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MPMI vol. 18, núm. 9, 2005, págs. 991–1001. DOI: 10.1094 / MPMI-18-0991. © 2005 Sociedad Americana de Fitopatología
El sistema de secreción tipo III
de BiocontrolPseudomonas fluorescensKD se dirige
al cromista fitopatógenoPythium ultimum y
promueve la protección del pepino
Fabio Rezonico,1carpeta cristiana,1Geneviève Défago,1y Yvan Moënne-Loccoz2
1Grupo de Fitopatología, Instituto de Ciencias Vegetales, Instituto Federal Suizo de Tecnología (ETH), Universitätstrasse 2,
CH-8092 Zürich, Suiza;2UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Université Claude Bernard (Lyon 1), 43 bd du 11 Novembre
1918, F-69622 Villeurbanne cedex, Francia
Presentado el 20 de diciembre de 2004. Aceptado el 9 de mayo de 2005.
Las proteobacterias utilizan el sistema de secreción de tipo
III (TTSS) para la interacción patógena o simbiótica con
huéspedes vegetales y animales. Recientemente, se cree
que los genes TTSS se originan a partir del fitopatógeno
Pseudomonas siringae se evidenciaron enPseudomonas
fluorescensKD, que protege al pepino del oomicetoPythium
ultimum (reino Chromista/Stramenopila). Sin embargo, no
se sabe si el TTSS contribuye a la protección de las plantas
por parte de la bacteria y, de ser así, si se dirige a la planta o
al fitopatógeno. Inactivación del gen TTSSHRCV después de
la inserción de un casete omega redujo fuertemente la
actividad de biocontrol de la pseudomonad contra
P. ultimoen pepino en comparación con el tipo silvestre, pero no
tuvo ningún efecto sobre su capacidad de colonización de raíces.
Análisis de un transcripcional basado en plásmidoshrpJ′-inaZ la
fusión del reportero reveló que la expresión en la cepa KD del
operón que contieneHRCVfue fuertemente estimulada in vitro e
in situ por el oomiceto y no por la planta. In vitro, tanto la cepa
KD como suHRCVmutante redujo el nivel de actividad de la
pectinasa poligalacturonasa (un factor clave de patogenicidad)
deP. ultimo, pero la reducción fue mucho más fuerte con el tipo
salvaje. Juntos, estos resultados muestran que el rango objetivo
de TTSS bacteriano no está restringido a plantas y animales,
sino que también puede incluir miembros de Chromista/
Stramenopila, y sugiere que los genes de virulencia adquiridos
horizontalmente de bacterias fitopatógenas se reciclaron
funcionalmente en biocontrol saprófito.Pseudomonasspp., lo
que resulta en una mayor protección de las plantas por parte de
este último.
El sistema de secreción tipo III (TTSS), que se encuentra ampliamente
distribuido entre los patógenos proteobacterianos de las plantas
(pertenecientes a los génerosPseudomonas,Erwinia,xantomonas,y
Ralstonia), animales y humanos (Hueck 1998), funciona como una jeringa
molecular para la introducción de factores de virulencia directamente en
las células huésped eucariotas. Los factores introducidos pueden
subvertir las funciones de la célula huésped de una manera que es
beneficiosa para las bacterias invasoras. En los patógenos de plantas, la
secreción de tipo III es esencial para la inducción de enfermedades en
plantas hospedantes susceptibles (Alfano y Collmer 1997).
Autor para correspondencia: Y. Moënne-Loccoz; Teléfono: +33 472 43 13 49; Fax: +33
472 43 12 23; Correo electrónico: moenne@biomserv.univ-lyon1.fr
La existencia de TTSS funcional también se ha demostrado en
bacterias no patógenas, es decir, el simbionte vegetalrizobio, que tiene la
capacidad de invadir la raíz de las leguminosas y fijar nitrógeno
atmosférico dentro de los nódulos de la raíz (Freiberg et al. 1997; Gottfert
et al. 2001; Meinhardt et al. 1993), así como pseudomonas saprofitas
asociadas a plantas (Mulya et al. . 1996; Preston et al. 2001).
Funcionalidad dehrpLa tecnología de expresión in vivo (IVET) mostró
genes para la colonización de raíces.Pseudomonas fluorescensSBW25
(Rainey 1999), aunque suhrpgrupo carece de parte deHRCVyhrcN(Preston
et al. 2001). Muchas de estas pseudomonas saprofitas asociadas a
plantas son rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) y
benefician a la planta a través del control biológico de patógenos
transmitidos por el suelo (Preston et al. 2001; Rezzonico et al. 2004). Los
genes TTSS parecen estar muy extendidos entre las pseudomonas
beneficiosas para las plantas según la secuenciación de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación de genes TTSShrcN(
Rezzonico et al. 2004) yhrcRST(Mazurier et al. 2004). Esto plantea la
cuestión de la contribución de los genes TTSS a las interacciones
beneficiosas entre procariotas y eucariotas que tienen lugar entre las
pseudomonas asociadas a la raíz y la planta, especialmente en el caso de
las interacciones de biocontrol.
EnPseudomonasspp., la relación filogenética derivada deRRR, que
codifica para el ARNr 16S, coincide con la filogenia de la especie
(Anzai et al. 2000). Comparación filogenética de RRRy el gen TTSS
que codifica ATPasahrcNentre pseudomonas biocontroladoras y
fitopatógenas mostró que hrcNes antiguo en la mayoría de los
linajes y ha evolucionado en paralelo conRRR, conhrcNalelos de la
mayoría de las pseudomonas de control biológico que difieren
claramente de los que se encuentran en sus contrapartes
fitopatógenas (Rezzonico et al. 2004). Por el contrario, elhrcNalelo
encontrado en la cepa de biocontrolPseudomonas fluorescensKD
agrupado con alelos de bacterias fitopatógenas en el hrcNárboles,
lo que apunta a una adquisición evolutivamente reciente del gen
por transferencia horizontal de genes de fitopatógenosP. siringae(
Rezzonico et al. 2004). Sin embargo, a pesar de exhibir un atributo
fitopatógeno,Pseudomonas fluorescens KD no se comporta como
un fitopatógeno, debido a su incapacidad para provocar la
respuesta hipersensible y causar síntomas de enfermedad en el
tabaco o el pepino (Rezzonico et al. 2004). Esto significa que la cepa
KD no actúa como un patógeno incompatible ni compatible,
mientras que el fitopatógeno establecidoP. siringaeexhibe ambas
propiedades. Por el contrario, la cepa KD muestra efectos de
biocontrol sobresalientes, notablemente contra la enfermedad del
pepino causada por Pythium ultimum(Sharifi-Tehrani et al. 1998).
Esto nos llevó a
vol. 18, núm. 9, 2005 /991
hipotetizar que TTSS enPseudomonas fluorescensla cepa KD se dirige al
fitopatógeno en lugar de a la planta y, por lo tanto, puede contribuir a la
protección de las plantas por parte de la bacteria de control biológico.
El objetivo de este trabajo fue investigar la importancia de
TTSS con respecto a las interacciones de biocontrol en
Pseudomonas fluorescensKD. Inactivación del gen TTSSHRCVse
implementó y el mutante resultante se comparó con el tipo
salvaje basado en i) el rendimiento del biocontrol contraP.
ultimosobre pepino y ii) efectos directos sobre el crecimiento y
potencial de virulencia del patógeno. Además, una transcripción
inaZ fusión con el promotor TTSS que controla la expresión del
hrpJoperón (que contieneHRCV), lo que dio como resultado el
plásmido pADJ6, y el plásmido se usó para evaluar la inducción
de genes TTSS en respuesta a la presencia de la planta, el
patógeno o ambos. Los resultados obtenidos indican que i) los
genes TTSS funcionales juegan un papel clave en la actividad de
biocontrol de KD, ii) su expresión es inducida por la presencia
del oomiceto patógenoP. último,y iii) su contribución al
biocontrol se dirige al propio fitopatógeno y no a la planta
huésped.
RESULTADOS
Construcción y evaluación in vitro
de unHRCV-mutante negativo dePseudomonas fluorescensKD.
Para la construcción de unHRCVmutante dePseudomonas fluorescens
KD, un 1.718 pbPstFragmento (incluidos los 219 pb finales dehrpJy los
primeros 1.503 pb deHRCV) obtenido de la cepa KD se interrumpió a una
smaI sitio (es decir, posición 915 deHRCV) con un Ωcassette que lleva un
gen de resistencia a la kanamicina (Fig. 1). Este fragmento se clonó en el
vector suicida pME3087 (Voisard et al. 1994) y el plásmido resultante
(denominado pCBW) se movilizó en la cepa KD. Inserción correcta de laΩ
casete dentroHRCV fue verificado para tetraciclina resistente a
kanamicinaPseudomonascolonias, tanto por PCR (usandoΩcebadores) y
Southern blot enPstADN genómico digerido con I. En una colonia, la
integración cromosómica del casete por recombinación homóloga doble
se confirmó además mediante secuenciación (realizada por Microsynth
GmbH, Balgach, Suiza), y se utilizó como un HRCV–mutante de KD. Las
extracciones de plásmidos utilizando el sistema de purificación de ADN
Wizard Plus SV Minipreps confirmaron la ausencia de pCBW (y de
cualquier otro plásmido) en elHRCV–mutante

Figura 1.Organización genética de los genes del sistema de secreción de tipo III encontrados en una cepa de control biológicoPseudomonas fluorescensKD (número de acceso
AY463491; Rezzonico et al. 2004) (panel superior) y construcción del plásmido suicida pCBW (para generar unHRCVmutante) (panel central) y la construcción informadora pADJ6
(panel inferior). La longitud de cada gen (bp) se muestra debajo de su nombre, con genes parcialmente secuenciados o truncados indicados por un asterisco (*). La longitud de las
brechas intergénicas no codificantes está subrayada y el número de bases compartidas por genes superpuestos se indica entre paréntesis. Las flechas horizontales sobre los
genes ( ) representan los operones putativos y la dirección en la que se transcriben. Se indica la posición de los sitios de restricción relevantes y, en el caso de pADJ6, se subrayan
sus nombres cuando corresponden a un sitio insertado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los triángulos negros ( ) representan la posición y orientación de los
cebadores de PCR utilizados para la clonación y verificación de las construcciones. Los triángulos blancos ( ) indican la posición y orientación delhrpcajas de transcripciónhrp-caja 1
(GGAACCCGATGGTGGGTTTGCGCCACCGA) yhrp-caja 2 (GGAACCTCTTTCGCCTCTGGC TCCACCTA), cuyohrpbox consenso (Xiao y Hutcheson 1994) contiene el motivo (mostrado en
negrita) GGAACC-Ndieciséis-CCAC-N2-A (Fouts et al. 2002). IR = repeticiones invertidas que flanquean elΩcasete.

992/Interacciones Moleculares Planta-Microbio

 La tasa de crecimiento de laHRCV–el mutante no difirió del KD de
tipo salvaje en Luria Bertani (LB; Sambrook et al. 1989), King's B
(King et al. 1954), caldo de patata dextrosa o medio mínimo (Huynh
et al. 1989). Ambas bacterias también mostraron el mismo patrón
de utilización de 95 compuestos diferentes como única fuente de C
en microplacas Biolog GN (BIOLOG Inc., Hayward, CA). Además, la
capacidad de producir metabolitos secundarios de biocontrol como
el cianuro de hidrógeno y
la pioverdina no se vio afectada por la mutación. Estos hallazgos
apuntan a la ausencia de efectos pleiotrópicos asociados conHRCV
inactivación en la cepa KD.
Efecto deHRCVinactivación enPseudomonas fluorescensKD sobre
biocontrol del marchitamiento del pepino.
En ausencia del patógenoP. ultimo, inoculación de
Pseudomonas fluorescensKD o suHRCVmutante deficiente en

La figura 2. A,Biocontrol dePythium ultimumamortiguamiento del pepino mediado porPseudomonas fluorescensKD y suHRCVmutante en mezcla para macetas no estéril a los 7
días.A,Peso fresco total de brotes (en negro, parte superior de la figura) y raíces (en blanco, parte inferior de la figura) registrados por maceta.B,Porcentaje de plantas vivas.C,Peso
fresco de brotes (en negro, parte superior de la figura) y raíces (en blanco, parte inferior de la figura) de plantas individuales. Las medias y los errores estándar (barras de error) se
derivaron de nueve repeticiones. Análisis de varianza de dos vías (Pseudomonastratamiento ×pitiotratamiento), y los datos con la misma letra latina o griega no son
significativamente diferentes (prueba de diferencia honestamente significativa de Tukey enPAG<0,05).

vol. 18, núm. 9, 2005 /993

La mezcla para macetas no estéril no tuvo efecto sobre la salud (datos no
mostrados), el peso fresco o la emergencia (Fig. 2) de las plantas de
pepino a los 7 días en condiciones de cámara de crecimiento. Adición del
patógenoP. ultimosolo redujo la emergencia de las plántulas a solo un 21
% (Fig. 2B) y redujo significativamente la biomasa promedio de las
plantas sobrevivientes de 1,13 a 0,45 g por planta (suma de raíces +
brotes) (Fig. 2C), lo que en general resultó en una pérdida del 91 %. en la
biomasa vegetal total por maceta (Fig. 2A). En la presencia de
P. ultimo, la cepa de biocontrol KD aumentó la emergencia de plantas de
21 a 72 % y la biomasa de plantas individuales de 0,45 a 0,79 g por planta
(es decir, +76 %). Por lo tanto, la biomasa total de plantas por maceta
aumentó más de cuatro veces en comparación con el tratamiento sin
protección. ElHRCV-mutante deficiente también tuvo efectos positivos
estadísticamente significativos sobre la emergencia de la planta (del 21 al
37%) y la biomasa de las plantas sobrevivientes (de 0,45 a 0,61 g de raíces
+ brotes por planta), pero estos efectos fueron mucho menores que los
del salvaje tipo, especialmente cuando se considera la emergencia de la
planta. En consecuencia, la biomasa vegetal total por maceta fue solo el
40% de la del tratamiento KD.
Para determinar si la interrupción delHRCVEl gen tuvo alguna influencia en
la capacidad de KD para sobrevivir en la mezcla para macetas y para colonizar
las raíces de pepino, se determinaron las UFC de las bacterias en el ensayo de
biocontrol. Los resultados indican que ambos inoculantes sobrevivieron bien
en la mezcla para macetas y colonizaron la rizosfera y las raíces con un alto
número de células (>107UFC g–1de suelo o raíz de la rizosfera) (Fig. 3) para el
día 7. Es importante destacar que no hubo una diferencia estadísticamente
significativa en el nivel de población entre la cepa KD y suHRCV–mutante,
independientemente de i) el compartimento estudiado y ii) si el patógeno
estaba presente. Inferimos que, al menos durante el período de observación,
laHRCV la mutación no redujo la aptitud ecológica del inoculante.
Construcción
de unhrpJ′-inaZFusión transcripcional del promotor.
UnhrpJ′-inaZla fusión transcripcional del promotor se
construyó en el pPROBE′gfp[sin etiqueta] (Miller et al. 2000)
derivado pAD1. Un amplicón de PCR de 405 pb que contiene
la región promotora delhrpJSe ligó el operón de la cepa KD
aguas arriba deinaZdentro de pAD1, produciendo pADJ6 (Fig. 1). La
orientación correcta de un único inserto en el plásmido se confirmó
mediante análisis de restricción y PCR. El plásmido pADJ6 se purificó
a partir deEscherichia coliy se transforma en CaCl2- células KD
competentes.
En condiciones in vitro, la retención del plásmido informador pADJ6 en
la cepa KD fue de 96,0±1,3% después de 20 generaciones y 90,2±2,4 %
después de 35 generaciones en cultivos LB en serie (es decir, subcultivo
realizado cada 12 h durante 4 días) sin selección para el mantenimiento
del plásmido. El gen informador se expresó a un nivel basal muy bajo, es
decir, -8,01 (±0.47) registro10(célula de núcleos de hielo–1), cuando la cepa
KD/pADJ6 se cultivó durante la noche en LB (es decir, en las condiciones
utilizadas para preparar el inóculo para experimentos de microcosmos).
Por lo tanto, los niveles de actividad que se midieron en este trabajo
reflejan la actividad génica real durante el transcurso de los
experimentos en lugar de la actividad residual de las células inoculantes.
NoinaZse encontró actividad en la cepa KD o KD que contenía el vector
vacío pAD1.
Actividad in vitro de lahrppromotor en presencia
deP. ultimoy plántulas de pepino.
El efecto de plántulas de pepino de 2 días esterilizadas en autoclave y
P. ultimoSe evaluó la actividad de nucleación en hielo de la cepa KD/
pADJ6 durante 27 h en cultivo líquido LB. El crecimiento de la cepa KD/
pADJ6 fue el mismo en todos los tratamientos (Fig. 4A). La actividad de
nucleación de hielo aumentó en paralelo con el número de células en el
control KD/pADJ6 (Fig. 4B). La presencia de plántulas de pepino
esterilizadas en autoclave no tuvo efecto sobre la actividad de nucleación
del hielo (Fig. 4B), y se hizo el mismo hallazgo cuando se usaron plántulas
desinfectadas en la superficie (en presencia de kanamicina a 10 µg ml–1
para evitar contaminaciones) (datos no mostrados). En cambio, la
actividad de lahrppromotor fue significativamente mayor (hasta una
unidad logarítmica) a partir de las 19 h (es decir, desde el final de la fase
de crecimiento exponencial) en presencia deP. ultimo.
Actividad in situ de lahrppromotor en el
pepino–P. ultimopatosistema
La actividad de nucleación del hielo se evaluó in situ a los 7 días en un
experimento de biocontrol en el que se utilizó la cepa KD/pADJ6

Fig. 3.Supervivencia dePseudomonas fluorescensKD (barras negras) y susHRCVmutante (barras blancas) a los 7 días en el sustrato, rizosfera y raíces de pepino cultivado en mezcla
para macetas no estéril. Las UFC se expresan por gramo de mezcla para macetas (para sustrato y rizosfera) o raíz (para el compartimento de raíces). Las bacterias se inocularon a
los 107UFC por gramo de mezcla para macetas. Las medias y las desviaciones estándar (barras de error) se derivaron de cuatro repeticiones. Dentro de cada compartimento,
análisis de varianza de dos vías (ANOVA) (Pseudomonastratamiento ×pitiotratamiento), y los datos con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba de diferencia
honestamente significativa de Tukey enPAG<0,05). Tanto en presencia como en ausencia de patógeno agregado, los datos para el sustrato y la rizosfera también se compararon
juntos (porque ambos se expresan por gramo de mezcla para macetas) para cada tratamiento correspondiente y diferencias estadísticamente significativas (ANOVA enPAG<0,05)
entre los dos se indican con un asterisco (*) en las barras de este último compartimento.

994/Interacciones Moleculares Planta-Microbio

(Figura 5). En este experimento, los niveles de emergencia de plantas y
biomasa en el tratamiento con KD/pADJ6 fueron los mismos que los
alcanzados con la cepa KD en el experimento de control biológico
original, y no se detectó actividad de nucleación de hielo indígena en los
tratamientos de control sin bacterias añadidas (datos no incluidos).
mostrado). El plásmido informador pADJ6 se mantuvo entre el 96,7 y el
98,0 %, según el análisis de células inoculantes reaisladas a los 7 días y
que crecieron en agar modificado con kanamicina, independientemente
de i) el compartimento microbiano (sustrato de mezcla para macetas,
rizosfera o raíz) y ii ) siP. ultimofue añadido. Un basicohrpJ′- inaZel nivel
de actividad se registró después de la residencia de las células KD/pADJ6
durante 7 días en un sustrato de mezcla para macetas no estéril sin
patógeno añadido. En comparación con el sustrato de mezcla para
macetas, un aumento modesto eninaZse encontró actividad de la cepa
KD/pADJ6 en la rizosfera (2,6 veces) y en las raíces (6 veces) en ausencia
del patógeno. Sin embargo, en presencia de este último, el aumento fue
de 17 veces en el sustrato de mezcla para macetas,
133 veces en la rizosfera y 184 veces en las raíces. En cada uno de
los tres compartimentos, la actividad delhrppromotor fue
significativamente mayor cuandoP. ultimofue añadido.
Efecto deHRCVinactivación enP. ultimoactividad pectinasa.
La producción por fitopatógenos de enzimas líticas extracelulares (p.
ej., pectinasa, que contribuye a la descomposición de las pectinas en las
paredes celulares de las plantas) es importante para la patogenia (Walton
1994). Aquí, usamos el nivel de actividad de la pectinasa
poligalacturonasa como un indicador del potencial de virulencia deP.
ultimoal evaluar el efecto dePseudomonas fluorescensKD y suHRCV-
mutante deficiente en el fitopatógeno. El experimento de confrontación
se llevó a cabo en medios líquidos y periódicamente se tomaron
muestras de alícuotas para evaluar la actividad pectinasa. No se pudo
detectar actividad de pectinasa en ausencia deP. ultimo(datos no
mostrados). CuandoP. ultimose incubó solo en LB, se detectó por
primera vez la producción de pectinasa

Figura 4.Efecto dePythium ultimum(barras negras) o plántulas de pepino esterilizadas en autoclave (barras blancas) enA,crecimiento yB,actividad de nucleación de hielo delhrpJ′-inaZ fusión de
Pseudomonas fluorescensKD/pADJ6 en medio Luria Bertani. Las barras rayadas representan el control (es decir, la cepa KD/pADJ6 sola). Los valores son las medias de cuatro repeticiones y las
barras de error en B representan las desviaciones estándar. En cada momento de muestreo, los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes (análisis de varianza y prueba
de diferencia honestamente significativa de Tukey enPAG<0,05).

Figura 5.Actividad de lahrpJ′-inaZfusión dePseudomonas fluorescensKD/pADJ6 a los 7 días en el sustrato, rizosfera y raíces de pepino cultivado en sustrato no estéril inoculado
(barras blancas) o no (barras negras) conPythium ultimum.inaZla actividad se expresa como el logaritmo del número de núcleos de hielo por célula de la cepa KD/pADJ6. Los
valores son la media de cuatro repeticiones y las barras de error representan las desviaciones estándar. Diferencias estadísticamente significativas resultantes deP. ultimo
inoculación (análisis de varianza enPAG<0.05) están marcados con un asterisco (*).

vol. 18, núm. 9, 2005 /995

a las 40 h (fig. 6A). CuandoP. ultimofue desafiado conPseudomonas
fluorescensKD, la producción de pectinasa se retrasó y los niveles fueron
estadísticamente más bajos. Por el contrario, elHRCV–mutante no retrasó
la producción de pectinasa enP. ultimo. Además, los niveles de pectinasa
fueron estadísticamente más altos con elHRCV–
mutante en comparación con KD. Se hicieron los mismos hallazgos
cuando se agregaron plántulas de pepino macerado (Fig. 6B) o
cuando se usó Czapek-Malt en lugar de LB (Fig. 6C y D), excepto en
Czapek-Malt suplementado con plántulas de pepino macerado
donde, a las 26 h, Ya se detectó producción de pectinasa en el
control pero no en los dos tratamientos bacterianos (datos no
mostrados). Por el contrario, no se encontró un efecto significativo
sobre la actividad de la pectinasa al complementar elP. ultimocultivo
con sobrenadantes de cultivo LB libres de células de la cepa KD (en
una proporción de 1:1), lo que significa que la pseudomona requiere
contacto físico directo con el patógeno.
DISCUSIÓN
La aparición inesperada de genes TTSS en bacterias de control
biológico antagonistas se ha documentado en los últimos años
(Preston et al. 2001; Mazurier et al. 2004; Rezzonico et al. 2004). Por
ejemplo, Preston y asociados (2001) han demostrado la presencia en
Pseudomonas fluorescensSBW25 de un grupo de genes de 20 kb
(llamadorsp, para la secreción expresada en la rizosfera) que se
asemeja al tipo III (hrp) grupo de genes de fitopatógenosP. siringae.
Para uno de estos genes, se demostró la expresión en la rizósfera,
pero no se disponía de un mutante knock-out para evaluar la
importancia ecológica de TTSS en esta bacteria. Tal mutante se
obtuvo en el trabajo actual.
con la inserción de unΩcasete que contiene un determinante de
resistencia a la kanamicina (2237 pb de largo) en elHRCVgen de
Pseudomonas fluorescensKD, porque la inactivación mutacional de
HRCVsuprime la secreción de tipo III en las bacterias (Casper-Lindley
et al. 2002; Holeva et al. 2004).
La mayoría de los genes TTSS encontrados hasta ahora en KD
(Rezzonico et al. 2004) están organizados como en los patógenos de
plantas.Erwinia amylovoraEa321 (Bogdanove et al. 1998),P. siringae
p.v.tomate DC3000 (Fouts et al. 2003), yP. siringaep.v.jeringas61
(Alfano et al. 2000), conhrpJ,HRCV,hrpO,yhrcNubicado en el mismo
operón controlado por un únicohrp-secuencia de caja (Fouts et al.
2002), que es reconocida por el factor sigma alternativo HrpL (Xiao y
Hutcheson 1994). Por lo tanto, además de la inactivación deHRCV, la
presencia de laΩcasete en HRCVi) causa un cambio de marco
(mutación polar) y ii) asegura a través de secuencias de terminación
de transcripción y traducción que los nueve genes TTSS ubicados
aguas abajo en elhrpJoperón ya no son funcionales (Prentki y Krisch
1984). sin embargo, elHRCVEl mutante no difirió de la cepa KD de
tipo salvaje cuando se cultivó sola en condiciones in vitro, según la
comparación de las tasas de crecimiento, la utilización de
compuestos 95 como única fuente de C y la capacidad de producir
los compuestos de biocontrol cianuro de hidrógeno y pioverdina.
A pesar de no producir el compuesto clave de control biológico 2,4-
diacetilfloroglucinol, a menudo asociado con la protección de las plantas
en las pseudomonas,Pseudomonas fluorescensKD es un agente de
control biológico efectivo (Sharifi-Tehrani et al. 1998), lo cual se confirmó
aquí. Los resultados de nuestro estudio indican que la inactivación de
HRCVreduce fuertemente la capacidad de biocontrol dePseudomonas
fluorescensKD contra el damping-off en elP. ulti-

Figura 6.Efecto dePseudomonas fluorescensKD (barras negras) y susHRCVmutante (barras blancas) en la actividad pectinasa dePythium ultimumenAyB,Luria Bertani oCyD,Medio
Czapek-Malta. Las muestras en B y D se incubaron en presencia de plántulas de pepino maceradas. Las barras rayadas representan controles sin bacterias. La actividad se evaluó
en un ensayo de copa-plato midiendo el diámetro de la zona libre de ácido poligalacturónico alrededor de un pocillo de 0,6 cm en el que se incubó una muestra de 200 µl durante
2 días a 24ºC. Los valores son las medias de tres repeticiones y las barras de error representan la desviación estándar de las medias. En cada muestreo, análisis de varianza de dos
vías (ANOVA) (Pseudomonastratamiento × medio). Dentro de cada uno de los cuatro gráficos, los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes (las pruebas
de diferencia honestamente significativa de Tukey enPAG<0,05). Para cada tratamiento, las diferencias estadísticamente significativas (ANOVA enPAG<0.05) debido a la presencia
de plántulas de pepino maceradas se indican con un asterisco (*).

996/Interacciones Moleculares Planta-Microbio

mamá–Patosistema del pepino. Este efecto no se debió a una menor
aptitud ecológica de laHRCVmutante, porque este último persistió
en la mezcla para macetas y colonizó las raíces de las plantas en la
misma medida que lo hizo la cepa KD de tipo salvaje,
independientemente de si el patógeno estaba presente o no. Hasta
donde sabemos, este es el primer informe de TTSS involucrado en la
actividad de biocontrol de una bacteria beneficiosa para las plantas.
Además, al tener en cuenta la hipótesis de una transferencia
horizontal evolutivamente reciente de genes TTSS del fitopatógeno
Pseudomonas siringaeal no patógenoPseudomonas fluorescensKD
(Rezzonico et al. 2004), esto apunta a la hipótesis de que los genes
de fitovirulencia se reciclaron funcionalmente, una vez adquiridos,
como componentes del arsenal de protección vegetal de la bacteria
biocontroladora.
Curiosamente, elHRCVEl mutante deficiente mostró efectos
fitosanitarios débiles pero estadísticamente significativos, de
acuerdo con el hecho de que, al igual que el tipo salvaje (Sharifi-
Therani et al. 1998), produce pioverdina y cianuro de hidrógeno,
siendo este último de particular importancia parapitiocontrol
biológico (Ellis et al. 2000; Ramette et al. 2003; Valverde et al. 2003).
La adquisición horizontal de capacidad simbiótica o patógena
(Blanc-Potard y Lafay 2003; Dale et al. 2001; Manulis y Barash 2003;
Ochman y Moran 2001; Sullivan et al. 1995) está bien establecida. En
el caso dePseudomonas fluorescensKD, planteamos la hipótesis de
que la transferencia horizontal de genes ha convertido un agente de
biocontrol débil en uno efectivo.
La expresión de los genes TTSS se induce fuertemente cuando las
bacterias patógenas (Aldon et al. 2000; Rosqvist et al. 1994; Watarai
et al. 1995) o simbióticas (Dale et al. 2002) interactúan con su
huésped. Aquí, usamos el plásmido pADJ6, que lleva un hrpJ′-inaZ
fusión transcripcional del promotor y ensayos de nucleación de
hielo para evaluar la actividad dePseudomonas fluorescens KDhrpJ
operón en el pepino–P. ultimopatosistema En un estudio anterior, la
tecnología reportera mostró que el gen TTSSrscCse expresó cuando
la cepa de biocontrol Pseudomonas fluorescensSBW25 coloniza la
rizosfera (Preston et al. 2001). En el presente trabajo, sin embargo,
el efecto de la planta sobrehrpJ′-inaZel nivel de actividad fue
pequeño, como lo indica la comparación de muestras de mezcla
para macetas, rizosfera y raíces en ausencia de agregadoP. ultimo(
figura 5). Esta observación es consistente con el hecho de que la
cepa KD no es patógena para el pepino ni provoca una respuesta no
compatible (hipersensible) en la planta huésped. En contraste con
este hallazgo, la adición deP. ultimoa la mezcla para macetas no
estéril produjo un fuerte aumento enhrpJactividad promotora en
Pseudomonas fluorescensKD/pADJ6, independientemente de si se
consideraron muestras de mezcla para macetas, rizosfera o raíz.
Esto lleva al concepto de que el TTSS dePseudomonas fluorescens
KD se dirige al patógenoP. ultimodurante la interacción bacteriana
con la planta, en lugar de la planta huésped. De hecho, las plántulas
de pepino no tuvieron ningún efecto sobrehrpJ′-inaZactividad
cuando la cepa KD/pADJ6 se cultivó in vitro, mientras que el
patógeno lo hizo (Fig. 4).
El hallazgo de queP. ultimoes el verdadero objetivo del TTSS de la cepa KD
se ve respaldado por el hecho de que la mutación en HRCVredujo la capacidad
de la bacteria para inhibir la producción de la pectinasa poligalacturonasa por
P. ultimo. De hecho, la producción de enzimas líticas extracelulares como las
pectinasas (que contribuyen a la descomposición de las pectinas en las
paredes celulares de las plantas) es importante para la inducción de
enfermedades por fitopatógenos (Agrios 1997). Debido a que la pectinasa es
un factor de virulencia clave, no sorprende que la cepa KD resulte en una
capacidad disminuida deP. ultimopara infectar plantas emergentes,
permitiéndoles crecer más allá de la etapa en la que pueden desarrollar
resistencia endógena contra este patógeno luego de la lignificación y
suberificación de las paredes celulares de las plantas (Agrios 1997). Este efecto
parece ser específico, porque la cepa KD no tuvo efecto sobre el crecimiento
de colonias dePAG.
ultimoen placas (datos no mostrados). Esta es la primera vez que se
demostró que TTSS media efectos nocivos contra un eucariota que
no es ni un animal ni una planta. En efecto,P. ultimo(familiapitiáceas,
clase Oomycetes, phylum Oomycota) pertenece al reino Chromista/
Stramenopila (base de datos CABI IndexFungorum), que también
incluye Prymnesiophyta, Sagenistans, diatomeas, silicoflagellates y
algas doradas, marrones y amarillo-verdosas (Campbell et al. 1999;
Cavalier-Smith 1997; Cavalier-Smith et al. 1994). La transferencia
horizontal de genes de virulencia de patógenos bacterianos de
plantas y animales puede conferir a las bacterias receptoras la
capacidad de causar enfermedades a una planta o un animal,
respectivamente (Blanc-Potard y Lafay 2003; Dale et al. 2001;
Manulis y Barash 2003). Aquí, sin embargo, un TTSS que se cree que
se originó a partir de un fitopatógeno (Rezzonico et al. 2004) apuntó
a un Chromista que era patógeno para la planta, y ahora está
favoreciendo a la planta cuando esta última se enfrentó al
patógeno.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos y condiciones de cultivo.
Escherichia coliLas cepas se cultivaron rutinariamente en
medio LB a 37°C yPseudomonascepas en agar King's B o en
caldo LB a 27ºC. La cepa KD/pADJ6 se cultivó en presencia de
kanamicina (50 µg ml–1).P. ultimo67-1 (obtenido de Allelix
Agriculture, Mississauga, Ontario, Canadá) se cultivó en placas
de agar de malta al 1,5% (Difco Laboratories, Detroit) a 20°C
durante 7 días. Los antibióticos se usaron en las siguientes
concentraciones a menos que se indique lo contrario: ampicilina
a 100 µg ml–1, tetraciclina a 25 µg ml–1y kanamicina a 25 µg ml–1.
Construcción, verificación y
evaluación in vitro de unHRCV–mutante de KD.
1.718 pbPstFragmento que abarca los 219 pb finales dehrpJy
los primeros 1.503 pb deHRCV(superposición de 4 pb entre
ambos genes) se clonó en el plásmido pUK21 (Vieira y Messing
1991), como se describió anteriormente (Rezzonico et al. 2004),
produciendo el plásmido pCBTypeIII. pCBTypeIII fue digerido
conHinIII yXbaI y el fragmento resultante clonado en
pBluescript II KS (Stratagene, Cedar Creek, TX, EE. UU.). El
producto intermedio se cortó en la posición 915 de HRCVcon
smaI, embotado, y ligado con unΩcassette, dando como
resultado el plásmido pCBBl2. ElΩcasete, que lleva un gen de
resistencia a la kanamicina, se derivó del plásmido pHP45 (Fellay
et al. 1987) porecológicoDigestión RI y despuntado antes de la
ligadura. pCBBl2 se cortó conXhoYo, embotado, luego digerido
conXbaI. El fragmento extirpado que porta genes TTSS se clonó
en el plásmido suicida pME3087 (Voisard et al. 1994),
previamente cortado conHindIII, despuntado y digerido conXba
I. Este derivado de pME3087 se denominó pCBW (Fig. 1) y se
movilizó mediante el apareamiento biparental deE. coli DH5α
que contiene el plásmido auxiliar pME497 paraE. coli HB101. En
un segundo apareamiento biparental, el superdonante HB101
se conjugó con la cepa KD.PseudomonasSe seleccionaron
células con plásmido integrado en base a su resistencia a la
kanamicina (25 µg ml–1) y cloranfenicol (40 µg ml–1). Se buscó la
escisión del vector por un segundo evento de recombinación
homóloga mediante enriquecimiento para células sensibles a
tetraciclina usando carbenicilina a 6 µg ml–1(Reimmann et al.
1988). La selección para la resistencia a la kanamicina aseguró
la presencia de laΩcasete.
Inserción correcta de laΩcasete fue verificado por transferencia de
Southern dePstADN genómico digerido con I tanto del tipo salvaje como
del mutante usando una molécula marcada con digoxigeninaHRCVsonda
derivada deErwinia amylovoraCNPB136 (Stuber et al. 2003), y por PCR
utilizando cebadoresΩ-adelante (5′-AGTTCACCACTAGGCGA TTG-3′)yΩ-
revolución (5′-GTCATACAACACGGCATGAC-3′),
vol. 18, núm. 9, 2005 /997
que recocen a las regiones flanqueantes de laΩsitio de inserción del
casete enHRCV. La amplificación por PCR se llevó a cabo en mezclas de
reacción de 20 µl que contenían 5 µl de lisado celular, según lo descrito
por Rezzonico y asociados (2003). La PCR incluyó una desnaturalización
inicial de 5 min a 94 °C, seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 57,5
°C y 1 min a 72 °C, y luego una elongación final de 10 min a 72 °C. ºC El
tamaño de los productos de la PCR se comprobó mediante electroforesis
en agarosa al 1,5 %.
Cepa KD y laHRCVmutante se compararon en función de la
utilización de la fuente de carbono en microplacas Biolog GN (Biolog
Inc., Hayward, CA, EE. UU.) según lo descrito por el fabricante. Las
tasas de crecimiento en LB, King's B, caldo de papa dextrosa y
medio mínimo se determinaron utilizando mediciones de densidad
óptica de los cultivos bacterianos a 600 nm. La producción de
cianuro de hidrógeno se evaluó cualitativamente utilizando papel
indicador HCN, como describen Castric y Castric (1983), y las
pioverdinas se estudiaron y compararon por isoelectroenfoque (20 h
a 10 W, 3500 V y 50 mA) en Immobiline Dry Strips NL pH 3-10
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE. UU.) usando una
unidad de electroforesis 2117 Miltipor II (LKB, Bromma, Suecia)
como se describe por Meyer y asociados (2002).
Experimentos de biocontrol in vivo.
Los experimentos con pepino se realizaron como se describe
(Sharifi-Tehrani et al. 1998), excepto que las plantas se cultivaron en
una mezcla para macetas comercial no estéril (sustrato BF4; Tref-De-
Baat, GVZ-Bolltec AG, Zúrich, Suiza). Brevemente,P. ultimose cultivó
durante 7 días en semillas de mijo esterilizadas en autoclave
(Biofarm, Kleindietwil, Suiza). Las semillas se picaron y las partículas
resultantes, de 1 mm de diámetro, se usaron para infestar la mezcla
para macetas a razón de 1 g de partículas por 2 cm.3de mezcla para
macetas. En los controles sin patógeno añadido, se utilizó la misma
cantidad de mijo esterilizado en autoclave. Semilla (Wyss Samen und
Pflanzen AG, Zuchwil, Suiza) de pepino (Cucumis sativaCV.
Chinesische Schlange) se desinfectaron superficialmente como se
describe (Sharifi-Tehrani et al. 1998) y se germinaron durante 3 días
en agar con agua al 1,2% a 24°C en la oscuridad. Células bacterianas
de cultivos LB durante la noche de la cepa KD o suHRCV–mutante se
lavaron con solución de NaCl al 0,9% y las suspensiones se ajustaron
a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 1,25 (es decir, 109UFC ml–
1). Se añadió suspensión celular (100 ml) a la mezcla para macetas,
correspondiente a 5 × 107UFC añadidas por gramo de mezcla para
macetas. En los controles sin inoculante bacteriano se añadió el
mismo volumen de agua bidestilada autoclavada. Después de la
inoculación o inoculaciones, la mezcla para macetas se mezcló
completamente. Un total de 36 macetas experimentales (70 cm3,
que contenía aproximadamente 85 g de mezcla para macetas)
distribuidos en nueve bandejas (es decir, nueve réplicas, con cuatro
macetas por réplica) se prepararon por tratamiento. En cada maceta
se sembraron cinco semillas de pepino pregerminadas. Las charolas
se colocaron en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (15 kLux)
a 22°C y 8 h de oscuridad a 17°C siguiendo un diseño de bloques al
azar. Se añadió agua bidestilada a cada bandeja (150 ml después de
la siembra, luego 50 ml al día) para alcanzar aproximadamente el 35
% peso/peso en la mezcla para macetas por movimiento capilar del
agua.
A los 7 días, se contaron y pesaron las plantas emergentes y se
determinó por triplicado el número de células de los inoculantes
bacterianos para el sustrato de la mezcla para macetas, la rizósfera
(es decir, la mezcla para macetas adherida estrechamente a la raíz) y
la raíz misma (es decir, el sustrato). superficie de la raíz y tejidos
radiculares internos) como se describe (Hase et al. 2000). La siembra
se realizó en agar papa dextrosa (Beever y Bollard 1970) (preparado
de acuerdo con las instrucciones de Difco Laboratories) que
contenía cloranfenicol (50 µg ml–1), que permitió la selección e
identificación visual de KD y suHRCV–mutante, ambos produciendo
998/Interacciones Moleculares Planta-Microbio
colonias azules en este medio. Las colonias se contaron después de 24 h
de incubación a 27ºC. No se encontró colonia azul al estudiar
tratamientos sin inoculación bacteriana. La identidad de la cepa se
verificó mediante PCR utilizando cebadoresΩ-adelante yΩ-rev descrito
anteriormente.
Construcción de unhrpJ′-inaZfusión transcripcional en el
plásmido pAD1.
El plásmido pAD1 fue proporcionado por N. Chaney y JE Loper
(Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de
Investigación Agrícola, Unidad de Investigación de Cultivos
Hortícolas, Corvallis, OR, EE. UU.). Se había construido
reemplazandogfpconinaZen pSONDA'gfp[sin etiqueta] (Miller et
al. 2000) (número de acceso AF286456), como sigue. La región
codificante deinaZdePseudomonas siringaeS203 (número de
acceso X03035) se extirpó de pJEL1696 (Loper y Lindow 1994)
usando ecológicoRI yBamHI y gel purificado. La región
codificante del gen de la proteína verde fluorescentegfpfue
extirpado de pPROBE′gfp[sin etiqueta] porHindeleción dIII y el
vector resultante digerido conHinIII yBamHola, antes de la
ligadura deinaZusando una combinación deecológicoRHODE
ISLAND-xmnyo yHindIII-xmnI adaptadores, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Beverly, MA,
EE. UU.). El plásmido pAD1 se transfirió aPseudomonascepa
CHA0 por movilización deE. coliDH5α (Sambrook et al. 1989).
Los cebadores de 30 mer prottss-2fB (5′-GTCTGGATCC CCCT
GATCTTTTGCGATGTG-3′)y prottss-1rB (5′-TCTTGGAT CC
GTCGAGCTGACGAAGGAGAG-3′),ambos contienen un BamEl sitio
de restricción HI (subrayado) se diseñó con base en las
secuencias del gen TTSS de la cepa KD (Rezzonico et al. 2004)
para amplificar un fragmento de 405 pb que contiene la región
promotora delhrpJ-hrcNoperón de KD en una reacción de PCR
que consiste en una desnaturalización inicial de 5 min a 95 °C,
seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 60 °C y 1 min a 72 °C,
y una elongación final de 10 min a 72°C. El tamaño del producto
de la PCR se comprobó mediante electroforesis en agarosa al
1,5 % y el fragmento se purificó con el kit de extracción en gel
QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). Mientras tanto, el vector
pAD1 se obtuvo de un cultivo nocturno de 15 ml de
Pseudomonas cepa CHA0/pAD1 en LB que contiene kanamicina
(50 µg ml–1) utilizando el sistema de purificación de ADN Wizard
Plus SV Minipreps (Promega Corp., Madison, WI, EE. UU.). Tanto
el vector de plásmido como el amplicón de PCR se digirieron
conBamHI y ligados juntos, después de la desfosforilación del
vector usando fosfatasa alcalina de camarón (USB Corporation,
Cleveland, OH, EE. UU.), usando T4-ligasa (USB Corporation). El
producto de la ligadura se transfirió a un laboratorio
competente.E. coliCélulas DH5α (Life Technologies Inc.,
Rockville, MD, EE. UU.) por transformación, siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las colonias resultantes se
examinaron en busca de una sola copia y la orientación correcta
del inserto en el plásmido utilizando enzimas de restricción.
ecológicoRI yClaI, y PCR con cebadores AD1mcs-3f (5′-AGG
AATTGGGGATCGGAAGC-3′,hibridación con el sitio de clonación
múltiple de pAD1) e InaZ-2r (5′-ATGTCTGCAACGG CAACTTC-3′,
recocido al comienzo del gen reportero), ambos diseñados en el
trabajo actual, en combinación con prottss-2fB y prottss-1rB
(Fig. 1). El plásmido de la colonia así seleccionada se denominó
pADJ6 (Fig. 1). La región promotora se verificó por PCR usando
los cebadores AD1mcs-3f e InaZ-2r y la secuenciación usando el
ABI PRISM BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit (v3.0;
Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) y un secuenciador
ABI3100 (Applied Biosystems) , seguido de análisis utilizando el
software Chromas (versión 1.45; Technelysium Pty. Ltd.,
Helensvale, Australia). El plásmido pADJ6 se purificó a partir deE.
colicomo se describió anteriormente y se transformó en CaCl2-
células KD competentes, como se describe (Cohen et al. 1972).
 La estabilidad del plásmido pADJ6 in vitro se determinó
replicando la placa en agar King's B suplementado con kanamicina
(50 µg ml–1). Durante 4 días se subcultivó la cepa KD/pADJ6 cada 12
h en LB sin antibióticos a 27°C con agitación. Se estimó el número
de generaciones y se determinó el porcentaje de colonias
resistentes a la kanamicina (indicativo de la presencia de pADJ6). La
actividad de nucleación de hielo basal del inóculo se evaluó en
diluciones de 10 veces de cultivos LB durante la noche, como se
describe a continuación.
Análisis deinaZactividad in vitro.
la actividad de lahrppromotor se evaluó in vitro midiendo la
actividad de nucleación de hielo de la cepa KD/pADJ6. KD/pADJ6 se
inoculó en una DO inicial600= 0.0001 (correspondiente a 4.9 log10
células ml–1) en 30 ml de medio LB, ya sea solo o junto con un disco
de 6 mm de agar malta cubierto conP. ultimo, 2 g de plántulas de
pepino de 2 días esterilizadas en autoclave, o 2 g de plántulas de 2
días desinfectadas superficialmente durante 30 min en una solución
de hipoclorito de sodio al 2%. Kanamicina (10 µg ml–1) se agregó al
usar pepino desinfectado en la superficie, para evitar el crecimiento
de contaminantes bacterianos. Se añadió un disco de agar de malta
sin inocular en el control. Se tomaron muestras a las 0, 8, 16, 19, 24
y 27 h después de la inoculación. El crecimiento bacteriano se evaluó
midiendo la DO600y número de células estimado (con 0.125 OD600
unidades correspondientes a 108células ml–1).inaZ la actividad en
cada muestra se determinó utilizando diluciones en serie de 10
veces, como se describe a continuación.
Análisis deinaZactividad en mezcla para macetas no estéril.
El montaje del experimento para evaluarinaZla actividad en la mezcla para
macetas fue similar a la del experimento de biocontrol descrito anteriormente,
y KD que lleva elhrpJ′-inaZSe utilizó el plásmido pADJ6 (en lugar de la cepa KD y
suHRCV–mutante). Se usaron cuatro macetas que contenían cinco semillas de
pepino cada una por tratamiento. Después de 7 días en la cámara de
crecimiento, las plantas de cada maceta se retiraron de la mezcla para macetas
y se agruparon. Se tomaron muestras de los sistemas de raíces de todas las
plantas emergentes y se enumeraron las UFC del inoculante en el sustrato de
la mezcla para macetas, la rizosfera y las raíces sembrando en agar papa
dextrosa suplementado con kanamicina (50 µg ml–1), como se describió
anteriormente. Las mismas diluciones en serie de 10 veces también se
sometieron al ensayo de nucleación en hielo. Esto se hizo utilizando una
modificación del método descrito por Loper y Lindow (1997). Para todas las
muestras, la concentración de núcleos de hielo se determinó colocando 40
gotas (cada una de un volumen Vdr.= 10 µl) en una lámina de aluminio
recubierta de cera (Turtle Wax, Skelmersdale, Inglaterra) enfriada a
– 6ºC en baño de etanol. La fracción (F) de congelación de gotitas en
cada dilución (DSrepresentando la dilución de la suspensión inicial) y
la actividad de nucleación de hielo se expresó como el número de
núcleos producidos. El número de núcleos se determinó como ln(1/
[1 –F])/[Vdr.× DS), según lo propuesto por Vali (1971), y normalizado
por el número de UFC recuperadas de cada muestra.
Actividad pectinasa deP. ultimoin vitro.
El efecto de la cepa KD y suHRCVmutante sobre la actividad de la
pectinasa poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) producida porP. ultimose
midió en medio Czapek suplementado (5 gl–1) con malta (es decir,
Czapek-Malt) o en LB, utilizando microplacas TPP de 12 pocillos
Costar (Corning Inc. Life Sciences, Acton, MA). Un enchufe de 6 mm
deP. ultimoSe añadieron células bacterianas lavadas o ambas a 3 ml
de medio. En ciertos pocillos se añadieron también 500 µl de una
suspensión obtenida por maceración de plántulas de pepino
esterilizadas en autoclave en NaCl al 0,9%. Los controles recibieron
un tapón de agar de malta no inoculado, 500 µl de solución de NaCl
al 0,9 % o ambos. La DO inicial600
cuando se utilizaron bacterias fue de 0,125 (es decir, 108células ml–1). Las
microplacas se incubaron en un agitador rotatorio a 45 rpm y 24 °C. Se
tomaron muestras (200 µl) de cada pocillo en cada muestreo hasta 64 h
después de la inoculación. La actividad de la pectinasa se evaluó en un
ensayo de placa de copa realizado con placas de agar al 1,2 % que
contenían ácido poligalacturónico al 1 %, extracto de levadura al 1 %,
EDTA 2,2 mM y acetato de sodio 110 mM (pH 5,5) (Chatterjee et al. 1995).
Se perforaron orificios (6 mm de profundidad) en el agar usando un
sacacorchos estéril de 6 mm de diámetro y se llenaron con las muestras.
Las placas se incubaron durante 2 días a 24ºC y se trataron vertiendo HCl
fumante al 37% (Merck, Darmstadt, Alemania), lo que da como resultado
una zona de separación donde se ha hidrolizado ácido poligalacturónico,
sobre la superficie. Los datos de la placa de copa se registraron 30
minutos más tarde y se expresaron como la relación del diámetro de la
zona de limpieza obtenida con el sobrenadante de la muestra dividido
por el diámetro obtenido con una solución que contenía 0,1 unidades de
pectinasa comercial (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Alemania). ). No se encontró actividad de pectinasa al agregar bacterias o
plántulas de pepino maceradas en ausencia deP. ultimo. Cada
tratamiento se estudió por triplicado (es decir, en tres pozos, cada uno
ubicado en una microplaca diferente). El experimento se ejecutó dos
veces, con resultados similares.
Análisis estadístico.
Todos los experimentos se realizaron dos o tres veces, con resultados
similares, y los datos de un ensayo se presentan en las figuras. En todos
los experimentos, cada tratamiento se repitió al menos tres veces. Los
datos se sometieron a análisis de varianza y, al comparar tres
tratamientos o más, se separaron las medias (cuando correspondía)
utilizando las pruebas de diferencia honestamente significativa de Tukey.
Todos los análisis se realizaron enPAG<0.05 utilizando Systat (versión
10.0; Systat Inc., Evanston, IL, EE. UU.).
EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Investigación
Científica (proyecto 31-64048.00), la Embajada de Francia en Suiza (beca de
investigación Francia-Suiza) y el proyecto PAI Francia-Suiza 'Germaine de Staël'.
Agradecemos a N. Chaney y J. Loper (Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos–Servicio de Investigación Agrícola Unidad de Investigación de Cultivos
Hortícolas, Corvallis) por el regalo del plásmido pAD1, a R. Notz (ETH) por el
asesoramiento técnico en los experimentos de nucleación de hielo y a T Corberand y
P. Lemanceau (INRA, Dijon, Francia) por su ayuda con la evaluación de la respuesta
hipersensible de la cepa KD.
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vol. 18, núm. 9, 2005 /1001