Práctico Nº 2:

MICROSCOPÍA

Introducción Existen dos factores importantes en

La evolución de una ciencia
generalmente se desarrolla en paralelo a la
invención de instrumentos que extiendan
los sentidos humanos hasta nuevos
límites. Desde la invención del
microscopio en el siglo VII hasta nuestros
tiempos en la actualidad se ha logrado
progresar considerablemente en el estudio
de la célula. Los primeros microscopios
usados por científicos renacentistas eran
MICROSCOPIOS DE LUZ.
Sin embargo, los microscopios de
aquella época eran considerados simples,
debido a que tenían un solo lente, como en
las lupas; en los actuales se alcanza una
mayor magnificación con un sistema de
dos lentes, y por ello se denominan
compuestos. En estos microscopios de luz,
la luz visible pasa a través de lentes de
vidrio. Las lentes refractan (cambian de
dirección) la luz de tal modo que la
imagen de la muestra se magnifica al
llegar al ojo humano, permitiendo
observar objetos que escapan al límite de
su resolución.
En esta actividad de laboratorio,
usted se familiarizará con el microscopio,
y luego observará diversos organismos
mientras aprende el uso apropiado de este
instrumento básico y esencial para un /a
biólogo/a celular, histólogo/a o patólogo/
a.
microscopía y son: MAGNIFICACIÓN y
RESOLUCIÓN.
Estos factores pueden ser descritos
como:
MAGNIFICACIÓN (o aumento): se
define como las veces que un objeto se
agranda respecto a su tamaño real.
RESOLUCIÓN: es una medida de la
distancia mínima que existe entre dos
puntos para ser distinguidos como dos
puntos separados.
Por ejemplo, lo que pareciera ser una
estrella cuando se mira al cielo puede ser
en realidad dos estrellas si se observa con
ayuda de un telescopio. Por lo tanto, el
telescopio tiene mayor capacidad de
resolución. Sin embargo, así como el ojo
humano es limitado, el poder de
resolución de un microscopio o telescopio
también es limitado.
Los microscopios pueden diseñarse
para magnificar objetos tanto como sea
posible pero, la luz del microscopio nunca
podrá resolver detalles más finos que 0.2
!m, como el tamaño de una pequeña
bacteria o de una mitocondria. Esta
resolución no se puede mejorar, está
limitada por la LONGITUD DE ONDA DE
LA LUZ VISIBLE usada para iluminar la
muestra. Los microscopios de luz sólo
pueden magnificar objetos efectivamente
hasta 1500 veces, más magnificación

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implicaría que el objeto se viera borroso.
Lo que se ha ido mejorando en
microscopía de luz es el CONTRASTE de
aquellos objetos que puedan ser resueltos
por el microscopio en uso.
La mayoría de las estructuras
subcelulares, u organelos, son muy
pequeños para ser resueltos con el
microscopio de luz.
La biología celular avanzó
rápidamente desde la década del
cincuenta con la introducción del
microscopio electrónico. En vez de usar
luz visible, el MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO enfoca un haz de
electrones a través de la muestra (objeto).
Los microscopios electrónicos modernos
pueden alcanzar una resolución de
aproximadamente 0.2 nanómetros (nm),
mil veces mejor que el microscopio de luz.
Los/as biólogos/as usan el término
ULTRAESTRUCTURA CELULAR para
referirse a la anatomía celular resuelta por
un microscopio electrónico. Una foto
obtenida con un microscopio de luz se
llama FOTOMICROGRAFÍA, y una foto
que resulte del microscopio electrónico se
llama MICROGRAFÍA ELECTRÓNICA
DE TRANSMISIÓN o de BARRIDO según
sea el microscopio electrónico que se
utilice.
Existen dos tipos de microscopio
electrónico: el MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN
(TEM) y el MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM).
El TEM dirige un haz de electrones
a través de una sección muy delgada de la
muestra, similar a lo que sucede en un
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microscopio de luz. Sin embargo, en vez
de usar lentes de vidrios, los cuales son
opacos a los electrones, el TEM usa
electroimanes. Los electroimanes actúan
como lentes que enfocan y magnifican la
imagen cambiando la dirección de los
electrones cargados. La imagen
últimamente se enfoca en una pantalla
para examinarla o en un film fotográfico
para tener un registro permanente. Para
aumentar el contraste en la imagen,
secciones muy delgadas de la muestra se
tiñen con átomos pesados de metales, los
cuales se adhieren a ciertos lugares en las
células. Los/as biólogos/as celulares usan
el TEM principalmente para estudiar la
ultraestructura interna de las células.
El SEM es especialmente útil para el
estudio detallado de la superficie de la
muestra. El haz de electrones cubre (o
barre) la superficie de la muestra, la cual
generalmente está recubierta con una
pequeña lámina de oro. El haz de
electrones excita electrones sobre la
superficie de la muestra, y estos electrones
secundarios se colectan y se enfocan en
una pantalla, formando una imagen de la
topografía de una muestra. Un atributo
importante del SEM es su gran
profundidad de penetración, la cual
resulta en una imagen tridimensional.
El microscopio electrónico revela
muchos organelos, imposible de resolver
con el microscopio de luz. Sin embargo, el
microscopio de luz ofrece muchas
ventajas, especialmente para el estudio de
células vivas. Una desventaja del
microscopio electrónico es que los
métodos químicos y físicos usados para
preparar la muestra no sólo mata células,
sino que también introduce artefactos,
estructuras físicas que se ven en la
micrografía que no existen en la célula
viva.
En este laboratorio usaremos el
microscopio compuesto. Las principales
partes de un microscopio compuesto son:
Sistema Mecánico
a. Pie: es la base de sustentación.
b. Columna: es la región articulada del pie.
c. Platina: es la plataforma horizontal que
sustenta a la preparación.
d. Tubo: contiene en su extremo superior
la lente ocular y en el inferior el objetivo.
e. Revólver o tambor: pieza giratoria que
contiene los objetivos.
f. Tornillos de focalización: al rotarlos
cambian el enfoque del microscopio, lo
cual lo logran variando la distancia entre
el objetivo y la platina. Existen dos
movimientos, macrométrico (enfoque
aproximado y grueso), micrométrico
(enfoque de precisión).
Sistema de iluminación
a. Fuente luminosa: esta puede ser natural
o artificial. Si es natural se utiliza un
espejo de cara plana. Si es artificial puede
o no haber espejo, si hay espejo se utiliza
por el lado cóncavo.
b. Condensador: dispositivo formado por
un sistema de lentes que concentra los
rayos luminosos en la muestra. Su mayor
utilidad la presta cuando se encuentra a
una distancia de 2 cm aprox. de la
muestra. Ubique el mejor punto por
ensayo y error.
c. Diafragma: está posicionado en el
condensador y sirve para regular la
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cantidad de luz que llega a la preparación.
Su diámetro se puede variar por medio de
una placa horizontal que se cierra o abre a
voluntad del operador.
d. Anillo porta filtro: generalmente se
utiliza un filtro de color verde pues así
descansa más la vista. La longitud de onda
modificada con el uso del filtro influye en
la resolución del microscopio.
Sistema de amplificación
a. Lentes oculares: son sistemas ópticos
ubicados en la parte superior del tubo,
próximo al ojo del observador. Los
oculares están formados por dos lentes
planas, convexas, simples o compuestas
separadas por un diafragma interno. El
lente inferior se llama lente de campo, su
propósito no es aumentar la imagen sino
recoger la mayor cantidad de rayos
divergentes que vienen del objetivo. Este
tiene su foco en el diafragma y ahí la
imagen es aumentada por la parte
superior. Los oculares más usados tienen
un aumento de 6X, 8X, 10X, 16X y 20X.
b. Lentes objetivos: sistemas de lentes
acomodadas en el revólver. En el objetivo
está inscrita la magnificación y la apertura
numérica, el aumento de estos varían entre
4X, 10X, 40X y 100X (inmersión).
En este práctico de laboratorio
solamente ocuparemos lentes oculares con
un aumento proporcionado de 10X.
 Capacidades del microscopio
El microscopio compuesto tiene la
capacidad de magnificar una imagen. El
Aumento Total (AT) se calcula
multiplicando el aumento del objetivo por
el aumento del lente ocular mediante la
fórmula:
AT = A. objetivo x A. ocular
Pregunta 1. Calcule el aumento de su
microscopio compuesto si el objetivo tiene
una magnitud de 10X y el ocular también
El Poder de Resolución (d) expresa
la capacidad de un sistema óptico de
discriminar detalles muy finos, de
distinguir o resolver dos puntos muy
cercanos entre sí.
El Poder de resolución de un
objetivo depende tanto de la longitud de
onda del rayo luminoso utilizado y la
apertura numérica del sistema óptico del
objetivo, el PR se expresa mediante la
fórmula de Abbé :
d =(0,61 x 𝜆 ) / AN
El resultado de esta operación se
denomina límite de resolución que
representa el valor matemático de la
menor distancia que debe existir entre
estos dos puntos para que sean
visualizados como unidades separadas.
Para la fórmula anterior el valor
0,61 es una constante que depende de
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factores como la coherencia de la luz,
criterio de visibilidad y naturaleza del
objeto, la constante de Abbé se multiplica
por el símbolo lambda 𝜆 que corresponde a
la longitud de onda del haz de luz visible
que penetra a través de la muestra y el
resultado de esta operación es dividido
por la abertura numérica (AN) que es la
medida que indica la capacidad que posee
la lente objetiva de poder captar los rayos
refractados que emergen del objeto
(muestra) se define matemáticamente
como la resultante de la multiplicación del
seno de la mitad del ángulo de abertura
de la lente (alpha) por el índice de
refracción (n) del medio a través del cual
atraviesa la luz.
AN = n (sen 𝞪)
10X/ 0,22
𝞪
Fig. 1. Esquema del ángulo alpha en el ángulo de
apertura en un lente objetivo.
El índice de refracción (n) es la
relación existente entre la velocidad de la
luz (300.000 km/s) y su velocidad en el
medio transparente utilizado
 En microscopía se utilizan objetivos
de inmersión que emplean medios de
mayor índice de refracción, con el
propósito de aumentar la abertura
numérica, por ende en un lente de AN
baja, los índices de refracción del
portaobjeto, cubreobjetos y del aire
provocan un desvío mayor de la luz
incidente, es por este motivo que al
colocar un medio de mayor índice de
refracción, como es el aceite de inmersión,
entre el portaobjeto y la lente frontal, se
neutraliza el efecto de la refracción de la
luz desviando en menor proporción la luz
visible permitiendo que la lente fontral
capte una mayor cantidad de rayos
luminosos obteniéndose una imagen de
mayor nitidez.
M
D F
Lente
n =1,00 n =1,52
aire aceite
Portaobjeto n =1,52
E M’ A
Fig.2. Ángulos de abertura del portaobjeto y de la
lente
Ondas electromagnéticas
Las ondas electromagnéticas son
aquellas que no necesitan un medio
material para poder propagarse, entre
ellas se incluye las ondas de luz visible, los
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rayos gamma, rayos x, ultravioleta, entre
otros. La luz visible dependiendo de sus
componentes varía en longitudes de onda
desde el violeta (400 nm), el verde (500
nm) hasta el rojo (700 nm), sin embargo la
longitud de onda de la luz incorporando
todos sus componentes en el vacío es de
589 nm.
El índice de refracción de algunos
materiales/sustancias son:
Material/sustancia n
Aire 1 atm, 0º C 1,00029
Aire 1 atm, 15º C 1,00029
Agua 1,3330
Fluorita 1,4340
Aceite castor 1,5150
Vidrio 1,5200
Flint 1,6600
Tab.1. Índices de refracción medidos con luz de
una longitud de onda en el vacío (589 mn)
Pregunta 2. ¿Cuál de los dos medios (aire
o aceite) resultará en un mejoramiento de
la imagen dada por el microscopio?
Pregunta 3. Si la longitud de onda de luz
visible en el vacío tiene un valor de 589
nm y la apertura numérica del objetivo es
1,25, ¿Cuál es el Poder de Resolución (d)
del microscopio compuesto?
La velocidad de la luz viaja a
300,000 Km/seg en el aire pero al
atravesar un medio transparente como el
vidrio del cual están fabricados las lentes
de los microscopios, su velocidad se
reduce a 200,000 km./seg, por lo tanto el
vidrio tendrá un índice de refracción de
1.5; pues el índice de refracción de un
objeto o una sustancia transparente se
expresa mediante la fórmula:
n = velocidad de la luz en el aire
velocidad de la luz en el medio
Pregunta 4. ¿Qué sistema microscópico
tendrá un mejor poder de resolución, un
sistema con d= 200 nm o uno con d= 300
nm ?
Pregunta 5. Si el índice de refracción de
aceite castor es 1,515, calcule la velocidad a
la cual la luz atraviesa este medio.
El microscopio también tiene la
capacidad o poder de definición, es decir
de proporcionar imágenes nítidas y
contornos definidos y finalmente, tiene
poder de penetración o de visualización
de los diferentes planos de una
preparación.
Tipos de microscopios
Microscopio simple o de lupa: lente
biconvexa capaz de formar una imagen
aumentada de un objeto colocado en su
distancia focal. Los rayos luminosos
reflejados en el objeto atraviesan la lente y
forman una imagen aumentada, virtual,
derecha del objeto. para obtener el
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aumento lineal se utiliza la siguiente
expresión matemática
Aumento lineal = longitud lineal
longitud objetivo
Microscopio compuesto: comprende tres
sistemas de lentes convergentes formados
por el condensador, objetivo y ocular. Los
rayos luminosos refractados cada uno de
los sistemas de lentes forman una imagen
aumentada, invertida y virtual con
relación al objeto.
Microscopio de luz polarizada:
microscopio utilizado en el estudio de
membranas, fibras, cristales, ya que, puede
proporcionar antecedentes de su
estructura físicoquímica.
Microscopio de luz ultravioleta: utiliza
luz UV (300 - 400 nm), y el poder de
resolución aumenta. Los lentes ópticos
deben ser de cuarzo o fluorita y se debe
recibir la imagen en placas fotográficas o
pantallas.
Microscopio de fluorescencia: utiliza luz
ultravioleta y se basa en la emisión de
radiación con diferente longitud de onda a
la luz que causó la excitación.
Microscopio de contraste de fase: es
capaz de diferenciar contornos basado en
los diferentes índices de refracción de la
muestra.
Microscopio de interferencia: es igual que
el anterior pero se puede variar el
contraste y seleccionar el más útil para un
objeto dado.
Microscopio de interferencia: es igual que impactar el portaobjeto. Luego de usar el
el anterior pero se puede variar el objetivo de aceite de inmersión (el cual
contraste y seleccionar el más útil para un nunca debe usarse sin aceite de inmersión)
objeto dado. se debe limpiar el lente cuidadosamente
Microscopio de rayos X: Los rayos X con un paño blanco para retirar restos del
también pueden ser usados en la aceite.
iluminación. Debido a que la óptica del
Microscopio electrónico: Enfoca un haz microscopio corrige defectos de la visión
de electrones a través de la muestra. humana, los lentes ópticos no necesitan ser
utilizados a menos que exista un severo
astigmatismo. El lente ocular puede
Técnica de microscopio limpiarse con un papel suave o paño
suave que no deje pelusas, humedecido
Todos los microscopios modernos con agua destilada.
son parafocales y paracentrales.
El término parafocal significa que el
foco no cambia apreciablemente cuando se
cambia el objetivo; sólo se requiere un
toque del tornillo micrométrico para
volver a ajustar el foco de la muestra.
El término paracentral indica que el
centro del campo no cambia cuando se
cambia el objetivo. Antes que el objetivo
cambie, el objeto debe ser ubicado en el
centro.
Siempre comience con el objetivo
de menor poder, cuidando que el
cubreobjeto se encuentre en la superficie
de arriba del portaobjeto, de esa manera
los objetivos de mayor poder no chocarán
con el portaobjeto. Para obtener una mejor
imagen, se debe usar un cubreobjeto, el
cual no debe sobrepasar de 0.17-0.18 mm
de espesor.
Los objetivos que utilizan aceite de
inmersión no son tan sensibles y pueden
ser usados sin el cubreobjeto. Este objetivo
trabaja a una distancia menor y pueden

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 Procedimientos

Para comenzar, familiarícese con el microscopio que se le asigne. El microscopio

siempre se debe manipular (levantarlo para cambiarlo de posición) tomándolo con una
mano por el brazo y sosteniendo el pie con la palma de la otra mano. Coloque el
microscopio en el mesón de modo que exista una distancia de al menos 3 cm entre el
borde del pie del microscopio y el borde del mesón.

P. ¿Cuál es la magnificación de cada objetivo y ocular en su microscopio?

R:

P. ¿Calcule la magnificación (aumento) total con cada objetivo disponible en el revolver.

R:

P. ¿Cuál es la A.N. de cada objetivo?.

R:

P. Calcule el índice de refracción del aceite de inmersión, si la velocidad de la luz a la cual

atraviesa este medio es de 198,012 Km/seg.

R:

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 Partes del Microscopio

En segunda instancia es crucial que distinga las partes que conforman el

microscopio

Iluminación Kohler

A continuación se describen los procedimientos necesarios para realizar una correcta

iluminación de la muestra:
1.- Prenda la luz del microscopio utilizando la menor intensidad.
2.- Eleve la platina hasta el tope superior. Abra el iris del diafragma de campo y el
condensador totalmente.
3.- Coloque el portaobjeto sobre la platina cuidando que el cubreobjeto quede en la parte
de arriba. Mueva la platina de tal forma que la muestra se encuentre en la vía de la luz.

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4.- Con el objetivo de menor magnificación, enfoque el objeto. Comience con el objetivo
muy cercano al portaobjeto y ajústelo con el tornillo macrométrico, modifique la distancia
entre el objetivo y el cubreobjeto hasta que el objeto esté en foco.
5.- Cuando se utiliza un microscopio binocular, se debe ajustar la distancia interpupilar;
para ello mueva los lentes oculares hasta que ambas imágenes se vean simultáneamente.
Para ajustar diferencias en la visión de ambos ojos, mientras mira por el ocular derecho
ajuste el foco con el tornillo micrométrico, luego mire por el ojo izquierdo y ajuste el foco
rotando el tornillo ubicado sobre el mismo ocular izquierdo, éste procedimiento acorta la
longitud del tubo izquierdo.
6.- Cierre el iris del campo. Luego baje el condensador hasta que aparezca una imagen
nítida de las hojas del diafragma superimpuesta sobre la imagen del objeto.
7.- Centre la imagen del iris con los tornillos del condensador si es que fueran ajustables.
Luego, abra el diafragma del campo hasta que la luz cubra casi todo los márgenes
externos del campo visual.
8.- Remueva un ocular y mire por él. Cierre el iris del condensador hasta que la luz casi
llegue hasta los márgenes externos del campo visual. Este paso ajusta el cono del ángulo
de luz para la apertura numérica del objetivo.
9.- Vuelve el ocular a su lugar. El microscopio se encuentra ajustado para el objetivo de
menos aumento.

Actividades I

En estas actividades usted tendrá la ocasión de observar preparados con los aumentos
lupa (4X), menor (10X), mayor (40X).

1. Enfoque la primera preparación con un aumento menor, si la muestra se mueve con la

platina hacia adelante, ¿hacia dónde se mueve la imagen?¿y si se mueve de izquierda a
derecha?.

R:

2. Enfoque la preparación de hilos entrecruzados de colores. ¿Con cuál objetivo se logra

un mayor poder de penetración?. Recuerde que el revólver sólo se gira en una dirección desde
menor a mayor objetivo.

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R:

3. Con un preparado de papel milimetrado indique el diámetro del campo visual usando
los dos primeros objetivos. El diámetro del campo visual logrado con el tercer objetivo
calcúlelo con la fórmula:

A.Objetivo A x Diám. Campo Visual A = A. Objetivo B x Diám. Campo Visual B

R:

Actividades II

En estas actividades usted tendrá la ocasión de observar preparados con los aumentos
lupa (4X), menor (10X), mayor (40X) y de inmersión (100X), en el Registro de Laboratorio
debe incluir todo el formato solicitado en el programa como por ejemplo indicar por cada
observación: la magnificación utilizada, el tipo de organismo (si sabe el nombre científico y
vernacular, anótelos) tipo de tinción o técnica utilizada, comentarios y rótulos de la
observación.
1.- Observe epidermis de cebolla con y sin tinción. Compare sus tamaños relativos.
Observe posición del núcleo, textura del citoplasma, ubique pared celular y membrana
plasmática. Calcule aproximadamente el tamaño de un objeto en el campo visual.

R:

Una vez finalizadas las actividades usted debe colocar el microscopio en su estado inicial, limpio
(si utilizó aceite de inmersión), con la platina baja, con el objetivo de menor aumento, el
condensador al mínimo, la luminosidad en su menor intensidad y por último el aparato
desenchufado.

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 Cuestionario

P. ¿Cuál es la diferencia entre magnificación y resolución?

R:

P. Se observa un insecto con el objetivo de menor poder y mide la mitad del diámetro del
campo visual en longitud y 1⁄4 del campo visual en ancho. Demuestre cómo podría
calcular la longitud real del insecto (largo y ancho) en milímetros.

R:

P. Una muestra “e” se orienta sobre el portaobjeto. Si se colocara sobre la platina de un

microscopio compuesto. Dibuje la orientación que tendría la muestra “e” visto a través del
ocular

R:

P.Un microscopio tiene un diámetro de campo visual de 5 mm cuando se utiliza una

magnificación total de 100 X con un objetivo de 10X. Se observa una sola célula por el
objetivo de 40X de este microscopio y la célula cabe dos veces en el campo visual. ¿Cuál es
el diámetro de la célula?

R:

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