F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

Efecto de la dexametasona sobre la actividad de fenoloxidasa

en la respuesta inmune de Aedes aegypti
Ana Beatriz Celma,1 Carlos G. García,1 Lilia A. González,1
Fernando García,1 y 2 Humberto Lanz3 y Fidel Hernández1 y 2
1
Universidad Simón Bolívar, 2Cinvestav-Instituto Politécnico Nacional,3CISEI-Instituto Nacional de Salud Pública

Resumen

Aedes aegypti es un díptero (Culicidae) vector de enfermedades como el dengue y la fiebre

amarilla. El conocimiento de los mecanismos de la respuesta inmune de estos mosquitos
resulta fundamental para, en un futuro, diseñar estrategias en el control biológico de estas
enfermedades. El sistema de la profenoloxidasa (proFO) es un mecanismo inmune enzimático
en cascada activado por moléculas de la superficie de microorganismos. El objetivo fue eva-
luar la actividad de la proFO en presencia de dexametasona (inhibidor de síntesis de
prostaglandinas) a diferentes concentraciones.

Abstract

Aedes aegypti is a dipterous (Culicidae) vector of diseases such as dengue and yellow fever.
The knowledge of the mechanisms of the immune response of these mosquitoes is relevant
and can be helpful in the design of strategies for biological control. The system
prophenoloxidase (proFO) is an enzimatic mechanism in cascades wich is activated by molecules
found in the surface of microorganisms. The objective was to evaluate the proFO activity in
presence of dexametasone (prostaglandin synthesis inhibitor) at different concentrations.

Introducción La melanización consiste en una serie de reacciones

Los invertebrados no tienen inmunoglobulinas ni
linfocitos. Algunos de sus mecanismos de defensa
para evitar el establecimiento de patógenos son: el
endurecimiento de la exocutícula, proceso donde
se añaden moléculas de quitina y melanina al pa-
tógeno (Ashida y Brey, 1995); encapsulación (Pech y
Strand, 2000); melanización del agente extraño para
inmovilizarlo; fagocitosis; formación de nódulos
(Stanley, 1998), y producción de quinonas citotóxi-
cas. Estas funciones son llevadas a cabo por los he-
mocitos (Gillespie, Kanost y Trenczek, 1997), en res-
puesta a la presencia de componentes micóticos y
bacterianos en ausencia de especificidad y de me-
moria inmunológica (Nation, 2002).
Algunos componentes de la respuesta inmune se
encuentran integrados en cascadas de reacciones co-
mo la coagulación y la activación de la proFO (Her-
nández, Gollas y Vargas, 2000).
que comienzan con la hidroxilación de tirosina para
formar L-DOPA (L-hidroxifenilalanina), la cual sufre
oxidación y da lugar a los dopacromos que producen
inolquinonas que se polimerizan y forman la mela-
nina (Söderhall e Iwanaga, 1996).
Las prostaglandinas (PGs) son eicosanoides cíclicos y
derivan de ácidos grasos monocarboxílicos insatu-
rados de 20 carbonos, los cuales están formados por
dos cadenas y un anillo de cinco carbonos, y están
relacionadas con la estimulación de la adenil ciclasa.
La dexametasona es un glucocorticoide que induce
la síntesis de lipocortina, la cual bloquea las primeras
reacciones enzimáticas involucradas en la síntesis de
protaglandinas (PGs) (Funk, 2001), inhibiendo la fos-
folipasa A2, por lo tanto, se frena la síntesis de ácido
araquidónico y de los derivados de éste, como son
las PGs (García, Lanz, Rojas y Hernández, 2002).

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La activación del sistema de la proFO se presenta
gracias a la transformación de esta proteína a
Fenoloxidasa (FO), dicho proceso se da por hidrólisis,
mediada por una proteasa de tipo serina que recibe
el nombre de enzima activadora de la proFO
(EAproFO). Esta reacción se inicia gracias a la unión
de los componentes estructurales de la membrana
de agentes micóticos y bacterianos, como los lipopoli-
sacáridos (LPS) y ß-1-3 glucanos (Laminarina), a un
receptor de membrana. Una vez activada la FO,
comienzan las reacciones de reducción de óxido que
permiten que los difenoles se transformen en qui-
nonas, moléculas precursoras de la melanización.
El conocimiento actual del sistema inmune de los
hexápodos deriva en su mayoría de los estudios
genéticos y moleculares en Drosophila (Zdobnov et al.,
2002). Sin embargo, al comparar otros organismos,
como el mosquito Anopheles, que responde a las
infecciones por Plasmodium, encontraron que los
genes en A. gambiae están asociados con la inmunidad
del insecto, y se demostró que ellos divergen amplia-
mente de los de Drosophila (Christophides et al., 2002).
Buenos ejemplos son las enzimas proFO (nueve en
el mosquito, tres en la mosca de la fruta); ya que
estas enzimas catalizan la síntesis de melanina, la
cual está asociada con varias reacciones de defensa
entre los insectos.
García Gil et al. (2002) realizaron un estudio sobre el
efecto de los inhibidores de la síntesis de prosta-
glandinas sobre la coagulación en el homóptero
Dactylopius coccus (cochinilla del nopal).
Aedes aegypti es un díptero de la familia Culicidae,
y la importancia de su estudio radica en que es un
vector de enfermedades como el dengue, la fiebre
amarilla y varios virus, entre ellos, el transmisor de
la encefalitis. Por tal motivo, el conocimiento del
sistema inmunológico de esta especie permitiría
crear estrategias para el control biológico, por
ejemplo, mediante una inmunodepresión específica
para dicho organismo (Söderhäll e Iwanaga, 1996).
Las hembras representan el factor de riesgo dentro
de este género, por ser hematófagas, hábito que
las hace susceptibles a adquirir el arbovirus (den-
gue o fiebre amarilla) (Söderhäll e Iwanaga, 1996).
El estudio de los hexápodos vectores cobra mayor
relevancia debido a que tienen una distribución
mundial, que abarca desde regiones tropicales, hasta
templadas.
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Objetivo
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la
dexametasona sobre la actividad de la proFO en la
hemolinfa de mosquitos de la especie Aedes aegypti,
con el propósito de, en un futuro, proponer estra-
tegias en el control de estos vectores dentro de sus
poblaciones naturales.
Metodología
Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo
fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las
compañías Sigma Chem (St. Louis Missouri),
Invitrogen y PE Applied Biosystems.
Para la realización de este proyecto, se obtuvieron
mosquitos A. aegypti cultivados en el insectario del
Centro de Investigación sobre Enfermedades Infec-
ciosas (CISEI) de Cuernavaca, Morelos, bajo condi-
ciones estándar (Chan et al., 1994) (Castex, Fachado
y Fonte, 1997).
Obtención de la hemolinfa. Para la manipulación
de A. aegypti, los ejemplares se sometieron a bajas
temperaturas para inducir un estado de letargo. Se
separaron en grupos experimentales de 15 hembras
cada uno, la extracción de la hemolinfa se hizo me-
diante una incisión en el abdomen y un centrifugado
de 15 min, dejando caer la hemolinfa en 50 µl de
NaCl (cloruro de sodio) al 0.8% para el grupo con-
trol. Para los grupos experimentales, se agregaron
concentraciones de 12.5, 25 y 50 µg/µl de dexame-
tasona y se incubaron durante 30 min.
Electroforesis de proteínas. Para su análisis, se ex-
trajeron proteínas, las cuales fueron obtenidas en pre-
sencia de inhibidores de proteasas (minicomplete TM
protease inhibitor Amersham Inc.), preparados en
amortiguador PBS (19 mM NaH2 PO4, 8.1 mM Na2
HPO4, 154mM NaCl, pH 7.4). Esto se corrió en un gel
de acrilamida (PAGE-SDS) al 10%, 100-110 Volts/2 h,
colocando 17 µg de proteína. Se realizó la cuantifica-
ción proteica por medio del método de Bradford.
La actividad enzimática se analizó mediante un
método espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En
los pozos de esta placa se agregó 30 µl de un sustrato,
L-dopa (4 mg/ml) más el inhibidor, 12.5, 25 y 50 µl de
hemolinfa y 30 µl del agente microbiano (LPS o
Laminarina). Los cambios de tonalidad se analizaron
19
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mediante espectrofotometría a 420 nm. Para determinar de manera cuantitativa si existen diferencias significativas
entre los grupos (p<0.05), se realizó la prueba estadística de Tukey (Sigma Stat 2.03).

Resultados
Análisis espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En todos los pozos se añadió L-dopa como sustrato,
un componente de membrana de microorganismo (LPS o Laminarina) y hemolinfa. En los pozos experimen-
tales se agregó un inhibidor de prostaglandinas (dexametasona) a diferentes concentraciones.

En el grupo 1, que contenía LPS como activador de la reacción inmune, se observó una melanización que se
consideró como testigo para comparar la concentración de melanina obtenida.

El grupo 2 fungió como un segundo grupo control (sin dexametasona), en el cual se utilizó laminarina co-
mo activador.

Al grupo 3 se le añadió dexametasona 12.5 µg/µl y LPS como activador. La melanización obtenida fue intensa,
análoga a los grupos control.

Al grupo 4 se le añadió dexametasona 25 µg/µl y LPS. Se observó una reducción en la melanización respecto al
grupo 3, pero no en relación con los grupos control.

El grupo 5 se trabajó con dexametasona 50 µg/µl y laminarina. La concentración de melanina disminuyó

respecto a los grupos control y a los dos grupos experimentales anteriores.

Tabla 1. Cuantificación de la producción de melanina en multiplaca ELISA por espectrofotometría (ABS 420 nm)

Grupo HL Dexametasona Laminarina LPS L-dopa Absorbancia (420nm)

1 (Control) + - - + + 0.000

2 + - + - + 0.036

3 + + - + + 0.290

4 + + - + + 0.055

5 + + + - + 0.001

Cuantificación de melanina (420 nm) en los diversos tratamientos de los pozos de la multiplaca ELISA.

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Figura 1. Efecto de la dosis de dexametasona sobre la producción
de melanina
1 2 3 4
HLc+Lam+ HL+dexa HL+dexa
L-dopa 50µg+LPS+ 25µg+LPS+
L-dopa L-dopa
Tratamientos (n=2) Tukey: P< 0.05
Actividad protéica por electroforesis (PAGE-SDS).
En el carril 1, se corrió el marcador de peso molecu-
lar; carril 2, la muestra del grupo control; carril 3,
tratamiento con dexametasona 25 µg/µl; carril 4, tra-
tamiento con dexametasona 50 µg/µl. No se apreció
ningún cambio aparente en el patrón de bandas de
proteínas en los diferentes tratamientos. En el grupo
control, se observaron los patrones proteicos nor-
males que posee el mosquito como respuesta ante
un agente extraño. El tamaño y grosor de las bandas
varió respecto a los otros dos carriles.
Figura 2. Análisis de proteínas de HL de A. aegypti por PAGE-SDS
KDa
Discusión
La activación de ciertas moléculas de la respuesta
inmune en invertebrados puede deberse a la presen-
cia de los agentes patógenos. El análisis de nuestros
resultados mostró que en todos los ensayos realiza-
dos existe un efecto del inhibidor de prostaglandina
(dexametasona) sobre el inductor LPS y laminarina.
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En el análisis espectrofotométrico de la melanización,
se observa que la dexametasona, a una concentración
de 25 µg/µl, tuvo el efecto más significativo. Esto se
puede comprobar mediante el análisis a detalle del
gel de proteínas, a través del cual se puede observar
que el ancho de las bandas de los carriles tres y cuatro
son distintas en cuanto a intensidad.
Para el análisis cuantitativo de estos resultados, se
aplicó la prueba estadística de Tukey, en donde la
probabilidad es < 0.05. Se demostró que existe una
HL+dexa diferencia significativa entre los tratamientos dexa-
12.5µg+Lam+
L-dopa metasona 12.5 µg/µl vs. 50 µg/µl. Los tratamientos
dexametasona 12.5 µg/µl vs. 25 µg/µl, dexa. 25 µg/µl
vs. control y control vs. dexa. 50 µg/µl, no mostraron
diferencia significativa.
El gel de acrilamida mostró un aumento de la activi-
dad proteica en las bandas correspondientes a 25 kDa,
lo que podría significar la presencia de péptidos
antimicrobianos caracterizados por un peso molecu-
lar similar (Müller, Dimopoulos, Blass y Kafatos, 1999).
Conclusiones
Las prostaglandinas tienen efecto sobre la respuesta
de melanización en Aedes aegypti y ésta puede ser
inhibida por acción de la dexametasona a concen-
traciones de 12.5, 25 y 50 µg/µl.*
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* Agradecemos el apoyo brindado por la Coordinación de Investi-

gación de la Universidad Simón Bolívar y del laboratorio de
Entomología Molecular del Cinvestav-IPN, así como al insectario
del CISEI-INSP.

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