Woollard 2016

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manuscrito aceptado
Determinación de ésteres de vitamina A y vitamina E en fórmulas infantiles y for
Leches en polvo tificadas por HPLC: uso de estandarización interna
David C. Woollard, Anja Bensch, Harvey Indyk, Adrienne McMahon
PII: S03088146(15)300790
DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.10.077
Referencia: FOCH 18272
Aparecer en: Química de Alimentos
Fecha de recepción: 11 de febrero de 2015

Fecha revisada: 11 de septiembre de 2015
Fecha de Aceptación: 18 de octubre de 2015
Cite este artículo como: Woollard, DC, Bensch, A., Indyk, H., McMahon, A., Determinación de vitamina A y
Ésteres de vitamina E en fórmulas infantiles y leches en polvo enriquecidas mediante HPLC: uso de estandarización interna, alimentos
Química (2015), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.10.077
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1 Determinación de ésteres de vitamina A y vitamina E en fórmulas infantiles y
2 Leches en polvo fortificadas mediante HPLC: uso de estandarización interna
4 David C. Woollarda*, Anja Benschb , Harvey Indykc y Adrienne McMahond
a
6 RJ Hill Laboratories Ltd, 1, Clyde Street, Hamilton 3216, Nueva Zelanda
b
7 Servicios de laboratorio de Nueva Zelanda, Auckland, Nueva Zelanda
C
8 Fonterra Cooperative Group Ltd, Waitoa, Nueva Zelanda
d
9 Wyeth Nutrition, Askeaton, Condado de Limerick, República de Irlanda
10
11 *Autor correspondiente. Tel.: +64 223134424.
12 Dirección de correo electrónico: david.woollard@hilllabs.co.nz
13
14 Abstracto
15
dieciséis Se describe un método de HPLC que utiliza condiciones de fase normales con una sílice no unida.
17 columna para determinar las concentraciones de ésteres suplementarios de vitamina A y vitamina E
18 y βcaroteno en fórmulas infantiles. El método utiliza doble canal selectivo.
19 fluorescencia para las vitaminas A y E y absorbancia visible para el βcaroteno. un atributo de
20 el método es el uso de propionato de retinol, propionato de αtocoferilo y todoEβapo8'
21 Estándares internos de éster etílico del ácido carotenoico para compensar las variaciones analíticas
22 asociado con estas vitaminas lábiles. La extracción se realiza sin saponificación,
23 con la ayuda de proteasa para eliminar la encapsulación de vitaminas y facilitar la partición de vitaminas
24 en disolvente hidrocarbonado. Las cifras de mérito indican que el método es adecuado para su
25 propósito previsto en el entorno de las fórmulas infantiles altamente reguladas, incluidas las fórmulas líquidas.
26 formulaciones. El método es extensible a leche entera en polvo donde la vitamina A total
27 Los datos de contenido se pueden calcular sumando los ésteres innatos de vitamina A de cadena larga con
28 los ésteres añadidos.

29 1. Introducción
30
31 Los métodos para la determinación de vitaminas liposolubles están ampliamente difundidos y
32 resumido en muchas revisiones autorizadas (De Leenheer, Lambert & Van Bocxlaer,
33 2000; Rucker, Suttie, McCormick y Machlin L, 2001; Eitenmiller, Landen y Ye, 2008).
34 En general, y excepto en el caso de la vitamina K, la preparación de muestras de alimentos incluida la leche
35 Los productos comienzan con la digestión alcalina, donde la matriz se rompe para liberar
36 materiales insaponificables para su posterior examen, generalmente mediante HPLC (DeVries &
37 Silvera, 2002 Eitenmiller et al., 2008; Gentili et al., 2013). Sin embargo, cuando la naturaleza de
38 el alimento permite una extracción simplificada, se evita el largo proceso de saponificación para
39 minimizar las pérdidas oxidativas y manipulativas del analito objetivo. Tal alternativa
40 Se han informado métodos para la vitamina A en la leche líquida (Hite, 2003) y la leche en polvo.
41 (Woollard & Woollard, 1984) utilizando extracción de grasa total y posterior fase normal
42 cromatografía líquida.
43 La vitamina A endógena existe predominantemente en la leche y los productos lácteos como una variedad
44 de ésteres de retinilo de ácidos grasos de cadena larga (Woollard & Indyk, 1989), mientras que el
45 las formas complementarias son invariablemente palmitato de retinilo o acetato de retinilo, ambos disponibles
46 comercialmente en gran cantidad. El acetato de retinilo está esencialmente ausente en la leche, por lo que este
47 El aditivo se puede determinar de forma única en un producto lácteo. La vitamina E endógena existe en
48 leche casi exclusivamente como dαtocoferol, aunque en baja concentración, mientras que el principal
49 Los aditivos son acetato de d,lαtocoferilo sintético o su equivalente de origen natural, dα
50 acetato de tocoferilo. Otros ésteres de vitamina E de importancia comercial son el αtocoferilo.
51 succinato y nicotinato de αtocoferilo, pero ninguno de los dos se utiliza habitualmente en la nutrición infantil.
52 Los aceites vegetales contienen cantidades significativas de dα no esterificados y otros tocoferoles.
53 y tocotrienoles, y son componentes comunes de las formulaciones infantiles.
54 La saponificación da como resultado la pérdida de identidad de especiación de los ésteres de vitamina A y E.
55 durante el análisis de HPLC posterior; por lo tanto fabricantes de productos nutricionales
56 Interesado tanto en el contenido total de vitaminas como en la concentración de las formas suplementarias.
57 Debe seleccionar métodos que eviten la saponificación, como los descritos por Woollard &
58 Blott (1986), Woollard, Blott & Indyk (1987), Hewavitharana, van Brakel & Harnett M.
59 (1996), Chase, Ye, Stoakes, Eitenmiller & Long (2004) o ChávezServín, Castellote &
60 LópezSabater (2006). Como reflejo de esta situación, los métodos recientes de la AOAC 2012.09
61 (Thompson et al., 2013) y 2012.10 (McMahon, Christiansen, Shine, Loi & Dowell,
62 2013), se han centrado en la separación en fase normal de los lípidos totales extraídos de lactantes y
63 formulaciones para adultos. El primero utiliza la conmutación de columnas en línea entre columnas duales de sílice de 3 µm.
64 columnas para crear un extracto limpio para la detección UV simultánea (UVD) de palmitato de retinilo,
sesenta y cinco acetato de retinilo, acetato de vitamina E y alcohol de vitamina E. Este último procedimiento empleado
66 uso selectivo de UVD a 325 nm y detección de fluorescencia (FLD) para crear eficiente
67 Detección de los mismos analitos, con separación lograda en una columna modificada con amina.
68 lo que permitió la elución en gradiente de grasas coextraídas. Este método incorporó una papaína.
69 digestión, que eliminó la encapsulación de vitaminas fortificadas si estaban presentes en las muestras.
70 Tras los primeros informes sobre fluorescencia del acetato de vitamina E (Woollard, Blott &
71 Indyk, 1987), el presente estudio mejora la metodología anterior para la cuantificación de
72 Ésteres de vitamina A y E utilizando modernos detectores de fluorescencia y una columna de sílice de 3 µm
73 para separaciones eficientes, junto con la cuantificación de analitos mediante el estándar interno
74 técnica. Se ha recomendado el uso de patrones internos para las vitaminas A, E y βcaroteno.
75 ampliamente informado para la estimación del contenido de retinol, αtocoferol y carotenoides en
76 suero (Woollard & Woollard, 1984; Nierenberg & Nann, 1992; Epler, Ziegler & Kraft,
77 1993; Aust, Sies, Stahl y Polidori, 2001: Liu Z., Lee HJ., Garofalo F., Jenkins DJA y
78 ElSohemy A. 2011; Kand'ár et al., 2013) y para cosméticos (Baruffini et al., 1992) y es
79 aplicado de manera similar aquí donde los materiales sustitutos para cada mensurando mejoraron en relación
80 recuperaciones compensando pérdidas por manipulación o degradación. Así, una sola
81 La extracción fue posible con una mejora concomitante en el rendimiento analítico. A
82 Se incorporó proteasa en el método para liberar eficientemente las vitaminas incrustadas.
83 de sus materiales encapsulantes. El método descrito también facilitó una estimación
84 del contenido total de vitamina A mediante la suma de los ésteres añadidos y naturales.
85
86
87 2. Material y métodos
88
89 2.1 Cromatografía
90 Un HPLC Shimadzu (Nakagyoku, Kyoto, Japón) LC20AT Prominence con
91 La bomba cuaternaria LC20AT y el muestreador automático SIL20AHT funcionaron en fase normal
92 modo con una columna de sílice Alltech Econosphere de 3 µm (150 x 4,6 mm, número de pieza
93
oh
228345), celebrada a las 25 C en un horno de columna CTO20AC. La detección utilizó un RF20A XS
94 detector de fluorescencia de longitud de onda dual y un detector de matriz de diodos SPDM20A en serie.
95 El canal 1 del detector de fluorescencia se configuró a 325 nm (excitación) y 450 nm
96 (emisión) con sensibilidad media (ganancia x4) para monitorear los ésteres de retinilo, mientras que el canal
97 2 se fijó en 280 nm (excitación) y 330 nm (emisión) con sensibilidad media (x4
98 ganancia) para detectar acetato de αtocoferilo. El detector de matriz de diodos se utilizó a 450 nm para
99 monitorear las señales de βcaroteno, pero también recopiló datos en otras longitudes de onda, en particular 325
100 nm para una opción alternativa de vitamina A. Se utilizó un caudal típico de 1,0 ml/min con
101 un volumen de inyección de 10 µL. Para una mayor sensibilidad, se pueden inyectar hasta 50 µL
102 sin exhibir un ensanchamiento excesivo de la banda.
103 Se demostró que otros equipos eran adecuados repitiendo análisis en un Agilent 1100.
104 (Santa Clara, CA, EE. UU.) con un detector de fluorescencia programable de un solo canal
105 (FLD) y detector de matriz de diodos. La configuración era i) FLD a 280 nm/330 nm
106 (excitación/emisión) para acetato de αtocoferilo con detección simultánea de absorbancia en
107 325 nm (ésteres de retinilo) y 450 nm (βcaroteno) o, ii) longitud de onda FLD programada
108 inicialmente a 325 nm / 450 nm para ésteres de retinilo, cambiado antes de acetato de αtocoferilo
109 elución, con βcaroteno en UVD a 450 nm.
110
111 2.2 Otros aparatos
112 Varian Cary 50 UVvis. espectrofotómetro (Palo Alto, CA, EE. UU.) con cuarzo de 1 cm
113 Se utilizaron cubetas para calibrar propionato de retinilo (325 nm), propionato de tocoferol (284
114 nm) y éster etílico del ácido apocarotenoico (450 nm). Se realizó la incubación de proteasa.
115
oh
a 50 ±3 C en un baño de agua Grant con controlador GD100 (Chelmsford, Reino Unido). Muestra
116 La clarificación se realizó en una centrífuga Gerber (FunkeGerber, Berlín, Alemania) en
117 1000 revoluciones/min (~ 350 rcf) y cubetas que contengan 50 ml de polipropileno Centristar®
118 tubos de centrífuga (Corning, NY, EE. UU.). El control del pH se realizó con un Metrohm 867 (Herisau.
119 Suiza).
120
121 2.3 Reactivos
122 Proteasa termoestable (EC 3.4.21.14), subtilisina A de Bacillus licheniformis fue
123 procedente de Megazyme (Bray, condado de Wicklow, Eire), código de producto EBSPRT en 50 % de glicerol,
124 con >300 U equivalentes de tirosina/mL (sustrato de caseína, pH 8).
125 Se preparó tampón Tris.HCl (1 M) disolviendo 121 g de base tris (Sigma Aldrich, St Louis,
126 MO, EE. UU.) en aproximadamente 800 ml de agua y luego llevar a pH 8,0 con la adición gota a gota de
127 Ácido clorhídrico concentrado. Esto se hizo hasta 1 litro y se diluyó hasta 0,1 M para su uso.
128 Los disolventes utilizados fueron hexano, etanol e isopropanol (IPA) de calidad HPLC de Fisher.
129 Científico (Loughborough, Reino Unido). Se preparó una solución de extracción de etanol al 50% en hexano.
130 Para preparar la fase móvil, se probaron varios volúmenes de IPA para lograr una separación óptima.
131 de ésteres de vitamina A y E, siendo el preferido 600 µL en 1 L de hexano. La fase móvil fue
132 filtrado a través de sulfato de sodio anhidro (Scharlau, Barcelona, España) en una lente de 0,45 µm
133 filtro de membrana con aparato de vacío estándar minimizando así su humedad y estabilizando
134 tiempos de retención. La fase móvil se recicló continuamente para reducir los costos de reactivos y
135 reemplazados cuando se observaron fluctuaciones en el tiempo de retención o en la línea base.
136 Se preparó cloruro de sodio saturado añadiendo 320 g de cloruro de sodio (Merck,
137 Darmstedt, Alemania) a 1 litro de agua desionizada, asegurando que quede algo de sólido
138 sin disolver.
139 El propionato de vitamina A (2.500.000 UI/g) se obtuvo de BASF (parte 50096515,
140 Basilea, Suiza) y almacenado en un congelador bajo gas nitrógeno. Una solución madre de aproximadamente
141 Se prepararon 625 UI/ml disolviendo 25 mg en 100 ml de isopropanol (IPA) que contenía 100
142 – 200 mg de cristales de hidroxitolueno butirato (BHT, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) para
143 Minimizar la degradación de las vitaminas. Este se almacenó en la oscuridad en un congelador (20 °C) hasta
144 seis meses y se utiliza como patrón interno para el palmitato y el acetato de vitamina A.
145
Se calibró, mediante la ecuación 1, mediante dilución de 100 µL a 10 mL con posterior
146
Medición de absorbancia frente a IPA a 325 nm. La recalibración se realizó en un
147
semanalmente. Los cálculos se convirtieron a UI/mL para permitir una respuesta unitaria (1,00).
148
factores sin importar qué ésteres de retinilo se estuvieran midiendo, incluido el efecto natural de larga duración.
149 ésteres de cadena.
150
151 = A325x104 _ x 100

Propionato de retinilo (UI/mL) (1)
152 1595 x 0,359
153
154 dónde
155 A325 = absorbancia observada a 325 nm (1 cm)
156 1595 = coeficiente de extinción en IPA a 325 nm
157 104 = conversión de % a µg/mL
158 0,359 = conversión de µg a UI para propionato de retinilo
159 100 = dilución para absorbancia utilizable
160
161
El palmitato de retinilo y el acetato de retinilo se obtuvieron de SigmaAldrich (St Louis,
162
MO, EE. UU.), que contienen 1.750.000 UI/g y 2.800.000 UI/g, respectivamente, y preparados en
163
IPA en concentraciones similares al propionato de retinilo para fines de identidad de picos.
164
El propionato de αtocoferilo, estándar interno para el acetato de αtocoferilo, no fue
165
disponible comercialmente, así preparado por acilación basada en el procedimiento descrito por
166
Bonrath y Cirillo (2002): 2,5 g (equivalente a 5,8 mmol) de αtocoferol (Sigma
167
Aldrich) se pesó en un matraz de fondo redondo de 50 ml que contenía 1,5 g (11,5 mmol, pb
oh
168
167 oC) de anhídrido propiónico (Merck & Co., NJ, EE. UU.). 200 µL (2,5 mmol, pb 115 C)
169
Se añadió piridina (Merck & Co) como catalizador y se instaló un condensador enfriado por agua.
170
El matraz y el condensador se mantuvieron en agua hirviendo durante 3 horas cubiertos con papel de aluminio.
171
protección de la luz. El producto se enfrió y se añadieron 20 ml de agua. el taponado
172
El matraz se agitó y se dejó durante la noche para hidrolizar el exceso de anhídrido propiónico a propiónico.
173
ácido. Se retiró la fase acuosa inferior y se lavó el éster de propionato oleoso.
174
dos veces con 20 ml de agua. Luego se dejó el matraz en evaporación rotatoria (Buchi R3 con
175 bomba V700 y enfriador F105, Flawil, Suiza) a 70 °C bajo un vacío de 80 mbar hasta
176
oh
seco. El propionato de vitamina E se almacenó en el matraz bajo gas nitrógeno a 20ºC. C hasta
177 requerido y fue estable durante > 1 año en tales condiciones.
178 Se preparó una solución madre de propionato de αtocoferilo disolviendo aproximadamente 250
179 mg en 100 ml de IPA que contienen 100 – 200 mg de BHT, para producir nominalmente 2,5 mg/ml, y
180
oh
almacenado por hasta seis meses a 20 C. Se calibró, utilizando la ecuación 2, después de la dilución.
181 de 100 µL a 10 mL con IPA y posterior medición de absorbancia frente a IPA en
182 284 nm. La recalibración se realizó semanalmente para proteger contra la degradación.
183 Propionato de αtocoferilo (mg/mL) = A284 x 10 x 100 (2)

184 42,3
185 dónde
187 42.3 = coeficiente de extinción en IPA a 284 nm
188 10 = conversión de % a mg/mL
189 100 = dilución para obtener una absorbancia utilizable
190
191 Se preparó una solución de acetato de vitamina E (SigmaAldrich) aproximadamente al mismo
192 concentración como propionato de vitamina E para fines de identidad de picos.
193 Éster etílico del ácido allEβapo8'carotenoico puro (CAS 1109111; CI 40825; E160f),
194 abreviado aquí como βapoéster, fue donado en viales de DSM (Heerlen, Países Bajos),
195 y se guarda en el congelador hasta su apertura. Se utilizó una solución madre de aproximadamente 1000 µg/ml.
196 preparado disolviendo ~ 100 mg de apoéster en 100 ml de diclorometano que contiene 100
197
oh
200 mg de BHT para minimizar la oxidación y se almacena hasta por un mes a 20 C. Fue
198 calibrado por dilución de 100 µL a 10 mL con IPA y posterior absorbancia
199 medición contra IPA a 449 nm usando la ecuación 3. Se realizó la recalibración
200 semanalmente para protegerse contra la degradación.
201
202 βapoÉster (μg/mL) = A449 x 104 x 100 (3)

203 2550
204 dónde
206 2550 = coeficiente de extinción en IPA a 449 nm
207 104 = conversión de % a µg/mL
208 100 = dilución para obtener una absorbancia utilizable
209
210 Se preparó una solución de βcaroteno (SigmaAldrich) aproximadamente al mismo
211 concentración como βapoÉster para fines de identidad de picos.
212 Se preparó un estándar interno mixto en un matraz de color ámbar de 25 ml usando 10 ml
213 propionato de retinilo, 10 ml de propionato de αtocoferilo y 5 ml de solución madre de apoéster
214 estándares, sin dilución adicional. Estas proporciones se adaptaban a la mayoría de las aplicaciones, pero eran
215 variado según sea necesario, teniendo cuidado de controlar la cantidad exacta de cada estándar interno
216 añadido a cada muestra.
217 Se preparó una solución de idoneidad del sistema mezclando 10 ml de propionato de retinilo, 10
218 ml de acetato de retinilo, 10 ml de palmitato de retinilo, 10 ml de propionato de αtocoferilo, 10 ml de α
219 acetato de tocoferilo, 5 ml de apoéster y 5 ml de soluciones madre de βcaroteno, para garantizar
220 Rendimiento óptimo de HPLC.
221
222 2.4 Extracción
223 Se pesaron con precisión 20,0 g de leche en polvo o fórmula infantil en un recipiente de 200 ml.
224 vaso de precipitados y 80,0 g de agua tibia (~ 40

oh
C) añadido. La mezcla se agitó para disolver el
225 polvo y 5,0 g de muestra reconstituida (equivalente a 1,0 g de polvo) pesados en un recipiente de 50
Tubo de centrífuga de polipropileno de 226 mL. En el caso de leche líquida o lista para tomar
227 Para formulaciones se utilizaron 5,0 g y se trataron de la misma manera.
228 Se añadieron 5 ml de tampón Tris.HCl 0,1 M, pH 8 al tubo de centrífuga, seguido de
229 20 µL de proteasa termoestable (Megazyme, actividad >300 unidades/mL) y se incubaron a 50 ±
230 3
oh
C durante 30 min mezclando ocasionalmente. Después de enfriar, 200 µL de estándar interno mixto
231 Se añadió con precisión la solución, seguida de 20 ml de mezcla de hexano: etanol (50:50) y
232 mezclar durante un minuto mediante vórtex o agitación. La extracción se completó añadiendo 5
233 ml de cloruro de sodio saturado y mezclar en vórtex o agitar nuevamente durante un minuto.
234 La separación de fases continuó permaneciendo en la oscuridad durante 30 a 60 minutos hasta que
235 completo, de lo contrario se centrifuga durante 10 min a ~350 rcf. La capa superior de hexano fue
236 Se filtró a través de un filtro de nailon de 0,45 µm y se recogieron 2 ml en un recipiente de color ámbar con tapa engarzada.
237 Vial de HPLC.
238
240 Se inyectaron extractos de muestra (10 µl) en el HPLC con el eluyente monitorizado.
241 simultáneamente por FLD y UVD. Los ajustes de ganancia FLD se ajustaron según sea necesario para mantener
242 picos en escala.
243 El caudal habitual fue de 1,0 ml/min con la columna de 3 µm, 150 x 4,6 mm de diámetro interno,
244
oh
mantenido en 25 C, la baja viscosidad del hexano produce una contrapresión mínima. El flujo
245 se elevó a 2 ml/min después de la elución del último pico de interés (αtocoferil
246 acetato) y continuó durante la duración del cromatograma para eluir los lípidos en preparación
247 para la siguiente inyección. Se implementó el reciclaje en fase móvil con el fin de conservar
248 solvente.
249
250 2.6 Cálculos
251 Las concentraciones de cada estándar interno en el estándar mixto se calcularon a partir de sus
252 concentraciones, según lo determinado por las ecuaciones 1 a 3 (en UI/mL, mg/mL o µg/mL, como se indica), multiplicadas por
253 sus proporciones en el patrón mixto (0,40 para las vitaminas A y E o 0,20 para el βapoéster). El
254 La cantidad de cada estándar interno agregado a las muestras se calculó multiplicando por 0,2 ml,
255 el volumen típico agregado.
256 Estos datos se utilizaron para calcular las concentraciones de vitaminas en muestras líquidas y reconstituidas.
257 según las ecuaciones 4, 5 y 6:
258
259 Ésteres de vitamina A, UI/100 g = ASMP x A propionato añadido (UI) x 100 x recon (4)
260 AIS x Ancho (g) x RF
261
262
263 Acetato de vitamina E, mg/100 g = ASMP x E propionato añadido (mg) x 100 x recon (5)
264 AIS x ancho (g) x RF
265
266
267 βcaroteno, µg/100 g = ASMP x apoéster añadido (μg) x 100 x recon (6)
268 AIS x Ancho (g) x RF
269
270 dónde
271 ASMP = área del pico de muestra
272 AIS = área del pico del estándar interno
273 W = peso (g) de muestra líquida o reconstituida, normalmente 5 g
274 reconocimiento = factor de reconstitución para muestras en polvo = 20 (1 para muestras líquidas)
275 FR = factor de respuesta (ver más abajo)
276 100 = conversión a 100 g de muestra
277
278 Los factores de respuesta utilizados fueron 1.000 para los ésteres de vitamina A, siendo las unidades (UI) independientes de
279 pesos moleculares. Se aplicaron factores de respuesta, como divisores, de 0,971 al acetato de vitamina E y
280 0,985 para βcaroteno respectivamente, según los valores de E1% en hexanopublicados en la literatura (FAO, 1991; JECFA,
281 2000). La experimentación demostró que estos factores de respuesta eran válidos durante el estudio actual.
282 Para expresar la vitamina A en unidades de peso, se multiplicó UI/100 g por 0,3 para obtener ug/100 g de retinol.
283 equivalentes. En el caso del acetato de vitamina E, UI/100 g y mg/100 g son equivalentes para el sintético.
284 formas.
285
286 2.6 Validación
287 El método fue sometido a desafíos normales dentro del laboratorio de precisión y
288 exactitud. Las pruebas repetidas de una variedad de formulaciones infantiles comerciales arrojaron resultados relativos.
289 desviaciones estándar (RSD) que se compararon para determinar la aceptabilidad utilizando el método de Horwitz
290 función. Se utilizaron materiales de referencia certificados (CRM) cuando correspondía, pero
291 inadecuado en el caso de la vitamina E porque los certificados indicaban tocoferol total, en lugar de
292 que la entidad acetato de αtocoferilo. Se generaron datos de recuperación con picos para cada uno de
293 las vitaminas.
294
295 3 Resultados y discusión
296
297 3.1 Antecedentes
298 Los fabricantes de fórmulas infantiles exigen cada vez más datos sobre el nivel de
299 vitaminas suplementarias agregadas durante los procesos de fortificación. Donde estos difieren
300 estructuralmente de las formas endógenas, y donde el proceso analítico no
301 modificar la estructura del analito, este objetivo es posible. Por lo tanto, una cuantificación inequívoca es
302 posible para los ésteres de acetato de vitamina A y E. En el caso del palmitato de retinilo y β
303 caroteno, ambos son innatos de la grasa láctea y potencialmente existen en las fórmulas infantiles, pero
304 Las estimaciones de las concentraciones de aditivos siguen siendo factibles porque la mayoría de las fórmulas infantiles
305 no contienen grasa láctea y tienen niveles endógenos mínimos de cualquiera de los compuestos.
306 Aunque no es el objetivo principal de este estudio, la casi ausencia del retinol en sí
307 leche significaba que el método descrito permitía una determinación de vitamina A total mediante
308 suma de todos los ésteres presentes. La vitamina A existe como un conjunto de vitaminas medias y
309 ésteres de cadena larga, en un patrón similar a los ácidos grasos triglicéridos (Woollard e Indyk,
310 1989). La identidad y el peso molecular variable de cada éster no es importante cuando
311 Las unidades de concentración se expresan en unidades internacionales. Conversiones basadas en el peso
312 Luego se realizaron unidades, típicamente µg/100 g de equivalentes de retinol, al finalizar la prueba.
313 cálculos.
314 Las determinaciones de vitamina E total no fueron posibles debido a la presencia de
315 considerable αtocoferol libre (y otros congéneres de tocoferol) de esos vegetales
316 aceites incorporados para reemplazar la grasa láctea, con una estimación del acetato de αtocoferilo agregado
317 significativamente menor que el contenido total de vitamina E. ChávezServın et al, (2006) utilizaron un
318 columna de aminas para detectar αtocoferol y sus congéneres utilizando gradientes de disolvente, una
319 La estrategia no fue posible en este estudio donde se utilizó una columna de sílice.
320
321 3.2 Selección de estándares internos
322 El uso de estándares internos para las vitaminas A, E y βcaroteno no es nuevo en
323 química clínica donde los ésteres de acetato se utilizan para retinol y αtocoferol en
324 suero (Kand'ár et al., 2013). En ausencia de saponificación, otros ésteres de vitamina A
325 y E son sustitutos ideales de los mensurandos y cuando se agregan temprano en la extracción
326 proceso, compensar las pérdidas oxidativas y manipulativas de los analitos lábiles, mientras
327 también tiene en cuenta las variables cromatográficas durante la cuantificación.
328 Los ésteres de propionato de retinol y αtocoferol se resolvieron bien con respecto
329 al acetato de retinilo, palmitato de retinilo y acetato de αtocoferilo, apoyando así su uso
330 como normas internas. El propionato de retinilo estaba disponible comercialmente, pero el αtocoferilo
331 propionato requirió preparación de laboratorio mediante un procedimiento de esterificación basado en
332 Borath y Cirillo (2002) que involucran la reacción catalizada por piridina de αtocoferol con
333
oh
anhídrido propiónico. 3 h calentando a 100 Se usó C en lugar de usar un microondas.
334 reactor durante 30 min pero la esterificación fue completa como lo demuestra la ausencia de
335 αtocoferol libre durante la cromatografía. Se utilizó un paso de lavado con agua adicional para
336 asegúrese de que se haya eliminado todo el anhídrido propiónico. Una esterificación similar ha sido confiablemente
337 demostrado en el análisis farmacológico de aditivos alimentarios de tocoferol realizado por GCFID, donde
338 la conversión a ésteres de propionato precede a las determinaciones por CG (JECFA, 2000).
339 Los ésteres de vitamina E disponibles comercialmente (succinato y nicotinato) tuvieron malos resultados.
340 propiedades cromatográficas sobre sílice debido a su naturaleza polar, por lo que no se pudieron considerar
341 como normas internas.
342 El βcaroteno no polar eluye cerca del volumen vacío en columnas de fase normal,
343 permitiendo el uso de una variedad de homólogos hidroxilados para la estandarización interna.
344 Muchas xantofilas candidatas eran costosas o altamente retenidas en columnas de sílice que
345 reducido el número de opciones prácticas. Éster etílico del ácido βapo8'carotenoico, todoE
346 (trans)isómero, se fabrica en grandes cantidades como aditivo alimentario para la coloración de los huevos, por lo que
347 fue elegido para estudios adicionales, aunque todoEβapo8'carotenal (CAS 1107262),
348 disponible en SigmaAldrich, también resultó útil.

349 El retinol y sus ésteres tienen coeficientes de extinción molar (ε) idénticos a los del éster.
350 El resto no influye en la estructura conjugada cromofórica, aunque su peso
351 Los coeficientes basados (E1% )son función del peso molecular. Para simplificar, los cálculos
352 de las concentraciones de vitamina A se mantuvieron en unidades internacionales (UI), donde, como ε, todas las formas
353 son iguales. Por lo tanto, se aplicó un factor de respuesta de 1,00 independientemente de cuál
354 El éster suplementario (acetato o palmitato) o éster natural estaba siendo calibrado por el
355 Patrón interno de propionato de retinilo.
356 De manera similar, el acetato de αtocoferilo, el único mensurando para la vitamina E, y el α
357 El propionato de tocoferilo tiene el mismo coeficiente de extinción molar. Los cálculos estaban en
358 unidades de peso, por lo que un factor de respuesta correspondiente a su relación de pesos moleculares (0,971)
359 se aplicó. Este factor de respuesta fue confirmado experimentalmente a partir de estándares.
360 soluciones, lo que demuestra que el carbono adicional en la cadena lateral no tiene un impacto mensurable en
361 absortividad espectral. Además, la variación estereoisomérica del resto αtocoferol
362 se ignoró, ya que se observó un único pico cromatográfico de acetato de αtocoferilo
363 independientemente de si se trata de una forma sintética (todoracαtocoferol) o extraída de forma natural
364 (RRRαtocoferol) estaba presente.
365 A pesar de la interrupción del anillo de βionona del βapoéster y del menor peso molecular de
366 este carotenoide C30 (460,7 mol/g) comparado con el βcaroteno C40 (536,9 mol/g), tiene un
367 similar reportado E1% (2550) como βcaroteno (2590) en hexano, lo que produce un valor teórico
368 factor de respuesta de 0,985. Hay un pequeño desplazamiento hipsocrómico del pico principal en
369 hexano de βapoéster (449 nm) en comparación con βcaroteno (453 nm), el resultado neto de
370 un enlace conjugado menos y un carbonilo extra (Schwieter et al., 1969). Esto no tuvo
371 impacto con un ancho de banda del detector de 8 nm como lo muestran experimentos con auténticos
372 Se podrían utilizar de forma fiable estándares que confirmen así el factor de respuesta teórico.
373
374 3.3 Preparación de la muestra
375 Los estudios realizados en la década de 1980 informaron sobre un método útil para probar la vitamina A.
376 y E en lácteos en polvo mediante una extracción rápida de la grasa en un solo tubo, seguida de
377 HPLC con detección selectiva de fluorescencia (Woollard & Indyk, 1986; Woollard & Indyk,
378 1989). El método actual siguió una estrategia similar pero utilizó avances en HPLC.
379 instrumentación y estandarización interna para mejorar la calidad de los datos. El original
380 método, que explota la extracción con dimetilsulfóxido (DMSO), fue modificado en el
381 presente estudio con digestión con proteasas para facilitar la liberación de vitaminas microencapsuladas
382 que están cada vez más presentes en los productos modernos mezclados en seco. La grasa hidrófoba
383 Las vitaminas solubles están incrustadas durante la fabricación en un material proteico como
384 gelatina o polisacárido de goma arábiga y, por lo tanto, requería una liberación efectiva en
385 solución antes de la extracción y detección. La goma arábiga tiene un esqueleto peptídico que es
386 susceptible a la alteración de las proteasas y a la liberación de contenidos atrapados.
387 Formulaciones infantiles mezcladas en seco, con sus encapsulaciones intactas y
388 distribución heterogénea, impulsó el uso de muestras de 20 g, fácilmente ampliable a muestras más grandes
389 pesos según sea necesario. Se probaron tamaños de muestra de hasta 50 g con aumentos concomitantes en
390 volúmenes, estándares internos y proteasa, pero no se observó ninguna mejora en la precisión
391 con las muestras analizadas.
392 Las fórmulas infantiles fabricadas mediante procesos alternativos de mezcla húmeda tienen
393 Las vitaminas suplementarias se agregaron antes de la evaporación y, por lo tanto, no quedan intactas.
394 encapsulación. Sin embargo, a efectos prácticos 20 g de estas muestras homogéneas
395 fueron tratados de manera idéntica a los productos mezclados en seco. Además, la digestión con proteasas tiene un
396 propósito secundario en la digestión de proteínas de la leche que potencialmente interfieren con la fase
397 separación de extracciones posteriores de hidrocarburos. Asimismo, las leches líquidas UHT y
398 Las formulaciones infantiles listas para beber se trataron con proteasa, aunque la vitamina
399 Es casi seguro que las encapsulaciones estaban ausentes.
400 La elección de la enzima proteolítica se basó en el conocimiento bien establecido.
401 Propiedades de las proteasas alcalinas, también llamadas proteinasas, del bacillus licheniformis.
402 (Ferrero, Castro, Abate, Baigorı & Sińeriz, 1996) y conocimientos previos de la dieta
403 Prueba de fibra donde es obligatoria la eliminación completa de las proteínas. Serina proteasa, subtilisina A,
404 de Bacillus licheniformis procedente de Megazyme demostró ser una solución conveniente y
405 proteasa estable, aunque se utilizó papaína en AOAC 2012.10 (McMahon et al., 2013).
406 Durante la extracción se utilizó una porción de 5 g del total de 100 g de digestión,
407 equivalente a 1 g de polvo. Esto se extrajo en 10 ml de hexano, como una mezcla 50:50.
408 con etanol y solución salina para mejorar la separación de fases. Solventes de mayor punto de ebullición,
409 El heptano y el isooctano fueron extractores igualmente efectivos, aunque el hexano fue más fácil.
410 reducir el volumen para mejorar la sensibilidad si es necesario, aunque no es necesario de forma rutinaria en este caso.
411 estudiar.
412
414 Se probaron con éxito columnas de sílice no adheridas de diversas geometrías, incluidas
415 columnas de 5 µm, pero se utilizó una columna Alltech de 3 µm (150 x 4,6 mm) con un tamaño de poro de 80 Å.
416 elegido para estudios posteriores. Hewavitharana et al. (1996) utilizaron con éxito un método similar.
417 columna pero con diferentes modificadores polares. Los volúmenes de inyección eran típicamente de 10 µL, pero
418 podría aumentarse a 30 µL (100 µL para columnas de 5 µm) sin pérdida de rendimiento.
419 El diámetro de la columna seleccionada se mantuvo al máximo para permitir una mayor
420 tasas de flujo para una eliminación más rápida de lípidos. La fase móvil tenía baja viscosidad, lo que permitía el flujo.
421 velocidades de hasta 3 ml/min (5 ml/min para columnas de 5 µm) sin contrapresión excesiva.
422 Esto promovió la eliminación rápida de los triglicéridos de la columna, creando un sistema más estable.
423 ambiente cromatográfico. El trabajo de Thompson, Schimpf y Baugh (2013)
424 superó el mismo problema mediante el cambio de columna, desviando así los lípidos hacia los desechos
425 de una breve precolumna. La cromatografía continuó aquí a un caudal elevado hasta
426 el αtocoferol relativamente polar no esterificado había eluido para evitar que se transmitiera
427 al siguiente cromatograma. Los β y γtocoferoles de elución tardía no causaron interferencia
428 problemas porque los picos se ampliaron indefinidamente.
429 Las vitaminas A y E tienen fluorescencia natural y el βcaroteno es selectivo.
430 nm de longitud de onda de visualización, por lo que son susceptibles de detección simplificada en presencia de otros
431 material lipídico. Los lípidos coextraídos pasaron a través de los detectores sin respuesta, y
432 salió de la columna lo suficientemente rápido para evitar la acumulación y los
433 cambios cromatográficos. En ausencia de detección de fluorescencia de doble canal,
434 Los ésteres de retinilo podrían detectarse satisfactoriamente mediante UVD a 325 nm con una longitud de onda múltiple
435 detector. Sin embargo, la vitamina E fue detectada necesariamente por fluorescencia porque la UVD
436 a 284 nm experimentó grandes interferencias.
437 Era importante evitar la incursión de agua en la columna de sílice con
438 en consecuencia, tiempos de retención reducidos. Como parte de este proceso, se llevó a cabo la fase móvil.
439 pasó a través de un desecante de sulfato de sodio anhidro antes de su uso, colocado sobre el
440 Filtro clarificador de disolventes de 0,45 um. La refiltración a través de sulfato de sodio anhidro se realizó
441 también una opción para mantener baja humedad. Para conservar disolventes, la fase móvil se
442 reciclado durante una semana; de lo contrario, reemplazado cuando se observaron cambios de retención o de referencia.
443 Los tiempos de retención fueron muy sensibles a la concentración del modificador polar.
444 isopropanol (IPA), que necesariamente se pipeteó en hexano de manera precisa. A
445 número de concentraciones de IPA se probaron en el rango de 0,04 0,08%, con 0,06%
446 Se ha demostrado que proporciona buenas separaciones de isómeros en la columna Alltech seleccionada. Esto era
447 reducir o aumentar según sea necesario en pequeños incrementos Incrementos de 50 µL para mantener el nivel óptimo
448 separación.
449 La selectividad cromatográfica para los analitos también dependía del IPA.
450 concentración, en particular, la retención de βapoéster disminuyó rápidamente con
451 aumentando el IPA hasta que eluyó cerca de los ésteres de retinilo o αtocoferilo. Sin embargo, el único
452 Los modos de detección FLD para ésteres de vitaminas A y E superaron cualquier potencial
453 interferencias cromatográficas del βapoéster y, a la inversa, ni la vitamina
454 absorbido en la región visible a 450 nm. De manera similar, a concentraciones más altas de IPA α
455 El acetato de tocoferilo también eluyó cerca del propionato de retinilo, pero sin interferencias espectrales.
456 La figura 1 muestra el resultado cromatográfico de un extracto típico de fórmula infantil.
457 que contiene palmitato de retinilo suplementario, acetato de αtocoferilo y βcaroteno utilizando
458 Fluorescencia de doble canal simultánea y detección visible. En esta última detección
459 modo, solo βcaroteno (isómeros combinados Z (cis) y E (trans)) y βapoéster
460 El estándar interno es visible. Cabe señalar que el αcaroteno, si está presente, no es
461 Se separa del βcaroteno y los cálculos representarán esencialmente el carotenoide total. En
462 Además, las xantofilas luteína, astaxantina y cantaxantina no

463 interfieren cromatográficamente con los carotenos no polares, aunque el licopeno coeluyó
464 con βcaroteno.
465 La figura 2 muestra cromatogramas de un extracto típico de leche entera en polvo que contiene
466 acetato de retinilo suplementario y acetato de αtocoferilo, con retinilo natural
467 ésteres y βcaroteno. Cuando estaban presentes picos geométricos del isómero Z (cis), eluían
468 antes de los picos correspondientes del isómero todoE (todotrans) y se incluyeron para dar un total
469 área máxima, pero sin correcciones por su menor biopotencia.
470
471 3.3 Precisión
472 Se seleccionaron cuatro formulaciones disponibles comercialmente para estudios de repetibilidad.
473 cada uno con acetato de αtocoferilo y βcaroteno suplementarios según lo juzgado en la etiqueta
474 declaraciones. Dos de las formulaciones contenían palmitato de retinilo, mientras que las otras dos
475 contenía acetato de retinilo; este último también se sabe que se mezcla en seco. Además
476 Se analizó repetidamente el contenido total de vitamina A de la leche entera en polvo vitaminada. El
477 Los resultados se dan en la Tabla 1, donde se calcularon las desviaciones estándar relativas de repetibilidad (RSDr).
478 observado en el rango del 3 al 10% en las tres vitaminas. Valores HorRat (observados
479 RSD/RSD calculada a partir de la ecuación de Horwitz) que confirman la aceptabilidad de
480 el RSDr observado en las concentraciones observadas. La repetibilidad observada fue igual o
481 mejores que los límites orientativos generalmente aceptados para la repetibilidad basados en duplicados ciegos
482 (HorRat 0,3 – 1,3; Horwitz y Albert, 2006). Los cálculos de vitamina A se convirtieron de
483 unidades internacionales a unidades de peso como lo requieren las matemáticas de Horwitz.
484 Se obtuvieron dos fórmulas infantiles de un fabricante de Nueva Zelanda y se probaron.
485 por duplicado (n=2), dos veces por semana durante cinco semanas (d = 10 pares), ambos fabricados por
486 Mezcla en seco de productos próximos con premezclas que contienen palmitato de retinilo y αtocoferilo.
487 acetato y βcaroteno. La Tabla 2 resume la precisión intermedia observada.
488 (RSDiR) obtenido utilizando estadísticas estándar (Chesher, 2008) y HorRat asociado,
489 históricamente se esperaba que estuviera entre 0,5 y 1,5 (Horwitz y Albert, 2006). La reestimación de RSDr fue
490 También se realizó en base a las diferencias (al cuadrado) entre duplicados que mostraron
491 comparabilidad con la Tabla 1.

492
493 3.3 Precisión
494 Para estimar las recuperaciones, cada una de las tres vitaminas, preparadas en IPA calibrado
495 solución, se añadieron en tres niveles en matrices adecuadas antes de la digestión con proteasa.
496 Para la vitamina A, se disponía de matrices en blanco adecuadas para palmitato y acetato.
497 ésteres mediante selección de fórmulas infantiles sin el analito objetivo. Para la vitamina E, una
498 Se utilizó leche entera en polvo sin acetato de αtocoferilo suplementario , mientras que una leche entera
499 Se utilizó fórmula infantil llena de aceite sin carotenoides fortificados para la recuperación de βcaroteno.
500 estimados. La Tabla 3 muestra una recuperación del 89 al 104% con un promedio del 98,5% en todos los
501 vitaminas. Cada vitamina tiene un estándar interno paralelo agregado al digesto que
502 Compensa las pérdidas potenciales por degradación, cambios de volumen y extracción.
503 Deficiencias, dejando así la calibración espectral y la dispensación del sistema interno.
504 estándares como los principales desafíos analíticos.
505 Se disponía de dos materiales de referencia certificados para fórmulas infantiles con datos sobre vitaminas.
506 del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST). Prueba por triplicado (n = 3) de
507 NIST 1849 y NIST 1849a arrojaron los datos de vitamina A que se muestran en la Tabla 4. Cuando se compararon
508 con las concentraciones certificadas la concordancia fue buena, lo que confirma la precisión del método. NIST
509 1849 y NIST 1849a contenían éster de palmitato de retinilo, sin acetato de retinilo, el
510 los datos se expresan como retinol usando masas moleculares relativas.
511 Comparación directa de los datos del acetato de vitamina E con los datos asignados en NIST 1849
512 no fue posible porque este último incluía αtocoferol total, la mayor parte del cual era aceite
513 derivado y por lo tanto no esterificado. Sin embargo, el certificado NIST 1849 señaló que aproximadamente
514 Se esperan 5 mg/100 g (50 mg/kg) de acetato de αtocoferol, lo que coincide con el
515 observaciones actuales como se muestra en la Tabla 4. NIST 1849a tenía un rango certificado para vitamina
516 E acetato.
517 De manera similar, no se asignó un valor de βcaroteno en NIST 1849 o NIST 1849a.
518 Aunque es muy variable en los documentos NIST 1849 (200 – 1200 µg/100 g, Sharpless et
519 al., 2010), las concentraciones observadas aquí fueron 239 µg/100 g (SDr = 35,4 µg/100 g), a
520 el extremo inferior de este rango, aunque se sabe que el βcaroteno es particularmente inestable.
521 Los resultados obtenidos para la vitamina A y el βcaroteno en la leche entera en polvo concordaron bien
522 con datos publicados, aunque se sabe que ambas vitaminas varían estacionalmente en Nueva
523 Zelanda (Indyk, Lawrence y Broda, 1993)
524
525 Conclusión
526
527 En respuesta a las necesidades de los fabricantes o reguladores de fórmulas infantiles para determinar la
528 cantidad y naturaleza de los ésteres suplementarios de vitaminas A y E, se ha desarrollado un método
529 desarrollado utilizando modernos equipos de HPLC con detección de fluorescencia de doble canal.
530 Los beneficios del método son evitar la saponificación, lo que permite que otros ésteres sean
531 utilizados como estándares internos, a saber, propionato de retinilo y propionato de αtocoferilo. El
532 El método se amplió para incluir βcaroteno con ácido etílico totalmenteEβapo8'carotenoico.
533 éster como estándar interno, aunque las limitaciones de su elución temprana de la fase normal
534 columnas se reconoce. El procedimiento de extracción, mediante digestión con proteasa simple, es
535 considerablemente más rápido que los métodos tradicionales que implican digestión alcalina con múltiples
536 lavados y extracciones, y proporciona una adecuada precisión y recuperación. Un corolario de
537 El método es la determinación rápida de la vitamina A total, incluidos los ésteres naturales y
538 provitamina A (βcaroteno) en la leche y la leche en polvo, aunque la pequeña cantidad o
539 Se excluye el retinol endógeno.

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628 Revista de Nutrición Clínica, 56, 4l7 426
629
630 Sharpless KE, Lindstrom RM, Nelson BC, Phinney KW, Rimmer CA, Sander L.
631 C., Schantz MM, Spatz RO, Thomas DB, Turk GC, Wise SA, Wood L. y Yen
632 JH (2010). Preparación y caracterización de material de referencia estándar 1849.
633 Fórmula nutricional para bebés/adultos. Revista de AOAC Internacional, 93, 1262 – 1274
634
635 Schwieter U., Englert N., Rigassi N. y Vetter W. (1969). Métodos físicos orgánicos en
636 Investigación de carotenoides. Química pura aplicada, 20, 365 420
637
638 Rucker RB, Suttie JW, McCormick DB y Machlin L. (2001). manual de vitaminas,
639 tercera edición Marcel Dekker, Nueva York. ISBN 0824704282
640
641 Thompson, LB, Schimpf, K y Baugh, S. (2013). Determinación de vitaminas A y E en
642 Fórmula infantil y fórmula nutricional para adultos/pediátricos mediante HPLC con UV y fluorescencia.
643 Detección: Primera acción 2012.09. Revista de AOAC Internacional,., 96, 14071413.
644
645 Woollard GA y Woollard DC (1984). La determinación del retinol sérico por alto
646 Cromatografía líquida de alto rendimiento. Revista de cromatografía de alta resolución y
647 Comunicaciones de cromatografía, 7, 466472
648
649 Woollard DC y Woollard GA (1984). Determinación de vitamina A en leche fortificada.
650 polvos mediante cromatografía líquida de alta resolución. Revista de lácteos de Nueva Zelanda
651 Ciencia y Tecnología, 16, 99 – 112
652
653 Woollard DC y H. Indyk H. (1986). El análisis por HPLC de los isómeros de la vitamina A en los productos lácteos.
654 productos y su importancia en las estimaciones de biopotencia. Revista de micronutrientes
655 Análisis, 2, 125 – 146

656
657 Woollard DC y Blott AD (1986). La determinación rutinaria de acetato de vitamina E en
658 Formulaciones de leche en polvo mediante cromatografía líquida de alta resolución. Diario de
659 Análisis de micronutrientes, 2, 97 – 115
660
661 Woollard DC, Blott AD y H. Indyk H. (1987). Detección fluorométrica de tocoferilo.
662 acetato y su uso en el análisis de fórmulas infantiles. Revista de análisis de micronutrientes, 3, 1
663 – 14
664
665 Woollard DC y H. Indyk H. (1989). La distribución de ésteres de retinilo en leches y leches.
666 productos. Revista de análisis de micronutrientes, 7, 35 – 52
667
668
669
670 Fig 1: Cromatogramas con fluorescencia de doble canal (gráficos A y B) y detección

671 visible (gráfico C) de un extracto típico de fórmula infantil que contiene palmitato de retinilo,
672 acetato de αtocoferilo y βcaroteno suplementarios.
673
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699 Fig 2: Cromatogramas con fluorescencia de doble canal (gráficos A y B) y visibles
700 detección (gráfico C) de un extracto típico de leche entera en polvo que contiene suplementos
701 acetato de retinilo y acetato de αtocoferilo, con ésteres de retinilo naturales y β
702 caroteno.
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728 Tabla 1: Estudios de repetibilidad de ésteres de vitamina A, acetato de vitamina E y βcaroteno (provitamina A)
729 en formulaciones fabricadas mediante repetición el mismo día (n=5)
730
731
Muestra vitamina a vitamina e βcaroteno

Media % Media % Media %
HorRat HorRat HorRat
ug/100 g RSDr mg/100 g RSDr ug/100 g RSDr
Fórmula 1a,c 502 3.09 0,15 5.28 3.95 0,28 118 8.93 0,40
Fórmula 2a,d 379 4.56 0,22 7.40 3.38 0,24 81.0 6.36 0,25
Fórmula 3b,c 983 5.70 0,33 8.71 3.76 0,28 137 6.60 0,29
Fórmula 4b,d 526 3.71 0,18 6.00 2,95 0,20 179 7.16 0,33
WMP 323 5.28 0,25 n/A n/A n/A 141 6.07 0,26
C d
aMezcla húmeda; bMezcla en seco; acetato de retinilo; palmitato de retinilo; na = no aplicable
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737 Tabla 2: Estimaciones de precisión para el mismo día (r) y entre días (iR) a partir de diez análisis duplicados entre
738 días
739
vitamina a vitamina e βcaroteno

R: Precisión intermedia
Media RSDiR Media RSDiR Media RSDiR
ug/100 g % mg/100 g % ug/100 g %
Fórmula 1 542 5,26 0,42 7.54 4.94 0,59 134 8.20 0,54
Fórmula 2 359 6,29 0,48 4.60 5,89 0,66 87,7 6.49 0,40
B: Repetibilidad
Media RSDr Media RSDr Media RSDr
ug/100 g % mg/100 g % ug/100 g %
Fórmula 1 542 3,67 0,30 7.54 3.08 0,37 134 5,76 0,38
Fórmula 2 359 3,83 0,29 4.60 3.68 0,41 87,7 4,25 0,26
740
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743
744 Tabla 3: Recuperación de ésteres de vitamina A, acetato de vitamina E y βcaroteno (provitamina A)

745 añadidos a fórmulas nutricionales o leches en polvo
746
Teórico Observado Recuperación %
Palmitato de retinilo (UI/100 g) 17a

1 507 510 97,2
2 1014 1021 99.0
3 1521 1567 101.9
Acetato de retinilo (UI/100 g) 0a

1 521 527 101.2
2 1042 1058 101,5
3 1563 1516 97.0
Acetato de αtocoferilo (mg/100 g) 0a

1 5.11 5.17 101.2
2 10.22 10.29 100,7
3 15.33 14,88 97.1
βcaroteno (ug/100 g) 7a
1 52 61 103.8
2 104 100 89,4
3 156 151 92.3
aConcentración sin picos (en blanco)

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749
750
751 Tabla 4; Resultados de ésteres de vitamina A y E comparados con materiales de referencia certificados
752 (CRM) del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST)
753
754
observada Certificado Rango
Palmitateb de retinol
NIST 1849 1631 (35,5) 1640 1510 – 1770

NIST 1849a 788 (19,2) 768 745 – 791
αtocoferil acetatec
d
NIST 1849 5,63 (0,31) 5 n/A
NIST 1849a 14,8 (0,93) 15.8 14,0 – 17,6
a b
Desviación estándar entre paréntesis; Unidades de vitamina A en µg/100 g, expresadas como
C
retinol, incluido en el certificado NIST en mg/kg; Unidades de vitamina E en mg/100 g, expresadas en
d
certificado NIST en mg/kg; Sólo información; na = no aplicable
755
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758
759 Aspectos destacados para revisión
760
761 Desarrollamos un método rápido para los aditivos de vitamina A, E y caroteno en los lácteos en polvo.
762 Utilizamos digestión con proteasas para abrir la encapsulación de vitaminas.
763 Evitamos la saponificación para permitir el uso de éster de propionato como estándares internos.
764 Ampliamos el método para incluir carotenos con estándar interno de apocarotenoato.
765 El método tiene potencial para mejorar el método oficial de la AOAC 2012.10 existente.
766
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Determinación de ésteres de vitamina A y vitamina E en fórmulas infantiles y for­

Leches en polvo tificadas por HPLC: uso de estandarización interna

David C. Woollard, Anja Bensch, Harvey Indyk, Adrienne McMahon

Aparecer en: Química de Alimentos

Fecha de recepción: 11 de febrero de 2015

Fecha de Aceptación: 18 de octubre de 2015

Química (2015), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.10.077

1 Determinación de ésteres de vitamina A y vitamina E en fórmulas infantiles y

2 Leches en polvo fortificadas mediante HPLC: uso de estandarización interna

4 David C. Woollarda*, Anja Benschb , Harvey Indykc y Adrienne McMahond

11 *Autor correspondiente. Tel.: +64 223134424.

12 Dirección de correo electrónico: david.woollard@hill­labs.co.nz

17 columna para determinar las concentraciones de ésteres suplementarios de vitamina A y vitamina E

18 y β­caroteno en fórmulas infantiles. El método utiliza doble canal selectivo.

19 fluorescencia para las vitaminas A y E y absorbancia visible para el β­caroteno. un atributo de

20 el método es el uso de propionato de retinol, propionato de α­tocoferilo y todo­E­β­apo­8'­

22 asociado con estas vitaminas lábiles. La extracción se realiza sin saponificación,

26 formulaciones. El método es extensible a leche entera en polvo donde la vitamina A total

28 los ésteres añadidos.

31 Los métodos para la determinación de vitaminas liposolubles están ampliamente difundidos y

34 En general, y excepto en el caso de la vitamina K, la preparación de muestras de alimentos incluida la leche

50 acetato de tocoferilo. Otros ésteres de vitamina E de importancia comercial son el α­tocoferilo.

53 y tocotrienoles, y son componentes comunes de las formulaciones infantiles.

54 La saponificación da como resultado la pérdida de identidad de especiación de los ésteres de vitamina A y E.

55 durante el análisis de HPLC posterior; por lo tanto fabricantes de productos nutricionales

71 Indyk, 1987), el presente estudio mejora la metodología anterior para la cuantificación de

72 Ésteres de vitamina A y E utilizando modernos detectores de fluorescencia y una columna de sílice de 3 µm

74 técnica. Se ha recomendado el uso de patrones internos para las vitaminas A, E y β­caroteno.

75 ampliamente informado para la estimación del contenido de retinol, α­tocoferol y carotenoides en

80 recuperaciones compensando pérdidas por manipulación o degradación. Así, una sola

81 La extracción fue posible con una mejora concomitante en el rendimiento analítico. A

82 Se incorporó proteasa en el método para liberar eficientemente las vitaminas incrustadas.

83 de sus materiales encapsulantes. El método descrito también facilitó una estimación

90 Un HPLC Shimadzu (Nakagyo­ku, Kyoto, Japón) LC20AT Prominence con

91 La bomba cuaternaria LC20AT y el muestreador automático SIL­20AHT funcionaron en fase normal

228345), celebrada a las 25 C en un horno de columna CTO­20AC. La detección utilizó un RF­20A XS

95 El canal 1 del detector de fluorescencia se configuró a 325 nm (excitación) y 450 nm

97 2 se fijó en 280 nm (excitación) y 330 nm (emisión) con sensibilidad media (x4

102 sin exhibir un ensanchamiento excesivo de la banda.

106 (excitación/emisión) para acetato de α­tocoferilo con detección simultánea de absorbancia en

109 elución, con β­caroteno en UVD a 450 nm.

111 2.2 Otros aparatos

116 La clarificación se realizó en una centrífuga Gerber (Funke­Gerber, Berlín, Alemania) en

121 2.3 Reactivos

122 Proteasa termoestable (EC 3.4.21.14), subtilisina A de Bacillus licheniformis fue

124 con >300 U equivalentes de tirosina/mL (sustrato de caseína, pH 8).

135 reemplazados cuando se observaron fluctuaciones en el tiempo de retención o en la línea base.

138 sin disolver.

139 El propionato de vitamina A (2.500.000 UI/g) se obtuvo de BASF (parte 50096515,

149 ésteres de cadena.

151 = A325x104 _ x 100

155 A325 = absorbancia observada a 325 nm (1 cm)

156 1595 = coeficiente de extinción en IPA a 325 nm

157 104 = conversión de % a µg/mL

158 0,359 = conversión de µg a UI para propionato de retinilo

159 100 = dilución para absorbancia utilizable

177 requerido y fue estable durante > 1 año en tales condiciones.

181 de 100 µL a 10 mL con IPA y posterior medición de absorbancia frente a IPA en

183 Propionato de α­tocoferilo (mg/mL) = A284 x 10 x 100 (2)

186 A284 = absorbancia observada a 284 nm (1 cm)

187 42.3 = coeficiente de extinción en IPA a 284 nm

Determinación de ésteres de vitamina A y vitamina E en fórmulas infantiles y for

12 Dirección de correo electrónico: david.woollard@hilllabs.co.nz

18 y βcaroteno en fórmulas infantiles. El método utiliza doble canal selectivo.

19 fluorescencia para las vitaminas A y E y absorbancia visible para el βcaroteno. un atributo de

20 el método es el uso de propionato de retinol, propionato de αtocoferilo y todoEβapo8'

50 acetato de tocoferilo. Otros ésteres de vitamina E de importancia comercial son el αtocoferilo.

74 técnica. Se ha recomendado el uso de patrones internos para las vitaminas A, E y βcaroteno.

75 ampliamente informado para la estimación del contenido de retinol, αtocoferol y carotenoides en

90 Un HPLC Shimadzu (Nakagyoku, Kyoto, Japón) LC20AT Prominence con

91 La bomba cuaternaria LC20AT y el muestreador automático SIL20AHT funcionaron en fase normal

228345), celebrada a las 25 C en un horno de columna CTO20AC. La detección utilizó un RF20A XS

106 (excitación/emisión) para acetato de αtocoferilo con detección simultánea de absorbancia en

109 elución, con βcaroteno en UVD a 450 nm.

116 La clarificación se realizó en una centrífuga Gerber (FunkeGerber, Berlín, Alemania) en

183 Propionato de αtocoferilo (mg/mL) = A284 x 10 x 100 (2)

191 Se preparó una solución de acetato de vitamina E (SigmaAldrich) aproximadamente al mismo

202 βapoÉster (μg/mL) = A449 x 104 x 100 (3)

210 Se preparó una solución de βcaroteno (SigmaAldrich) aproximadamente al mismo

211 concentración como βapoÉster para fines de identidad de picos.

213 propionato de retinilo, 10 ml de propionato de αtocoferilo y 5 ml de solución madre de apoéster

218 ml de acetato de retinilo, 10 ml de palmitato de retinilo, 10 ml de propionato de αtocoferilo, 10 ml de α

219 acetato de tocoferilo, 5 ml de apoéster y 5 ml de soluciones madre de βcaroteno, para garantizar

315 considerable αtocoferol libre (y otros congéneres de tocoferol) de esos vegetales

322 El uso de estándares internos para las vitaminas A, E y βcaroteno no es nuevo en

348 disponible en SigmaAldrich, también resultó útil.

350 El resto no influye en la estructura conjugada cromofórica, aunque su peso

356 De manera similar, el acetato de αtocoferilo, el único mensurando para la vitamina E, y el α

361 absortividad espectral. Además, la variación estereoisomérica del resto αtocoferol

362 se ignoró, ya que se observó un único pico cromatográfico de acetato de αtocoferilo

364 (RRRαtocoferol) estaba presente.

427 al siguiente cromatograma. Los β y γtocoferoles de elución tardía no causaron interferencia

429 Las vitaminas A y E tienen fluorescencia natural y el βcaroteno es selectivo.