Texto de Practicas de Laboratorio

Carrera de Bioquímica Farmacia U.N.S.
XX Inmunología
UNIVERSIDAD NACIONAL SIGLO XX

CARRERA BIOQUÍMICA FARMACIA
INMUNOLOGIA
TEXTO DE PRACTICAS DE LABORATORIO
Docente: Dr Grover Lopez Zabala
Catavi - Llallagua – Potosi

Año 2022
Dr. Grover López Z. 1

Carrera de Bioquímica Farmacia U.N.S. XX Inmunología
PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA
PRUEBA DE AGLUTINACION EN PLACA PARA LA DETERMINACION DE

PROTEINA “C” REACTIVA
SIGNIFICACION CLINICA
La proteína C Reactiva (PCR) es una proteína termolábil que no atraviesa la

barrera placentaria y cuya movilidad electroforética se encuentra entre las zonas
de las alfa y beta globulinas.
Su nombre se debe a la capacidad para precipitar los polisacáridos C de los
pneumococos.
Es una de las llamadas proteínas de fase aguda y se incrementa en suero, en una
gran variedad de enfermedades inflamatorias o como respuesta a necrosis tisular.
Su determinación es importante debido a que aumenta rápidamente al comienzo
de la enfermedad, 14 a 26 horas luego de la inflamación o injuria tisular y
desaparece en la etapa de recuperación, apareciendo solo durante la fase activa
del proceso inflamatorio.
La PCR se encuentra comúnmente aumentada en: artritis reumatoidea activa,

infecciones virales, tuberculosis, fiebre reumática activa, infarto agudo de
miocardio. Tambien se la puede hallar luego de una operación quirúrgica y en gran
porcentaje luego de transfusiones sanguíneas. La determinación de PCR no solo
indica la intensidad de la enfermedad sino también la respuesta del paciente a un
tratamiento dado.
FUNDAMENTO
La proteína C reactiva presente en la muestra, es capaz de aglutinar las
partículas de latex recubiertas con anticuerpos anti – PCR. El PCR se detecta en
suero por reacción con un anticuerpo especifico absorbido sobre un soporte inerte
de latex. La PCR se une a los anticuerpos absorbidos produciendo la aglutinación
de las partículas de latex
REACTIVOS
- Reactivo de latex: suspensión de partículas de latex- poliestireno

sensibilizadas con anticuerpos anti – PCR
- Control negativo: dilución de suero negativo
- Control positivo: dilución de suero positivo
PRECAUCIONES Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

- Los reactivos provistos son para uso diagnostico “in vitro”
- Los controles han sido ensayados para HIV y HBV, encontrándose no
reactivos. Todos los controles deben ser empleados como si se tratara de
material infectivo.
- Los reactivos son estables a 2 -10 ºC

- La aglutinación del reactivo de latex es indicio de deterioro del mismo

MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero.- Obtener de la manera usual. No deben usarse muestras inactivadas

por calor Las sustacias interferentes; hemolisis, ictericia, y fármacos.
MATERIALES
 Placa de vidrio fondo negro

 Gotero de 25 microlitros
 Varilla de vidrio o aplicadores
 Cronometro
 Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados
Fuente de luz
PROCEDIMIENTO
- Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.

Agitar el reactivo de latex antes de usar, vaciando previamente la pipeta
del gotero.
Tecnica Cualitativa
- En la palca de vidrio colocar a cada pocillo una gota de muestra, una gota
de control positivo y una gota de control negativo respectivamente.
- Añadir inmediatamente a los tres pocillos una gota de reactivo de latex.
- Mezclar con un palillo descartable hasta obtener una suspensión uniforme
en toda la superficie del circulo.
- Inmediatamente disparar un cronometro, balancear suavemente la palca y
observar macroscópicamente el resultado bajo un haz luminoso dentro de
los tres minutos.
Tecnica de Titulacion Semi Cuantitativa

- Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en 8
tubos de Kahn.
- Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos.
- Agregar 0,5 ml de suero al tubo Nº 1 y mezclar.
- Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo Nº2 y mezclar, continuando asi las
diluciones hasta el ultimo tubo. Las diluciones asi obtenidas equivalen a 1:2,
1:4, 1:8, 1:16, etc
- Ensayar cada dilución según la Tecnica Cualitativa y realizar la respectiva
lectura.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Lectura de Técnica Cualitativa
Negativo: Se presenta como una suspensión homogénea uniforme.

Positivo: Presenta aglutinación uniforme que aparece dentro de los tres
minutos. Se califica por cruces de 1 a 4 (+)
Lectura de Tecnica Semicuantitativa
Titulacion: Se calcula a partir de la inversa de la máxima dilución a la que se

produce la aglutinación visible macroscópicamente. Es decir en la máxima
dilución donde se produce la aglutinación.
La concentración aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada

por la formula siguiente:
PCR (mg/L) = Titulo x Sensibilidad de la reacción (6 mg/L)
Ejemplo: la muestra presenta un titulo de 1:2. Su concnetracion de PCR es

de 2 x 6 = 12 mg/L
METODO DE CONTROL DE CALIDAD
Procesar simultáneamente el control Negativo y el Control Positivo

provistos, empleando una gota del Control correspondiente en lugar de la
muestra.
VALORES DE REFERENCIA
- Para la técnica cualitativa: Negativo si no presenta aglutinación, positivo

cuando presenta aglutinación indicando patología.
- En la técnica semi cuantitatica, hasta 6 mg/L, valores superiores indican
presencia patológica.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
- Susutancias interferentes conocidas en muestra.

- Tiempos de reacción mayores de tres minutos pueden producir reacciones
falsamente positivas por efectos de secado de los reactivos.
- Sueros lipemicos, ictéricos, hemolisados y presencia de fármacos
interfieren la reacción.

PERFORMANCE
Sensibilidad: detecta 6 mg/L de proteína C reactiva
RESULTADOS
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INTERPRETACION DE RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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PRUEBA DIRECTA DE AGLUTINACION EN PLACA PARA EL DIAGNOSTICO

DE ARTRITIS REUMATOIDEA
INTRODUCCION.- La artritis reumatoidea es un síndrome crónico de etiología de

diferentes etiologías, caracterizado por una inflamación inespecífica y
generalmente simetrica de las articulaciones, que a veces evoluciona hacia la
destrucción de las estructuras articulares y periarticulares.
En la articulación enferma se observa un engrosamiento de la membrana sinovial
con formación de pliegues y proliferación de linfocitos. Estas células, que forman
folículos linfoides, son las responsables de la sisntesis de factores reumatoideos
(FR) y otras inmunoglobulinas.
Los FR son generalmente de tipo IgM anti – IgG, es decir que reaccionan con las
fracciones Fc de las IgG. Tambien se han encontrado FR de tipo IgG, aunque en
mucho menor proporción de casos.
Los FR de tipo IgM están presentes en el 85 – 90 % de los adultos con artritis
reumatoidea aunque no es especifico de la enfermedad puesto que también se
han encontrado en individuos sanos (en un 3 a 5% de los casos).
Por tal motivo, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad distinta de la
artritis reumatoidea, frente a una reacción de aglutinación positiva es aconsejable
realizar la precipitación de las globulinas con sulfato de amonio. De tal forma, se
asegura la precipitación completa de lo FR y se mantiene en solución cualquier
agluitinina responsable de una falsa reacción positiva, como asi también algún
posible inhibidor.
FUNDAMENTO DEL METODO
El factor reumatoideo del tipo IgM se detecta en presencia de gamma –

inmunoglobulina o fracción II de Con (que en este caso es el antígeno) absorbida
sobre un soporte inerte de latex – poliestireno. Este antígeno se une a los FR (anti
–IgG) produciendo una aglutinación de las partículas de latex polestireno, visible
macroscópicamente.
REACTIVOS
Reactivo Latex; suspensión de partículas de latex –poliestireno de 0,20 micrones

de diámetro, que tiene absorbidas moléculas termoagregadas de gamma-
inmunoglobulina o fracción II de Cohn.
Control Positivo; dilución de proteínas sericas conteniendo factor reumatoideo.
Equivalente a +++ (positivo)
Control Negativo; dilución de proteínas sericas no reactivas.
PRECAUCIONES Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

Los controles han sido ensayados para HIV y HBV encontrándose inanctivos. No
obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo.
Es estable en refrigeración de 2 – 10ª C.

La aglutinación del reactivo latex es indicios de deterioro del mismo, en tal caso
desechar.
MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
Suero.- Obtener de la manera usual. No deben usarse muestras inactivadas por

calor Las sustacias interferentes; hemolisis, ictericia, y fármacos.
MATERIALES
 Placa de vidrio fondo negro

 Gotero de 25 microlitros
 Varilla de vidrio o aplicadores
 Cronometro
 Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados
 Fuente de luz
PROCEDIMIENTO
Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.
I TECNICA CUALITATIVA
- En uno de los posillos delimitados de la placa de vidrio, colocar:
Muestra 25 microlitros
Control Positvo 25 microlitros
Control negativo 25 microlitros
- A los tres posillos tanto a la muestra, control positivo, control negativo

añadir el Reactivo de Latex 1 gota o 25 microlitros
- Mezclar con palillo o varilla de vidrio hasta obtener una suspensión
uniforme en toda la superficie delimitada de la palca.
- Inmediatamente, disparar un cronometro, balancear suavemente la palca y
observar macroscópicamente el resultado dentro de los tres minutos bajo
un haz luminoso.
II TECNICA CUANTITATIVA
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en 6 tubos de

Kahn.

- Colocar 0,4 ml. De solución fisiológica al primer tubo y 0,2 ml. De solución
fisiológica a los 5 tubos restantes.
- Agragar 0,1 ml. (100 microlitros) de suero al tubo Nº 1 y mezclar. Transferir
0,2 ml. De esta dilución al tubo Nº 2 Y MEZCLAR, CONTINUANDO DE
ESTA MISMA FORMA A LAS DILUCIONES HASTA EL ULTIMO TUBO.
- Las diluciones asi obtenidas equivalen a 1:5 , 1:10 , 1:20 , 1:40 , 1:80 ,
1:160
- Cada una de las diluciones obtenidas ensayar según la técnica cualitativa.
Negatiov: Suspension homogénea

Positivo: Aglutinacion que aparece dentro de los tres minutos. Se califica de 1 a 4
cruces (+)
Titulo: Inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible

macroscópicamente.
La concentración aproximada de factor reumatoideo en la muestra puede ser

calculada por la formula siguiente:
FR(UI/ml) = Titulo x Sensibilidad de la reacción (1 UI/ml)
Ejemplo: la muestra presenta un titulo de 1:40. Su concentración en FR es

de 40 x 1 = 40 UI/ml.
CONTROL DE CALIDAD DEL METODO
- Procesar simultanemente los controles provistos o sueros probadamente

reactivos, empleando 25 ul. Del control correspondiente y 25 ul de reactivo
de latex según la técnica cualitativa.
- Se considera patológicos valores superiores a 20 – 30 UI/ml en el método

cuantitativo.
- En el método cualitativo desde positivo (+) se considera patológico
- Cualquier substancia extraña produce alteración en la reacción..

- Alteracion en la proporción de la muestra y el reactivo.

PERFORMANCE
Sensibilidad y Especificidad Analitica.- Se encuentra una sensibilidad de 1 UI/ml.

Los métodos mas adecuados en esta prueba tienen que tener un aproximado de
una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 99,3%
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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PRUEBA DE LATEX PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINA

O EN SUERO
SIGNIFICACION CLINICA.- El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra

presente en casi todas las personas en títulos bajos, debido a que las infecciones
estreptocócicas son comunes. Sin embargo un titulo alto o creciente de
antiestreptolisina O, indica una infección reciente producida por un estreptococo
beta hemolítico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal,
erisipela.
FUNDAMENTO
Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en suero por su reacción con la

estreptolisina O adsorbida sobre soporte inerte de latex. Los anticuerpos
antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinación
visible macroscópicamente.
REACTIVOS
Reactivo de latex: suspensión de partículas de latex poliestireno recubiertas con

estreptolisina O.
Control Negativo: suero no reactivo con el reactivo de latex.
Control Positivo: Suero humano conteniendo antiestreptolisina O en
concentraciones superiores a 250 UI/ml
Solucion fisiológica.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnostico in vivo

Los controles positivos y negativos han sido examinados para antígeno de
superficie del virus de hepatitis B y anticuerpos contra HIV ½, encontrándose no
reactivos.
ALMACENAMIENTO DE REACTIVOS
- Los reactivos son estables en refrigerador (2 – 10ºC). No congelar.

- La autoaglutinacion del reactivo latex es indicio de deterioro del mismo,
desechar el reactivo.

MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero
Sustancias interferentes conocidas: los sueros marcadamente lipemicos ictéricos o

con presencia de farmacos o contaminados pueden dar reslutados falsamente
positivos o negativos..
La muestra es estable durante 24 horas refrigerada de 2 – 10ºc o congelados por
periodos prolongados.
MATERIALES
- 1 Placa de vidrio
- 1 Gotero
- Goteros o pipetas para dispensar los volúmenes indicados
- Palillos o aplicadores para mezclas descartables.
- Cronometro
- Lampara o fuente de luz
- Tubos de kahn
EQUIPOS
- Agitador de placas con control de r.p.m.

- Centrifugadora de tubos
- Baño Maria
TECNICA
Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo de

Latex antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero.
I TECNICA CUALITATIVA
- En cada uno de los sectores delimitados de la placa de vidrio colocar:

Una gota (o 50 microlitros) de la muestra, una gota del control positivo,y una
gota del control negativo.
- Inmediatamente añadir a cada uno de los pocillos una gota (o 50 microlitros
) del reactivo de latex.
- Mezclar con palillo o aplicador descartable (uno para cada muestra) hasta
obtener una suspensión uniforme en la superficie delimitada de la placa.
Inmediatamente dispara un cronometro.
- Balancear o llevar a un agitaro de placas durante tres minutos.
- Observar macroscópicamente el resultado dentro los tres minutos.

II TECNICA SEMICUANTITATIVA (Titulacion)
- Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en

tubos de Kahn.
- Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos (5 tubos).
- Agregar 0,5 ml de suero al tubo Nº 1 y mezclar
- Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo Nº 2 y mezclar, continuando asi las
diluciones hasta el ultimo tubo.
- Las diluciones asi obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 etc.
- Ensayar cada dilución según la técnica cualitativa.
Negativo: suspensión homogénea.

Positivo: Aglutinacion que aparece dentro los tres minutos de agitación. Se califica
como Positivo de una cruz acuatro cruces (+).
Titulacion: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible

macroscópicamente.
El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra puede ser calculada por
la formula siguiente:
ASO (UI/ml) = Titulo x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml)
Ejemplo: la muestra presenta un titulo de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x 200 = 400

UI/ml
Es conveniente procesar simultáneamente el control positivo y el control negativo

provistos, empleando una gota del control correspondiente en lugar de la muestra
y una gota del reactivo de latex según la técnica cualitativa.
- En la técnica cualitativa negativo sin patología cuando la suspensión es

homogénea y positivo cuando hay aglutinación.
- En la técnica semicuantitativa valor normal de referencia hasta 200 UI/ml,
valores superiores son considerados patológicos.
- Tiempos de reacción mayores de 3 minutos pueden producir reacciones

falsamente positivas por efecto del secado de los reactivos.
- Se puede producir falsos negativos en niños mayores de 6 meses y
menores de 6 años con infecciones recientes.

- Debe tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones, un resultado

aislado solo constituye un dato auxiliar, por lo que se recomienda efectuar
determinaciones seriadas cada 15 -20 dias durante 4 o 6 semanas.
PERFORMANCE
- Sensibilidad: 200 UI/ml

- Especificidad: la técnica tine que tener una especificidad superior al 96%
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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PRUEBA NO TREPONEMICA PARA LA DETECCION SEROLOGICA DE

SIFILIS
INTRODUCCION.- La sífilis es una enferemdad venérea causada por el

Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en areas de
abrasiones. El contacto sexual es la forma mas común de transmisión.
La detección y tratamiento de la enferemdad en sus estadios tempranos es
fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sífilis cardiovascular,
neurosifilis y sífilis congénita.
El diagnostico de esta enfermedad sifre la carencia de un método para cultivar el
microorganismo en medios de laboraotrio y la dificultad para detectarlo en estadios
de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidérmicas.
Sin embargo, desde el comienzo de la infección aparecen en el suero del indivicuo
infectado ciertas sustancias denominadas “reagininas”, que reaccionan con
antígenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reagininas junto alos signos
clínicos son por lo tanto los procedimientos mas rapidos y utiles disponibles para
diagnostico de sífilis.
FUNDAMENTOS DEL METODO
En la prueba rápida para reagininas plasmáticas (RPR), las “reagininas” presentes

en el suero de individuos infectados con treponema pallidium, se detecta por
acción de las mismas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido
sobre partículas de carbón.
La reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente, favorecida por
las partículas de carbón.
Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente
purificado y el agragado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar
la muestra.
REACTIVOS
Reactivo RPR: suspensión de antígeno de cardiolipina 0,003%, lecitina 0,02% y

colesterol 0,09%, adsorbido sobre partículas de carbón 0,02% especialmente
tratado en buffer fosfatos 0,01 mol/L con cloruro de colina 0,72 mol/L, EDTA 12,5
mmol/L y merthiolate 0,1% como conservante.
Control Positivo: dilución de suero reactivo

Control Negativo: dilución de suero no reactivo
Solucion fisiológica (ClNa 9 g/L)
- Los reactivos conservarlos en refrigeración ( 2 – 10ºC)
- Los reactivos son para uso diagnostico in vitro.
- Los controles positivos y negativo han sido examinados para antígenos de
superficie del virus de hapatitis B y anticuerpos contra HIV ½,
encontrándose no reactivos.

MATERIALES Y EQUIPOS
- Tarjetas de reacción
- Gotero metalico para dispensar el reactivo.
- Goteros plásticos descartables para dispensar y distribuir las muestras
- Agitador de placas rotativo con control de r.p.m.
- Centrifugadora de tubos
MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero o plasma: obtener la muestra de la manera usual no es necesario

inactivar.. En caso de obtener plasma, utiliza heparina, EDTA, fluoruro u
oxalato de sodio como anticuagulantes. Lasmuestras lipemicas, ictéricas,
hemolisadas y con presencia de fármacos interfieren la reacción dando
resultados erróneos.
PROCEDIMIENTO
I PRUEBA CUALITATIVA
- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar

el ensayo.
- En cada uno de los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero
plástico provisto: una gota de muestra, una gota de control positivo, una
gota de control negativo.
- Con la ayuda de un aplicador distribuir la muestra en todo el pocillo.
- Añadir a cada uno de los pocillo donde se esta trabajando una gota de
rectivo de RPR (a la muestra, al control positivo, al control negativo).
- Meclar cada uno de los pocillos con un aplicador (un aplicador para cada
pocillo).
- Llevar a un agitador rotativo a 100 r.p.m. durante 5 minutos, o en su caso
realizar la rotación de forma manual.
- Realizar la lectura al termino del tiempo de rotación.
- Tiempos de lectura mayores dan lugar a falsos resultados.
II PRUEBA SEMICUANTITATIVA
- Con las muestras positivas realizar diluciones seriadas; 1:2, 1:4, 1:8,
hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder de la misma manera
que en la técnica cualitativa.
- El titulo estará dado por la inversa de la ultima dilución que se observe
reactiva.

- Se informa como REACTIVO: cuando hay presencia de aglutinación visible

en forma de grumos negros sobre el fondo claro que indica presencia de
“reagininas” en la muestra. Se informa Reactivo y la dilución hasta que
dilución es reactivo (ej REACTIVO Dilucion 1:16)
- Se informa como NO REACTIVO: cuando no hay aglutinacion y el aspecto
es gris homogeneo que indica ausencia de “reagininas” en la muestra.
- Para controlas la calidad del sistema procesar un control Positvo y un

control negativo utilizándolos de la misma forma que la muestra.

- Evitar el contacito de los dedos con los círculos de la tarjeta de reacción,
dado que el deposito de grasa en los mismos puede ocasionar una mala
distribución de la muestra, produciendo resultados erróneos. Si la muestra
no puede ser distribuida uniformemente en toda la superficie de prueba se
recomienda utilizar otro circulo de la tarjeta.
- Una vez utilizado el gotero metalico para dispensar el reactivo RPR,
descartar el remanente y enjuagarlo con agua destilada.
- El reactivo RPR debe dispensarse manteniendo el gotero en posición
vertical respecto a la tarjeta de reacción a fin de asegurar que el volumen
de la gota sea el correcto.
- A temperaturas elevadas o humedad ambiente baja se recomienda el uso
de una cámara humeda durante la rotación, para evitar que las muestras se
sequen.
PERFORMANCE
- Los estudios estadísticos realizados indican que la sensibilidad y

especificidad del método son similares a los correspondientes a la prueba
USR
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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ANTIGENOS FEBRILES
REACCIONES PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS
CONTRA SALMONELLA Y BRUCELLA
INTRODUCCION.- Las Salmonellas se consideran patógenos entéricos obligados.

Los alimentos y el agua contaminados son los mecanismos de transmisión. La
enfermedad puede presentarse como gastroenteritis, septicemia con lesiones en
diversos órganos o fiebre tifoidea.
La Brucelosis se presenta en la mayoría de los casos con anorexia, fiebre,
decaimiento y esclofrios, pudiendo aparecer luego complicaciones importantes
como son las oseas y neuropsiquicas.
A pesar de que el método definitivo para establecer la etiología de estas
enfermedades es a través del aislamiento del agente patógeno, esto resulta difícil
debido a que la investigación se realiza frecuentemente en periodos tardios de la
enferemdad y luego de una terapia antibiótica.
Por este motivo es de gran importancia diagnostica la detección de los anticuerpos
específicos producidos en el curso de cada una de estas patologías. Una prueba
aislada es de escaso valor, siendo necesarias dos o mas pruebas seriadas a fin de
poder en evidencia cambios en el titulo de anticuerpos.
FUNDAMENTO
El suero del paciente se pone en contacto con antígenos específicos. En este caso
se utilizan suspensiones de Salmonellas o Brucellas muertos. Si la muestra
contiene los anticuerpos correspondientes se producirá una aglutinación visible
macroscópicamente.
REACTIVOS
Antigenos Febriles Salmonella:suspensión contiene los siguientes antígenos

bacterianos:
- Antigenos Paratyphoid A (Salmonella, antígeno flagelar a).
- Antigenos Paratyphoid B (Salmonella, antígeno flagelar b).
- Antigenos Typhoid H (Salmonella, antígeno flagelar d)
- Antigenos Typhoid O (Salmonella, antígeno somatico D).
Antigenos Febriles Brucella: suspensión de antígenos bacterianos (Brucella

abortus, cepa 1119-3). Las bacterias utilizadas, ensayadas por el método de la
acriflavina, se encuentra en fase lisa.
Antigenos Febriles Controles;

- Control Positivo: dilución de suero inactivado positivo.
- Control Negativo: dilución de suero negativo.

Solucion Fisiologica
Los reactivos llevar a temperatura ambiente y agitar vigorosamente antes de su
empleo
Precauciones con el Reactivo.- Los reactivos son para uso diagnostico “in vitro”.
Los controles han sido examinados para HIV y HBV encontrándose no reactivos.
No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo..Los
reactivos tienen que ser almacenados entre 2 – 10 ºC , No congelar. Cualquier
contaminación bacteriana de los reactivos producida durante el uso puede ser
causa de deterioro, deschar.
MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero: Obtener suero limpio en forma esteril. El suero no se inactiva ni se

calienta puesto que los anticuerpos son termolábiles.. No añadir aditivos.
Sueroshemolizados, lipemicos, ictéricos y con presencia o restos de
antibióticos dan reacciones inespecíficas.
MATERIALES
- Placa de vidrio (pocillos)

- Micropipetas
- Tubos de hemolisis
- Varillas de vidrio o aplicadoras
- Reloj o cronometro
- Rotador con control de r.p.m.
PROCEDIMIENTO
TECNICA RAPIDA EN PLACA
- colocar en una palca una gota (50 ul) de suero y agregar una gota (50 ul)
de suspensión de Antigeno. Mezclar y agitar la palca en forma circular
durante 2 minutos.
- Observar la presencia o ausencia de aglutinación utilizando una luz
indirecta sobre fondo oscuro.
II TITULACION RAPIDA EN PLACA
- Utilizar una placa de vidrio con pocillos se utilizara un sector de pocillos

para cada uno de los reactivos ( Antigenos Paratyphoid A, Antigenos
Paratyphoid B, Antigenos Typhod H, Antigenos Typhoid O).
- Empleando las micropipetas apropiadas colocar en estos sectores 80 ul, 20
ul, 10ul y 5 ul de suero límpido. Repetir el procedimiento para el control
positivo y el control negativo.

- Colocar 1 gota de antígeno (A, B, H y O) previamente agitado sobre cada

gota de suero en cada dilución correspondiente.
- Mezclar el suero y el antígeno utilizando una varilla abarcando todo el area
del pocillo. Debe emplearse una varilla distinta para cada dilución de suero.
- Agitar la palca durante 2 minutos en forma circular.
- Observar la aglutinación utilizando luz indirecta sobre fondo oscuro.
- Las diluciones del suero en la titulacion en placa equivalen
aproximadamente a las de la prueba en tubo como se muestra a
continuación:
Volumen de Suero (ml) Dilucion aproximada en la prueba en tubo

0,08 1:20
0,04 1:40
0,02 1:80
0,01 1:160
0,005 1:320
III TITULACION EN TUBO
- Agitar vigorosamente el Antigeno para obtener una suspensión homogénea

y preparar una dilución 1:20 del mismo con solución fisiológica (SF).
- En una serie de 10 tubos colocar: 0,9ml de SF en el primer tubo y 0,5 ml de
SF en los restantes.
- Agregar 0,1 ml de suero en el primer tubo. Mezclar bien y transferir 0,5 ml
de este suero diluido al segundo tubo y asi sucesivamente hasta el decimo
tubo.
- Descartar 0,5 ml del suero diluido del tubo Nº 10.
- Colocar un tubo adicional por cada lote de determinaciones con 0,5 ml de
SF. Rotular “Control de SF”.
- Agregar en cada tubo 0,5 ml de suspensión de Antigeno diluida de acuerdo
a lo indicado en el paso
- Se obtiene diluciones desde 1:20 hasta 1:10.240.
- Mezclar por agitación e incubar en baño de agua según el siguiente cuadro
Temperatura Tiempo
Salmonella O grupo D 45 – 50 ºC 18 hs
Salmonella H grupo D 45 – 50 ºC 2 hs
Salmonella Paratyphoid A 45 – 50 ºC 2 hs
Salmonella Paratyphoid B 45 – 50 º C 2 hs
Brucella 37ºC 48 hs
- Observar con luz indirecta sobre fondo oscuro
- Cuatro cruces (4+): todos los microorganismos aglutinan.

- Tres cruces (3+): aglutinan aproximadamente el 75%

- Dos cruces (2+): aglutinan aproximadamente el 50%
- Una cruz (1+): aglutinan aproximadamente el 25%
- Negativo: no aparece aglutinación.
En la técnica I: Los resultados se indican solamente como positivo o negativo.
En la técnica II y III: Se reporta el titulo, se considera la ultima dilución que da

aglutinación del 50% (++).
- Generalmente títulos de 1:40 o 1:80 son sospechosos de enferemedad.
Solo títulos mayores de 1:80 pueden considerarse probatorios de
diagnostico de enfermedad cuando estén acompañados de la
sintomatología clínica..
- Titulos significativos pueden obtenerse en individuos inmunizados por

vacunas tifoideas. Pueden observarse reacciones inespecíficas con
antígenos de Salmonella O grupo D en suero de pacientes con influenza.
- Tambien se encontraron reacciones inespecíficas en pacientes con
enfermedad hepática crónica activa y consumidores de narcoticos.
- Los antígenos de Brucella pueden dar reacciones cruzadas en individuos
vacunados contra cólera.
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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PRUEBA DE HEMAGLUTINACION INDIRECTA (HAI) PARA LA DETECCION

DE ANTICUERPOS CONTRA EL TOXOPLASMA GONDII
INTRODUCCION
La toxoplasmosis es una enferemdad infecciosa generalmente benigna y

asitomatica del hombre y de los animales, cuyo agente etiológico es el
Toxoplasma gondii, parasito intracelular obligado de distribución mundial.
Cuando la infección por T. gondii se adquiere durante la gestación, existe un alto

riesgo de infección en el feto, pudiendo provocar abortos o lesiones graves que
son mas severas cuanto mas precoz sea la contaminación materna.
Las determinaciones serológicas son las mas convenientes y certeras para el

diagnostico de la toxoplasmosis y debe establecerse: a) la seroconversión de
negativo a positivo, b) un aumento en el titulo de anticuerpos y c) la presencia de
IgM especifica que indicara infección activa.
FUNDAMENTO
Se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos anti – T, gondii de producir

aglutinación en presencia de globulos rojos sensibilizados con antígenos
citoplasmáticos y de membrana del parasito. El empleo de ambos tipos de
antígenos incrementa la sensibilidad del método permitiendo la detección precoz
de la infección. Tanto la presencia de anticuerpos heterofilos como la aparición de
IgM, característica del periodo agudo de la parasitosis, se investigan empleando
tratamiento con 2 mercaptoetanol (2 ME) y eritrocitos no sensibilizados para
control y absorción de heterofilia.. Los anticuerpos heterofilos se absorben con
eritrocitos no sensibilizados. En los sueros de pacientes con infección aguda
tratados con 2-ME, se observa una ciada del titulo en por lo menos dos diluciones
comporados con los mismos sueros sin tratar con 2-ME
REACTIVOS
- Reconstituyente HAI: solución fisiológica tamponada a pH7.

- Antigeno HAI: liofilizado de globulos rojos de carnero sensibilizados con
antígenos citoplasmáticos y de superficie de T. gondii
- GR no sensibilizados: suspensión al 1% de eritrocitos de carnero no
sensibilizados, para control y absorción de heterofilia.
- Buffer HAI: solución fisiológica tamponada con fosfatos a pH 7,5 con
colorante inerte.
- Solucion Proteica: solución de albumina bovina.
- 2 - Mercaptoetanol: ampolla conteniendo 2 – mercaptoetanol (2-ME)

- Control Positivo: suero inactivo conteniendo anticuerpos contra el

Toxoplasma gondii.
- Control Negativo: suero no reacivo, inactivado.
- Solucion fisiológica
INSTRUCCIONES PARA USO DE REACTIVOS
- Antigeno HAI: preparar con 5,2 ml de reconstituyente HAI. Esperar una hora
antes de usar agitando enérgicamente cada 20 minutos para permitir una
correcta rehidratación del reactivo.
Cada vez que se emplea homogeneizar mediante agitación.
- GR no sensibilizados: homogenizar mediante agitación antes de usar,
evitando la formación de espuma.
- Diluyente de sueros HAI: agregar 0,2 ml de solución proteica cada 10 ml de
buffer HAI. Mezclar, rotular y fechar.
- 2-mercaptoetanol: una vez abierta la ampolla, trasvasar el contenido al
frasco vacio provisto, el que se deberá tapar inmediatamente después de
usar.
- 2 – mercaptoetanol al 1%: con el 2- ME provisto, preparar una dilución
1/100 con solución fisiológica en cantidad suficiente de acuerdo al numero
de pocillos que se utilicen. Ejemplo: para 96 pocillos; 25 ul de 2-ME en 2,5
ml de solución fisiológica.
- Controles positvo y negativo listos para usar.
PRECAUCIONES
Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran cpaces de
transmitir infección. Los controles se encuentran inactivados, sin embargo deben
emplearse como si se tratara de material infectivo.
Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de
asegurar la inactivación de agentes patógenos. El método recomendado para este
procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121 ºC. Los liquidos de desecho
pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concnetracion final 5%).
Indicios de inestabilidad o deterioro
Cuando el control negativo y todas las diluciones de suero son reactivas, puede
ser indicios de autoaglutinacion del antígeno HAI, sin la muestra, el reactivo esta
deteriorado..
La ausencia de reactividad en todas las diluciones de sueros y control positivo,
puede ser indicio de deterioro de los reactivos. Procesar una muestra con
positividad conocida.

MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero
Recoleccion: el paciente debe estar preferentemente en ayunas. Obtener suero
de la manera usual. No usar plasma.. No se requeiren aditivos. No agregar
conservadores.
Sustancias interferentes conocidas: hemolisis o hiperlipemia (quilomicronemia)
son causa de resultados erróneos. Para periodos prolongados de
almacenamiento del suero conservar, en congelación a – 20 ºC evitando
reiterar descongelamiento y congelamiento. Los sueros envejecidos tienden a
gelificarse al contacto con el 2-ME, provocando resultados falsos positivos.
MATERIALES
- 1 frasco vacio para trasvasar el 2-me DE LA AMPOLLA

- 5 POLICUBETAS CON 96 POCILLOS DE FONDO EN u (8 HILERAS Y 12
COLUMNAS).
- Espatulas
- Goteros plásticos descartables
- Microdilutores (25ul)
- MIcrogoteros 25 ul
- Tubos de ensayo
- Material volumétrico adecuado
- Cinta adhesiva.
PROCEDIMIENTO
- Seleccionar una policubeta con pocillos sin usar de fondo en U.

- Pasar un trapo húmedo por la base antes de usar
I TITULACION SIN 2 – ME
- Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de diluyente de sueros HAI en

todos los pocillos a usar de la policubeta.
- Tomar una alícuota de cada suero o controles a ensayar con microdilutores
de 25 ul (uno para cada muestra) y colocar en los pocillos de la columna 1.
Se utilizaran tantas hileras horizontales como sueros o controles deban
procesarse.
- Realizar diluciones a partir de la columna 1 (dilución ½), pasando los
microdilutores a la columna 2 (dilución 1/4) y asi sucesivamente hasta la
columna 6 (dilución 1/64). Si se procesaran mas de 8 sueros, se utilizaran
las columnas 7 a 12, realizando las diluciones de la manera antes descripta.
- Colocar en las columnas 1 y 2 (diluciones ½ y 1/4) una gota (25 ul ) de GR
no sensibilizados, para control de heterofilia. Hacer lo mismo en las
columnas 7 y 8 en caso de ser empleadas.

- En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de antígeno HAI.
- Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las pardes laterales,
durante 30 segundos por lo menos.
- Dejar en reposo, al resguardo de vibraciones, durante 90 minutos.
- A partir de los 90 minutos, leer.
- Se puede aumentar la nitidez de la imagen, leyendo sobre un espejo,
iluminado la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco y traslucido
entre la policubeta y la fuente de luz.
II TITULACION CON 2-ME
- Colocar una gota de suero o controles en cada uno de los pocillos de la

columna 1 ( y 7 si es necesario), empleando espátulas – gotero
descartables (una por cada suero) en posición vertical.
- Agregar una gota de 2-Mercaptoetanol al 1% a los mismos pocillos,
utilizando una espátula – goterodescartable.
- Sellar los pocillos con cinta adhesiva y agitar la policubeta golpeando con
los dedos en las paredes laterales.
- Incubar 30 – 60 minutos a 37º C a 90 minutos a temperatura ambiente.
- Retirar la cinta adhesiva, pasar un trapo húmedo por la base de la
policubeta y , con microgotero de 25ul, colocar una gota de Diluyente de
suero HAI en los pocillos restantes de las hileras utilizadas.
- Realizar los pasos 3 al 8 descriptos en la titulación I.
III TECNICAS ALTERNATIVAS
- Cuando se estudian sueros altamente reactivos o en caso de poblaciones

con una elevada prevalencia de toxoplasmosis donde habitualmente se
encuentran títulos superiores a 1/32 pueden emplearse algunas de las
siguientes técnicas alternativas:
o Tecnica Alternativa 1: Continuar con las diluciones hasta la columna
12 inclusive con lo que se obitene una dilución final de ¼.096.
o Tecnica alternativa 2: Colocar en un tubo “ad-hoc” 50 ul de suero y
350 ul de Diluyente de sueros HAI (dilución 1/8). Tomar 25 ul de esta
dilución y colocarlo en la columna 1 de la policubeta. Proseguier
según se describe en I, hasta la columna 6, de esta forma se obtiene
una dilución final de 1/512.
IV ABSORCION SOBRE GLOBULOS ROJOS NO SENSIBILIZADOS
- En sueros que presenten heterofilia los anticuerpos heterofilos pueden

absorverse sobre GR no sensibilizados de la siguiente forma: en un tubo de
hemolisis con tapon colocar 50 ul de GR no sensibilizados provistos + 50 ul
de suero en ensayo. Dejar la suspensión durante 30 minutos a 37ºC
agitando de tanto en tanto. Luego centrifugar a 2000 r.p.m durante 5
minutos. Del sobrenadante se toman 50 ul y se emplea como dilución ½ ,

colocándola en la primera columna. Si se emplea en titulación con 2-ME

esta columna corresponde a dilución ¼
Titulacion cin 2-ME: Titulos mayores o iguales a 16 significan mayor probabilidad

de infección toxoplasmica. A fin de determinar una primoinfeccion reciente deben
procesarse 2 muestras tomadas con un intervalo de 2-3 semanas. Un aumento de
titulo mayor de diluciones entre la primera y segunda muestra indican infección
recientemente adquirida.
Titulacion con 2-ME: La aparición de títulos bajos en la titulación sin 2-ME y

reactividad con globulos rojos no sensibilizados que desaparece al efectuar la
titulación con 2-ME y/o absorción con GR no sensibilizados, serian indicativos de
la existencia de heterofilia.
Por el contrario, títulos elevados sin el empleo de 2-ME que disminuyen
considerablemente al utilizar 2-ME indicarían la presencia de IgM, características
de infección aguda. Los controles de heterofilia en este caso deben dar reacción
negativa en el suero sin tratar o tras absorción con GR no sensibilizados
(1) Manto
(2) Punto final (50%)
- No reactivo: Presencia de un sedimento en forma de botón o pequeño anillo

de bordes regulares.
- Reactivo: Formacion de una película o manto que cubre el 50% o mas del
fondo de los pocillos.
- Dentro de las técnicas inmunológicas, la HAI es considerada un método
confiable para la determinación de anticuerpos específicos. No obstante,
sus resultados, al igual que los de cualquier método serológico, solo
constituyen un dato auxiliar para el diagnostico.
- Se consideran presumiblemente parasitados aquellos individuos cuyos
sueros son reactivos en diluciones mayores o iguales a 1/16.
- Se debe tener en cuenta que la concentración de anticuerpos en suero
viaria en distintas poblaciones, razón por la cual es posible encontrar
sueros reactivos correspondientes a individuos no parasitados. Por esta
razón es necesario determinar los vaolores de referencia de la población en
estudio.

Posibles causas de resultados erróneos:

- Falta de acondicionamiento previo de la policubeta. Para eliminar la carga
electrostática es necesario pasar un trapo húmedo por la base.
- Falta de homogeneización de los reactivos antes de su uso.
- Deficiencias de mezclado
- Vibraciones accidentales durante el reposo necesario para el desarrollo de
la reacción.
- Sueros envejecidos o congelados repetidamente.
- Contaminaciones accidentales de los reactivos o del material empleado en
el ensayo.
- Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja reutilizar pocillos.
- Diluyente de sueros HAI conservado mas de 5 dias.
- Ecceso o defecto de diluyente de sueros HAI en los pocillos de la
policubetas.
- No respetar los tiempos y temperaturas de incubación en el tratamiento con
2-ME al 1%
- 2-Mercaptoetanol al 1% no preparado en el momento. Debe tenerse en
cuenta que este tipo de infecciones las titulaciones aisladas proveen escasa
información por lo que se prefiere efectuar determinaciones seriadas cada
15-20 dias que permitan observar las variaciones en los títulos. Para este
procedimiento es conveniente conservar congelados alícuotas de las
muestras de distintos días y procesarlas simultáneamente con los mismos
reactivos y el mismo operador
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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PRUEBA DE HEMAGLUTINACION INDIRECTA PARA LA DETECCION DE

ANTICUERPOS CONTRA EL TRIPANOSOMA CRUZI
INTRODUCCION
La enferemdad de chagas es una infección parasitaria producida por el

Trypanosoma cruzi. En la mayoría de los casos la enfermedad evolucionara hacia
la fase crónica. El diagnostico de laboraotrio depende del estadio en el cual se
encuentra la enfermedad. Durante la fase aguda, el diagnostico se efectua
mediante la comprobación de los parasitos en sangre. Durante la fase crónica, se
usan métodos serológicos como prueba de screening.
FUNDAMENTO
La hemaglutinación indirecta (HAI) se basa en la propiedad que tienen los

anticuerpos (que en este caso son anti- T. cruzi) de producir aglutinación
especifica en presencia de globulos rojos sensibilizados con antígenos
citoplasmáticos y de membrana del Trypanosoma cruzi (chagatest HAI screening,
utiliza globulos rojos de ave, que al ser de mayor tamaño que los de carnero,
aceleran la visualización de la reacción.
Los anticuerpos interferentes, que pueden causar aglutinación inespecífica, se
eliminan con el agrgado de la solución proteica, la cual tiene inhibidores de los
mismos
REACTIVOS
- Antigeno HAI: Suspension de globulos rojos de ave sensibilizados con

antígenos citoplasmáticos y de membrana de T. cruzi en buffer fosfatos con
ClNa, 8.5 g/L y conservante menor a 0,1 %
- Buffer HAI: solución fisiológica (8.5 g/L ClNa) tamponada con fosfatos 20
mmol/L, pH7,1 y conservante menor a 0,1%
- Solucion Proteica: solución de proteínas, 5 g/dl y conservante menor a
0,1%
- Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos contra el
Trypanosoma cruzi y conservante menor a 0,1%
- Control Negativo: dilución de proteínas sericas no reactivas y conservante
menor a 0,1%
INSTRUCCIONES DE USO DE LOS REACTIVOS
- Antigenp HAI cada vez que se utilice debe homogeneizarse perfectamente

por agitación, evitando la formación de espuma.
- Diluyente de sueros HAI: agregar 0,2 ml de solución proteica a 5 ml de
buffer HAI , mezclar, rotular y tapar.
- Controles positivos y negativos: listos para usar , homogenizar antes de
usar

PRECAUCIONES
- Las muestra de pacientes, los controles positivos y negativos deben

manipularse como si fuera capaces de transmitir infección.
- Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de
asegurar la inactivación de agentes patógenos, procedimiento
recomendado autoclavado durante una hora. La desifeccion con hipoclorito
de sodio
INDICIOS DE INESTABILIDADO DETERIOR DE LOS REACTIVOS

- Cuando el control negativo y todas las diluciones de sueros son reactivas,
puede ser indicio de autoaglutinacion del antígeno HAI. Verificar destinado
un pocillo de la policubeta para mezclar antígeno HAI y diluyente de sueros
HAI, sin la muestra. Si aun es este caso se observa agluitnacion, el reactivo
estará deteriorado. Desechar.
- La ausencia de reactividad en todas las diluciones de sueros y el control
positvo, puede ser indicio de deterioro de los reactivos.
MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero: la recolección de la muestra preferentemente en ayunas. Obtener

suero de la manera usual. No usar palsma. Las muestras inactivadas por
calor pueden provocar resultados falsos positvos.
No agrgar conservantes a las muestras. Sustancias interferentes conocidas:
hemolisis o hiperlipemia (con quilomicronemia) son causas de resultados
erróneos.
MATERIALES
- Policubetas de 96 pocillos fondo en V
- Micropipetas de volumen varible
- Tubos de hemolisis
PROCEDIMIENTO
Selccionar una policubeta de pocillos de fondo en V sin usar. Pasar un paño

húmedo por la base de la misma antes de usar

I PRUEBA CUALITATIVA
- En un tubo de hemolisis colocar 400 ul de diluyente de sueros HAI y
adicionar 10 ul de suero o controles (dilución 1/40).
- Colocar 50 ul de la dilución 1/40 de suero o controles en un pocillo de la
policubeta y agrgar 25 ul de antígeno HAI.
- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la cubeta durante por
lo menos 30 segundos.
- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos a
temperatura ambiente.
- Leer a partir de los 60 minutos.
- Puede aumentarse la nitidez de la apreciación, leyendo sobre un espejo,
iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco traslucido
entre la policubeta y la fuente de luz.
II PRUEBA CUANTITATIVA
- En una serie de 6 pocillos colocar 50 ul de diluyente de sueros HAI en los

pocillos 2,3,4,5 y 6.
- Pipetear 50 ul de la dilución 1/40 de suero o controles en los pocillos 1 y 2.
- Transferir 50 ul del pocillo 2 al 3 y asi sucesivamente, desechando 50 ul del
ultimo pocillo, evitando la formación de burbujas.
- Homogenizar por inversión el antígeno HAI.
- Agrgar a cad dilución 25 ul de antígeno HAI
- Agitar la policubeta aplicando suaves golpes en los laterales durante por lo
menos 30 segundos.
- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos.
- Leer a partir de los 60 minutos.
- El titulo del suero será de la mayor dilución de suero reactivo
DILUCIONES CORRESPONDIENTES
Pocillo 1 2 3 4 5 6
Titulos 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280
CRITERIOS DE VALIDACION
El ensayo se considera valido si se cumple simultáneamente las siguientes

condiciones:
- El control negativo debe dar un botón nítido en el fondo del pocillo
- El control Positivo debe dar una película o manto en el fondo del pocillo. Si
una o ambas condiciones no se cumplen, repetir el ensayo.

- No Reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón, nítido y de

bordes netos en el fondo del pocillo.
- Reactivo débil: manto pequeño sobre el fondo del pocillo con botón mas o
menos definido en el centro.
- Fuertemente Reactivo: formación de una película o manto a veces de
bordes irregulares en el fondo del pocillo
- Dentro de las técnicas inmunológicas, la HAI es considerada un método

confiable para la determinación de anticuerpos específicos.
- Se considera presumiblemente parasitados aquellos individuos cuyos
sueros son reactivos con títulos mayores o iguales a 1/40
Las posibles causas de resultados erróneos son:

- Falta de acondicionamiento previo de la policubeta. Para eliminar la carga
electrostática es necesario pasar un trapo húmedo por la base.
- Falta de homogeneización de los reactiovs antes de su uso.
- Deficiencias de mezclado
- Vibraciones accidentales durante el reposo necesario para el desarrollo de
la reacción.
- Sueros envejecidos o congelados repetidamente.
- Sueros inactivados por calor
- Contaminaciones accidentales de los reactivos o del material empleado en
el ensayo.
- Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja rehusar pocillos
- Diluyente de sueros que no sea de preparación reciente
- Dilucion de la muestra preparada por mas de 24 horas
PERFORMANCE
- Sensibilidad y especificidad: en poblaciones endémicas, empleando el

método, el 100 % de los títulos mayores y el 99% de los títulos menores de
1/40 fueron confirmados por emtodos de referencia.
- En poblaciones no endémicas, el 100% de los individuos sanos presento
títulos menores a 1/40 empleando el método HAI.
- La sensibilidad del método es de 95,3% y una especificidad del 99,2%
comparado con el método de ELISA.

RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA) PARA LA DETECCION DE

ANTICUERPOS CONTRA LOS VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
(HIV-1 Y HIV-2)
INTRODUCCION
Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) causantes del SIDA,

son transmitidos principalmente por contacto sexual o atraves de sangre o
productos contaminados derivados de la sangre.
Individuos infectados con estos virus aparecen anticuerpos, como respuesta del
sistema inmunitario a la invasión viral. Estos anticuerpos no son protectores y no
confieren inmunidad, pero por ser marcadores tempranos de la infección, su
detección constituye la base del estudio de la patología.
Esta técnica nos permite determinar conjuntamente la presencia de los
anticuerpos anti – HIV-1 y anti HIV-2
La secuencia de los virus HIV – 1 y HIV-2 ha demostrado que poseen un60% de
homologos en los genes pol y pag, que desciende al 30 – 40% en los demás
genes y en la región LTR. El presente método emplea antígenos sinteticos con
secuencias correspondientes a regiones antigénicas codificadas por dichos genes
que adicionalmente, cumplen con la condición de generar anticuerpos de
temprana aparición en la seroconversión. Esta condición y su gran
inmunoreactividad otorgan una mayor sensibilidad a la determinación.
FUNDAMENTO
La muestra se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizado el

antígeno. Si la misma contiene los anticuerpos específicos, estos formaran un
complejo con los antígenos y permanecerán unidos al soporte. La fracción no
unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos anti –
inmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reacción en
la primera etapa del proceso, se unira el conjugado. Luego de un nuevo lavado se
agrega el sustrato enzimático. En los casos en que se haya unido el conjugado
habrá aparición de color celeste. La reacción se detiene con acido sulfúrico, con lo
que el color celeste vira al amarillo.
REACTIVOS
- Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con pocillos que

contienen antígenos sinteticos de HIV -1 y HIV -2 inmovilizados.
- Conjugado: anti- inmunoglobulinas humanas (cabra) conjugadas con
peroxidasa.
- Revelador A: peróxido de hidrogeno 60 mmol/L en buffer citrato 50 mmol/
ph 3,2
- Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/L en acido clorhídrico 0,1
N.

- Stopper: acido sulfúrico 2 N.

- Buffer de lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/L en buffer fosfatos
100 mmol/L y tensioactivo no ionico 0,1 g/L
- Diluyente de Muestras: albumina bovina en solución fisiológica tamponada
con buffer fosfatos pH 7,2
- Control Positivo: dilución de suero inactivado conteniendo anticuerpos
contra HIV-1 y HIV-2
- Control Negativo: dilución de suero no reactivo, inactivado.
INSTRUCCIONES DE USO DE REACTIVOS
- Buffer de lavado: para usar diluir 1 + 4 con agua destilada (1 parte de buffer
de lavado concetrado + 4 partes de agua destilada). A baja temperatura los
componentes del reactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en baño
de agua a 37ºC unos minutos, mezclando luego por inversión.
- Policubetas sensibilizada: listo para usar
- Conjugado: listo para usar.
- Revelador A: listo para usar.
- Revelador B: listo para usar
- Stopper: listo para usar
- Diluyente de muestras: listo para usar.
- Control positivo y Control negativo: listo para usar
PRECAUCIONES
- Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran
capaces de transmitir infección. Los controles se encuentran inactivados,
sin embargo, deben emplearse como si se tratara de material infectivo..
- La policubeta se encuentra recubierta con antígenos sinteticos de HIV-1 y
HIV-2. Cualquier posibilidad de contaminación con la misma puede
descartarse con absoluta certeza.
asegurar la inactivación de agentes patógenos. El método recomendado
para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121ºC. Los liquidos
de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio,
(concnetracion final 5%) durante por lo menos 60 minutos.
- Las policubetas deben incubarse en estufa. No usar baño de agua.
- Los reactivos son para uso diagnostico “in vitro”
- Evitar el contacto del acido sulfúrico con la piel y mucosas.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
- Los reactivos provistos son estables en refrigeración (2-10ºC) , no congelar.

- Buffer de lavado estable 3 meses a temperatura ambiente.
- Policubetas sensibilizadas: las tiras de pocillos con antígeno inmovilizado
se proveen cerradas al vacio y con desecante. No abrir el envoltorio hasta
el momento de usar. Las tiras de pocillos no utilizadas deben conservarse
dentro del sobre con el desecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-

10ºC. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas

dentro de los 5 meses posteriores mientras no se supere la fecha de
vencimiento del equipo.
MUESTRA
- Suero o plasma
Obtener la muestra de la manera usual. No deben usarse muestras
inactivadas por calor.
Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquier anticoagulante de
uso corriente en la practica transfusional.
Sustancias interferentes conocidas: la muestras hemolisadas,
hiperlipemicas, ictéricas, con presencia de fármacos, pueden ser causa de
resultados erróneos. En algunos casos pueden ser clarificados por
centrifugación.
MATERIALES
- Micropipetas con capacidad de medir diferentes volúmenes.

- Reloj cronometro
- Estufa a 37ºC
- Espectrofotometro para lectura de policubetas. Lector de ELISA
CONDICIONES DE REACCION
- Longitud de onda primaria: 450 nm

- Longitud de onda secundaria (bicromatica 620 – 650 nm.
- Calibracion del instrumento: llevar a cero el espectrofotómetro con blanco
de reactivos procesándolo de la misma forma que una determinación pero
omitiendo colocar la muestra.
- Tiempo total de reacción: 90 minutos.
- Temperatura de reacción: 37ºC y temperatura ambiente.
- Volumen de muestra: 10 ul
PROCEDIMIENTO
- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar

la prueba. Una vez inicado el análisis debe cpmpletarse sin interrupción.
- Procesar simultáneamente 2 controles Positvos (CP), 3 controles Negativos
(CN) y los Desconocidos (D). Al depositar la muestra y/o controles sobre el
diluyente de muestras debe asegurarse de colocar los mismos en el seno
del liquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. Enjuagar la pipeta
con diluyente dispensando en el pocillo para asegurar una correcta
homogenezacion. En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar

D CP CN
Diluyente de 200 ul 200 ul 200 ul
Muestras
Control Positivo - 10 ul -
Control Negativo - - 10 ul
Muestra 10 ul - -
- Mezclar aplicando cuaves golpes en los laterales de la policubeta durante

10 segundos una vez cargadas las muestras en cada tira. Para evitar la
evaporación, cubrir la palca con una cinta autoadhesiva e incubar en la
estufa 30 minutos a 37ºC.
- Luego aspirar cuidadosmanete el liquido de cada pocillo recibiéndolo en un
recipiente para desechos biológicos que contenga 5% de hipoclorito sódico.
- A continuación , lavar 5 veces con buffer de lavado empleando
aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Despues de cada lavado, el liquido se
descartara también en el recipiente con hipoclorito. Puede emplearse
también lavador automatico. Al finalizar el ultimo lavado, eliminar por
completo el liquido residual, invirtiendo la policubeta y golpeándola varias
veces sobre papel absorbente, ejerciendo una leve presión con la mano
sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la caída de las tiras de
pocillos.
- Luego agregar a cada pocillo:
D CP CN
Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota
- En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 60 ul.

- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante
10 segundos. Para evitar la evaporación, cubrir la placa con una cinta
autoadhesiva e incubar durante 30 minutos en estufa a 37ºC.
- Luego aspirar el liquido de los pocillos, recibiéndolo en el recipiente con
hipoclorito y lavar según se indico mas arriba.
- Al finalizar el ultimo lavado, eliminar por completo el liquido residual,
invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel
absorbente, ejerciendo una leve presión sobre los laterales mayores del
soporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos.
- Luego agregar en cada pocillo:
D CP CN
REVELADOR A 1 gota 1 gota 1 gota
REVELADOR B 1 gota 1 gota 1 gota

10 segundos.

- Incubar 30 minutos a temperatura ambiente y luego agragar:
D CP CN
STOPPER 1 gota 1 gota 1 gota

10 segundos.
- Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromatico 450/620-650 nm o
evaluar el resultado a simple vista por comparación con los controles
positivos y negativos.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
- El color de la reacción es estable durante 30 minutos, por lo que los

resultados deben observarse durante ese lapso.
CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA
- La corrida se considera valida si se cumple simultáneamente las siguientes

condiciones:
a) Las lecturas de al menos 2 de los controles negativos corregidas contra
el blanco de reactivos deben ser menores o iguales a 0.150 D.O.
b) La lectura media de los controles positivos corregida debe ser mayor o
igual a 0,600 D.O.. Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir
la corrida. Para ambos casos recordar que las lecturas obtenidas
dependerán de la sensibilidad del aparato empleado.
a) Con Instrumento Optico.- La presencia o ausencia de anticuerpos anti-HIV

se determina relacionando la absorvancia de la muestra respecto al valor
Cut-off.
Cut-off = CN + 0.150 D.O.
CN: Promedio de las lecturas del Control Negativo.

Zona de Indeterminacion : Cut-off + - 10%
Muestras No Reactivas: Se considera aquellas con absorbancias menores que el

limite de la zona de indeterminación.
Muestras Raectivas: Se consideran aquellas con absorbancias mayores que el
limite superior de la zona de indeterminación.
Estas muestras deben analizarse nuevamente por duplicado con el mismo método
antes de su interpretación definitiva. Si uno o ambos duplicados resultan reactivos,
deben realizarse una prueba confirmatoria como Westerm Blot.

Muestras Indeterminadas: Se consideran aquellas con absorbancias que caen

dentro de la zona de indeterminación. Estas muestras deben ser ensayadas
nuevamente.
b) Interpretacion Visual: Prar este tipo de interpretación debe considerarse ,

No Reactiva toda muestra que no presente una coloración mayor que la de
los Controles Negativos. Por el contrario, una muestra netamente amarilla
se considera Reactiva. Colores tenues mayores que el Control Negativo,
requieren la interpretación instrumental.
Esquema de Interpretacion
Muestra Original
Lectura menor la limite de Lectura mayor al limite superior de

La zona de indeterminación la zona de indeterminación
No Reactiva Inicialmente reactiva

(repetir sobre muestra original
Por duplicado)
Ambas lecturas 1 o mas lecturas

Menor al limite inferiror mayor al limite superior
De la zona de de la zona de
Indeterminación indeterminación
No Reactiva No Reactiva
Ensayar usando método de

Referencia (Western Blot) y
Discriminar HIV-1 y HIV-2
- Constituyen causas de muestras no repetidamente reactivas: Lavado

incorrecto de los pocillos de reacción. Contaminacion cruzada de muestras
No Reactivas con anticuerpos procedentes de una muestra reactiva..
Contaminacion de la solución cromógena con agentes oxidantes (cloro,
etc.). Contaminacionn del Stopper. Conservacion inadecuada de las tiras de
pocillos no utilizadas. Contaminacion inadecuada de las tiras de pocillos no
utilizadas. Contaminacion del Buffer de lavado diluido. Se recomienda
verificar la limpieza de los recipientes donde prepara y almacena. Si se

observa aparición de turbidez o precipitación al prepararlo, debe

desecharse.
- Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por métodos de
referencia como Western Blot.
- Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientes situaciones:
enferemedades autoinmunes, tuberculosis, lupues eritematoso, embarazo,
vacunaciones contra hepatitis B y otras inmunizaciones, hemodiálisis,
enfermedad hepática y otras enfermedades.
- Ocasinalmente, al efectuar lecturas bicromaticas, pueden obtenerse
absorbancias negativas que no invalidan la determinación..
- No utilizar muestras inactivadas por calor ya que pueden ocasinar
resultados falsos positivos..
- No utilizar baño de agua para la incubación.
PERFORMANCE
a) Sensibilidad: en estudio realizado por un centro de referencia sobre

376 muestras seropositivas provenientes de drogadictos
intravenosos, homosexuales, heterosexuales, infectados perinatales
y dadores de sangre, la sensibilidad se estima en un 100 %. La
seropositividad se determina por un algoritmo de referencia
compuesto por un método ELISA como referencia y por Western blot
como método confirmativo.
b) Especificidad:en un estudio realizado sobre 708 muestras
provenientes de banco de sangre y 280 de consultorio externo, la
especificidad basada en una prevalencia del 0% de anticuerpos anti
HIV en individuos sanos, se estima en un 99,6%
c) Estudio de población: en una población general que incluye
individuos sanos, donantes, pacientes con enferemedad
relacionadas y no realcionadas al SIDA, e individuos que padencen
esta enferemdad, la correlacion con respecto a métodos
confirmativos, fue del 99.5%
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA) PARA LA DETECCION DEL

ANTIGENO DE SUPERFICIE DE VIRUS DE LA HEPATITIS B (HBsAg)
INTRODUCCION
La hepatitis B es una enferemdad viral caracterizada por un periodo prolongado de
incubación (45 – 160 dias). El virus cuasante de esta patología (HBV) es una
particula compuesta por una región interior o “core” donde se encuentra el DNA y
una envoltura exterior antigénica conocida como antígeno de superficie (HBsAg).
Su presencia en el suero indica enferemdad activa. El antígeno de superficie de la
hepatits B (HBsAg) y su correspondiente anticuerpo son específicos para
infecciones por virus B. El antígeno puede ser detectado en el suero y secreciones
de pacientes en periodo agudo o en infecciones crónicas por HBV.
El HBsAg es generalmente loa primera evidencia de infección por HBV, que puede
preceder en semanas o meses a cualquier otra manifestación de laboraotrio o a
los síntomas y signos clínicos de la enfermedad. Puede ser en algunos casos el
único indicador de portadores asintomáticos en individuos con hepatitis B crónica.
La detección del HBsAg es importante por lo tanto, no solo para el diagnostico de
la enfermedad aguda, sino para el control de portadores en bancos de sangre,
unidades de diálisis y areas hospitalarias donde exista la posibilidad de
transmisión de la infección.
FUNDAMENTO
La muestra se pone en contacto con un anticuerpo monoclonal anti – HBs

inmovilizado sobre el soporte solido. Si la misma contiene antígeno HBsAg, este
formara un complejo con los anticuerpos y permanecerá unido al soporte. La
fracción no unida se elimina por lavado tras lo que se agrega otro anticuerpo
monoclonal anti – HBs conjugado conperoxidasa. Si se produjo la reacción en la
primera etapa del proceso, se unira el conjugado. Luego de un nuevo lavado se
agrega el sustrato enzimático. En los caosos en que el HBsAg este presente en la
muestra, habrá desarrollo de color celeste. La reacción se detiene con el agregado
de acido sulfúrico, con lo que el color celeste vira al amarillo.
REACTIVOS
- Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con pocillos que

contienen anticuerpo monoclonal anti – HBs inmovilizado.
- Conjugado concentrado: anticuerpo monoclonal anti- HBs conjugado con
peroxidasa.
- Diluyente de conjugado: buffer tris conteniendo aditivos y conservantes.
- Revelador A: peróxido de hidrogeno 60 mmol/L
- Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0.01mol/L en acido clorhídrico 0.1
N.
- Stopper: acido sulfúrico 2 N
- Buffer de lavado concentrado: cloruro de sodio 1.4 mol/L en buffer fosfatos
100 mmol/L y tensioactivo no ionico 0.1 g/L

- Control Positivo: dilución de suero inactivado, reactivo para HBsAg.

- Control Negativo: dilución de suero inactivado, no reactivo.
INSTRUCCIONES USO DE REACTIVOS
- Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo pueden

cristalizar. En tal caso, antes de diluir, colocar en baño de agua a 37ºC unos
minutos, mezclando luego por inversión. Para usar diluir 1 + 4 con agua
destilada (1 parte de buffer de lavado concentrado + 4 partes de agua
destilada).
- Policubetas sensibilizadas: lista para usar.
- Conjugado: antes de diluir, para optimizar el aprovechamiento del reactivo,
es conveniente centrifugar suavemente el conjugado concentrado para
arrastrar lo que pudiera quedar retenido en las paredes del tubo. Preparar
diluyente 1 parte de conjugado concentrado + 50 partes de diluyente de
conjugado (ej: para una tira colocar 20 ul conjugado concentrado + 1 ml
diluyente de conjugado o cantidades equivalentes).
- Revelador A y B: listos para usar
- Stopper: listo para usar
- Control Positivo y Negativo: listo para usar.
PRECAUCIONES

capaces de transmitir infección. Los controles se encuentran inactivados.
Sin embargo, deben emplearse como si se tratara de material infectivo.
- Los sueros controles han sido examinados para HIV encontrándose
negativos.
asegurar la inactivación de agentes patógenos. El método recomendado
para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121ºC. Los liquidos
de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio
(concetracion final 5%) durante por lo menos 60 minutos.
- Las policubetas deben incubarse en estufa.
- Evitar el contacto del acido sulfúrico con la piel y mucosas.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DE REACTIVOS
- Los reactivos son estables en refrigeración a 2 -10ºC, no congelar

- El buffer de lavado: estable 3 meses a temperatura ambiente.
- Policubetas sensebilizadas: las tiras de pocillos con anticuerpo inmovilizado
se proveen cerradas al vacio y con desecante. No abrir el envoltorio hasta
el momento de usar, ni antes que haya tomado temperatura ambiente, de lo
contrario se favorecerá la humectación del contenido.
- Las tiras de pocillos no utilizadas deben conservarse dentro del sobre con
el desecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2 -10ºC.

- Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de

los 5 meses posteriores mientras no se supere la fecha de vencimiento del
equipo.
- Conjugado: estable 24 horas en refrigeración 2 -10ºc
MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero o plasma (preferentemente suero)
Recolectar la muestra de la manera usual, no usar muestras inactivadas por
calor.
Si se emplea plasma puede utilizarse cualquier anticoagulante de uso
corriente en la practica transfusional.
Las muestras no tienen que presentar hemolisis, hiperlipemia, ictericia,
restos de fármacos y otras causas de turbiedad pueden provocar resultados
erróneos. Estas muestras deben ser clarificadas por centrifugación.
MATERIALES
- Micropipetas de volumen variable

- Cronometro
- Estufa calibrada a 37ºC
- Espectrofotometro para lectura de policubetas (Lectos de ELISA)
- Cama oscura
CONDICIONES DE REACCION DE TRABAJO
- Longitud de onda primaria 450 nm

- Longitud de onda secundaria (bicromatica): 620 – 650 nm
- La calibración del instrumento óptico, llevar a cero el espectrofotómetro con
blanco de reactivos procesándolo de la misma forma que una
determinación pero omitiendo colocar la muestra y conjugado, es decir
revelador A, revelador B y Stopper.
- Tiempo de reacción total: 2 horas 30 minutos.
- Temperatura de reacción: 37ºC y temperatura ambiente
- Volumen de muestra: 100ul
PROCEDIMIENTO
- Una vez iniciado el procedimiento debe completarse sin interrupción.

- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar
la prueba.
- Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP), 3 Controles
Negativos (CN) y los Desconocidos (D).

- En los poscillos a utilizar de la policubeta colocar:
D CP CN
MUESTRA 100 ul - -
CONTROL POSITIVO - 100 ul -
CONTROL NEGATIVO - - 100 ul
- Para evitar la evaporación, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e

incubar en estufa 60 minutos a 37ºC.
- Luego aspirar cuidadosamente el liquido de cada pocillo recibiendo en un
recipiente para desechos biológicos que contenga 5% de hipoclorito sódico.
- A continuación lavar 5 veces con Buffer de Lavado empleando
aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Despues de cada lavado, el liquido se
descartara también en el recipiente con hipoclorito, opcionalmete emplear
lavador automatico.
invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel absorvente,
ejerciendo una leve presión con la mano sobre los laterales mayores del
soporte, para evitar la ciada de las tiras de pocillos.
- Luego agregar en cada pocillo:
D CP CN
CONJUGADO 100 ul 100 ul 100 ul
- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta curante

10 segundos. Para evitar la evaporación, cubrir la palca con una cinta
autoadhesiva e incubar durante 60 minutos en estufa a 37 ºC.
- Luego eliminar el liquido de los pocillos, recibiéndolo en el recipiente con
hipoclorito y lavar según se indico mas arriba.
invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel absorvente,
ejerciendo una leve presión con la mano sobre los laterales mayores del
soporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos.
- Agregar:
D CP CN
REVELADOR A 1 gota 1 gota 1 gota
REVELADOR B 1 gota 1 gota 1 gota

10 segundos.
- Incubar 30 minutos a temperatura ambiente y luego agragar:
D CP CN
STOPPER 1 gota 1 gota 1 gota


10 segundos.
- Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromatica a 450/620 – 650 nm o
evaluar el resultado a simple vista por comparación con los controles
Positivos y Negativos.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
-El color de la reacción es estable durante 30 minutos por lo que los

resultados deben obsrvarse de ese lapso
CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA
La corrida se considera valida si se cumplen simultáneamente las siguientes

condiciones:
- Las lecutras de al menos 2 de los 3 controles Negativos corregidas contra

el Blanco de Reactivos ser menores o iguales a 0.150 D.O.
- La lectura media de los controles Positivo corregida debe ser mayor o igual
a 0.600 D.O. Si alguan de estas condiciones no se cumple, repetir la
corrida. Para ambos casos recordar que las lecturas obtenidas dependerán
de la sensibilidad del aparato empleado
a) Con Instrumento Optico: La reactividad de la muestra se determina

relacionando la absorvancia de la muestra respecto a valor cut – off
Cut – off = CN + 0.060 D.O.
Donde CN = promedio de las lecturas del Control Negativo.
Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorvancias mayores o

iguales al valor cut – off.
Las muestras inicialmente reactivas deben analizarse nuevamente por
duplicado con el mismo método antes de su interpretación definitiva.
Si uno o ambos duplicados resultaran reactivos la muestra debe
considerarse repetidamente reactiva.
Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias menores
que el valor cut – off.
b) Interpretacion Visual: Si se opta por este tipo de interpretación, debe

considerarse No Reactiva toda muestra que no presente una coloración
mayor que los Controles Negativos.

Por el contrario, una muestra netamente amarilla se considera reactiva.

Colores tenues mayores que el del control Negativo, requieren la
interpretación instrumental.
Constituyen causas de resultados erróneos:
- Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.

- Contaminacion cruzada de muestras no Raectivas con antígeno procedente
de una muestra Reactiva.
- Contaminacion de la solución cromógena con agentes oxidantes (cloro,
etc).
- Contaminacion del Stopper.
- Conservacion inadecuada de las tiras de pocillos no utilizadas.
- Uso de baño de agua en lugar de estufa para la incubación.
- Contaminacion de Buffer de Lavado diluido. Se recomienda verificar la
limpieza de los recipientes donde se prepara y almacena. Si se observa
aparición de turbidez o precipitado al prepararlo, debe desecharse.
Ocasionalmente, al efectuar lecturas bicromaticas, pueden obtenerse
absorvancias negativas que no invalidan la determinación. Esto se debe a que
algunas muestras dan lecturas inferiores al Blanco de Raectivos.
PERFORMANCE
a) Sensibilidad: utilizando el Estándar Internacional para Hepatitis B Suface

Antigen (subtype ad) NIBSC (cod 80/549) diluido en PBS-BSA 5%, azida
sódica 0,1% se detectan cantidades de antígeno de 0.5 ng/ml.
b) Especificidad: se realizaron diferentes estudios sobre una población de
individuos hospitalizados y ambulatorios provenientes de centros de salud y
se obtuvieron los siguientes resultados:
- Estudio en 85 individuos obteniéndose una especificidad de 100%
- Estudio en 76 individuos, obteniéndose una especificidad de 98.7%
- Estudio en 127 individuos, obteniéndose una especificidad de 100 %
c) Estudio poblacional: en una población general que incluye individuos sanos
y doantes, la correlacion con respecto a otros ensayos disponibles en el
mercado, fue del 98.8%

RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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METODO INMUNOTURBIDIMETRICO PARA LA DETERMINACION

CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA M
INTRODUCCION
La determinación cuantitativa de IgM es necesario en la tipificación de

inmunodeficiencias y de mielomas.
Es importante para el seguimiento de infecciones agudas.
FUNDAMENTO
La inmunoglobulinas M reaccionan con el anticuerpo especifico formando

inmunocomplejos insolubles. La turbidez provocada por estos inmunocomplejos es
proporcional a la concentración de IgM en la muestra y puede medirse
espectrofotométricamente.
REACTIVOS
- Antisuero Anti – IgM: anticuerpo monoespecifico anti – IgM

- Buffer IgM: solución fisiológica tamponada, pH7,5
- Solucion fisiológica.
- Calibrador proteínas nivel alto
MATERIAL BIOLOGICO
MUESTRA
- Suero o Plasma heparinizado

a) Recoleccion: obtener la muestra de la manera usual
b) Aditivos: encaso de que la muestra a emplear sea plasma, se
recomienda el uso de haparina como anticoagulante.
c) Sustancias interferentes o contaminados: no emplear sueros
hemolizados, ictéricos, hiperlipemicos o con restos de
farmacosNo se observan interferencias por bilirrubina hasta 20
mg/dl, triglicéridos hasta 25 g/L ni hemoglobina hasta 1 g/dl.
d) Instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser
preferentemente fresca. Puede ser conservado la muestra una
semana en refrigeración 2 -10ºC. En caso que se deba procesar
en un periodo mas largo de tiempo conservarlo a – 20ºC
MATERIALES
- Espectrofotometro
- Cubetas y pipetas capaces de medir diferentes volúmenes
- Tubos de Kahn o hemolisis

- Cronometro
- Longitud de onda:340 nm
- Temperatura de reacción ambiente 25ºc
- Tiempo de reacción: 30 minutos
PROCEDIMIENTO
CURVA DE CALIBRACION
- Realizar en tubos de Kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica

del calibrador Proteinas nivel alto: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, empleando
solución fisiológica como punto cero.
Calibrador Proteinas Diluido 60 ul

Buffer IgM 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia de cada dilución a 340 nm (DO),

llevando el aparato a cero con agua destilada.
- Luego agregar:
Antisuero Anti - IgM 100 ul
- Mezclar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.

- Leer la absorvancia a 340 nm (DO2), llevando el aparato a cero con agua
destilada.
- Calcular la diferencia de absorvancia (Delta A = DO2 – DO1) para cada
dilución del Calibrador Proteinas, incluyendo el punto cero.
- Representar en papel milimétrico las diferencias de absorvancia Delta A en
función de la concetracion en mg/dl (g/L) del calibrador Proteinas.
PROCEDIMIENTO PARA MUESTRAS
- Realizar diluciones 1:10 de las muestras en solución fisiológica

Muestra diluida 60 ul
Buffer IgM 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia a 340 nm (DO), llevando el aparato a

cero con agua destilada.
- Luego agregar:
Antisuero Anti - IgM 100 ul

CALCULO DE RESULTADOS
- Calcular la diferencia de absorbancia (deltaA = DO2 – DO1)

correspondiente a cada muestra analizada. Interpolar esta Delta A en la
curva de calibración para determinar la concentración en mg/dl
correspondiente a la muestra estudiada.
- Las muestras con absorvancias superiores a la del Calibrador Proteinas
nivel alto deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas
nuevamente. Mueltiplicar el resultado obtenido por dos.
- Control inmunológico: El control es procesado de la misma manera que las

muestras.
40 – 260 mg/dl (0.40 – 2.60 g/L)
Cada laboratorio debe establecer sus propios valores de referencia.
- En el caso de muestras con características clínicas no definidas, deberá

realizarse una electroforesis de proteínas para detectar un eventual exceso
de antígeno, como ocurre en las gammapatias.
- La turbiedad y partículas en las muestras pueden interferir con la prueba.
Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una coagulación
incompleta o de una desnaturalización de las proteínas, deben ser
removidas por centrifugación antes de proceder a su ensayo.
PERFORMANCE
Rango Dinamico: se puede obtener valores entre la concentración de calibrador

mas baja y mas alta de la curva de calibración (alrededor de 300 mg/dl).
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA G
INTRODUCCION
La determinación cuantitativa de IgG es necesaria en la tipificación de

inmunodeficiencias y de mielomas. Tambien es importante para el seguimiento de
infecciones crónicas de diversos orígenes, donde se encuentran altos niveles de
IgG.
FUNDAMENTO
La inmunoglobulina G reacciona con el anticuerpo especifico formando

proporcional a la concentración de IgG en la muestra y puede medirse
REACTIVOS
- Antisuero Anti IgG: anticuerpo monoespecifico anti – IgG

- Buffer IgG: solución fisiológica tamponada pH 7.5
- Calibrador de proteínas nivel alto
MUESTRA
- Suero o plasma heparinizado

o Recoleccion: obtener la muestra de la manera usual.
o Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se
recomienda el uso de heparina como anticuagulante.
o Sustancias interferentes conocidas: no emplear sueros hemolisados,
ictéricos, lipemicos o con restos de fármacos. No se observan
interferencias por bilirrubina hasta 20 mg/dl, triglicéridos hasta 25 g(L
ni hemoglobina hasta 1 g/dl.
MATERIALES
- Espectrofotometro
- Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas
- Micropipetas y pipetas para medir diferentes volúmenes
- Tubos de kahn o hemolisis
- Reloj cronometro
- Longitud de onda:340 nm

- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (25ºC), puede oscilar entre

22 y 30ºC
- Tiempo de reacción:30 minutos
PROCEDIMIENTO
- Realizar en tubos de kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica
del calibrador de proteínas nivel alto: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160,
empleando solución fisiológica como punto cero.
CALIBRADOR PROTEINAS DILUIDO 40 ul
BUFFER IgG 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia de cada dilución a 340 nm (DO),

- Luego agregar:
ANTISUERO Anti - IgG 160 ul

- Leer la absorvancia a 340 nm (DO2), llevando el aparto a cero con agua
destilada.
- Calcular la diferencia de absorvancia (DeltaA = DO2 – DO1) para cada
- Representar en papel milimétrado las diferencias de absorbancia DeltaA en
función de la concentración en mg/dl (g/L) del calibrador proteínas.
- Realizar diluciones 1:10 de las muestras en solución fisiológica.
MUESTRA DILUIDA 40 ul
BUFFER IgG 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia a 340 nm (DO), llavando el aparato a

- Luego agregar:
ANTISUERO Anti - IgG 160ul

destilada.

CALCULO DE RESULTADOS
- Calcular la diferencia de absorvancia (Delta A = DO2 – DO1)

correspondiente a cada muestra analizada, interpolar esta Delta A en la
curva de calibración para determinar la concentración en mg/dl (g/L)
correspondiente a la muestra estudiada.
- Las muestras con absorvancia superiores a la del Calibrador Proteinas nivel
alto deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas
nuevamente.
- Multiplicar el resultado obtenido por dos.
- 700 – 1600 mg/dl (7.0 – 16.0 g/L)
- En el caso de muestras con características clínicas no definidas, deberá

de antígeno, como ocurre en las gammapatias.
Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una coagulación
PERFORMANCE
- Rango Dinamico: se pueden obtener valores entre la concentración de

calibrador mas baja y mas alta de la curva de calibrador (alrededor de 2800
mg/dl)
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA A
INTRODUCCION
La determinación cuantitativa de IgA es necesaria en la tipificación de

inmunodeficiencias y de mieloma. Tambien es importante para el seguimiento de
infecciones agudas y crónicas de diversos orígenes.
FUNDAMENTO
La inmunoglobulina A reacciona con el anticuerpo especifico formando

proporcional a la concentración de IgA en la muestra y puede medirse
REACTIVOS
- ANTISUERO Anti – IgA: anticuerpo monoespecifico anti – IgA

- Buffer IgA: solución fisiológica tamponada, pH 7.5
- Calibrador Proteinas nivel alto
PRECAUCIONES
- Los reactivos son para uso in vitro. Todas las muestras de pacientes deben
manipularse como si fueran capaces de transmitir infección..los reactivos
refrigerar de 2 – 10ºc
MUESTRA

o Recoleccion; obtener la muestra de la manera usual
o Aditivos en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se
recomienda el uso de heparina como anticoagulante
o Sustancias interferentes conocidas: no emplear sueros hemolizados,
interferencias por bilirrubina hasta 20 mg/dl. Triglicéridos hasta 25
g/L ni hemoglobina hasta 1 g/dl
MATERIALES
- Esoectrofotometro
- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados

- Reloj cronometro
- Longitud de onda: 340 nm

- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (25ºC). El control de
temperatura no es critico, pudiendo oscilar entre 22 y 30 ºc
- Tiempo de reacción: 30 minutos.
PROCEDIMIENTO
- Realizar en tubos de kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica

del Calibrador Proteinas nivel alto: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, y 1:160,

BUFFER IgA 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia de cada dilución a 340 nm (DO1)

- Luego agregar:
Antisuero Anti - IgA 80 ul

destilada.
- Calcular la diferencia de absorvancia (Delta A= DO2 – DO1) para cada
- Representar en papel milimetrado las diferencias de absorvancia Delta A en
función de la concentración en mg/dl (g/L) del Calibrador Proteinas.
BUFFER Ig A 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia a 340 nm (DO1) llevando el aparto a

cero con agua destilada. Luego agregar:
ANTISUERO Anti - IgA 80 ul


destilada
CALCULOS DE LOS RESULTADOS

correspondiente a cada muestra analizada.
- Interpolar esta Delta A en la curva de calibración para determinar la
concentración en mg/dl (g/L) correspondiente a la muestra estudiada.
- Las muestras con absorvancias superiores a la del calibrador proteínas
nivle alto deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas
nuevamente.
- Multiplicar el resultado obtenido por dos.
- 70 – 400 mg/dl (0.7 – 4.0 g/L)
- En el caso de muestras con características clínicas no definidas deberá

de antígeno, como ocurre en las gammapatias..
Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una cuagulacion
removidas por centrifugación antes de proceder a su ensayo
PERFORMANCE
- Rango dinamico: se pueden obtener valores entre la concetracion de

calibrador mas baja y mas alta de la curva de calibración (alrededor de 600
mg/dl).

RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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CUANTITATIVA DEL COMPONENTE C4 DEL COMPLEMENTO
INTRODUCCION
El C4 es una beta – 1 – proteína componente del complemento. Niveles bajos en

suero se asocian con lupus sistémico, enfermedades hereditarias e infecciones a
repetición.
FUNDAMENTO
La proteína C4 del complemento reacciona con el anticuerpo especifico anti – C4

formando inmunocomplejos insolubles. La turbidez provocada por estos
inmunocomplejos es proporcional a la concentración de C4 en la muestra y puede
medirse espectrofotométricamente.
REACTIVOS
- Antisuero Anti – C4: anticuerpo monoespecifico anti C4.

- Buffer C4: solución fisiológica tamponada, pH 7.35
PRECAUCIONES
- Los reactivos son para uso in vitro
capaces de transmitir infección
MUESTRA
- Suero o plasma heparinizado

o Recoleccion: obtener la muestra de la manera usual
o Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se
recomienda no emplear niveles en exceso de haparina como
anticoagulante.
o Sustancias interferentes conocidas: no emplear sueros hemolizados,
muy ictéricos, lipemicoa o con restos de fármacos.
o No se observan interferencias por bilirrubina hasta 20 mg/dl,
triglicéridos hasta 500 mg/dl, ni hemoglobina hasta 10 g/dl.
MATERIALES
- Espectrofotometro
- Micropipetas y pipetas de volumen variable

- Reloj Cronometro.
- Longitud de onda: 340nm

- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (25ºC. El control de la
temperatura no es critico, pudiendo oscilar entre 22 y 30 ºC
PROCEDIMIENTO
- Realizar en tubos de Kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica,

del calibrador Proteinas nivel alto: 1.10, 1:20, 1:40, 1:80, y 1:160,
empleando solución fisiológica como punto cero
CALIBRADOR PROTEINAS DILUIDO 150 UL

BUFFER C4 900 ul

llevando el aparto a cero con agua destilada.
- Luego agragar:
ANTISUERO Anti – C4 120 ul

destilada.
- Calcular la diferencia (Delta A = DO2 – DO1) para cada dilución del
Calibrador Proteinas, incluyendo el punto cero.
- Representar en papel milimetrado las diferencias de absorvancia (Delta A =
DO2 – DO1) en función de la concetracion en mg/dl (g/L) del calibrador
proteínas.

BUFFER C4 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia a 340 nm (DO1) llavando el aparto a

- Luego agregar:

- Mezclar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente

destilada.

correspondiente a cada muestra analizada. Interpolar esta diferencia (Delta
A) en la curva de calibración para determinar la concentración en mg/dl
correspondiente a la muestra.
- Las muestras con absorvancia superiores a la del calibrador proteínas nivel
alto, deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas
nuevamente. Multiplicar el resultado obtenido por dos
10 – 40 mg/dl (0.1 – 0.4 g/L)
- La turbidez y la presencia de partículas en las muestras, pueden interferir

con la prueba.
- Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una coagulación
incompleta, o de una desnaturalización de las proteínas, deben ser
- Las muestras que presentan absorvancias superiores al calibrador mas alto
de la curva de calibración, deberán ser diluidas y ensayadas nuevamente.
- La concentración de C4 para dichas muestras se obtiene multiplicando el
resultado obtenido por el factor de dilución correspondiente
PERFORMANCE
- Rango dinamico: se pueden obtener valores entre la concnetracion de

mg/dl)
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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CUANTITATIVA DEL COMPONENTE C3 DEL COMPLEMENTO
INTRODUCCION
El C3 es una Beta – 2 proteina que constituye el componente central de la via

clásica y de la alternativa del complemento.
Se comporta además como una proteína de fase aguda, por lo tanto, niveles
sericos aumentados se realacionan con enfermedades inflamatorias agudas.
Niveles sericos disminuidos se observan en enferemdades autoinmunes,
glomerulonefritis, deficiencias congénitas.
FUNDAMENTO
La proteína C3 del complemento reacciona con el anticuerpo especifico anti – C3

formando inmunocomplejos insolubles. La turbidez provocada por estos
inmunocomplejos es proporcional a la concnetracion de C3 en la muestra y puede
medirse espectrofotométricamente.
REACTIVOS
- Antisuero anti – C3: anticuerpo monoespecifico anti – C3

- Buffer C3: solución fisiológica tamponada, pH7.35
PRECAUCIONES
- Los reactivos son para uso in vitro

capaces de transmitir infección
MUESTRA

o Recoleccion: obtener la muestra de la manera usual
o Aditivos: en caso que la muestra a emplear sea plasma, se
recomienda no emplear nuveles en exceso de heparina como
anticoagulante.
o Sustancias interferentes: no emplear sueros hemolizados, muy
interferencias por bilirrubina hasta 20 mg/dl, triglicéridos hasta 25
g/L, ni hemoglobina hasta 10 g/dl

MATERIALES
- Espectrofotometro
- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados
- Tubos de kahn o hemolisis
- Reloj Cronometro
- Longitud de onda: 340 nm

- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (25ºC). El control de la
temperatura no es critico, pudiendo oscilar entre 22 y 30 ºC
PROCEDIMIENTO
- Realizar en tubos de Kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica,

del Calibrador Proteinas nivel alto: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160,

BUFFER C3 900 ul

llevando el aparto a cero con agua destilada.
- Luego agragar:

destilada.
- Calcular la diferencia (Delta A = DO2 – DO1), para cada dilución del
Calibrador Proteinas, incluyendo el punto cero.
- Representar en papel milimetrado las diferencias de absorvancia (Delta A =
DO2 – DO1), en función de la concentración en mg/dl (g/L) del Calibrador
Proteinas.

- Realizar diluciones 1:10 de las muestras en solución fisiológica
BUFFER C3 900 ul
- Homogenizar y leer la absorvancia a 340 nm (DO1) llevando el aparto a

cero con agua destilada
- Luego agregar:

destilada.

correspondiente a cada muestra analizada. Interpolar esta diferencia (Delta
A) en la curva de calibración para determinar la concentración en mg/dl
correspondiente a la muestra.
- Las muestras con absorvancia superiores a la del calibrador proteínas nivel
alto, deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas
nuevamente. Multiplicar el resultado obtenido por dos
90 – 180 mg/dl (0.9 – 1.8 g/L)
- La turbidez y la presencia de partículas en las muestras, pueden interferir

con la prueba.
- Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una coagulación
incompleta, o de una desnaturalización de las proteínas, deben ser
- Las muestras que presentan absorvancias superiores al calibrador mas alto
de la curva de calibración, deberán ser diluidas y ensayadas nuevamente.
- La concentración de C3 para dichas muestras se obtiene multiplicando el
resultado obtenido por el factor de dilución correspondiente

PERFORMANCE
- Rango dinamico: se pueden obtener valores entre la concnetracion de

mg/dl)
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES
FUNDAMENTO.- Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que el
individuo entra en contacto con el medio ambiente y en el cual se encuentran
microorganismos como algunas bacterias coliformes que contienen sustancias
qumicas en su estructura parecidas a las de este sistema. Por anticuerpos
regulares debemos identificar a los que existen en todos los individuos y que estos
tendrán durante toda la vida.
Los anticuerpos irregulares son los que no están de esa manera, aunque en el
caos de los anturales no se conoce a ciencia cierta que o como se induce su
producción. Los adquiridos se conocen también como inmunes y son el resultado
de la exposiscion a antígenos desconocidos por el individuo al momento de la
transfusión o en las mujeres por el embarazo; estos anticuerpos son dirigidos
contra antígenos de sistemas diferentes al ABO.
Los anticuerpos naturales regulares son preferentemente inmunoglobulinas M, las

cuales fijan de manera tan eficiente el complemento que pueden provocar lisis
intravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso la muerte del paciente. Los
anticuerpos adquiridos o inmunes son generalmente inmunoglobulinas G, las
cuales producen hemolisis extravascular en el bazo o en el hígado mediante
fagocitosis del complejo eritrocitario mas anticuerpo.
Los anticuerpos irregulares (adquiridos) mas comunes en nuestra población son

los que involucran a los sistemas MNSs, P1, Kidd (Jka, Jkb), Duffy (Fya, Fyb),
Lewis y Diego.
OBJETIVO
Identificacion del anticuerpo irregular a través de las diferentes tecncas.
MATERIALES
- 10 tubos de ensayo
- 10 pipetas pasteur
- 1 gradilla
- 1 bulbo
- Papel parafim
EQUIPOS
- Microcentrifuga
- Baño Maria o Estufa

MATERIAL BIOLOGICO
- Globulos rojos lavados al 3 – 5 %

- Suero
REACTIVOS
- Suero de coombs
- Albumina bovina
- Solucion Salina
- Solucion de Liss
TECNICA SOLUCION SALINA
- Lavar los eritrocitos con solución salina (3 veces)
SALINA RAPIDA
- Agregar una gota de eritrocitos lavados.

- Diluirlo al 3-5% con solución salina 0.9%
- Agregar 2 gotas de suero.
- Centrifugar y observar, anotar desprendimiento del botón.
SALINA 37ºC BAÑO MARIA
- Incubar tubos a Baño maria a 37ºc durante 1 hora (o 20 min).

- Centrifugar después de haber pasado el tiempo.
- Desprender el botón de eritrocitos y observar.
AGLUTINACION – No es compatible
NO AGLUTINACION – Lavar 3 veces.
TECNICA LISS
- Poner dos gotas de LISS en cada tubo, agragar una gota de eritrocitos
lavados y al 3 – 5 %, según el numero de tubo correspondiente.
- Mezclar y centrifugar un minuto, decantar el sobrenadante y con la ayuda
de una gasa limpiar el exceso del reactivo.
- Poner nuevamente 2 gotas de LISS, resuspender, por agitación, agragar 2
gotas de suero problema, mezclar, incubar 15 minutos a 37ºc. Centrifugar
30 seg. a 1000 r.p.m.
- Anotar los resultados
A las pruebas negativas realizar Coombs:

- Lavar 3 veces las células, agragar suero de Coombs centrifugar 30 seg.

- Leer aglutinaciones y anotar resultados.
TECNICA ALBUMINA BOVINA
- Agregar 2 gotas de albumina al 22 %.

- Centrifugar 20 segundos
- Observar aglutinación o hemolisis, o o no aglutinación
- A los tubos con lecturas negativas, incubar 20 minutos en baño maria a
37ºC
- Centrifugar y observar:
Aglutinacion o hemolisis: reportar incompatible
No aglutinación: llevar a Coombs.
- Lavar tres veces, decantar y quitar el exceso de salina con gasa y agregar 2
gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20 segundos y observar:
Aglutinacion o hemolisis: reportar incompatible.
No aglutinación: reportar compatible.
RESULTADOS E INTERPRETACION DE RESULTADOS
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ANTICUERPOS IRREGULARES: Anticuerpo c.
Interpretacion
Estos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo M y ocasionalmente
tipo G, y debido a esa temperatura de reacción carecen de importancia clínica
salvo que su reacción ocurra también a 37ºC, su importancia radica en pacientes
que seran intervenido a 22 ºC como es el caso de operación de corazón.
Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura optima de reacción a

37ºC a estos anticuerpos tienen una relevante importancia clínica ya que se les
asocia con reacciones transfusionales de intensidad moderada a severa, que
pueden ocasionar la muerte
CONCLUSION
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PRUEBA DE COMPATIBILIDAD
INTRODUCCION
Para requerir una optima transfusión actualmente se requeire de aceptaciones

inmunológicas receptor - donante, ya que la transfusión de sangre o la de sus
componentes celulares de un donante a un receptor es una forma de transplante.
La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia de anticuerpos no

aglutinantes en el suero de sujetos sensibilizados a uno o mas antígenos
sanguíneos. Es útil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacion
materno – fetal y se emplea también en otro tipo de pruebas como identificación
de anticuerpos autoinmunes, detección de algunos sistemas sanguíneos y
pruebas de compatibilidad sanguínea.
La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normales incubados in vitro con el

suero de estudio. Durante este periodo, si existe un anticuerpo, este se fija sobre
su respectivo determinante antigénico. Una vez fijados, los eritrocitos son
igualmente lavados y se agrga el reactivo de Coombs, produciendo agluitnacion.
Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que existe anticuerpos libres en
el suero de la persona, los cuales puede ser igualmente auto – anticuerpos o
isoanticuerpos.
MATERIALES Y EQUIPOS
- Pipetas automaticas de 10, 25, 50 microlitro y 1 ml.

- Puntas de pipetas desechables.
- Tubos de vidrio.
- Incubadora para tarjetas DG Gel.
- Centrifuga para tarjetas DG Gel
MATERIAL BIOLOGICO
- Hematies reactivo para investigación e identificación de anticuerpos

irregulares de Diagnostic Grifols, S.A.
- Suero de hemoclasificacion.
- Muestras de sangre de extracción reciente, recogida con anticuagulante o
sin anticoagulante.
- Tarjetas DG Gel
- DG Gel Sol.

REACTIVOS
- Tarjetas DG Gel Coombs

- DG Gel sol.
TECNICA
METODO MANUAL
- Dejar atemperar (18 - 25ºc) muestras y reactivos

- Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar
- Identificar las tarjetas y muestrasa utilizar
- Despegar con precaucion la lamina de metal que cubre los microtubos para
prevenir contaminaciones cruzadas entre ellos.
- Preparar una suspensión con hematíes al 1% en DG Gel sol (10 microlitros
de sedimento o concentración de hematíes en 1 ml de DG Gel Sol). Utilizar
los hematíes del donante para la PC mayor y hematíes del receptor para la
PC menor. Asegurar la suspensión de los hematíes antes de utilizar.
- Dispensar en el tubo correspondiente, 50 microlitros de suspensión de los
hematíes al 1 % del donante (PC mayor) o 50 microlitros de suspensión de
los hematíes al 1 % del receptor (PC menor).
- Añadir 25 microlitros de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25
microlitros de suero o plasma del donante (PC menor).
- Preparar auto control con 50 microlitros de suspensión de los hematíes al 1
% del receptor y 25 microlitros de suero o plasma del receptor.
- Incubar 15 minutos a 37ºC
- Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel.
- Leer los resultados
INTERPRETACION
Negativo - Banda de hematíes en el fondo de la columna sin aglutinación visible

Positivo +/- Escasos aglutinados de pequeño tamaño en la mitad inferiror de la
columna
Positivo 1+ Algunos aglutinados de pequeño tamaño en la columna
Positivo 2+ Aglutinados de tamaño pequeño o mediano a lo largo de la columna
Positivo 3+ Banda superior de aglutinados, de tamaño mediano en la mitad
superior de la columna
Positivo 4+ Banda de hematíes aglutinados en la parte superior de la columna
DP Doble población (doble banda de hematíes, en el fondo y en la parte
superior de la columna

RESULTADOS
Paciente: Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)
Donador 1 : Orea Valero Erasmo (A+)

Donador 2: Moreno Adolfo (O+)
M1 m1 M2 m2 Autocontrol
GR de GR del GR de GR del GR del
donador 1 + paciente + donador 2 + paciente + paciente +
suero del suero de suero del suero de suero del
paciente donador 1 paciente donador 2 paciente
- + - + -
Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar
eritrocitos al paciente (AB+), lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle
eritrocitos; no asi plasma por parte de ambos donadores pues la prueba que hubo
reacción en ambas pruebas menores.
RESULTADOS
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CONCLUSIONES
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ANTÍGENO DE SUPERFICIE PARA HEPATITIS B
INTRODUCCIÓN.- El virus de la hepatitis B de 42 nm de diámetro presenta una

doble cubierta externa y una parte central o core.
La detección antígena de superficie HbsAg se lo realiza en los últimos días del

periodo de incubación y en los primeros días del periodo de estado de hepatitis B
aguda. Aunque en la mayoría de los casos desaparecerá a las 3 o 4 semanas del
comienzo clínico de la enfermedad, en muchos pacientes persiste durante meses,
años o de por vida (portadores).
FUNDAMENTO.- Reacción antígeno anticuerpo mediante prueba rápida para la

detección de antígeno de superficie de hepatitis B, por prueba de difusión con
formación complejo conjugado coloreado.
MATERIALES
Taco de prueba rápida

Suero
Cámara oscura
Gotero
Timer
Baño maria
Micro pipetas
PROCEDIMIENTO
Toma de muestra: tomar una muestra venosa (sangre)

Llevar a Baño María durante 10 minutos
Separar el suero en tubo de hemolisis
Prepara el taco de prueba rápida
Introducir tres gotas de suero en el pocillo circular del taco de prueba rápida
Llevar a la cámara oscura durante 10 minutos
RESULTADOS
Observar la formación de líneas en el taco de prueba rápida.
La formación de una línea de control significa prueba negativa

La formación de dos líneas indica prueba positiva para antígeno de superficie de
hepatitis B

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CONCLUSIONES
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PRUEBA DE DETECCIÓN DE HEPATITIS C
INTRODUCCIÓN.- La hepatitis C es una de las hepatitis mas virulentas junto con

la hepatitis B. de origen viral y que sus manifestaciones clínicas son similares que
una hepatitis B y muchas veces confundida.
Su detección es muy importante especialmente en personal de salud por su gran

predisposición de infectarse en sus centros de trabajo.
FUNDAMENTO.- Prueba rápida de reacción antígeno anticuerpo con formación de

reacción de solución conjugada y formación de complejo coloreado.
MATERIALES
Taco de prueba rápida

Suero
Gotero
Baño María
Cámara oscura
Solución conjugada
Micro pipetas
PROCEDIMIENTOS
Muestra: tomar una muestra de sangre venosa

Llevar a Baño María durante diez minutos
Separar el suero correspondiente en un tubo de hemolisis
Con un gotero sacar suero
Depositar tres gotas en el pocillo del taco de prueba rápida para hepatitis B
Esperar la difusión de la muestra durante un tiempo de un minuto y medio
Introducir cuatro gotas de solución de conjugado
Llevar a cámara oscura durante un tiempo de 15 minutos
Sacar de cámara oscura y proceder a la lectura correspondiente
RESULTADOS
La lectura del taco de prueba rápida se lo realiza de la siguiente manera:
La formación de un punto coloreado que va de una intensidad de color de rosado

a rojo indica una prueba positiva.
La no formación de ningún punto coloreado y una difusión sin la formación de
ningún punto indica prueba negativa para hepatitis C
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CONCLUSIONES
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DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO EN EL SISTEMA RH - HR
INTRODUCCIÓN.- la existencia del sistema Rh fue reconocida por primera vez a

través de dos descubrimientos simultáneos, pero independientes: uno referente a
los anticuerpos humanos y el otro referente a los anticuerpos animales.
El primero fue la descripción realizada por Levine y Stetson 1939 de un anticuerpo
encontrado en el suero de un paciente que tuvo una reacción transfusional
hemolitica al serle infundida sangre de su esposo.
El matemático Fisher, trabajando con datos serologicos, propuso un modelo de 3

locus unidos tan estrechamente en el cromosoma. Estos locus fueron
denominados C, con un alelo c; E con unn alelo e; y D con un alelo d
Un fenotipo puede considerarse como la suma total de antígenos detectados en
los hematies por antisueros seleccionados
FUNDAMENTO consiste en observar la presencia o ausencia de los antígenos

C,c,E,e,D. con la utilización de antisueros específicos.
La prueba puede ser realizada en tubo o en placa.
Se utiliza para cada uno de ellos la misma técnica para cada determinación
valiéndose de los distintos sueros: Anti-C, Anti-c, Anti-E, Anti-e, Anti-D.
MATERIALES
Glóbulos rojos lavados

Tubos de hemolisis
Centrifugadora
Baño maria
Anti sueros C,c,E,e,D
Micropipetas
TÉCNICA
Técnica en Tubo
- Identificar (nombre y numero) en un tubo y anotar el reactivo a utilizar:

(c,c,E,e,D)
- Colocar una gota de suero anti C u otro en el tubo
- Agregar dos gotas de suspensión globular al 2%
- Incubar la mezcla durante 15 minutos a 37ºC
- Centrifugar a 3500 rpm durante un minuto
- Resuspender suavemente el botón de glóbulos , observando la presencia o no
de los grumos característicos de la aglutinación.

TÉCNICA EN PLACA
- Colocar en la placa una gota de suero anti - C u otro

- Poner al lado de la gota de suero una gota de sangre total y aparte otra gota de
sangre total sola, como "gota testigo".
- Con una varilla mezclar la primera gota de sangre con el suero anti -C u otro y
extender la mezcla en una superficie de 2 x 2 cm. y con una varilla extender de
la misma forma la gota de sangre sola.
- Colocar la placa sobre un visor para fuente de luz y calor.
- Oscilar la placa en forma antero - posterior observando si aparece o no la
aglutinación. Comparar con la gota testigo que no debe aglutinar en ningún
caso.
RESULTADOS
La formación de aglutinación con los diferentes Anti sueros (C,c,E,e,D), nos indica
la presencia de los antígenos.
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CONCLUSIONES
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Bibliografía
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ed Barcelona: Salvat Edit 1987.
2. Edwards MS, Baker CJ. Pinciples and Practice of Infections Diseases 2 nd Ed

New York; 1985.
3. Aguilera A, Gonzales M, de Hidalgo, Estudio sobre inmunidad, Biomedica

1981.
4. Balcells A. La Clinica y el Laboratorio. Mexico Editorial Salvat; 1989.
5. Campuzano M German. Temas de Laboratorio. Medellin 1987.
6. Todd, Sanford, Davidsohn. Diagnostico y Tratamientos Clinicos por el

Laboratorio 8ª Ed Ed. Barcelona: Salvat Editores 1987.
7. Gordon LB lo esencial de la inmunología. Mexico Edit. Manual Moderno;

1981.
8. Henry JB Tovar HR Inmunología e inmunopatologia En Todd - Sanford -

Davidsohn, eds. Edit Salvat; 1084.

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Carrera de Bioquímica Farmacia U.N.S.

UNIVERSIDAD NACIONAL SIGLO XX

Docente: Dr Grover Lopez Zabala

Catavi - Llallagua – Potosi

Dr. Grover López Z. 1

PRUEBA DE AGLUTINACION EN PLACA PARA LA DETERMINACION DE

La proteína C Reactiva (PCR) es una proteína termolábil que no atraviesa la

La PCR se encuentra comúnmente aumentada en: artritis reumatoidea activa,

- Reactivo de latex: suspensión de partículas de latex- poliestireno

PRECAUCIONES Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

Dr. Grover López Z. 2

- La aglutinación del reactivo de latex es indicio de deterioro del mismo

- Suero.- Obtener de la manera usual. No deben usarse muestras inactivadas

 Placa de vidrio fondo negro

- Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.

Tecnica de Titulacion Semi Cuantitativa

Dr. Grover López Z. 3

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Lectura de Técnica Cualitativa

Negativo: Se presenta como una suspensión homogénea uniforme.

Lectura de Tecnica Semicuantitativa

Titulacion: Se calcula a partir de la inversa de la máxima dilución a la que se

La concentración aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada

PCR (mg/L) = Titulo x Sensibilidad de la reacción (6 mg/L)

Ejemplo: la muestra presenta un titulo de 1:2. Su concnetracion de PCR es

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Procesar simultáneamente el control Negativo y el Control Positivo

- Para la técnica cualitativa: Negativo si no presenta aglutinación, positivo

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

- Susutancias interferentes conocidas en muestra.

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Sensibilidad: detecta 6 mg/L de proteína C reactiva

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PRUEBA DIRECTA DE AGLUTINACION EN PLACA PARA EL DIAGNOSTICO

INTRODUCCION.- La artritis reumatoidea es un síndrome crónico de etiología de

FUNDAMENTO DEL METODO

El factor reumatoideo del tipo IgM se detecta en presencia de gamma –

Reactivo Latex; suspensión de partículas de latex –poliestireno de 0,20 micrones

PRECAUCIONES Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

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Suero.- Obtener de la manera usual. No deben usarse muestras inactivadas por

 Placa de vidrio fondo negro

Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.

- En uno de los posillos delimitados de la placa de vidrio, colocar:

- A los tres posillos tanto a la muestra, control positivo, control negativo

Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en 6 tubos de

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INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Negatiov: Suspension homogénea

Titulo: Inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible

La concentración aproximada de factor reumatoideo en la muestra puede ser

FR(UI/ml) = Titulo x Sensibilidad de la reacción (1 UI/ml)

Ejemplo: la muestra presenta un titulo de 1:40. Su concentración en FR es

CONTROL DE CALIDAD DEL METODO

- Procesar simultanemente los controles provistos o sueros probadamente

- Se considera patológicos valores superiores a 20 – 30 UI/ml en el método

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

- Cualquier substancia extraña produce alteración en la reacción..

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Sensibilidad y Especificidad Analitica.- Se encuentra una sensibilidad de 1 UI/ml.

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