multiplican las células contadas no debe ser mucho mayor que
25 para obtener resultados confiables.
3) Conteo de campo—En muestras que contengan mucho plancton (10 o más
plancton por campo), haga conteos de campo en lugar de conteos de tiras. Cuente
los tablones en campos aleatorios, cada uno de los cuales consta de una cuadrícula
de Whipple. El número de campos contados dependerá de la densidad de plancton
y la precisión estadística deseada (ver 10200F.1). Calcule la cantidad de plancton
por mililitro de la siguiente manera:
C 1000 mm3
N.°/mL
alimentador automático de documentos
donde:
C número de organismos contados, A área
de un campo (área de imagen de cuadrícula de Whipple), mm2
D profundidad de un campo (profundidad de celda S–R), mm y
F número de campos contados.
Multiplique o divida el número de células por mililitro por un factor de corrección
para ajustar la dilución o concentración de la muestra.
Una vez más, para obtener resultados fiables, el factor por el que se multiplican las
células contadas no debe ser mucho mayor que 25. b. Métodos de aumento
intermedio (bajo a 500): la celda de nanoplancton Palmer­Maloney (P­M)3 está
diseñada específicamente para la enumeración de nanoplancton. Tiene una cámara
circular de 17,9 mm de diámetro y 0,4 mm de profundidad, y contiene 0,1 ml. La
poca profundidad permite el uso de 40 a 45 objetivos con suficiente distancia de
trabajo. La principal desventaja de la celda P­M es que estos aumentos (400 a 450)
a menudo son insuficientes para la identificación y enumeración del nanoplancton.
Debido a que se examina una porción de muestra relativamente pequeña en la
celda P–M, no la use a menos que la muestra contenga una población densa (10 o
más tablones por campo). Una porción de muestra tan pequeña de una población
menos densa conduce a una grave subestimación de la densidad. Esto se puede
superar contando más área
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
sobre más cámaras; nuevamente, use la guía de un factor de multiplicación
máximo de 25.
Con el cubreobjetos en su lugar, pipetee la muestra en uno de los canales de 2
a 5 mm en el costado de la cámara. Después de 10 minutos
período de sedimentación, cuente los tablones en campos aleatorios (el número
de campos depende de la densidad y variedad del plancton, y de la precisión
estadística deseada). Las tiras se pueden contar en esta o en cualquier otra celda
circular midiendo el diámetro efectivo y contando dos tiras perpendiculares que se
cruzan en el centro.
Calcule el número por mililitro de la siguiente manera:
C 1000 mm3
N.°/mL
alimentador automático de documentos
donde:
C número de organismos contados, A
área de un campo (imagen de cuadrícula de Whipple), ,
mm2 D profundidad de un campo (profundidad de celda
P–M), mm y F número de campos contados.
Multiplique o divida el número de células por mililitro por un factor de corrección
para ajustar la dilución o concentración de la muestra.
Ahora hay disponibles otras cámaras similares que funcionan de manera muy
similar a las cámaras P­M. Por ejemplo, el hematocitómetro médico estándar
(utilizado para enumerar las células sanguíneas) tiene una rejilla reglada
mecanizada en una placa de recuento y está equipada con un cubreobjetos de
vidrio esmerilado. La rejilla se divide en divisiones de 1 mm2 y la cámara tiene una
profundidad de 0,1 mm. Pipetee la muestra en la cámara y visualícela con un
aumento de 450. Cuente todas las celdas dentro de la cuadrícula. El fabricante de
la cámara proporciona una hoja de instrucciones detalladas sobre los cálculos y el
uso adecuado. Una desventaja del hemocitómetro es que la muestra debe tener
una densidad de plancton muy alta para producir datos estadísticamente confiables,
o los analistas deben ver un área mucho mayor en varias cámaras. C. Métodos de
gran aumento: el examen del fitoplancton con gran aumento requiere el uso de
objetivos de inmersión en aceite.
,
Los procedimientos adecuados incluyen cámaras de microscopio invertidas,
montajes de filtros de membrana, montajes de portaobjetos sedimentados, el
método de gota Lackey y montajes de diatomeas.
1) Recuentos con microscopio invertido: prepare una muestra para su examen
llenando la cámara de sedimentación. Después del tiempo de asentamiento
deseado (ver 10200C.1), transfiera la cámara a la platina del microscopio. Cuente
las tiras perpendiculares a través del centro del cubreobjetos inferior. Los conteos
de tiras se pueden realizar a través de una rejilla de Whipple o de oculares de
conteo especiales con un par de hilos paralelos ajustables y un hilo cruzado.
Determine el ancho de la tira con un micrómetro de platina y cuente los organismos
a medida que pasan por la cruz, que funciona como punto de referencia. Mantenga
constante el ancho de la tira para cualquier serie de muestras. Alternativamente,
examine campos aleatorios que no se superpongan hasta que se cuenten al menos
100 unidades de la especie dominante.
Para ser más preciso, particularmente porque la distribución de algas puede no ser
uniforme, cuente todo el piso de la cámara. Alternativamente, realice un conteo
mínimo de campo aleatorio para lograr una precisión de al menos 85%.4 Esto se
puede superar contando
17
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PLANCTON (10200)/Técnicas de conteo de fitoplancton

más área sobre más cámaras; nuevamente, use la guía de un factor de CUADRO 10200:II. TABLA DE CONVERSIÓN PARA LA TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA
multiplicación máximo de 25. (BASADA EN 30 CAMPOS PUNTUADOS )

TOTAL F*
C en OCURRENCIA % NORTE†

Recuento de tiras (n.º/mL)

LWSV
3.3 0.03
1 6.7 0.07
donde: 2 10.0 0.10
3 13.3 0.14
C número de organismos contados, en 4 16.7 0.18
el área total del fondo de la cámara de sedimentación, , 5 20.0 0.22
mm2 L longitud de una tira, mm, W ancho de una tira 6 23.3 0.26

(ancho de imagen de cuadrícula de Whipple), mm, S número 7 26.7 0.31

8 30.0 0.35
de tiras contadas y V volumen de muestra sedimentada , ml.
9 33.3 0.40
10 36.7 0.45
11 40.0 0.51
C en
Recuento de campo (n.º/mL) 12 43.3 0.57
por FV 13 46.7 0.63
14 50.0 0.69
donde: 15 53.3 0.76
16 56.7 0.83
Af área de un campo (área de imagen de cuadrícula de Whipple), mm2 , 17 60.0 0.91
F número de campos contados, y 18 63.3 1.00
otros términos son como se definen anteriormente. 19 66.7 1.10
20 70.0 1.20
2) Montajes de filtro de membrana: concentre la muestra como se indica en 21 73.3 1.32
10200C.2 o prepare el filtro de membrana como se indica en 10200D.2a y 2b. 22 76.7 1.47
23 80.0 1.61
Examine las muestras, que se concentran en filtros de membrana sin 24 83.3 3
revestimiento y se montan en aceite o HPMA, como se describe anteriormente. 25 86.7 0.2.7
Cuente suficientes campos aleatorios para garantizar el nivel deseado de 26 90.0 2.79
precisión estadística (consulte 10200F.1). Seleccione el nivel de aumento y el 27 93.3 1.61
28 96.7 3
tamaño del campo del microscopio (cuadrado) para que las especies más
29 30 100.0 0.2.7 2
abundantes aparezcan en al menos el 70% pero no más del 90% de los campos
microscópicos examinados (80% es óptimo). Ajuste el tamaño del campo del Número total de ocurrencias de especies 100
*F
microscopio usando todo el campo de visión, o parte o todo el micrómetro ocular/ Número total de campos examinados
rejilla de Whipple. Examine al menos 30 campos de microscopio aleatorios y † N número de organismos por campo.

registre el número de campos en los que se produjo cada especie, según la

densidad. Informe los resultados como organismos por mililitro, calculados de la
siguiente manera:
precisión (ver 10200F.1). Calcular el número de organismos por mililitro de la
siguiente manera:
NQ
(Núm./mL)
CEO
C en
(Núm./mL)
Yo SV
donde:
donde:

Densidad de N (organismos/campo) de la Tabla 10200:II, C número de organismos contados,

Q número de campos por filtro, V mililitros filtrados y D
factor de dilución (0,96 para el conservante de formalina
al 4 %) (el factor de dilución no es necesario para el conservante a una
concentración
2%).
3) Montajes de portaobjetos sedimentados: examine los montajes que se
prepararon según se indica en 10200D.2c.
4) Método de gota de Lackey: el método de gota de Lackey (microtransecto)5
es un método simple para obtener conteos de considerable precisión con
muestras que contienen una población densa de plancton. Es similar al conteo
de tiras S–R.
Prepare los portaobjetos como se indica en 10200D.1. Los objetivos de
inmersión en aceite se pueden utilizar con los portaobjetos semipermanentes.
Cuente los organismos en suficientes tiras para asegurar el nivel deseado de estadística vivas y muertas obtenido del plancton.
,
en el área del cubreobjetos, mm2
como área de una tira, mm2 S,número
de tiras contadas y V volumen de
muestra debajo del cubreobjetos, ml.
5) Montajes de diatomeas: prepare las muestras como se indica en 10200D.3.
Para el conteo proporcional de especies de diatomeas, examine las muestras
de diatomeas bajo inmersión en aceite con un aumento de al menos 900.
Escanee las tiras laterales del ancho de la cuadrícula/campo de Whipple hasta
que se cuenten al menos 500 válvulas (2 válvulas por celda).
El tiempo disponible y la precisión requerida dictan el número de válvulas a
contar. Determine el porcentaje de abundancia de cada especie a partir de
recuentos contados y calcule los recuentos por mililitro de cada especie
multiplicando el porcentaje de abundancia por el recuento total de diatomeas

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207 18
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PLANCTON (10200)/Técnicas de conteo de fitoplancton
cámara de conteo. Para mayor precisión (si el material y los objetivos del
estudio lo indican claramente), distinga entre diatomeas vivas y muertas a
nivel de especie.
6) Técnica de tinción de fitoplancton: la tinción de algas permite a los
analistas diferenciar entre diatomeas "vivas" y "muertas"6 para que el
fitoplancton total se pueda enumerar en una sola muestra sin sacrificar la
taxonomía detallada de diatomeas. También da como resultado diapositivas
de referencia permanentes. Este procedimiento es más útil cuando las
diatomeas son componentes principales del fitoplancton y es importante
distinguir entre diatomeas vivas y muertas. Se pueden usar otras tinciones
para resaltar las características que facilitan la separación de los principales
grupos taxonómicos. Alternativamente, si la muestra se conservó en
glutaraldehído, se puede utilizar la epifluorescencia.
Para el trabajo con diatomeas, preferiblemente conserve las muestras
en solución de Lugol, glutaraldehído o formalina (consulte 10200B.2a).
Para el análisis, mezcle bien la muestra y filtre una porción a través de un
filtro de membrana de 47 o 25 mm de diámetro (diámetro de poro 0,45 o 0,65 m). 3. Referencias
Use un vacío de 16 a 20 kPa (25 mm Hg) y nunca deje que la muestra se
seque. Agregar de 2 a 5 ml de solución acuosa de fucsina ácida al filtro y
dejar reposar durante 20 min. (Cree una solución acuosa de fucsina ácida
disolviendo 1 g de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada a la que se le
han agregado 2 ml de ácido acético glacial). Después de la tinción, filtre la
muestra, lave brevemente con agua destilada y vuelva a filtrar. Administre
enjuagues sucesivos de propanol al 50, 90 y 100 % a la muestra mientras
se filtra. Remoje durante 2 min en un segundo lavado con propanol al 100
%, filtre y agregue xileno. Se requieren al menos dos lavados; deje el último
en remojo 10 min antes de filtrar. Recorte el filtro empapado en xileno y
colóquelo en un portaobjetos de microscopio en el que hay varias gotas de
medio de montaje.* Aplique varias gotas más de medio en la parte superior
del filtro e instale un cubreobjetos. Exprima con cuidado el exceso de medio
de montaje. Hacer el
*
Permount, Fisher Scientific Co., o equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
montaje final permanente mediante lacado de los cantos del cubreobjetos.
Cuente los organismos usando el aumento más apropiado.
Las diatomeas "vivas" suelen ser rojas, mientras que las "muertas" no
están teñidas. La inmersión en aceite es necesaria cuando se identifican
diatomeas para especies y muchas otras algas. Cuente franjas o campos
aleatorios y calcule las densidades de plancton por mililitro:
C en
N.°/mL
yv
donde:
C número de organismos contados, En
área total de filtro efectivo antes de recortar y montar, Ac área
contada (tiras o campos), y V volumen de muestra filtrada, mL.
1. INGRAM, WM Y CM PALMER. 1952. Procedimientos simplificados para
recolectar, examinar y registrar el plancton en el agua. J. Amer.
Asociación de Obras Hidráulicas 44:617.
2. VENRICK, EL 1978. Cuantas células contar. En A. Sournia, ed.
Manual de Fitoplancton; Monografía. Oceanogr. Métodos No. 6.
Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la
Cultura, París.
3. PALMER, CM Y TE MALONEY. 1954. Una nueva diapositiva de conteo para
nanoplancton; Especificaciones. Pub. Nº 21. Sociedad Americana. Limnología
y Oceanografía.
4. SOURNIA, A., ed. 1978. Manual de Fitoplancton; Monogr. Oceanogr.
Método. No. 6. Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la
Cultura, París.
5. LACKEY, JB 1938. La manipulación y el conteo del plancton fluvial y los
cambios en algunos organismos debido a la conservación con formalina. Pub.
Salud Rep. 53:2080.
6. OWEN, BB, JR., M. AFZAL Y WR CODY. 1978. Preparaciones de tinción
para fitoplancton y perifiton. británico Phycol. J. 13:155.
19
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PLANCTON (10200)/Técnicas de conteo de zooplancton

10200 G. Técnicas de Conteo de Zooplancton

1. Submuestreo

Cuente muestras completas con un bajo número de zooplancton (200

zooplancton) sin submuestreo. Sin embargo, la mayoría de las muestras
de zooplancton contendrán más organismos de los que se pueden
enumerar en la práctica, así que utilice un procedimiento de submuestreo.
Antes de submuestrear, elimine y enumere todos los organismos grandes
poco comunes (p. ej., larvas de peces en agua dulce o celenterados,
decápodos, larvas de peces, etc., en agua salada). Submuestra por pipeta
o método de división.
En el método de la pipeta, ajuste la muestra a un volumen conveniente
en un cilindro graduado o cono Imhoff. Es conveniente y preciso concentrar
la tonelada de tablones a través de un bulbo de goma y un tubo de plástico
acrílico transparente con una red de malla fina instalada en el extremo
(Figura 10200:9). Para microzooplancton más pequeños, use las técnicas
de sedimentación descritas para concentrar fitoplancton. Transfiera la
muestra a un vaso de precipitados u otro recipiente de boca ancha para
submuestrear a través de una pipeta Hensen­Stempel o similar de diámetro
ancho. Revuelva suavemente la muestra por completo y al azar con la
pipeta y extraiga rápidamente de 1 a 5 ml. Transferir a una cámara de
recuento adecuada.
Alternativamente, submuestree dividiendo mediante cualquiera de una
serie de dispositivos de los cuales el divisor de plancton de Folsom1 es el
más conocido (Figura 10200:10). Divisor de nivel antes de usar. Coloque
la muestra en el divisor y divídala en subdivisiones. Enjuague el divisor en
submuestras. Repita hasta obtener un número viable (200 a 500 individuos)
en una submuestra. Tenga cuidado de proporcionar divisiones imparciales.
Incluso cuando se utiliza el divisor de Folsom, no se pueden asumir
submuestras imparciales sin cuestionamientos;2 por lo tanto, cuente los
animales en varias submuestras de la misma muestra para verificar que el
divisor sea imparcial y para determinar el error de muestreo introducido al
usarlo.
Otro método permite estimaciones de abundancia de niveles de precisión
más equivalentes entre taxones que los obtenidos con la pipeta Hensen­
Stempel o el divisor de Folsom.3 Los procedimientos normales de conteo
contabilizan los organismos en función de su abundancia en una muestra.
Por lo tanto, en una muestra con un organismo dominante que represente
el 50 % de los números totales, la cuenta del taxón dominante será grande Figura 10200:9. Un dispositivo simple y eficiente para concentrar plancton.
y tendrá un pequeño error. Sin embargo, los errores relacionados con los El tubo se baja al vaso de precipitados que contiene la muestra.
subdominantes aumentarán a medida que disminuya el recuento de cada El agua que se filtra en el tubo se elimina mediante un bulbo de goma.
taxón. Al aceptar un nivel de precisión, la técnica3 ha sido desarrollada El filtro es una tela de malla de monofilamento de nailon que se pega
al fondo del tubo. El tamaño de la malla debe ser lo suficientemente
para obtener el mismo error sobre dominantes y subdominantes, permitiendo
pequeño para evitar que el zooplancton entre en el filtrado (según
comparaciones cuantitativas entre taxones en tiempos sucesivos o entre
Dodson y Thomas5 ).
estaciones.

2. Enumeración
solución en la cámara antes de contar para reducir los movimientos de
Con un microscopio compuesto y un aumento de 100, cuente el organismos, o utilice bandejas de recuento especiales con ranuras o
zooplancton pequeño (protozoos, rotíferos y nauplios) en una celda de particiones paralelas o circulares.4,5 Cuente los microcrustáceos con un
recuento de plástico acrílico transparente de 1 a 5 ml equipada con un microscopio binocular de disección con un aumento de 20 a 40. Si la
cubreobjetos de vidrio. Para microcrustáceos maduros más grandes, utilice identificación es cuestionable, elimine los organismos con un asa de
una cámara de recuento que contenga de 5 a 10 ml. Una celda de Sedgwick­ transferencia microbiológica y examine con mayor aumento bajo un
Rafter no es adecuada debido a su tamaño. Es deseable una cámara de microscopio compuesto.
recuento abierta de 80 50 2 mm de profundidad; sin embargo, una cámara Informar zooplancton como número por litro o número por cúbico
medidor,
abierta es difícil de mover sin sacudir e interrumpir el conteo. Coloque un detergente suave dependiendo del sistema y objetivos del estudio:

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207 20
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PLANCTON (10200)/Clorofila
Figura 10200:10. El separador de plancton de Folsom.
CV
Nº/m3
vv
donde:
C número de organismos
contados, V volumen de la muestra
concentrada, mL, V volumen contado, mL y
V volumen de la muestra al azar, m3. Para
obtener organismos por litro, divida por 1000.
3. Referencias
1. LONGHURST, AR Y DLR SEIBERT. 1967. Habilidad en el uso del
separador de muestras de plancton de Folsom. Limnol. Oceanogr. 12:334.
10200 H. Clorofila
Las concentraciones de pigmentos fotosintéticos se usan
ampliamente para estimar la biomasa de fitoplancton.1,2 Todas las
plantas verdes contienen clorofila a, que constituye alrededor del 1 al
2% del peso seco de las algas planctónicas. Otros pigmentos en el
fitoplancton incluyen clorofilas b y c, xantofilas, ficobilinas y carotenos.
Los productos importantes de la degradación de la clorofila que se
encuentran en el medio ambiente acuático son las clorofilidas, los
feófordos y las feofitinas. La presencia o ausencia de varios pigmentos
fotosintéticos se utiliza, entre otras características, para identificar los
principales grupos de algas.
Tres métodos para determinar la clorofila a en el fitoplancton son el
espectrofotométrico,3–5 fluorométrico,6–8 y el de alto rendimiento.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
2. MCEWEN, GF, MW JOHNSON Y TR FOLSOM. 1954. Un análisis
estadístico del divisor de muestras de Folsom basado en
observaciones de prueba. Arco. Meteorol. Geofísico. Bioklimatol.,
Ser. A, 6:502.
3. ALDEN, RW, III, DAHIYA RC y YOUNG RJ , JR. 1982. Un método
para la enumeración de muestras de zooplancton. Exp. J. Mar. Biol.
Ecol. 59:185.
4. GANNON, JE 1971. Dos celdas de conteo para la enumeración
de microcrustáceos de zooplancton. Trans. Amer. microsc. Soc. 90:
486.
5. DODSON, AN & WH THOMAS. 1964. Concentración de plancton
de manera suave. Limnol. Oceanogr. 9:455.
técnicas cromatográficas de líquidos (HPLC) .9 La prueba de fluoroma
es más sensible que la espectrofotometría, requiere menos muestra y
puede usarse para mediciones in vivo.10 Estos métodos ópticos
pueden subestimar o sobrestimar significativamente las concentraciones
de clorofila a ,11–18 en parte . porque las bandas de absorción y
fluorescencia de los pigmentos accesorios y los productos de
degradación de la clorofila coexistentes se superponen.
La feoforbida a y la feofitina a, dos productos de degradación
comunes de la clorofila a, pueden interferir con la determinación de la
clorofila a porque absorben la luz y emiten fluorescencia en la misma
región del espectro que la clorofila a . Si estos feopigmentos están
presentes, se producirán errores significativos en los valores de clorofila a .
21
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PLANCTON (10200)/Clorofila
resultado. Los feopigmentos se pueden medir mediante espectrofotometría o
fluorometría, pero en ambientes marinos y de agua dulce, el método fluorométrico
no es confiable cuando se produce clorofila b co, a menos que se utilice un
método sin acidificación (método 445.0 de la EPA). Al acidificar la clorofila b, la
emisión de fluorescencia resultante de la feofitina b coincide con la de la feofitina
a, provocando una subestimación y sobreestimación de la clorofila a y los
feopigmentos, respectivamente. El método de no acidificación tiene las siguientes
ventajas: datos de clorofila a más precisos , requiere menos mano de obra,
necesita menos recursos y es muy sensible.
La HPLC es un método útil para cuantificar los pigmentos fotosintéticos
,9,13,15,16,19–21, incluida
laslaclorofilas
clorofila a,
b ylos
c) pigmentos accesorios
y los productos (por ejemplo,
de degradación de
la clorofila (clorofilidas, feoforbidas y feofitinas). La distribución de pigmentos es
útil para la evaluación cuantitativa de la composición de la comunidad de
fitoplancton y la actividad de pastoreo de zooplancton.22
1. Extracción de pigmentos
Se prefieren los filtros de fibra de vidrio para eliminar las algas del agua.
Las fibras de vidrio ayudan a romper las células durante la molienda, se pueden
filtrar mayores volúmenes de agua y no se forman precipitados después de la
acidificación. Los filtros de membrana inertes, como los filtros de poliéster, se
pueden usar cuando estos factores son irrelevantes. Los filtros tomados de agua
con pH 6 pueden colocarse en bolsas de plástico herméticas y almacenarse
congeladas durante 28 días. Procese las muestras de agua naturalmente ácida
con pH 6 inmediatamente después de la filtración para evitar la posible degradación
de la clorofila del agua ácida residual en el filtro.
(El agua naturalmente ácida tiene un pH de 6 debido al ácido húmico o al
contenido de las células senescentes, no a los conservantes).
La clorofila se puede extraer de las células, normalmente recogidas en un filtro,
con varios disolventes (p. ej., acetona, etanol y metanol). El procedimiento descrito
aquí utiliza acetona. Realice este procedimiento con extractos de clorofila en luz
tenue para evitar la degradación. Use recipientes opacos o envuélvalos con papel
de aluminio.
Los pigmentos se extraen del concentrado de plancton con acetona acuosa y la
absorbancia del extracto (densidad óptica) se determina mediante un
espectrofotómetro. La facilidad con la que se eliminan las clorofilas de las células
varía considerablemente con las diferentes algas. Para extraer completamente
los pigmentos de manera consistente, rompa las células mecánicamente con un
molinillo de tejidos. una. Equipos y reactivos: 1) Triturador de tejidos*: puede ser
difícil macerar con éxito los filtros de fibra de vidrio en trituradores de tejidos
con un tubo de trituración y una maja de diseño cónico. Preferiblemente, utilice
tubos de trituración de fondo redondo con un mortero a juego que tenga ranuras
en la punta de TFE. Alternativamente, puede usarse sonicación.
2) Centrífuga clínica o de sobremesa (5000 a 7500 rpm) [g
(0.00001118r)(rpm), donde r radio de la centrífuga].
3) Tubos de centrífuga: graduados de 15 ml, con tapa roscada.
4) Equipo de filtración: filtros, fibra de vidrio† o membrana (0,45 m de porosidad,
47 mm de diámetro); bomba de vacío (o vacío de laboratorio); conjunto de filtro
resistente a los solventes (p. ej., un filtro completamente de vidrio)
* Kontes Glass Co., Vineland, NJ 08360: Triturador de vidrio/vidrio, modelo n.º
88855, que requiere un adaptador 78800 y un motor agitador 790040 operado a
500 rpm: Triturador de vidrio/TEE, modelo 886000; o equivalente. † Whatman GF/
F (0,7 m), GFB (1,0 m), Gelman AE (1 m),23 o equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
aparato de soporte que se puede limpiar con agua y solventes orgánicos), tamaño
de poro de 1,0 m;‡ jeringa resistente a solventes de 10 ml.
5) Solución saturada de carbonato de magnesio: agregue 1,0 g de MgCO3 en
polvo fino a 100 ml de agua destilada.
6) Solución acuosa de acetona—Mezcle 90 partes de acetona (grado reactivo
BP 56°C) con 10 partes de solución saturada de carbonato de magnesio. Para el
análisis de pigmentos HPLC, mezcle 90 partes de acetona de grado HPLC con
10 partes de agua destilada. b. Procedimiento de extracción: 1) Concentrar la
muestra por centrifugación o filtración tan pronto como sea posible después de
la recolección. Si se debe retrasar el procesamiento, mantenga las muestras
en hielo oa 4 °C y protéjalas de la exposición a la luz. Utilice botellas opacas
porque incluso una breve exposición a la luz durante el almacenamiento alterará
los valores de clorofila. Enjuague el recipiente de almacenamiento de la muestra
con aproximadamente 20 ml de agua de laboratorio libre de sustancias orgánicas
(que también se pasa por el mismo filtro de muestra para asegurarse de que se
recolecten todas las células). Utilice cristalería y cubetas que estén limpias y libres
de ácido.
Agregue aproximadamente 2 ml de solución de MgCO3 a la muestra justo antes
de que se complete el proceso de filtración. La solución de MgCO3 actúa como
un amortiguador de pH para evitar que la clorofila se degrade.
2) Colocar la muestra en un triturador de tejidos, cubrir con 2 a 3 mL de
solución acuosa de acetona al 90% y macerar a 500 rpm durante 1 min.
Utilice un molinillo de vidrio/TFE para un filtro de fibra de vidrio y un molinillo de
vidrio/vidrio para un filtro de membrana.
3) Transfiera la muestra a un tubo de centrífuga con tapa roscada, enjuague el
molinillo con unos pocos mililitros de acetona acuosa al 90 % y agregue el
enjuague a la suspensión de extracción. Ajuste el volumen total a 10 ml con
acetona acuosa al 90 % (se utilizan técnicas adicionales para los análisis de
HPLC; consulte 10200H.4). Use solvente con moderación y evite la dilución
excesiva de pigmentos. Remoje las muestras al menos 2 horas a 4°C en la
oscuridad. Los filtros de fibra de vidrio de 25 y 47 mm de diámetro tienen
volúmenes de desplazamiento en seco de 0,03 y 0,10 mL, respectivamente, e
introducen errores de aproximadamente 0,3 y 1,0 % si se utiliza un volumen de extracción de 10 m
4) Aclarar filtrando a través de un filtro desechable resistente a los disolventes
[p. ej., un filtro de jeringa de PTFE de 0,45 m y 13 mm (para minimizar la retención
de extracto en el filtro y el portafiltro, forzar de 1 a 2 ml de aire a través de filtro
tras extracto)] o mediante centrifugación en tubos cerrados durante 20 min a 500
go 3000 rpm [g (0,00001118r)(rpm), donde el radio de la centrífuga]. Decantar el
r extracto clarificado en un tubo de centrífuga limpio, calibrado, de 15 ml, con
tapón de rosca y medir el volumen total. Proceda como en 10200H.2, 3, 4 o 5.
2. Determinación espectrofotométrica de clorofila
una. Equipo y reactivos: 1)
Espectrofotómetro: con un ancho de banda (paso) estrecho (0,5 a 2,0 nm)
porque el pico de absorción de la clorofila es relativamente estrecho. Con un
ancho de banda espectral de 20 nm, la concentración de clorofila a puede
subestimarse hasta en un 40 %.
2) Cubetas, con longitudes de paso óptico de 1, 4 y 10 cm.
3) Pipetas, 0,1 y 5,0 ml.
4) Ácido clorhídrico (HCl), 0,1N. b.
Determinación de clorofila a en presencia de feofitina a: la clorofila a puede
sobrestimarse al incluir feopigmentos que absorben cerca de la misma longitud
de onda que la clorofila a.
Agregar ácido a la clorofila a da como resultado la pérdida del magnesio.
‡ Gelman Acrodisc, o equivalente.
§ Whatman GF/F, o equivalente.
22
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PLANCTON (10200)/Clorofila
átomo, convirtiéndolo en feofitina a. Acidifique cuidadosamente hasta una molaridad
final de no más de 3 ∙10–3M para evitar que ciertos pigmentos accesorios cambien
para absorber a la misma longitud de onda que la feofitina a.13 Cuando una solución
de clorofila a pura se convierte en feofitina a mediante acidificación, la absorción ­la
relación máxima (absorbancia 664/absorbancia 665) de 1,70 se usa para corregir la
concentración aparente de clorofila a para la feofitina a.
Se considera que las muestras con una relación de absorbancia 664
antes:absorbancia 665 después de la acidificación (664b:665a) de 1,70 no contienen
feofitina a y se encuentran en excelentes condiciones fisiológicas. Las soluciones de
feofitina pura no muestran reducción en la absorbancia 665 tras la acidificación y tienen
una relación 664b:665a de 1,0. Por lo tanto, las mezclas de clorofila a y feofitina a
tienen proporciones máximas de absorción que oscilan entre 1,0 y 1,7. Estas
proporciones se basan en el uso del 90%
acetona como disolvente. El uso de acetona al 100% como solvente da como resultado una
clorofila con una proporción de acidificación antes­después de aproximadamente 2.0.3
Procedimiento espectrofotométrico: transfiera 3 ml de extracto clarificado a una
cubeta de 1 cm y lea la absorbancia a 750 y 664 nm. Acidificar el extracto en la cubeta
con 0,1 mL de HCl 0,1 N. Agite suavemente el extracto acidificado y, 90 s después de
la acidificación, lea la absorbancia a 750 y 665 nm. Los volúmenes de extracto y ácido,
y el tiempo después de la acidificación son críticos para obtener resultados precisos y
consistentes.
La absorbancia 664 antes de la acidificación debe estar entre
0.1 y 1.0. Para extractos muy diluidos, utilice cubetas con un recorrido más largo. Si se
usa una celda más grande, agregue un volumen proporcionalmente mayor de ácido.
Corrija la absorbancia obtenida con cubetas más grandes a 1 cm antes de realizar los
cálculos.
Reste el valor de absorbancia de 750 nm de las lecturas antes (absorbancia 664
nm) y después de la acidificación (absorbancia 665 nm).
Usando los valores corregidos, calcule la clorofila a y la feofitina a por metro cúbico
de la siguiente manera:
26.7 664b 665a V1 V2 L
Clorofila a, mg/m3
26.7 1.7665a 664b V1 V2 L
Feofitina a, mg/m3
donde:
664b , 665a absorbancia del extracto de acetona al 90 % antes y después
de la acidificación, respectivamente, V1 volumen de
extracto, L, V2 volumen de muestra, m3 L longitud del paso de
luz o ancho de la cubeta, cm. ,y
El valor 26,7 es la corrección de absorbancia y es igual a
Y
donde:
Un coeficiente de absorbancia para la clorofila a a 664 nm 11,0,
y
Relación K que expresa la corrección por acidificación.
664b clorofila pura a
665a
664b 664b
clorofila a pura feofitina a pura
665a 665a
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
1.7
2.43
1.71.0
C. Determinación de clorofila a, byc ( método tricromático): Procedimiento
espectrofotométrico—Transferir el extracto a una cubeta de 1 cm y medir la absorbancia
a 750, 664, 647 y 630 nm.
Elija una longitud de paso de celda o una dilución para obtener una absorbancia 664
entre 0,1 y 1,0.
Utilice las lecturas de absorbancia a 664, 647 y 630 nm para determinar la clorofila
a, b y c, respectivamente. La lectura de absorbancia a 750 nm es una corrección por
turbidez. Reste esta lectura de cada uno de los valores de absorbancia del pigmento
de las otras longitudes de onda antes de usarlos en las ecuaciones a continuación.
Debido a que la absorbancia del extracto a 750 nm es sensible a los cambios en las
proporciones de acetona a agua, siga estrictamente la fórmula de 90 partes de
acetona:10 partes de agua (v/v) para la extracción de pigmentos. La turbidez se puede
eliminar fácilmente mediante filtración a través de un filtro desechable resistente a los
disolventes conectado a una jeringa o mediante centrifugación durante 20 min a 500 g.
Calcule las concentraciones de clorofila a, b y c en el extracto insertando las
densidades ópticas corregidas en las siguientes ecuaciones:5
a) Ca 11.85(absorbancia 664) – 1.54(absorbancia 647)
– 0.08(absorbancia 630)
b) Cb 21.03(absorbancia 647) – 5.43(absorbancia 664)
– 2.66(absorbancia 630)
c) Cc 24.52(absorbancia 630) –7.60(absorbancia 647)
– 1.67(absorbancia 664)
donde:
Concentraciones de Ca, Cb y Cc de clorofila a, b y c,
respectivamente, mg/L, y absorbancia 664,
647 y 630 densidades ópticas corregidas (con un paso de luz
de 1 cm) en las respectivas longitudes de onda.
Después de determinar la concentración de pigmento en el extracto,
calcular la cantidad de pigmento por unidad de volumen de la siguiente manera:
Volumen de extracción de Ca , L
Clorofila a, mg/m3
Volumen de muestra, m3
3. Determinación fluorométrica de clorofila a
El método fluorométrico para la clorofila a es más sensible que el método
espectrofotométrico, por lo que se pueden usar muestras más pequeñas. Para lograr
resultados aceptables, calibre el fluorómetro espectrofotométricamente con una muestra
de la misma fuente. La sensibilidad óptima para las mediciones del extracto de clorofila
a se obtiene a una longitud de onda de excitación de 430 nm y una longitud de onda de
emisión de 663 nm. Se encuentra disponible un método para medir continuamente la
clorofila a in vivo , pero se informa que es menos eficiente que el método in vitro que
se proporciona aquí (que produce alrededor de una décima parte de la fluorescencia
por unidad de peso).
23
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PLANCTON (10200)/Clorofila
como la misma cantidad en solución). La feofitina a también puede determinarse
mediante fluorometría.24 a. Equipos y reactivos: Además de los enumerados en
10200H.1a y 2a:
Fluorómetro, equipado con una lámpara azul F4T.5 de alta intensidad; tubo
fotomultiplicador R­446 (sensible al rojo); orificios de ventana deslizante 1, 3, 10 y
30; y filtros para emisión de luz (CS­2­64) y excitación (CS­5­60). Es preferible una
puerta de alta sensibilidad. b. Procedimiento de extracción: Prepare la muestra como
se indica en 10200H.1b.
1) Calibre el fluorómetro con una concentración conocida de solución de clorofila
de la siguiente manera. Preparar extracto de clorofila y analizar
espectrofotométricamente. Prepare diluciones en serie del extracto para proporcionar
concentraciones de aproximadamente 2, 6, 20 y 60 g de clorofila a/L. Realice
lecturas fluorométricas para cada solución en cada configuración de sensibilidad
(orificio de ventana deslizante): 1, 3, 10 y 30. Con los valores obtenidos, obtenga
factores de calibración para convertir las lecturas fluorométricas en cada nivel de
sensibilidad en concentraciones de clorofila a, de la siguiente manera:
C'a
fs
$ ambiente. Filtrar a través de filtro de fibra de vidrio‡‡ o centrífuga. Mida la
donde:
Factor de calibración Fs para ajuste de sensibilidad S,
C aconcentración de clorofila a determinada
espectrofotométricamente, g/L, y
Lectura del fluorómetro Rs para el ajuste de sensibilidad S.
2) Mida la fluorescencia de la muestra en configuraciones de sensibilidad que
proporcionen una lectura de escala media. (Evite usar la ventana 1 debido a los
efectos de extinción). Convierta las lecturas de fluorescencia en concentraciones de
clorofila a multiplicando las lecturas por el factor de calibración adecuado. C.
Determinación de clorofila a en presencia de feofitina a: Este método normalmente
no es aplicable a muestras de agua dulce. Ver discusiones bajo 10200H y 2b.
1) Equipos y reactivos: además de los enumerados en 10200H.1a y 2a, clorofila
a# pura (o un extracto de clorofila de plancton con una relación espectrofotométrica
de acidificación antes y después de 1,70 que no contenga clorofila b).
2) Procedimiento fluorométrico—Calibre el fluorómetro como se indica en el ¶ b1)
anterior. Determine la fluorescencia del extracto en cada configuración de sensibilidad
antes y después de la acidificación. Calcule los factores de calibración (Fs) y el
índice de fluorescencia antes y después de la acidificación dividiendo la lectura de
fluorescencia obtenida antes de la acidificación por la obtenida después de la
acidificación. Evite lecturas en la escala 1 y aquellas fuera del rango de 20 a 80
unidades fluorométricas.
3) Cálculos: determine la clorofila a y la feofitina a “corregidas” en los extractos
de muestra a través de las siguientes ecuaciones:8,24
r ve
Clorofila a, mg/m3 Fs Rb Ra rl
contra
Modelo 10­005, Turner Designs, Sunnyvale, CA, o equivalente.
# Clorofila a purificada, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO., o equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
r
Feofitina a, mg/m3 Fs rl Ver rRb Ra
contra
donde:
Fs factor de conversión para ajuste de sensibilidad S (ver 10200H.2b), r
Rb/Ra, determinado con clorofila a pura para el
(Redeterminar r y FS si se cambian los filtros o la fuente de luz),
fluorescencia Rb del extracto antes de la acidificación,
fluorescencia Ra del extracto después de la acidificación, volumen Ve
del extracto y volumen Vs de la muestra.
d. Extracción de agua entera, muestras no filtradas: Como alternativa, para evitar
la lisis celular durante la filtración, extraiga la muestra de agua entera.
1) Equipo y reactivos—Fluorómetro equipado con un fototubo R928 de alta
sensibilidad** con una impedancia de salida de 36 ma/W a 675 nm y una puerta de
alta sensibilidad. Coloque un filtro de densidad neutra (40 a 60 N) en la trayectoria
de la luz trasera,†† seleccionado para permitir el blanco del reactivo en la escala de
sensibilidad más alta.
2) Procedimiento de extracción: decantar 1,5 ml de muestra en un tubo de
ensayo con tapón de rosca y agregar 8,5 ml de acetona al 100 %. Mezclar con
mezclador vórtex y mantener en la oscuridad durante 6 horas a temperatura
fluorescencia como se describe en 10200H.3 y estime las concentraciones como en
el ¶ c anterior. Las sustancias húmicas interfieren, por lo que si están presentes,
filtre una porción de muestra (consulte 10200H.1b) y procese el filtrado con la muestra.
Reste la fluorescencia del filtrado (en blanco) de la de la muestra.
4. Determinación por cromatografía líquida de
alto rendimiento de clorofilas de algas y sus productos de
degradación
una. Equipos y reactivos: Además de los enumerados para la extracción de
pigmentos, 10200H.1a: 1) Cromatógrafo de líquidos de alta presión con capacidad
para un caudal de 2,0 ml/m.
2) Válvula inyectora de alta presión equipada con un circuito de muestra de 100
L.
3) Precolumna: 4,0 0,5 cm, material de relleno C18 , tamaño de partícula de 3 m
o sistema de protección equivalente) para prolongar la vida útil de la columna
principal.
4) Columna de HPLC de fase inversa.§§ 5)
Detector de fluorescencia capaz de excitación a 430 30 nm
y medir emisiones a longitudes de onda de 600 nm.
6) Dispositivo registrador de datos— Registrador gráfico de bandas o,
preferiblemente, un integrador electrónico.
7) Jeringa, vidrio, 250­L.
8) Eluyentes de HPLC: Sistema A (mezcla 80:15:5 de metanol, agua reactiva y
solución de emparejamiento de iones, respectivamente) y Sistema B (mezcla 80:20
de metanol y acetona, respectivamente). Utilice disolventes de grado HPLC; mida
los volúmenes antes de mezclar. Filtrar los eluyentes a través de un filtro de 0,4 m
resistente a los disolventes antes de su uso y desgasificar con helio. Prepare la
solución de emparejamiento iónico (IP) de
** Hammamatsu Corp., Middlesex, NJ, o equivalente. †† Si
utiliza el modelo 10­005, Turner Designs o equivalente. ‡‡
Whatman GF/F, o equivalente. §§ Columna Microsorb C18 , 10
cm de largo, tamaño de partícula de 3 m, Rainin Co. o equivalente.
24
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PLANCTON (10200)/Clorofila

15 g de acetato de tetrabutilamonio y 77 g de acetato de amonio## hasta completar 1

L con agua reactiva.15 9) Estándares de calibración —Disolver individualmente 1 mg
de cada clorofila ayb pura en 100 mL de acetona al 90%. Determinar las
concentraciones exactas espectrofotométricamente (664 para clorofila a en acetona al
90% 87,67 L/g∙cm; 647 para clorofila b en acetona al 90% 51,36 L/g∙cm).5 Preparar
estándares de feofitina aa y bb a partir de la clorofila primaria a y b patrones
acidificación
vía con
ácido clorhídrico; concentraciones respectivas correctas para la pérdida de Mg2.
Extraiga la clorofila c con un 90 % de acetona a partir de diatomeas, purifíquela
mediante cromatografía en capa fina (TLC)25 y calibre espectrofotométricamente (631)
para obtener una mezcla que contenga cantidades iguales de clorofilas c1 y c2 en un
90 % de acetona que contenga un 1 % de piridina 42,6 L/g cm Se supone que la
ausencia de esta pequeña cantidad de piridina causa solo pequeñas diferencias en las
propiedades de absorción de la clorofila c . Preparar clorofilida a a partir de diatomeas,27
purificar por TLC25 y calibrar espectrofotométricamente en acetona al 90% (664 para
clorofilida a 128 L/g cm).28 Preparar feofórbido a por acidificación de clorofilida a,
purificar por TLC25 y calibrar espectrofotométricamente en Acetona al 90 % (665 para
feóforo bidido a 69,8 l/g cm).28 Los estándares almacenados en nitrógeno en la
oscuridad a –20 °C son estables durante aproximadamente 1 mes.
5 Figura 10200:11. Cromatograma HPLC de fase inversa para una dilución
c2, g/ml 24,36E630 – 3,73E664)
quíntuple de muestra EPA. Volumen de inyección 100
L; picos detectados por espectroscopía de fluorescencia
(ej: 400 – 460 nm; ej: 600 nm). Las identidades
máximas son: 1: clorofilida a, 2: clorofila c, 3: feoforbida
a, 4: clorofila b, 5: clorofila a, 6: feofitina a y 7: feofitina a.
Los productos de degradación de la clorofila b (feofitina b y feofitina b)
estaban por debajo de los límites de detección. Identidades de picos
confirmadas por espectroscopía de matriz de diodos en línea (350–550 nm).
b. Procedimiento:

1) Preparar y equilibrar la HPLC con el Sistema A de disolvente a un caudal de 2 ml/

min. Ajuste la sensibilidad del fluorómetro para proporcionar una lectura de escala almacenarlo en metanol al 100% entre ejecuciones. Enjuague periódicamente el HPLC
completa con el estándar de clorofila a más concentrado . con agua reactiva para evitar la acumulación de agentes de emparejamiento de iones.
2) Calibrar HPLC preparando estándares de trabajo a partir de los estándares 5) Calcule las concentraciones de pigmentos individuales usando el siguiente
primarios (el día de uso). Una vez que se determinan los tiempos de retención de los fórmula baja:
estándares para un sistema en particular, simplifique la estandarización preparando
diluciones en serie a partir de estándares mixtos. Preparar estándares mixtos por AsFi VE
Allí
separado para las clorofilas y la clorofilida a y para las feofitinas y el feoforbido a. vivas
Mezcle porciones de 1 mL de estándares con 300 L de soluciones de emparejamiento
de iones y equilibre durante 5 minutos antes de la inyección (el uso de agentes de donde:
emparejamiento de iones mejora en gran medida la separación de pigmentos
desfitolados, clorofilida a, clorofila c y feoforbido a). Concentración de pigmento individual Ci , mg/l,
como área del pico de pigmento individual de la inyección de la
Prepare los espacios en blanco mezclando 1 ml de acetona al 90 % con 300 l de muestra, factor de respuesta estándar Fi (mg de pigmento/estándar
solución IP. Enjuague la jeringa dos veces con 150 L de estándar y extraiga unos 250 de 0,1 ml dividido por el área del pico correspondiente).
L de estándar en la jeringa para inyección. Coloque la jeringa en la válvula del inyector Volumen de extracción VE , ml,
y llene completamente el bucle de muestra de 100 L. volumen de inyección VI (0,1 ml) y
Construya curvas de calibración trazando áreas (o alturas) de picos de fluorescencia volumen de muestra VS , l.

frente a concentraciones de pigmento estándar.
3) Prepare muestras para inyección mezclando una porción de 1 ml de
el extracto de pigmento de acetona al 90% con 300 L de solución IP.
4) Use un programa de solvente de dos pasos para optimizar la separación de las
clorofilas de sus productos de degradación.15 Después de la inyección, cambie del
Sistema A de solvente al Sistema B durante 5 min y siga con el Sistema B durante 15
min a una velocidad de flujo de 2 mL/ mín. Vuelva a equilibrar la columna con el Sistema
A durante 5 min antes de la siguiente inyección, para un tiempo de análisis total de unos
25 min. Desgasifique los sistemas solventes con helio durante el análisis. Aumente la
vida útil de la columna de HPLC en
6) Este método está diseñado únicamente para cuantificar las clorofilas y sus
productos de degradación. Para detectar pigmentos carotenoides, que también están
presentes en los extractos de acetona al 90 % pero que no emiten fluorescencia, use la
espectroscopia de absorbancia (a aproximadamente 440 nm).21 7) Se muestran el
orden de elución y los tiempos de retención aproximados para los principales
pigmentos de clorofila y sus productos de degradación. en la Figura 10200:11. Los
límites de detección [relación señal/ruido (s/n) 2] varían según la configuración del
fluorómetro y el caudal; sin embargo,
mayoría oscilanyentre
de las clorofilas 10 y 100 pg
sus productos de por inyección para la
degradación.15,21,29
La precisión del método HPLC depende principalmente de la pureza de los pigmentos
estándar. Preferiblemente mida los espectros de absorción de los estándares (350 a
750 nm) y compárelos con los datos publicados.

Fluka Chemical Corp., 980 South Second Street, Ronkonkoma, NY, o equivalente.
## Sigma Chemical Company, o equivalente. La pureza del pigmento también se puede evaluar mediante análisis HPLC si hay

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207 25
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PLANCTON (10200)/Clorofila

CUADRO 10200:III. COEFICIENTES DE EXTINCIÓN Y PROPIEDADES CROMATOGRAFICAS DE PIGMENTOS SEPARADOS MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA
RENDIMIENTO EN FASE INVERSA (CF. FIGURA 10200:12)

Longitud de Retención
Pigmento onda (solvente) E1cm Árbitro. Hora % cv (n Absorción Máxima en Eluyente*
Identidad Nuevo Méjico
L/g∙cm No. min 3 inyección) Nuevo Méjico

clorofilida a 664 (90 % acetona) 631 128,0 28 7,8 5,7 nd† nd nd

clorofila c12 (90 % acetona) 42,6 26 8,9 0,6 444 576 630

peridinina 466 (acetona) 134,0 33 10,0 1,2 472

fucoxantina 449 (acetona) 160,0 44 11,0 0,9 446 (466)
neoxantina 439 (etanol) 443 224,3 35 11,5 5,9 416 441 470
violaxantina (etanol) 448 255,0 35 13,2 2,6 416 440 470
diadinoxantina (acetona) 445 223,0 36 14,6 6,0 422 446 476
luteína (etanol) 450 255,0 35 17,5 0,7 (422) 446 476
Zeaxantina (etanol) 647 (90 254,0 35 18,0 2,2 (428) 454 478
clorofila b % acetona) 664 (90 % 51,36 5 21,1 1,0 456 596 646
Clorofila a ,­ acetona) 453 (90 % 87,67 5 22,3 0,8 431 618 665
caroteno acetona)‡ 262,0 35 25,4 2,0 427 462 480

* Todos los máximos de absorción son de Wright et al.,31 excepto los de clorofila c12 (RR Bidigare y M. Latasa, datos no publicados). † No
determinado. ‡ Debido a un posible problema de insolubilidad del ,­caroteno en etanol, prepare este estándar en acetona al 90 %, no en
etanol. Se supone que el coeficiente de extinción de
El ,­caroteno en acetona al 90% es el mismo que en etanol.

no son contaminantes coeluyentes con absorción y sus bandas de fluorescencia
se superponen a las de los estándares. Las concentraciones de pigmento
derivadas espectrofotométricamente y de HPLC para los estándares disponibles
de la EPA concuerdan razonablemente bien (20 %) si los resultados
espectrofotométricos se corrigen para los feopigmentos y los resultados de HPLC
se expresan como equivalentes de pigmento (p. ej., clorofila a equivalentes
clorofila a clorofilida a clorofila a, siempre
que se apliquen las correcciones de peso molecular adecuadas).30 Por lo tanto,
si están presentes cantidades significativas de derivados de la clorofila, se
sobrestimarán las concentraciones de pigmento determinadas
espectrofotométricamente. La concordancia entre los resultados obtenidos por
HPLC y fluo rométricamente depende de la presencia de clorofilas accesorias b,
c y sus derivados. Las inyecciones por triplicado de una dilución quíntuple de
una muestra de la EPA dieron coeficientes de variación de 7,5 % (clorofilida a),
9,1 % (clorofila c), 13,4 % (feofórbido a), 9,6 % (clorofila b), 0,5 % (clorofila a) ,
6,2% (feofitina a), y 22,9% (feofitina a), con un valor promedio de 10% para los
siete pigmentos analizados.
5. Determinación por cromatografía líquida de
alto rendimiento de clorofila de algas y pigmentos carotenoides
6) Dispositivo de registro de datos: registrador de gráficos de tira o,
preferiblemente, un integrador electrónico o una computadora equipada con
hardware y software para el análisis de datos cromatográficos.
7) Jeringa, vidrio, 500­L.
8) Eluyentes de HPLC ­ Eluyente A [mezcla 80:20 de metanol y acetato de
amonio 0,5 M (v:v), respectivamente; pH 7,2]; Eluyente B [mezcla 90:10 de
acetonitrilo y agua (v:v), respectivamente], y Eluyente C (acetato de etilo). Utilice
disolventes de grado HPLC. Mida los volúmenes antes de mezclar. Filtrar los
eluyentes a través de un filtro de 0,4 m resistente a los disolventes antes de su
uso y desgasificar con helio.
9) Estándares de calibración : se pueden comprar clorofilas a y b, y ,­
caroteno,†††, al igual que zeaxantina y lu teína.‡‡‡ Se pueden purificar otros
estándares de pigmentos a partir de extractos de plantas mediante cromatografía
en capa fina (TLC)25 o HPLC a escala preparativa. Determine la concentración
de todos los estándares usando un espectrofotómetro basado en monocromador
en los solventes apropiados antes de calibrar el sistema HPLC. Los coeficientes
de extinción recomendados para los pigmentos de algas más comunes que se
encuentran en los sistemas de agua dulce se dan en la Tabla 10200:III. Mida la
absorbancia en una cubeta de 1 cm a la longitud de onda adecuada (generalmente
al máximo) y 750 nm (para corregir la dispersión de la luz).
Calcule las concentraciones de los estándares de la siguiente manera:

una. Equipos y reactivos: Además de los enumerados para la extracción de Amax A750nm
Allí 1000
pigmentos, 10200H.1a: El cm b
1) Bomba de cromatografía líquida de alto rendimiento : capaz de suministrar donde:
gradientes de tres disolventes a un caudal de 1 ml/min.
2) Válvula inyectora de alta presión —equipada con un loop de muestra de Concentración de pigmento individual Ci , mg/L,

200 L. Una absorbancia a una longitud de onda específica,

3) Precolumna—(50 4,6 mm, material de relleno C18 ,*** E1cm coeficiente de absorción específico del peso, L/g cm,
b longitud del camino de la cubeta, cm, y
tamaño de partícula de 5 m) para prolongar la vida útil de la columna primaria.
1000 factor de conversión, g a mg.
4) Columna de HPLC de fase reversa—con tapa final (250 4.6
mm, tamaño de partícula de 5 m, columna C18 ***). Los estándares almacenados bajo nitrógeno en la oscuridad a –20 °C son estables
durante aproximadamente 1 mes.
5) Longitud de onda variable o detector de absorbancia de filtro—con celda
de flujo continuo de bajo volumen. La longitud de onda de detección es de 436 nm.

††† Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, o equivalente.

‡‡‡ Roth Chemical Co., distribuida por Atomergic Chemetals Corp., Farmingdale,
*** Spherisorb ODS­2, Phase Separations Inc., Norwalk, CT, o equivalente. NY, o equivalente.

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PLANCTON (10200)/Clorofila

Figura 10200:12. Cromatograma de pigmento HPLC de fase inversa para una mezcla de pigmentos de algas comunes que se encuentran en los sistemas de agua dulce. Para más datos, véase
la Tabla 10200:III. La muestra contenía un extracto natural con adiciones auténticas conocidas. Los pequeños picos sin marcar son productos de degradación de pigmentos.

b. Procedimiento: 2) Calibre la HPLC usando estándares de trabajo (alrededor de 0 a 1000 ng/

1) Configure y equilibre la HPLC con el Eluyente A a una velocidad de flujo mL) preparados a partir de estándares primarios el día de uso.
de 1 ml/min. Mezcle 1 mL de estándar con 300 L de agua destilada, agite y

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PLANCTON (10200)/Clorofila

CUADRO 10200:IV. PROGRAMA DEL SISTEMA DE DISOLVENTE HPLC 8) La precisión del método se evaluó realizando inyecciones por triplicado de una
mezcla de fitoplancton y extractos de plantas.
Hora Velocidad de
Porcentaje de eluyente
Los coeficientes de variación oscilaron entre 0,6 y 6,0% (Tabla 10200:III). El uso de un
min flujo ml/min Condiciones ABC patrón interno adecuado aumenta la precisión.

Protocolo de análisis:
0,0 1,0 2,0 1,0 2,6 1,0 100 0 Más información sobre estos pigmentos y sobre el método de análisis
0 inyección
13,6 1,0 18,0 1,0 23,0
1,0 0 100 ods está disponible.33–37
0 Gradiente lineal
25,0 1,0 26,0 1,0 34,0
1,0 0 90 10 Gradiente lineal
0 65 35 Gradiente lineal 6. Referencias
0 31 69 Gradiente lineal
0 31 69 Espera
1. ROTT, E. 1980. Análisis espectrofotométrico y cromatográfico de clorofila:
0 100 0 Gradiente lineal
comparación de resultados y discusión del método tricromático. Ergebn.
100 0 0 Gradiente lineal
Limnol. (Suplemento a Arch. Hydrobiol.) 14:37.
100 0 0 espera
2. MARKER, AFH, EA NUSCH, H. RAI Y B. RIEMANN. 1980. La medición de
pigmentos fotosintéticos en aguas dulces y estandarización de métodos:
Protocolo de apagado:
Conclusiones y recomendaciones.
0,0 1,0 3,0 1,0 6,0 1,0
16,0 100 0 0 Análisis completo
1,0 17,0 0,0 0 100 resultados Limnol. (Suplemento de Arch. Hydrobiol.) 14:91.
0 Gradiente lineal
0 0 3. LORENZEN, CJ 1967. Determinación de clorofila y pigmentos feo:
100 Gradiente lineal
0 0 100 Lavado ecuaciones espectrofotométricas. Limnol. Oceanogr. 12:343.
0 0 100 apagado 4. FITZGERALD, GP & SL FAUSTO. 1967. Un método espectrofotométrico
para la estimación del porcentaje de degradación de clorofilas a feopigmentos
en extractos de algas. Limnol. Oceanogr. 12:335.
5. JEFFREY, SW Y GF HUMPHREY. 1975. Nuevas ecuaciones
equilibre durante 5 min antes de la inyección (la dilución de los estándares y los
espectrofotométricas para determinar las clorofilas a, b y c en plantas
extractos de muestra con agua aumenta la afinidad de los pigmentos por la columna en
superiores, algas y fitoplancton natural. Bioquímica Fisiol. Pflanzen 167:191.
el paso de carga, lo que resulta en una mejor separación de los pigmentos más polares).
Enjuague la jeringa dos veces con 300 L de estándar y extraiga 500 L de estándar en
6. YENTSCH, CS Y DW MENZEL. 1963. Un método para la determinación de
la jeringa para inyección. Coloque la jeringa en la válvula del inyector, llenando en
clorofila y feofitina de fitoplancton por fluorescencia. Resolución de aguas
exceso el bucle de muestra de 200 L 2,5 veces. Para verificar posibles interferencias profundas. 10:221.
en el solvente de extracción y/o el filtro, prepare un blanco extrayendo un filtro de fibra 7. LOFTUS, YO Y JH CARPENTER. 1971. Un método fluorométrico para
de vidrio en acetona al 90%; mezclando 1 mL de extracto de filtro de acetona al 90% determinar las clorofilas a, b y c. J. Mar Res. 29:319.
con 300 L de agua destilada; e inyectar en la HPLC. Trace las áreas (o alturas) de los 8. HOLM­HANSEN, O., CJ LORENZEN, RW HOLMES Y JDH STRICK LAND.
picos de absorción frente a las concentraciones de pigmento estándar. Calcule los 1965. Determinación fluorométrica de clorofila. J. Contras.
factores de respuesta como la pendiente de la regresión entre los pesos de los Cons. Perma. Int. Exploro. Mer. 30:3.
estándares inyectados (ng) y las áreas del pigmento principal (más las áreas de 9. BIDIGARE, RR, L. VAN HEUKELEM & CC TREES. 2005. Análisis de
isómeros estructuralmente relacionados, si están presentes). Estos isómeros contribuyen pigmentos de algas por cromatografía líquida de alta resolución. En AR
a la señal de absorción de los estándares; ignorarlos da como resultado una Anderson, ed. Técnicas de cultivo de algas. Prensa académica, Nueva
York, NY
sobreestimación de los pigmentos en los extractos de muestra.32
10. LORENZEN, CJ 1966. Un método para la medición continua de la
concentración de clorofila in vivo . Resolución de aguas profundas. 13:223.
11. JACOBSEN, TR 1978. Un método cuantitativo para la separación de las
3) Preparar muestras para inyección mezclando una porción de 1 mL del extracto
clorofilas ayb de los pigmentos de fitoplancton por cromatografía líquida de
de pigmento de acetona al 90 % con 300 L de agua destilada, agitar y equilibrar durante
alta presión. Ciencia de marzo. Com. 4:33.
5 min antes de la inyección.
12. BROWN, LM, BT HARGRAVE Y MD MACKINNON. 1981. Análisis de
4) Después de la inyección de la muestra, utilice un programa de gradiente para clorofila a en sedimentos por cromatografía líquida de alta resolución.
optimizar la separación de los pigmentos de clorofila y carotenoides. El sistema descrito Poder. J. Pescado. agua ciencia 38:205.
en la Tabla 10200:IV se ha desarrollado a partir del método original31 para garantizar 13. GIESKES, WW Y GW KRAAY. 1983. Derivados de clorofila a desconocidos
la elución de la mayoría de los pigmentos hidrofóbicos. Desgasifique el sistema solvente en el Mar del Norte y el Océano Atlántico tropical revelados por análisis
con helio durante el análisis. HPLC. Limnol. Oceanogr. 28:757.
Enjuague periódicamente la HPLC con agua destilada para evitar la acumulación de 14. GOWEN, RJ, P. TETT Y BJB WOOD. 1983. Cambios en los principales
reactivos de emparejamiento de iones. pigmentos del plancton de dihidroporfirina durante la floración primaveral
5) Determinar rutinariamente las identidades de los picos comparando los tiempos del fitoplancton en dos lagos marinos de Scoottish. J. Mar. Biol. Asoc. Reino
Unido 63:27.
de retención de los picos de la muestra con los de los estándares puros. Confirme las
identidades de los picos espectrofotométricamente recolectando los picos de elución 15. MANTOURA, RFC Y CA LLWEWLLYN. 1983. La determinación rápida de
pigmentos de clorofila y caroteniodo de algas y sus productos de
de la salida de la columna (o directamente con un espectrofotómetro de matriz de
degradación en aguas naturales mediante cromatografía líquida de alta
diodos en línea). La tabla 10200:III enumera la absorción máxima de los pigmentos
resolución de fase reversa. Anal. quim. Acta 151:297.
más comunes que se encuentran en los sistemas de agua dulce.
16. GIESKES, WWC Y GW KRAAY. 1984. Fitoplancton, sus pigmentos y
6) Calcule las concentraciones de pigmentos individuales usando el for
producción primaria en una estación central del Mar del Norte en mayo,
mula dada en 10200H.4b5).
julio y septiembre de 1981. Neth. J. Mar Res. 18:51.
7) Este método está diseñado para separar la clorofila y los pigmentos carotoides
17. HALLEGRAEFF, GM Y SE JEFFREY. 1985. Descripción de nuevos
(Figura 10200:12); sin embargo, también separa los principales productos de productos de alteración de clorofila a en fitoplancton marino. Resolución de
descomposición de la clorofila. aguas profundas. 32:697.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207 28
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PLANCTON (10200)/Determinación de Biomasa (Cultivo en Pie)
18. ÁRBOLES, CC, MC KENNICUTT II Y JM BROOKS. 1985. Errores asociados
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19. ESKINS, K., CR SCHOFIELD Y HJ DUTTON. 1977. Cromatografía líquida
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20. WRIGHT, SW Y JD SHEARER. 1984. Extracción rápida y cromatografía
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21. BIDIGARE, RR, MC KENNICUTT II Y JM BROOKS. 1985. Determinación
rápida de clorofilas y sus productos de degradación por cromatografía
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comentarios sobre la determinación fluorométrica de clorofila y feopigmentos.
Limnol. Oceanogr. 31:449.
10200 I. Determinación de Biomasa (Cultivo en Pie)
La biomasa es una estimación cuantitativa de la masa total de organismos
vivos en un área o volumen determinado. Puede incluir la masa de una
población (biomasa de la especie) o de una comunidad (biomasa de la
comunidad) , pero no brinda información sobre la estructura o función de la
comunidad. Los métodos más precisos para estimar la biomasa son el peso
seco, el peso seco libre de cenizas y el volumen de organismos vivos.
Los métodos indirectos incluyen estimaciones de carbono total, contenido
calórico, nitrógeno, lípidos, carbohidratos, sílice (diatomeas) y clorofila
(algas). El trifosfato de adenosina1 (ATP) y el ácido desoxirribonucleico2,3
(ADN) también se han utilizado como esti indirecto.
compañeros
La mayoría de las estimaciones de biomasa pueden verse afectadas
por detritos orgánicos e inorgánicos; Los análisis de ATP y ADN incluyen
contribuciones de la flora bacteriana.4 La biomasa calculada a partir de
recuentos celulares directos y mediciones dimensionales incorporará
errores, pero evitará incluir materias extrañas, como sedimentos y detritos,
que otras técnicas no pueden segregar de sus resultados.
1. Clorofila a
La clorofila a se utiliza como indicador de la biomasa de algas.5
Suponiendo que la clorofila a constituye, en promedio, el 1,5 % del peso
seco libre de cenizas de las algas, calcule la biomasa de algas
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
29. SARTORY, DP 1985. Determinación de pigmentos clorofílicos de algas
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fluorescencia. En Métodos para la Determinación de Sustancias Químicas
en Muestras Ambientales Marinas y Estuarinas. Agencia de Protección
Ambiental de los Estados Unidos, Cincinnati, Ohio.
multiplicando el contenido de clorofila a por 67 (ver 10200H para la
metodología de clorofila a ). Sin embargo, la relación entre clorofila y peso
seco variará entre los principales grupos taxonómicos, por lo que la relación
podría ajustarse en función del conocimiento de la composición de las algas.
2. Biovolumen (biovolumen celular)
Los datos de plancton derivados sobre una base de volumen por
volumen a menudo son más útiles que los números por mililitro porque
permiten el análisis de las contribuciones de taxones o especies individuales
a la estructura y función de la comunidad sobre la base de la biomasa (p.
ej., 1 célula­Chlamy domonas: 100 m3 vs. 1 célula­Ceratium: 40 000 m3 ).6
Determine el biovolumen celular usando la configuración geométrica más
simple (p. ej., esfera, cono, cilindro, cuña) que mejor se adapte a la forma
de la célula que se está midiendo.7–10 Mida solo el biovol ume de células
vivas, no vainas y setas. El tamaño de las células de un organismo puede
diferir sustancialmente en diferentes aguas o en la misma agua en
diferentes épocas del año, por lo tanto, para cada período de muestreo,
promedie las mediciones de 10 a 30 individuos de cada especie o taxón
(utilice una cantidad mayor de individuos para géneros variables como
Microcystis). Calcular el biovolumen total
29
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PLANCTON (10200)/Determinación de Biomasa (Cultivo en Pie)
de cualquier especie multiplicando el biovolumen celular promedio (en m3 ) por el
número de células por mililitro.
Calcule el biovolumen total de algas húmedas como:
norte
tu nosotros
Vermont
i1
donde:
Vt biovolumen total de células de plancton, mm3 /L,
Ni número de organismos de la i­ésima especie/L, y
Vi biovolumen medio de células de i­ésima especie, m3 .
La biomasa de carbono en las células de los componentes individuales del
fitoplancton también se puede estimar directamente a partir de las mediciones del
biovolumen celular.8
3. Volumen/Área de superficie
Una estimación del área de superficie por unidad natural es valiosa cuando
analizando las interacciones entre la unidad natural y las aguas circundantes. Calcule
el área de superficie promedio en m usando configuraciones geométricas similares y
multiplicando por el número por mililitro de la especie que se está considerando .
colonias celulares de diatomeas).
Las estimaciones de volumen y área de unidades naturales permiten el análisis de la
dinámica de nutrientes, el pastoreo y la dinámica de suspensión.
4. Volumen de desplazamiento
Este método11 mide el volumen de líquido que desplaza una muestra. El volumen
de desplazamiento se puede determinar a través de varios métodos. Para una
medición sencilla y directa, coloque la muestra en un tamiz cuya malla sea igual o
menor que la de la red de captura. Deje que la muestra se drene y transfiera a un
volumen medido de agua en un cilindro graduado. Mida el nuevo volumen (muestra
más volumen conocido). El volumen de desplazamiento es igual al nuevo volumen
menos el primer volumen medido de agua. Este método
funciona bien para muestras de macroalgas y zooplancton.
5. Métodos gravimétricos
La biomasa de la comunidad de plancton se puede estimar a partir de
determinaciones gravimétricas, aunque interfieren sedimentos y detritos orgánicos.
Determinar el peso seco colocando 100 mg de muestra concentrada húmeda en un
crisol de porcelana limpio, encendido y tarado y secar a 105 °C durante 24 h. Como
alternativa, filtre un volumen conocido de muestra a través de una membrana de
porosidad de 0,45 m o un filtro de fibra de vidrio previamente enjuagado, secado y
pesado. (NOTA: la muestra pequeña utilizada en la filtración directa puede dar lugar a
errores si no se manipula correctamente). Enfríe la muestra en un desecador y pésela.
Obtenga el peso libre de cenizas encendiendo la muestra seca a 500 °C durante 1 h
en un horno de mufla. Enfriar, rehumedecer la ceniza con agua destilada y llevar a
peso constante a 105°C. (La ceniza se vuelve a humedecer para restaurar el agua de
hidratación de las arcillas y otros minerales; esto puede representar hasta un 10 % del
peso perdido durante la incineración.12) El peso seco libre de cenizas es la diferencia
entre el peso seco y el peso de el residuo de ceniza después de la incineración. Al
comparar mixto
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
conjuntos, se prefiere el peso libre de cenizas al peso seco porque el contenido de
cenizas de las muestras varía mucho. La ceniza puede constituir el 50% o más del
peso seco del fitoplancton con estructuras inorgánicas, como las diatomeas. En otras
muestras, el contenido de cenizas es solo alrededor del 5% del peso seco.
6. Trifosfato de adenosina (ATP)
La única forma de determinar la biomasa de plancton viable total es medir el
trifosfato de adenosina (ATP) en el plancton. El ATP se encuentra en todas las plantas
y animales, pero solo en las células vivas; no está asociado con partículas no vivas.
La proporción de ATP a biomasa varía de una especie a otra, pero parece ser lo
suficientemente constante como para permitir estimaciones confiables de biomasa
basadas en mediciones de ATP.13 El método es simple y relativamente económico, y
la instrumentación es estable y confiable. El método también tiene muchas aplicaciones
potenciales en el trabajo de arrastre y bioensayo, especialmente en los estudios de
mortalidad del plancton. una. Equipo y reactivos: 1) Material de vidrio, matraces ,
vasos de precipitados y pipetas de vidrio de borosilicato limpios, estériles y secos.
2) Filtros, filtros de membrana de 47 mm de diámetro y 0,45 m de porosidad.
3) Equipos de filtración.
4) Congelador (–20°C).
5) Baño de agua hirviendo.
6) Instrumentos de detección, diseñados específicamente para medir ATP.*
7) Microjeringas: 10, 25, 50, 100 y 250 L.
8) Cubetas y viales de reacción.
9) Tampón Tris (0,02 M, pH 7,75): disolver 7,5 g de trishidroximetilaminometano
en 3 L de agua destilada y ajustar el pH a 7,75 con HCl al 20 %. Esterilice en autoclave
porciones de 150 ml a 115 °C durante 15 min.
10) Preparación de enzima luciferina­luciferasa†— Rehidratar extractos liofilizados
congelados (–20°C) de linternas de luciérnaga con tampón Tris según las indicaciones
del proveedor; dejar reposar a temperatura ambiente de 2 a 3 h, luego centrifugar a
300 g por 1 min y decantar el sobrenadante en un tubo de ensayo limpio y seco; dejar
reposar a temperatura ambiente durante 1 h.
11) Estándar de ATP purificado: disuelva 12,3 mg de ATP disódico en 1 L de agua
destilada y diluya 1,0 mL a 100 mL con Tris
buffer; 0,2 ml 20 de ATP. b. Procedimiento:
1) Calibración: para determinar el factor de calibración, F, prepare una serie de
diluciones de ATP estándar purificado y registre la emisión de luz de varias porciones
de cada concentración de estándar. Corrija el área media de los estándares restando
la lectura del pico o el área media de varios espacios en blanco utilizando 0,2 ml de
tampón Tris. Calcule el factor de calibración FS:
C
fs
Como
donde:
Fs factor de calibración en la sensibilidad S,
C concentración de ATP en solución estándar, ng/mL, y
* Beckman, JRB, Turner Designs o equivalente.
† Dupont, Sigma Chemical o equivalente.
30
Machine Translated by Google
PLANCTON (10200)/Medidas de tasa metabólica
Como lectura máxima o área media bajo la curva de ATP estándar
corregida para el blanco.
2) Análisis de la muestra: recolecte una muestra de 1 a 2 L en un muestreador
limpio y estéril. Pase a través de una red de 250 m para eliminar el zooplancton13
grande y filtre a través de un filtro de porosidad de 47 mm y 0,45 m aplicando un vacío
de unos 30 kPa. (IMPORTANTE: interrumpa la succión antes de que la última película
de agua atraviese el filtro). Coloque rápidamente el filtro en un vaso de precipitados
pequeño. Inmediatamente cubra el filtro con 3 ml de tampón Tris hirviendo, utilizando
una pipeta automática. Coloque el vaso de precipitados en un baño de agua hirviendo
durante 5 minutos y, con una pipeta Pasteur, transfiera el extracto a un tubo de ensayo
limpio, seco y calibrado. Enjuague el filtro y el vaso de precipitados con 2 ml de tampón
Tris hirviendo; combine los extractos, registre el volumen, aumente el volumen hasta 5
mL con tampón Tris, cubra los tubos con parafilm y, si las muestras no se pueden
analizar inmediatamente, congele a –25 °C. Los extractos se pueden almacenar
durante muchos meses en un congelador. Preparar al menos extractos por triplicado de cada muestra.
El procedimiento analítico depende del equipo de detección utilizado. Si se utiliza
un contador de centelleo, pipetee 0,2 ml de preparación de enzima (en blanco) en un
vial de vidrio. Mida las emisiones de luz de la preparación de enzimas durante 2 a 3
minutos con ajustes de sensibilidad cercanos a los previstos para la muestra. Agregue
0,2 ml de extracto de muestra al vial, registre el tiempo y agite. Comience a registrar la
salida de luz 10 s después de combinar el extracto de ATP y la preparación de
enzimas; registro de salida durante 2 a 3 min, utilizando el mismo período de tiempo
para todas las muestras. Determine la media de las áreas bajo las curvas obtenidas y
corrija restando la media de las áreas bajo las curvas obtenidas de los espacios en
blanco preparados como se indica en Strickland y Parsons.14
C. Cálculos: Calcular la concentración de ATP:
Ac Ve Fs
ATP, de/L
contra
donde:
Ac área media corregida bajo las curvas de extracción,
Ve volumen de extracción, mL, factor de calibración Fs
y Vs volumen de muestra, L.
Suponiendo un contenido de ATP de 2,4 g de ATP/mg de materia orgánica en peso
seco,15 la biomasa viva total del plancton (B), como materia orgánica en peso seco,
se da como:
atp
B, mg/L
2.41000
10200 J. Mediciones de tasa metabólica
La condición fisiológica de la comunidad acuática y el espectro de interacciones
biológicas deben ser considerados al evaluar el estado de las aguas naturales. En
estudios anteriores, el número, la composición de especies y la biomasa fueron las
principales consideraciones. El reconocimiento de las limitaciones de este enfoque
condujo a la medición de las tasas de los procesos metabólicos, como la fotosíntesis
(productividad), la fijación de nitrógeno, la respiración y el transporte de electrones.
Estos proporcionan una mejor comprensión de la naturaleza compleja del ecosistema
acuático. Se puede determinar una indicación de la eficiencia fotosintética a través del
índice de productividad (mg C fijado/unidad de clorofila a).1
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
7. Referencias
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Técnicas de Bioensayo y Química Ambiental. Ann Arbor Science Publ., Ann
Arbor, Michigan.
1. Fijación de nitrógeno
La capacidad de un organismo para fijar nitrógeno es una gran ventaja competitiva
y juega un papel importante en la dinámica de la población.
Dos métodos confiables para estimar las tasas de fijación de nitrógeno en el laboratorio
son el método de trazador de isótopos 15N2,3 y el método de reducción de acetileno.4
Debido a que la tasa de fijación de nitrógeno varía mucho con diferentes organismos
y con la concentración de nitrógeno combinado, las tasas de fijación de nitrógeno no
pueden utilizarse para estimar la biomasa del órgano fijador de nitrógeno
31
Machine Translated by Google
PLANCTON (10200)/Medidas de tasa metabólica
ismos Sin embargo, el método de reducción de acetileno es útil para medir los balances
de nitrógeno y en el trabajo de ensayo de algas.5
2. Productividad, método de oxígeno
En este contexto, la productividad es la tasa a la que el carbono inorgánico se
convierte en una forma orgánica. Los organismos portadores de clorofila (fitoplancton,
perifiton, macrófitos) sirven como productores primarios en la cadena alimentaria acuática.
La fotosíntesis finalmente da como resultado la formación de una amplia gama de
compuestos orgánicos, la liberación de oxígeno y la reducción de dióxido de carbono
(CO2) en las aguas circundantes.
La productividad primaria6 puede determinarse midiendo los cambios en las
concentraciones de oxígeno y CO2.7 En aguas pobremente amortiguadas, el pH puede
usarse para detectar variaciones en el sistema. A medida que se elimina el CO2
durante la fotosíntesis, el pH aumenta. Este cambio se puede usar para estimar tanto la
fotosíntesis como la respiración.8 El mar y muchas aguas dulces están demasiado
amortiguadas para que esto sea útil, pero se ha aplicado con éxito a los estudios de
productividad en algunas aguas lacustres.
Dos métodos para medir la tasa de absorción de carbono y la fotosíntesis neta in situ
son el método del oxígeno9 y el método del carbono­14.10 En ambos métodos, se llenan
botellas transparentes (claras) y oscurecidas (oscuras) con muestras de agua y se
suspenden a una profundidad regular. intervalos de 3 a 4 h (tasa máxima) o por un
período de 24 horas (tasa integrada), o las muestras se incuban en condiciones
controladas en cámaras de crecimiento ambiental en el laboratorio.
Las reacciones básicas en la fotosíntesis de las algas implican la absorción de
carbono inorgánico y liberación de oxígeno:
CO2 H2O 3 CH2Ox O2
Las principales ventajas del método del oxígeno son que proporciona estimaciones
de la productividad bruta y neta y de la respiración, y que los análisis se pueden realizar
con equipos de laboratorio económicos y reactivos comunes. La concentración de
oxígeno disuelto (OD) se determina al principio y al final del período de incubación.
La productividad se calcula en base a la suposición de que se asimila un átomo de
carbono por cada molécula de oxígeno liberada. una. Equipo: 1) Frascos de DBO :
numerados, de 300 ml, de vidrio de silicato de boro transparente y opaco, con tapón
de vidrio esmerilado y boca acampanada, para la incubación de muestras. Limpie con
ácido las botellas, enjuáguelas bien con agua destilada y, justo antes de usarlas,
enjuáguelas con el agua que se va a probar.
No utilice detergentes que contengan fósforo.
Si no se dispone de botellas opacas adecuadas, haga opacas las botellas
transparentes de DBO pintándolas de negro y envolviéndolas con cinta impermeable
negra. Como precaución adicional, envuelva todo el frasco en papel de aluminio o
colóquelo en un recipiente que no le dé luz durante la incubación.
2) Línea de apoyo o rack que no dé sombra a las botellas suspendidas.
3) Muestreador Van Dorn de plástico acrílico opaco no metálico o
equivalente, de 3 a 5 L de capacidad.
4) Equipos y reactivos para determinaciones de DO—Ver Sección 4500­O.
5) Pirheliómetro.
6) Fotómetro submarino.
7) Termómetro. b.
Procedimiento:
1) Usando un pirheliómetro, obtenga un perfil de la entrada de energía solar
radiación para el fotoperíodo.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
2) Usando un fotómetro submarino, determine la profundidad de la zona eufótica (la
región que recibe el 1% o más de la iluminación de la superficie).
Seleccione intervalos de profundidad para la colocación de botellas. Para aproximarse
mucho a la curva de profundidad de la fotosíntesis, coloque muestras a intervalos iguales
a una décima parte de la profundidad de la zona eufótica. Estime la productividad en
aguas relativamente poco profundas con menos intervalos de profundidad.
3) Mida la concentración de oxígeno a través de una sonda o titulación y la temperatura
y salinidad para determinar si el agua está sobresaturada con oxígeno (consulte la Tabla
4500­O:I). Si el agua está sobresaturada, burbujee gas nitrógeno a través de la muestra
para reducir la concentración inicial de oxígeno al 80 % de saturación.
4) Mantenga las muestras alejadas de la luz solar directa durante su manipulación.
Introduzca las muestras tomadas de cada profundidad preseleccionada en botellas
duplicadas transparentes, oscurecidas y de análisis inicial. Inserte el tubo de suministro
del muestreador hasta el fondo de la botella de muestra y llénelo de manera que se
desborden tres volúmenes de agua. Retire el tubo lentamente y cierre la botella. Use
agua de la misma muestra para llenar un "conjunto" (una botella clara, una oscura y una
inicial).
5) Inmediatamente trate (fije) las muestras tomadas para determinar químicamente
el OD inicial (consulte la Sección 4500­O) con sulfato manganoso (MnSO4), yoduro
alcalino y ácido sulfúrico (H2SO4) o verifique con una sonda de oxígeno. Los análisis
pueden retrasarse varias horas, si es necesario, si las muestras se fijan o congelan y se
almacenan en la oscuridad.
6) Suspender botellas duplicadas transparentes y oscurecidas a la profundidad de la
que se tomaron las muestras e incubar durante al menos 2 h, pero nunca más de lo que
tardan en formarse burbujas de gas de oxígeno en botellas transparentes o se agota el
OD en botellas oscuras. .
7) Al final del período de exposición, determine inmediatamente el DO como se
describe anteriormente.
C. Cálculos: El aumento en la concentración de oxígeno en la botella de luz durante
la incubación es una medida de la producción neta, que (debido a que el oxígeno se usa
al mismo tiempo en la respiración) es algo menor que la producción total (bruta). La
pérdida de oxígeno en la botella oscura se utiliza como estimación de la respiración total
del plancton. Por lo tanto:
fotosíntesis neta botella ligera DO inicial DO
inicial DO botella oscura DO
Respiración
Fotosíntesis bruta botella clara DO botella oscura DO
Resultados promedio de duplicados.
1) Calcular la producción bruta o neta para cada profundidad de incubación y parcela:
mg carbono fijo/m3 mg oxígeno liberado/L 32/12
1000 L/m3 K
donde K es el cociente fotosintético (PQ), que varía de 1 a 2 según el aporte de
nitrógeno.11,12
Utilice el factor 12/32 para convertir oxígeno en carbono; en condiciones ideales, se
libera 1 mol de O2 (32 g) por cada mol de carbono fijado (12 g).
2) En este contexto, la productividad es la tasa de producción; generalmente se
reporta en gramos de carbono fijados por metro cuadrado por día. Determine la
productividad de una columna vertical de agua de 1 m cuadrado trazando la productividad
para cada profundidad de exposición e integrando gráficamente el área bajo la curva.
32
Machine Translated by Google
PLANCTON (10200)/Medidas de tasa metabólica
3) Utilizando el perfil de radiación solar y la tasa de fotosíntesis durante la
incubación, ajuste los datos para representar la productividad del fitoplancton durante
todo el fotoperíodo. Debido a que las tasas fotosintéticas varían ampliamente durante
el ciclo diario,13,14 no intente
convertir datos a otras circunstancias de prueba.
3. Productividad, Método Carbon­14
Agregue solución de carbonato radiactivo (14CO3 2–) a botellas claras y oscuras
que se hayan llenado con muestra, como se describe para el método de oxígeno.
Después de la incubación in situ, recolecte el plancton en un filtro de membrana,
trátelo con vapores de ácido clorhídrico (HCl) para eliminar el carbono inorgánico­14
y analice la radiactividad. La cantidad de carbono fijado es proporcional a la fracción
de carbono radiactivo asimilado. Este procedimiento difiere del método del oxígeno
en que mide directamente la absorción de carbono y mide solo la fotosíntesis neta.15
Es básicamente más sensible que el método del oxígeno, pero no tiene en cuenta los
materiales orgánicos que se filtran de las células16,17 durante la incubación. una.
Equipos y reactivos: 1) Pirheliómetro.
2) Fotómetro submarino.
3) Botellas de DBO y aparatos de soporte—Ver 10200J.2a1) y 2).
4) Dispositivo de filtración de membrana y filtros de 25 mm con porosidades de
0,22, 0,30, 0,45, 0,80 y 1,2 m.
5) Equipo de contaje para medir la radiactividad: escalador con tubo de ventana
en el extremo, medidor de flujo de gas o contador de centelleo líquido (consulte la
Sección 7030B.3). El tubo de ventana delgada es el detector menos costoso y,
cuando se usa con un escalador pequeño, proporciona datos aceptables a un costo
moderado.
6) Cámara de vapor: use un desecador de vidrio con HCl concentrado de
aproximadamente 1,4 cm de profundidad en la cámara desecante. Se recomienda la
cámara de vapor para la descontaminación del filtro.18,19 7) Jeringa o pipeta, no
metálica.
8) Reactivos químicos—Vea las Secciones 4500­CO2 (Carbon Di
óxido) y 2320 (Alcalinidad).
9) Soluciones de carbonato radiactivo a)
Solución de dilución de cloruro de sodio, NaCl al 5 % (p/v): agregue 0,3 g de
carbonato de sodio (Na2CO3) y una pastilla de hidróxido de sodio (NaOH) por litro.
Úselo solo para estudios marinos.
b) Solución de carbonato radiactivo sin portador: comercialmente disponible en
viales sellados que contienen alrededor de 5 Ci 14C/mL.
Confirme la ausencia de metales tóxicos suspendidos y disueltos20 o filtre y pase a
través de una columna de intercambio iónico.* c) Soluciones de trabajo con actividades
de 1, 5 y 25 Ci 14C/ 2 ml: para estudios en agua dulce, use radiactivo libre de
portador carbonato. Para estudios de agua marina, prepárelo diluyendo una solución
de carbonato radiactivo sin portador con una solución de dilución de NaCl.
d) Ampolla madre: prepare ampollas que contengan 2 ml de la solución de trabajo
requerida. Llene las ampollas y autoclave las ampollas selladas a 121 °C durante 20
min.21
b. Procedimiento:
1) Usando un pirheliómetro, obtenga un registro de la radiación solar incidente
radiación para el fotoperíodo.
2) Determinar los intervalos de profundidad para el muestreo y la incubación como
descrito arriba.
* Chelex 100, o equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.207
3) Use botellas claras y oscuras duplicadas en cada profundidad. Además, use
botellas oscuras o botellas recolectadas en el tiempo cero. llenar botellas
con la muestra, agregue 2 ml de solución de carbonato radiactivo (usando una pipeta
no metálica) al fondo de cada botella y mezcle bien invirtiendo repetidamente. La
concentración de carbono­14 debe ser de alrededor de 10 Ci/L en aguas relativamente
productivas, a 100 Ci/L o más en aguas oligotróficas (océano abierto). Para obtener
significación estadística, tenga al menos 1000 cuentas por minuto (cpm) en la muestra
filtrada. Tome muestras duplicadas en cada profundidad para determinar la
concentración inicial y la disponibilidad de CO3 2–) de carbono inorgánico (CO2,
HCO3 – apto para la fotosíntesis (consulte la Sección 4500­CO2). Para muestras
, marinas
estime las concentraciones totales de carbono inorgánico con un sencillo
y deprocedimiento
estuarios,
de titulación22 y realice mediciones iniciales de temperatura, salinidad y pH.
4) Incube las muestras hasta por 4 h. Si se requieren mediciones para todo el
fotoperíodo, superponga períodos de 4 horas desde el amanecer hasta el anochecer.
Un período de incubación de 4 horas puede ser suficiente si se utiliza la entrada de
energía como base para extrapolar el período de incubación al fotoperíodo completo.
Para el procedimiento de incubación, consulte 10200J.2b6).
5) Después de la incubación, retire las botellas de muestra y colóquelas
inmediatamente en la oscuridad. Filtre las muestras sin conservantes rápidamente.
Evite la conservación de la muestra para evitar la lisis de las células o la inclusión
inadvertida de productos extracelulares.
6) Filtrar dos porciones de cada muestra a través de un filtro de membrana cuyo
tamaño de poro sea consistente con la retención cuantitativa de plancton. Aunque el
filtro de poro de 0,45 m suele ser adecuado, determine la eficiencia de retención de
muestras de una amplia gama de tamaños de poro inmediatamente antes del
análisis.23,24 Aplique unos 30 kPa de vacío durante la filtración. El exceso de vacío
puede causar una ruptura celular extensa y pérdida de radioactividad a través de la
membrana.25 Use un volumen de muestra máximo consistente con una filtración
rápida (1 a 2 min), pero no obstruya el filtro.
7) Coloque las membranas en vapores de HCl durante 20 min. Cuente los filtros
tan pronto como sea posible, aunque es aceptable un almacenamiento prolongado
en un desecador.
8) Determinar la radiactividad contando con un tubo de ventana final,
detector de flujo de gas sin ventana o contador de centelleo líquido.
9) Determine la geometría de conteo de los detectores de flujo de gas de ventana
delgada y sin ventana.26 Utilizando tres ampollas de carbono­14, prepare una serie
de precipitados de carbonato de bario (BaCO3) en filtros de membrana tarados de
0,45 m, como se indica a continuación. Los precipitados contendrán la misma cantidad
de actividad de carbono­14, pero su espesor oscilará entre 0,5 y 6,0 mg/cm2 .
Diluir cada
ampolla a 500 mL con una solución de 1,36 g Na2CO3/L agua destilada libre de CO2.
Pipetee porciones de 0,5 ml en cada uno de los siete matraces cónicos que contengan
0, 0,5, 1,5, 2,5, 3,5, 4,5 y 5,5 ml, respectivamente, de una solución de 1,36 g de
Na2CO3/L de agua destilada libre de CO2.
Agregue, respectivamente, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8, 2,4, 3,0 y 3,6 ml de solución de cloruro
de bario (BaCl2) al 1,04 %. Deje reposar el precipitado de BaCO3 durante 2 h con
agitación suave cada media hora. Recoja cada precipitado en un filtro (utilizando un
aparato con un área de filtración comparable a la de las muestras). Con succión,
seque los filtros sin lavar; colocar en un desecador durante 24 h, pesar y contar. La
tasa de conteo aumenta exponencialmente a medida que disminuye el espesor del
precipitado.
Extrapole gráficamente (o matemáticamente) a un espesor de precipitado cero y
multiplique la tasa de conteo de espesor cero por 1000 para corregir la dilución de la
ampolla. Esto representa la cantidad de
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PLANCTON (10200)/Medidas de tasa metabólica
actividad añadida a cada botella de muestra utilizada para determinar la
fracción de carbono­14 absorbida en botellas claras y oscuras. C. Cálculos:
1) Reste el recuento medio de muestra de botella oscura o tiempo cero
de los recuentos medios de botellas de luz para cada par de réplicas.
2) Determinar el carbono inorgánico disuelto total disponible para la
fotosíntesis (carbonato, bicarbonato y CO2 libre) a partir de mediciones de
pH y alcalinidad; realice la medición directa del CO2 total de acuerdo con la
Sección 4500­CO2 o los métodos descritos en la literatura.27–30 3)
Determine la cantidad de carbono fijo de la siguiente manera:
tasa de conteo de la actividad total de la
mg carbono fijo/L
muestra filtrada añadida a la muestra
300
mg/L de carbono inorgánico inicial 1.064†
volumen filtrado
4) Integrar la productividad para toda la profundidad de la zona eufótica y
expresarla en gramos de carbono fijo por metro cuadrado por día [ver
10200J.2c2)].
5) Utilizando los registros de radiación solar y las tasas de fotosíntesis
durante la incubación, ajuste los datos para representar la productividad del
fitoplancton durante todo el fotoperíodo. Si las muestras se incubaron durante
menos del fotoperíodo completo, aplique un factor de corrección.
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