15 de Septiembre de 2020

Dr. Alex Romero

Acuicultura y enfermedades de peces

CLASE 5: VACUNAS
Vacunas
Algunas vacunas están presentes en el mercado y otras en fase de experimentación. Las vacunas
antes de poder usarse tienen que ser probadas, y deberían estar seguras de que no producirán
efectos adversos o ningún efecto sobre la producción.
● El propósito de una vacuna es estimular la respuesta inmune sin someter al individuo
vacunado al riesgo de una infección real.
● La vacunación se ha practicado por más de 200 años manteniéndose el objetivo de inducir
una respuesta inmune humoral y/o celular que proporcione una protección frente a la
infección natural con el patógeno, tomando la capacidad de los animales de presentar una
memoria inmunológica. Si el individuo se enfrenta al patógeno su respuesta será mucho
mayor en comparación a si se enfrentara por primera vez sin vacuna previa.

Estado actual de las vacunas para peces

De las varias estrategias de vacunación posibles de aplicación a peces, cada una tiene sus ventajas
y desventajas:
● Patógenos vivos atenuados: normalmente producen buena inmunidad en los peces, pero
tienen un riesgo asociado debido al riesgo de reversión de la virulencia, especialmente para
otras especies silvestres de peces.
○ Vacuna viva heteróloga: Renogen → Contra BKD, enfermedad bacteriana del riñón,
producida por Renibacterium salmoninarum. Es particular ya que está formada por
Arthrobacter spp, una bacteria similar filogenéticamente a Renibacterium
salmoninarum (comparten antígenos comunes y Arthrobacter no es patógena).
También puede tener acción con la piscirickettsiosis. Hay más vacunas heterólogas
para otras especies, pero en salmónidos esta es la más importante.
○ Vacuna viva atenuada: LiVac → Contra la Piscirickettsia salmonis. Posee peligro de
reversión de la virulencia. Está compuesta por el patógeno Piscirickettsia salmonis
atenuado. La atenuación se produce debido a que se cultiva seriadamente sin tener
que infectar a un pez, reduciendo sus factores de virulencia porque la bacteria no la
expresa. Tanto las vacunas vivas heterólogas y vivas atenuadas mantienen una
actividad antigénica alta, por lo tanto, producen una fuerte respuesta mediada por
anticuerpos y son fácilmente reconocidas por macrófagos. Las vacunas inactivadas
trabajan a nivel del sistema inmune humoral, mientras que en el caso de la vacuna
con la bacteria viva atenuada, esta trabaja fortaleciendo el sistema inmune celular. Al
ser la Piscirickettsia salmonis una bacteria intracelular, los anticuerpos generados por
la vacuna inactiva en muchos casos son menos eficaces en detectarla. En cambio,
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
Alpha Jct LiVac SRS actúa a nivel celular fagocitando las células donde se encuentra
la bacteria, por lo que es más efectiva.

Se han hecho varios estudios de esta vacuna. En el primer grafico se ve la mortalidad

de la Piscircikettsiosis usando la vacuna viva atenuada (azul) y la inactivada (amarillo).
La mortalidad con la vacuna viva atenuada es menor, y esto dentro de un sistema
productivo es significativo. Lo mismo ocurre con el índice de consumo de antibióticos,
en donde los peces con vacuna atenuada azul tienen una disminución del uso de
antibióticos. Finalmente, la biomasa cosechada, que es lo que los productores quieren,
es mayor en peces vacunados con vacuna viva atenuada, vs con la vacuna tradicional
inactivada. Estos resultados dan cuenta de que esta vacuna tiene buenos resultados
del punto de vista productivo. Se han realizado todas las pruebas y se ha concluido
que la vacuna viva atenuada no tendría problemas de reversión de virulencia, por lo
que si se puede aplicar en el sistema productivo.

o Vacunas mucosas: Son aquellas que se aplican a nivel de mucosas debido a que en
estas hay tejido linfoide que puede ser estimulado.

o Vacunas orales: Aprovechando que el intestino tiene una alta cantidad de superficie y
este también tiene tejido linfoide asociado, se usan vacunas orales. Los peces son
capaces de absorber y presentar antígenos en el segundo segmento del tracto
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
intestinal principalmente. En este caso, el antígeno es incorporado en el alimento, y esto
se puede hacer de varias formas en el proceso de elaboración del alimento. En la imagen
con tinción, podemos ver como se absorben los antígenos provenientes del alimento a
ese nivel, por lo tanto, si podemos usar esa vía para inmunizar a los peces.
➢ Desventajas:
- Requiere que todos los peces coman, y ojalá una misma ración → Si el pez por alguna
razón no puede comer (por enfermedad previa o por jerarquía) no obtendrá la
inmunización.
- Integridad del antígeno → Debe mantenerse a través del tracto gastrointestinal donde
hay variaciones de pH importantes. Se ha arreglado con estrategias de
microencapsulación.
- Debe mantenerse por un tipo mínimo → Para ser absorbido en el intestino.
➢ Ventajas:
- Ahorro de inyección y efectos relacionados → Esto generalmente se hace a nivel de
engorda, en el mar.
- Posibilidad de booster (s) → Permite reforzar a la vacuna que se inyecta al animal. Se
hace especialmente cuando los peces cambian a agua dulce.
Blueguard SRS oral → Es una vacuna oral usada para combatir la piscirickettsiosis
salmonis. Tiene un sistema de microencapsulación para proteger al antígeno en su paso
por el tracto gastrointestinal. Se utiliza principalmente en salmones en fase de mar.
Durante la vacunación en agua dulce los niveles de anticuerpos van subiendo, pero
cuando se hace el proceso de cambio a agua de mar bajan los anticuerpos por lo que hay
una ventana de susceptibilidad que provoca una posible infección. Debido a esto se
administra Blueguard SRA oral en fase de mar, ya que es un booster para la vacuna
inyectable de fase dulce, recuperando el número de anticuerpos y disminuyendo la
probabilidad de que se infecten peces con el patógeno. La linea roja es la suceptibilidad
de los peces a infeccion en relación a la cantidad de anticuerpos, con el booster es más
constante.
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
● Patógenos inactivados: No tienen riesgo de reversión porque se inactivan tanto por un
shock de temperatura o de forma química (principalmente formalina), sin embargo, estos dos
procesos hacen que los antígenos disminuyan significativamente, por lo tanto si bien
mantienen su efecto protector, el hecho de inactivar provoca una baja en la antigenicidad. Se
usan varias de estas para salmónidos. Riesgo de reversión si no están completamente
inactivadas. Son poco inmunogénicas. Las bacterias muertas (bacterinas) se usan como
vacunas para peces, pero excepto unos pocos ejemplos (Yersinia, Aeromonas, Vibrio, etc.)
la mayoría deben de ser inyectadas con adyuvantes (para mantener una liberación constante
del antígeno, además de activar de forma inespecifica la inmunidad de los peces) oleosos
(aceitosos) que pueden causar alteraciones en las vísceras, en el lugar de inyección
(adherencias).
*Aún no se ha demostrado claramente la hipersensibilidad en peces.
Sistema de expresión de proteínas recombinantes E. coli
• Vacunas recombinantes: Pueden ser
inyectables o por vía oral. Se han encontrado
proteínas altamente antigénicas en patógenos,
y estas proteínas son codificadas por genes, por
lo tanto lo que se hace es aislar al gen de esa
proteína, se incorporan a un plasmidio, y este
plasmidio se transfiere a una E. coli, el cual será
capaz de producir la proteína recombinante del
patógeno. Posteriormente se extraen y se
purifican las proteínas recombinantes
purificadas, altamente antigénicas y se elabora
una vacuna recombinante. Una vacuna puede
estar compuesta por más de una proteína.
Las vacunas por subunidades; generalmente
vacuna recombinantes: son caras de producir
en grado de purificación suficiente y en cantidad.
Definición: Se considera una proteína recombinante aquella proteína cuya síntesis se
realiza en un organismo distinto al nativo (*).

Está el gen del patógeno. Esto se inserta en un vector o plasmidio, se pone en E. coli y se obtiene
la proteína antigénica.
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
Una empresa farmacéutica está tratando de hacer una vacuna recombinante contra COVID-19
usando una proteína de superficie del virus.

Ejemplo de vacuna recombinante:

Trabajo realizado por un grupo chileno, donde utilizaron proteínas recombinantes para producir una
vacuna para pisciriketsiosis en el 2006. Dentro del genoma de P. salmonis pudieron identificar
algunos genes que codificaban para proteínas asociadas a factores de virulencia o con alta
capacidad antigénica, varias de las proteínas estaban en la superficie de la bacteria, o eran
proteínas asociadas a factores de virulencia. La selección se hizo porque se sabía que estas
proteínas producían respuestas en otros hospederos tanto a nivel humoral como celular o bien eran
altamente inmunogénicas, principalmente esas asociadas al flagelo. Hicieron todo el proceso de
recombinación y usaron varias combinaciones o formulaciones de las proteínas.
Hicieron un ensayo con peces vacunados con las
vacunas recombinantes, y con peces control
inyectados con solución salina. Posteriormente los
peces fueron infectados con las bacterias para ver
como funcionaron las vacunas y pudieron ver que
a los 15 días empezaron a morir. Fueron 4 grupos:
• Control →A los 15 días comenzaron a morir.
Casi muruó el 100%.
• Formulación 1 → Si funcionó, la mortalidad
llegó máximo a 20%.
• Formulación 2 → Si funcionó, la mortalidad
llegó máximo a 20%.
• Formulación 3 → Funcionó, pero casi nada.
En A (arriba) se usó 8 veces la dosis local 50 (altísima), en B (abajo) se usó solo 2 veces la DL50
por lo que la inmunidad fue mejor.
La formulación 1 tenía proteínas de shock termino y flagelina. La formulación 2 tenía dos proteínas
de membrana. Estas dos fueron las que más funcionaron y se concluyó que las vacunas
recombinantes si funcionan. Comercialmente hoy en día muchas de las vacunas que se
comercializan tienen componentes recombinantes de los patógenos.
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
Tabla resumen con
investigadores, antígenos
utilizados, tipo de vacuna y su
eficiencia. Refleja lo que existe
hoy en dia en terminos de
vacunas aplicadas a los
peces.
▪ Bacterina (bacteria
muerta) inactivada por
formalina, resultados
inconsistentes.
▪ Proteínas
recombinantes, principalmente OspA o proteína de superficie A, tuvo un efecto importante.
▪ Vacunas de DNA, aún no se usan hoy en día.
▪ Bacterinas inactivadas por T° o formalina, con RPS 70 y 50%, no les fue muy bien.
▪ Otras proteinas recombinantes Hsp70 con mortalidad 8%, efecto importante.
▪ Arthrobacter davidanieli, vacuna viva heteróloga, tiene efectos sobre P. salmonis.
▪ Otras vacunas recombinantes del experimento donde los RPS fueron muy buenos 95-94%,
(Formulación 1). La formulación 3 tubo 10% de RPS, no le fue bien.
▪ Vacunas con bacteria completa inactivada que se incorpora en microcápsulas para su
utilización vía oral, tiene bastantes buenos resultados.
RPS → Índice de eficiencia de la vacuna, lo ideal es 90%. Es un cociente que se obtiene después
de un ensayo de desafío de un patógeno en peces vacunados. Es el cociente entre peces muertos,
sobrevivientes y el total de peces. Para que una vacuna sea eficiente tiene que tener 90-95%, 85%
aún es aceptable, cuando es menor a 80% la vacuna no es muy eficiente.

• Vacunas de DNA: Las vacunas de DNA constituyen, no una

nueva tecnología, pero si una distinta, de vacunación cuya
aplicación se comienza a experimentar en acuicultura. Se trata de
inducir inmunidad contra un patógeno utilizando la expresión in
vivo de alguna de sus proteínas a través de la transferencia de
gen(es) codificador(es) a las células del hospedador.
Se inyecta directamente el plásmido recombinante al hospedero
(pez), las células toman el DNA, forman proteínas que salen de la
célula y estas son tomadas como antígenos por el sistema inmune
(células presentadoras de antígeno, etc.) para producir
anticuerpos. Se ha probado y funciona bastante bien, pero hay
situaciones que no permite que se apliquen principalmente en peces aún.
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
Está el gen de interés, se incorpora dentro de
un plasmidio, se inyecta principalmente
intramuscular, y dentro de la célula muscular el
plasmidio produce la proteína, y la célula
secreta la proteína. La proteína se expone a
células del sistema inmune (células
presentadoras de antígenos, linfocitos, etc.) y
se producen anticuerpos. Lamentablemente la
célula que produce la proteína “heteróloga” es
eliminada, pero en ese proceso se alcanzan a
producir anticuerpos que van a mejorar la
respuesta contra el patógeno.
Etapas en el desarrollo de una vacuna DNA para peces
1. Identificación del patógeno capaz de inducir protección: ¿Qué gen elegir? Genes que
codifiquen para proteínas de la cápside o membrana, los de la superficie del patógeno ya que
son las primeras que serán reconocidas por las células presentadoras de antígeno.
2. Clonamiento del gen identificado en plásmidos adecuados.
3. Evaluación de la expresión de la vacuna: Para
optimizar la expresión in vivo y poder realizar gran
cantidad de experimentos. El nivel de transfección in vivo
puede ser evaluado por PCR (presencia del gen de
interés), así como por expresión de la proteína.
4. Evaluación in vivo: Para evaluar sus respuestas
inmunes humorales y celulares, así como su resistencia
a la contraprueba con el patógeno de interés.
Ejemplo imagen: Virus VHS, el gen en verde codifica para la
proteína de la superficie, y el plasmidio se inyecta en las células
musculares del pez.
Ejemplo paso 3: En la imagen A, se ve como inyectan
el plasmidio al pez intramuscularmente. Cuando se
incorpora, lo primero que hay que evaluar es que la
proteína se exprese, osea que el gen se transcriba y se
produzca la proteína. Esto se evalúa en la imagen B.
La imagen B es un corte histológico de músculo donde
fue inyectada la vacuna. Se le realizó
inmunohistoquímica con anticuerpos contra la proteína
de interés. Si fibras musculares tienen color rosado
significa que producen la proteína, mientras que las
fibras que no tienen tinción significa que no les llegó el
 15 de Septiembre de 2020
Dr. Alex Romero
Acuicultura y enfermedades de peces
plasmidio. Además, se ve un gran infiltrado inflamatorio principalmente de linfocitos en la parte
donde hay fibras musculares con tinción. Con el tiempo las células son eliminadas, pero en su
momento en que expresaron la proteína fue suficiente para que el pez desarrolle anticuerpos contra
el patógeno.
En la evaluación in vivo después de que ya se
sabe que se produce la proteína, se ve si se
produjo una respuesta inmune humoral
(anticuerpos) y celular. Cuando esto está probado
se enfrentan los peces vacunados ante el
patógeno.
Ejemplo paso 4: En la línea negra continua del gráfico se
inyectaron los peces con DNA, el plasmidio solo sin el
gen del virus VHS, es el control. Cuando estos peces se
enfrentan al patógeno la protección es nula y la
mortalidad llega cerca del 100%. Cuando los peces
vacunados con una concentración muy baja del
plasmidio (0.001 microgramos) recombinante hay cierta
protección, casi nada. Cuando empezamos a aumentar
la cantidad de DNA inyectado (0.01 – 0.1 – 1
microgramo), la protección va aumentando, incluso
llegando hasta casi un 100% de protección cuando se
una 1 microgramo. Por lo tanto, estas estas estrategias de vacunación son relativamente buenas.
*Tabla de todos los estudios de vacunas de DNA
para peces. En la mayoría de los casos existe
protección, en otras no, en otras es parcial,
depende del antígeno usado. Se usa
preferentemente para patógenos virales, es donde
más funciona, en bacterias si pero aún no hay
resultados consistentes.
¿Por qué no se usan mucho comercialmente
vacunas DNA? Porque el plasmidio que se usa ha
ido cambiando, pero algunos genes no han sido
adecuados para usarlos en peces. Hay una sola
que se comercializa en Canadá. Otra razón por la
que no se ha usado es que siempre está la
sensación pública de que eventualmente el
plasmidio pueda unirse al genoma de los peces, aunque no se ha comprobado queda la sensación
de que se puedan generar organismos genéticamente modificados, lo cual no es así pero esa es la
percepción. Además, para que el gen se exprese necesita un promotor, y se cree que el consumidor
al comerse un plasmidio con ese promotor genere un problema en él, pero son percepciones, no se
ha demostrado, ante las dudas estas vacunas solo quedan como experimentales.