Distribución del SNP rs8065080CC en poblaciones humanas y

su efecto sobre la proteína TRPV1

Khaleel Y. Mullah-Roa
khamullah3@gmail.com
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

RESUMEN
La capacidad de detectar y reaccionar ante estímulos potencialmente dañinos en el entorno
está seleccionada positivamente, esta capacidad se encuentra en todos los reinos de la vida, en
animales con un sistema nervioso complejo esta capacidad se conoce como nocicepción y
corresponde al proceso neural de codificación de los estímulos nocivos. Un receptor clave de
las neuronas nociceptoras es la proteína TRPV1. En este trabajo se usaron herramientas de
alineamiento de secuencias y de acoplamiento molecular (docking) para poner a prueba el
efecto que tiene el SNP rs8065080CC (que produce la sustitución no-sinónima I585V) en la
afinidad de TRPV1 por el ligando capsaicina. Además, se analizó la distribución de dicho SNP en
individuos de culturas asiduas a consumir alimentos picantes (Asia del Este) y no-asiduas
(Europa). Los modelos obtenidos por el docking no fueron favorables debido a que la proteína
no estaba en su forma biológicamente activa (en una membrana y formando homotetrámeros).
Sin embargo, se propone un mecanismo por el cual la mutación I585V podría disminuir la
sensibilidad a la capsaicina.

PALABRAS CLAVE
Capsaicina, picante, nocicepción, acoplamiento molecular.

INTRODUCCIÓN dominios y reinos de la vida gobernada por

los fenómenos de quimiotaxis y
Las palabras de Charles Darwin siguen quimiotropismo, no obstante, esta
siendo válidas aún después de 162 años: capacidad se ha llevado a otro nivel en las
"cualquier variación... si es en algún grado especies del reino Animal que poseen un
beneficiosa para un individuo de cualquier sistema nervioso complejo (es decir, los
especie... tenderá a la preservación de ese Poríferos no), en ellos la capacidad toma el
individuo, y generalmente será heredada nombre de nocicepción (derivada del latín
por su descendencia" [1]. De esta manera, un nocere que significa herir/dañar) y
organismo capaz de detectar y reaccionar corresponde al proceso neural de
ante estímulos potencialmente dañinos en codificación de los estímulos nocivos [2].
el entorno está seleccionado positivamente,
dicha capacidad se encuentra en todos los
Cuando dichos estímulos nocivos, son lo
suficientemente intensos y potencialmente
capaces de causar lesiones tisulares, se
alcanza el umbral de activación de las
terminales nerviosas nociceptivas, lo que
genera potenciales de acción que se
transmiten y son percibidos como señales
de dolor. La transformación de estos
estímulos en señales eléctricas y la
transducción de los potenciales de acción
implican la participación de múltiples
receptores y canales, siendo la superfamilia
TRP una de las más abundantes en las
terminaciones nerviosas libres y en las
terminales sinápticas [3].
La superfamilia TRP es topológicamente
similar a las otras superfamilias de canales
iónicos activados por voltaje debido a la
existencia en común del pliegue (fold) de
seis dominios transmembrana en sus
estructuras, en mamíferos esta superfamilia
se divide en siete familias: TRPC (Canonical),
TRPM (Melastatin), TRPV (Vanilloid), TRPA
(Ankyrin), TRPP (Polycystin), TRPML
(Mucolipin) y TRPN (no mechanoreceptor
potential C) [4]. Todos los TRP son canales
catiónicos, aunque la permeabilidad para
diferentes cationes mono y divalentes varía
mucho entre las isoformas. Dichos canales
generalmente son homotetraméricos,
aunque se han observado heterotetrámeros
compuestos por monómeros codificados
por genes de la misma familia [4, 5].
La familia TRPV ("vanilloide") comprende
actualmente seis miembros (TRPV1-TRPV6),
estos se dividen a su vez en dos subgrupos:
TRPV1-4 y TRPV5-6. El primer grupo, TRPV1-
4, forma canales que muestran una leve
selectividad de Ca2+ y además son
termosensibles. Mientras que los TRPV5 y
TRPV6 pueden formar canales que son
altamente selectivos para el Ca2+ [6]. Todas
estas proteínas contienen entre 3 y 5
repeticiones de anquirina en el extremo N-
terminal. A pesar de la gran similitud de la
secuencia, todos los miembros de la familia
TRPV presentan mecanismos de activación y
funciones fisiológicas específicas. Muchas
de las proteínas TRPV son activadas por
múltiples estímulos, lo que sugiere que
pueden participar en la activación de varias
cascadas descendentes [6].
El receptor vanilloide 1 (TRPV1), fue el
primer miembro de los mamíferos de esta
subfamilia que se identificó, y el que se ha
estudiado más ampliamente, cada una de
sus subunidades consta de seis hélices
transmembrana (S1-S6) más un dominio de
bucle-hélice reentrante situado entre S5 y
S6, lo que da lugar a una disposición en
forma de cono donde se encuentra el filtro
de selectividad (FS). Las hélices S5 y S6 y el
FS constituyen el poro central del canal, que
está flanqueado por un dominio tipo sensor
de voltaje (SV) formado por las hélices S1-
S4 [7]. Fuera de la membrana se encuentran
los dominios específicos de los TRP: (i)
cuatro repeticiones de anquirina en el
extremo N-terminal, responsables de la
unión de múltiples ligandos y de la
modulación de la sensibilidad del canal;7 (ii)
el enlazador P360-V415, conservado entre
los subtipos de TRPV, y que conecta las
repeticiones de anquirina con la hélice S1; y
(iii) una hélice interfacial extendida y
retorcida a continuación de S6, que
corresponde al característico "dominio TRP"
que se encuentra en muchos canales TRP [8].
El TRPV1 está ampliamente implicado en la
nocicepción donde contribuye a la
detección e integración de estímulos
químicos y térmicos dolorosos, siendo
activado por compuestos vanilloides como
la capsaicina, la resiniferatoxina y el olvanil,
así como por otros múltiples estímulos,
como el calor moderado (≥43 ◦C) y el pH
bajo (≤5,9) [4]. El agonista más estudiado de
los canales TRPV1 es la capsaicina. Esta
molécula procede de plantas del género
Capsicum, y es el componente activo de los
chiles responsable de la sensación de ardor.
El picante es, en general, una sensación
química repulsiva provocada por los
capsaicinoides de las plantas que, según se
cree, sirven para disuadir a los herbívoros
(mamíferos e insectos) y, al mismo tiempo,
permite a las aves, que son insensibles a
estos compuestos, ingerir las semillas para
una mayor dispersión [9]. Irónicamente, el
ser humano es la única especie que busca
deliberadamente el picante en los
alimentos, siendo este un ingrediente clave
para las cocinas de muchas culturas (como
México, China, Corea del Sur, Japón, India e
Indonesia) [10]. El grado de gusto por la
sensación picante difiere entre individuos
debido a factores de carácter genético,
personal y cultural [11]. En esta investigación
se emplearon métodos in silico para
determinar el efecto de la mutación I585V
(rs8065080CC) sobre la afinidad del
receptor TRPV1 por la molécula de
capsaicina en individuos de culturas asiduas
a consumir alimentos picantes (Asia del
Este) y no-asiduas (Europa).
MATERIALES Y MÉTODOS
Isoformas de TRPV1 en humano
Se descargaron secuencias de todos los
transcritos registradas para el gen TRPV1
(geneID: 7442) de humano en los servidores
NCBI y Ensembl (Tabla S1) y se alinearon
con MUSCLE [12] usando parámetros
estándar, se observa que todos los
transcritos producen péptidos con la misma
longitud, con lo cual se decidió escoger un
único péptido (NP_ 542437.2) como
representante de la especie humana para
los subsecuentes análisis.
Variación poblacional en el humano
Se consultó en la base de datos dbSNP del
NCBI [13]. los SNPs que generan mutaciones
no-sinónimas (Tabla 1) en los residuos de
aminoácidos reportados en la literatura
como importantes para la estabilidad de la
capsaicina en el receptor TRPV1 en
humanos. Estos SNPs se consultaron en la
base de datos del proyecto 1000 genomas
humanos [14] desde Ensembl para observar
su distribución en distintas poblaciones de
humanos.
Tabla 1. SNPs asociados a mutaciones no-sinónimas
en los residuos de aminoácidos clave para la
interacción con la capsaicina en TRPV1.
Posición en SNP asociado
el péptido
Y511 rs1367883955
S512 rs770999796
L547 rs919749928
T550 -a
E570 -a
I585 rs8065080
T671 rs745882219
a
: -No existen entradas asociadas a esta posición.
Además, se realizó una búsqueda con BLAST
para encontrar secuencias similares a NP_
542437 en humanos que provinieran de las
regiones geográficas en estudio.
Se realizó una prueba de Chi-cuadrado para
determinar si las poblaciones en estudio
(Tabla S2) estaban en equilibrio de Hardy-
Weinberg.
Variación entre primates
Se alinearon con COBALT [15] las secuencias
de todos los transcritos (observados
experimentalmente y predichos
computacionalmente) de 29 especies de
primates en la base de datos de ortólogos
para el gen TRPV1
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7442/
ortholog), para cada una de las 29 especies
se descargó la secuencia del péptido (Tabla
S3) que tuviera la longitud más cercana al
péptido de referencia en humano (NP_
542437.2, 839 aa) y posteriormente se
alinearon con MUSCLE usando los
parámetros estándar (Archivo S1).
Modelado de la proteína:
Se crearon dos modelos de la proteína
TRPV1 de humano (TRPV1-WT y TRPV1-
I585V) por homología empleando el
servidor Swiss-Model [16], se escogió como
plantilla la proteína 7LR0 [17] (TRPV1 de la
ardilla Ictidomys tridecemlineatus, la
estructura está unida a capsaicina y se
encuentra en una bicapa de un derivado de
la fosfatidilcolina) ya que presentó el mayor
valor de Score al realizar un BLAST contra la
base de datos del PDB (datos no
mostrados), la estructura de la proteína
7LR0 se determinó con cryo-EM a 3.81 Å, no
obstante contiene regiones indeterminadas
(residuos 1-110, 605-626 y 779-844).
Los modelos generados tuvieron valores
altos de QMEANDisCo (TRPV1-WT 0.76 y
TRPV1-I585V 0.73) lo que nos permite
usarlos para los análisis posteriores, estos
modelos se refinaron 1 vez en el servidor
GalaxyWEB [18], en todos los casos se
escogió el modelo que tuviera el mayor
valor del score Rama favored (Tabla 2) ya
que este indicador representa el porcentaje
de residuos que están en conformaciones
óptimas (respecto a los ángulos de torsión
de enlace Φi, Ψi) en el modelo.
Tabla 2. Calidad de los modelos (TRPV1-WT y TRPV1-
I585V) generados por homología, se emplea el score
de Rama favored como indicador de la calidad del
modelo antes y después de ser refinado.
Proteína Modelo Rama
favored
TRPV1-WT Inicial 88.6
Modelo 4 97.0
TRPV1-I585V Inicial 87.5
Modelo 1 96.1
Efecto de la mutación I585V en la afinidad
de TRPV1 por la capsaicina
Para determinar los efectos que tiene la
mutación I585V (rs8065080CC) en el
receptor TRPV1 de humano sobre la
afinidad por la capsaicina, se realizaron
ensayos de acoplamiento molecular
(docking) con ambos modelos (TRPV1-WT y
TRPV1-I585V) en presencia del ligando
capsaicina (ZINC1530575) en el servidor
web SwissDock [19], y posteriormente se
analizaron en UCSF Chimera [20] para
escoger los modelos que cumplieran los
siguientes criterios: 1) el valor de energía
libre más bajo; 2) el valor del score
FullFitness más bajo y 3) presencia del
ligando en el sitio de unión
correspondiente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De rata a humano: Trasladando las
mutaciones que afectan la interacción con
la capsaicina
Los primeros estudios estructurales de la en la bibliografía, todas las mutaciones de
proteína TRPV1 [21] fueron realizados sobre pérdida de función fueron nombradas a
una proteína truncada de rata (Rattus partir de la secuencia de rata.
norvegicus) que carecía de los extremos N y
De aquí en adelante, las menciones de los
C-terminal, estas estructuras resueltas se
residuos de aminoácidos clave para la
encuentran en el PDB bajo los códigos 3J5P
interacción con la capsaicina hacen alusión
(sin capsaicina) y 3J5R (con capsaicina) y
a la secuencia de TRPV1 de origen humano
fueron las que se usaron en estudios de
y no de rata (Figura 1).
mutagénesis sitio-dirigida para conocer los
residuos de aminoácidos clave para la
interacción con este ligando, es por ello que

Figura 1. Alineamiento de secuencias de la proteína TRPV1 en humano (NCBI: NP_ 542437), rata (PDB: 3J5R, usada
para la nomenclatura inicial de mutaciones) y ardilla (PDB: 7LR0, usada como plantilla para el modelado por
homología).

I585V en poblaciones que consumen (o no)
alimentos picantes
Al estudiar cómo están distribuidas las
frecuencias alélicas a lo largo de las 26
poblaciones diferentes comprendidas en el
proyecto 1000 Genomas Humanos se
observa que las frecuencias del alelo
rs8065080T (I585I) predomina en la
mayoría de poblaciones excepto en la
región del Este Asiático (EAS), la cual está
conformada por individuos de varios grupos
étnicos (Dai y Han de China; Japoneses; Kinh
de la ciudad Ho Chi Minh de Vietnam) aquí
observamos que la frecuencia del alelo
rs8065080C (I585V) es mayor aunque no
por mucho (EAS – T: 0.412 , C: 0.588).
Al efectuar la prueba de Chi-cuadrado
(Tabla S2) se determinó que todas las
poblaciones analizadas están en el estado
de equilibrio Hardy-Weinberg, con
excepción de la población de chinos de la
etnia Han de Beijing (CHB) y la de
poblaciones ibéricas en España (IBS) las
cuales parecen tener mayor número de
heterocigotos y de un homocigoto;
sorprendentemente la población de
japoneses de Tokio (JPT) a pesar de
presentar las mayores diferencias en las
frecuencias alélicas (T: 0.317 y C: 0.683) y
de tener la frecuencia genotípica más
elevada para el homocigoto rs8065080CC se
encuentra en equilibrio H-W.
Un locus en equilibrio H-W es un locus
ignorado por la evolución, quizás este sea el
caso para rs8065080 ya que la mutación
que genera puede no causar cambios
significativos para la fisiología del individuo
debido a que el aminoácido isoleucina y
valina son similares fisicoquímicamente,
también su efecto podría pasar
desapercibido hasta cierto punto ya que el
sentido de nocicepción contiene varias
rutas que se entrelazan (es un sistema
redundante) debido a la existencia de otras
proteínas (de la familia TRP) con
características similares a TRPV1 (capacidad La mutación I585V (rs8065080C) se produce
de unir vanilloides, de activación por en una de las a-hélices que conforman el
cambios de pH y temperatura). bolsillo de unión a la capsaicina (Figura 2),
pero su cadena lateral no forma parte de la
superficie de dicho bolsillo, de manera que
I585V et al mutaciones en TRPV1 de el efecto que ejerce sobre la afinidad por la
primates capsaicina es menos conspicuo que el que
se observaría con una sustitución que
La proteína TRPV1 tiene un elevado grado genere un impedimento estérico a los
de conservación (67%) en los 29 primates residuos clave (Y511A, S512, L547, T550I,
estudiados [Tabla S3, Archivo S1]. Todo el E570, T671).
bolsillo de unión a capsaicina (V510 – I575,
F582 – A596, A659 – N678) está
ampliamente conservado excepto la
posición L534 donde 9 especies poseen
sustituciones de aminoácidos con distintas
características fisicoquímicas (L534C, 4;
L534R, 5).
Curiosamente, casi todos los primates
(24/29) presentan la sustitución en estudio
I585V, excepto dos capuchinos (Cebus
imitator y Sapajus apella), un tití común de
Brasil (Callithrix jacchus), un lémur
(Microcebus murinus), y un gálago
(Otolemur garnetti). L547 también está
altamente conservado, solamente cambia
en 3 especies, un lémur (Carlito syrichta),
un gálago (O. garnetti) y el tití común de
Brasil (C. jacchus). El residuo de aminoácido Figura 2. Bolsillo de unión a capsaicina en un
que interactúa con el “cuello” de la monómero de TRPV1 de la ardilla Ictidomys
tridecemlineatus (PDB: 7LR0). En azul las 2 hélices
molécula de capsaicina (T550) está del monómero A (F582 - N678) y en rojo las 3 hélices
altamente conservado, únicamente 2 del monómero B (D511 - I575); en magenta la
especies de lémures (M. murinus y molécula de capsaicina y el residuo equivalente a la
Propithecus coquereli) tienen la sustitución sustitución I585V; en amarillo todos los residuos
T550I. Todas las posiciones relacionadas clave para la estabilidad de la capsaicina.
con la interacción de la “cabeza” de la
capsaicina (Y511, S512, E570 y T671) están
híper conservadas (29/29). La mutación I585V se ubica en la hélice
transmembrana 5 (aa 572 – 599), esta
región es contigua a la hélice
Efecto de la mutación I585V en TRPV1 de transmembrana 6 (aa 659 – 687) que se
humano encuentra en el canal y contiene el filtro de
selectividad (loop P), así que quizás esta
mutación no afecta la afinidad por la
capsaicina sino la efectividad con la que la
unión de este ligando se traduce en la
apertura de este canal (Figura 3).

Figura 4. Docking de la capsaicina en un monómero

de TRPV1-WT de humano (NP_ 542437.2). El
monómero de TRPV1-WT es verde bosque, en
amarillo están los residuos de aminoácidos clave
para la estabilidad del ligando, en magenta la
posición I585 sin mutar, en blanco la molécula de
capsaicina acoplada a TRPV1 de rata (no mostrada),
en rojo el mejor modelo de docking (cluster 18,
modelo 3) de la molécula de capsaicina en un
monómero de TRPV1-WT de humano.

Figura 3. Bolsillo de unión a capsaicina en un Al analizar los modelos generados por el

tetrámero de TRPV1 de la ardilla Ictidomys docking de la proteína TRPV1-I585V, se
tridecemlineatus (PDB: 7LR0). Se ocultaron ciertas observó que en la mayoría de los modelos
regiones (aa 1 – 509 y 714 – 844). Cada monómero (70%), el ligando quedaba completamente
tiene un color distinto (azul, cian, verde y amarillo);
fuera de su sitio de unión, en el 30% de los
en blanco se señala la molécula de capsaicina y el
filtro de selectividad (aa 644 – 647) y en rojo la modelos se ubicaba cerca del sitio de unión,
mutación I585V; el punto magenta en el centro del pero en la orientación opuesta (“cola”
canal corresponde a un átomo de sodio. adentro y “cabeza” afuera), ningún modelo
se asemejó a los mejores modelos
obtenidos para la proteína tipo salvaje.
Ninguno de los modelos generados por el
El resultado anterior es inesperado e
docking de la proteína TRPV1-WT cumplió
interesante porque a pesar que al
los 3 requisitos propuestos (menor valor de
superponer las estructuras de la proteína
energía libre, menor valor de FullFitness y
TRPV1 en las 2 formas estudiadas (WT e
ubicación en el sitio activo), sin embargo,
I585V) se observa que se solapan
los que tuvieron la ubicación más cercana al
perfectamente (Figura 5), la mutación I585V
sitio activo fueron los modelos 3, 5 y 7
produce cambios no observables en la
(FullFitness -3369.304 y deltaG -6.412) del
estructura pero que sí afectan a los
cluster 18 (Figura 4) aunque su orientación
modelos obtenidos por el docking.
no es del todo correcta, ya que la “cabeza”
y el “cuello” de la capsaicina no están cerca
de los residuos que la estabilizan y
únicamente están en orientación adecuada
la región de la “cola” alifática.

Figura 5. Solapamiento entre las estructuras de los
monómeros de TRPV1-WT (verde bosque) y TRPV1-
I585V (rojo), en amarillo se observa la ubicación del
sitio con la mutación I585V.
En condiciones normales lo anteriormente
dicho bastaría para intentar explicar el
fenómeno, pero en este escenario es
necesario aclarar que una fuente de error
muy probable se deba a las condiciones en
que se realizó el ensayo de acoplamiento
molecular, ya que debemos recordar que
TRPV1 es una proteína integral de
membrana con una conformación biológica
homotetramérica y el servidor empleado
para ejecutar el docking (SwissDock) no
permite ingresar archivos de más de 1000
residuos, y un dímero de TRPV1 contiene
2x839 aa, además, en su configuración, el
servidor no posee parámetros que puedan
ser ajustados para tomar en cuenta la
presencia de una bicapa lipídica, lo cual
posiblemente incrementa la inestabilidad
intrínseca de la proteína durante el análisis
y disminuye las conformaciones favorables
del ligando.
CONCLUSIONES
Al momento de generar un modelo
computacional de una proteína es
indispensable incorporar de alguna manera
parámetros que contengan información
sobre la realidad biológica de la proteína
(como su conformación multimérica o su
existencia en una membrana) con el fin de
generar modelos lo más fieles posibles.
La insensibilidad a la capsaicina puede que
provenga por otros factores más allá de la
mutación I585V, como mutaciones que
afecten a la expresión del gen.
Las preferencias gastronómicas de una
población no necesariamente tienen que
tener una base molecular sino más bien un
origen cultural.
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