Se basan en provocar un cambio fisico en las propiedades de los contaminantes Son los tratamientos més simples. En general, buscan la eliminacién del contaminante como sélido 0 combinado con sélido 0 liquide. Los tratamientos tipicos son: 1. Sedimentacién. Se basa en la separacién por la accién de la gravedad de los contaminantes sdlidos, cuya densidad sea mayor que la del liquido. Los sélidos se depositaran en el fondo del equipo, de donde son retirados. Las densidades relativas de los sdlidos eliminados estén comprendidas entre 1,05 y 2,6. 2.Flotacién. Se basa en la separacién por diferencia de densidad de los contaminantes sdlidos cuya densidad es menor que la del liquido. Esta flotacién puede ser natural 0 provocada, como cuando se introduce aire para favorecerla. Los sélidos se recogen en la superficie del liquido. 3.Filtracién. Se fundamenta en el proceso de retencién que provoca la interposicién de un medio poroso al paso del liquido. Los sélidos quedan retenidos en la superficie o en el interior del medio poroso, segiin donde se realice el proceso de filtracién. Como medio poroso se utilizan materiales tales como: arena, carbén, vidrio y cerémicas porosas. 4, Evaporacién. Se persigue la vaporizacién de un liquido de una solucién o de una suspensién. El objetivo es concentrar la solucién. Para ello se requiere un aporte de energia 5. Adsorcién. Por medio de un sdlido se busca retirar un contaminante de una solucién. El contaminante se fija, fisica 0 quimicamente, en la superficie del s6lido. Como sélidos se utilizan carbén activo y zeolitas, entre otros. 6. Desorcién - Stripping. Se provoca un stripping (desorcién) cuando se pone en contacto una masa liquida con aire, al cual se transfiere un contaminante. Este proceso es tipico para la eliminacién de amoniaco de las aguas. Extraceién, Por este proceso se retira un contaminante de una masa liquida al ponerla en contacto con otro liquido no miscible con ella, y en el cual el contaminante es més soluble Ventajas e inconvenientes de los distintos tratamientos fisicos.Evaporacion |contaminantas disueltos ‘Reduccion de volumen Elimina contaminantes disueltos Emision de yolaties |Dsposicion de lodos impli | Emision de volatiles Reaulere edition | Disposiion de espurnas ja algunes Posiblos atascamiontoe | Crecimiento bacteriano "Emision de velities | Posibles atascamientos Aasoicion |Desoreibn-Stipping Extraccién Elimina contaminantes disualtos Elimmina contaminantes disueltos | Elimina contaminantes: [Regeneiacien adsorbente | lores Posibles atascamientos |Crecimiento bactoriano | Posibles atascamientos | Emision de volatiles |Cortients liquida adicional [sistetosEstos tratamientos modifican las propiedades quimicas de los contaminantes. Se persigue la destruccién quimica del contaminante o la conversién del mismo en otro producto que sea facilmente separable. Los tratamientos tipicos son: 1. Coagulacién-Floculacién. Se realiza la separacién de sélidos de pequefio tamajio mediante un proceso de agregacién (coagulacién-floculacién), lo cual permite aumentar el tamafio de los sdlidos y utilizar alguno de los tratamientos fisicos anteriores para la separacién. Para ello, se utilizan sustancias, coagulantes y floculantes, que provocan la unién entre las particulas de los sélidos, generando sélidos de mayor tamajio, 2.Precipitacién quimica. Mediante este tratamiento se consigue que contaminantes solubles se transformen en formas insolubles, o que disminuya la solubilidad del contaminante en el liquido. Para ello, se afiaden diferentes aditivos, tales como: lechado de cal, hidréxido sédico 0 carbonato sédico, entre otros. Los contaminantes son posteriormente eliminados por tratamientos fisicos. Se utiliza, principalmente, para eliminar metales pesados de las aguas. 3. Oxidacién/reduccién quimica. Consiste en reacciones en las cuales las moléculas de un reaccionante pierden electrones (oxidacién) mientras que las moléculas de! otro reaccionante los ganan (reduccién). Se han de utilizar aditivos oxidantes, como peréxido de hidrégeno, ozono, cloro y permanganato potasico; y también reductores, como sulfito sédico. 4,Reduccién electrolitica, Este tratamiento incluye reacciones de oxidacién/reduccién sobre la superficie de los electrodos, cétodo y anodo. Se provoca una deposicién del contaminante sobre uno de los electrodos, generalmente el cdtodo. Es un procedimiento de recuperacién 5. Intercambio iénico. Consiste en poner en contacto un liquide con un sélido que presente facilidad para intercambiar iones, cationes o aniones. Como sélido de intercambio se utilizan resinas. Se aplica para eliminar dureza del agua, asi como iones de calcio y magnesio. 6. Osmosis inversa. En este tratamiento se realiza la migracién de agua a través de una membrana semipermeable que separa soluciones de diferente concentracién. La membrana es permeable al agua, pero retiene los contaminantes disueltos, tales como: sales y componentes de alto pesomolecular. En este caso se aplica una presién a la solucién mas concentrada para conducir el agua hacia el lado de la menos concentrada, en contra del flujo osmético normal Ventajas e inconvenientes de los distintos tratamientos quimicos. [Tratamnientos Guimicos ‘Venraias Tnconvenientes Coaguiacidn-Fleculacion — | Ampito uso Emision de volanles Disposicion de logos Precipitacion quimies Elmina contaminantes Eliminac:an de volatles disuattos Disposicion de logos Elimnacién selectiva Oudacionreduccian Elmina altas Eliminecitn selechva [concertraciones Elimina cortarminantes | asutos Recuperacion fElimina altes EliminedGn seleciva Evectroltica [concentraciones Posibles atescamienios Eliming cortaminantes /ésueltos Tniercamieie romeo elimina cortaminantes Elmina bas isuettos concentraciones Elimingcien selectiva Posibles atescamientos Comoais inverse Eliming co reartinantes liming bajas isuatos concentiaciones Eliminacion soloctiva Posibles atescamicnios Ventajase incorveniertes de los tratamientos quimicos3.3. Tratamientos térmicos Estos tratamientos utilizan elevadas temperaturas para descomponer los contaminantes. Las especies metélicas pasan a las formas més elementales, generando cenizas y gases puros; mientras que los compuestos organicos se descomponen a C02, agua y gases halégenos. Presentan como inconveniente la formacién de compuestos intermedios no deseados, as{ como elevados costes de energia. Por lo que se reservan normalmente para el tratamiento de sélidos y aguas residuales refractarias a otros tratamientos. En todos estos procesos las eficacias de eliminacién de contaminantes son superiores al 99,99%. Los tratamientos tipicos son: 1. Oxidacién hiimeda. En este proceso se pone en contacto la fase Iiquida con aire a temperaturas de 150-325° C y presiones de 2.000-20.000 kPa. Este proceso se utiliza en corrientes residuales con contaminantes en bajas concentraciones, pero atin téxicos para los procesos biolégicos. También se utiliza para eliminar materia organica refractaria antes de un proceso biolégico, as{ como para regenerar el carbén activado. 2. Oxidacién supercritica. En este proceso se explotan las propiedades del agua a temperatura y presién criticas, 374° C y 25,3 Mpa. En estas condiciones las sustancias orgénicas son completamente miscibles y las sales son insolubles. 3. Incineracién. Este es un proceso de destruccién térmica. El liquido es inyectado bien directamente en el quemador, o en la llama, o en la cémara de combustién y al mismo tiempo se introduce oxigeno. Opera en el rango de temperatura de 1.000-1.700° C. Ventajas e inconvenientes de los distintos tratamientos térmicos.Tratamientos Tarmicos ventas Ineorvenientes Oxidacion humede Elimina attas Formacion de compuestos ‘concentraciones intermedios Elimina contaminantes disuetos Proceso desiructivo No precisa tratamiento posterior ‘Oxidation supereritica Elmina alas concentraciones Elmina contaminantes disuetos Proceso destructivo No precisa tratamiento posterior Formacion 0 Compuestos intermedios Tneineracion Elimina alias ‘concentraciones Elimina contaminantes disuetos, Proceso destructive. Precise tratamiento de gases1/2 Estos tratamiento utilizan mecanismos biolégicos y bioquimicos para llevar a cabo un cambio quimico en las propiedades de los contaminantes. Estos tratamientos se basan en la utilizacién como alimento de ciertos compuestos organicos por los microorganismos, con lo que se generan nuevos microorganismos. En ellos se persigue una doble accién, la degradacién de contaminantes orgdnicos y la formacién de fléculos biolégicos facilmente separables. Los tratamientos tipicos son’ 1. Filtros bacterianos. En este proceso los microorganismos se presentan fijos sobre un soporte, mientras que el liquido fluye a través de ellos. El oxigeno necesario se introduce en el sistema por tiro natural, o mediante tiro forzado en caso necesario. 2. Lodos activo: Consiste en poner en contacto, en suspensién, un licor constituido por microorganismos con el liquido a depurar. El proceso es aerobio, por lo que se precisa la introduccién de oxigeno, por medio de burbujeadores 0 mediante aireadores superficiales 3. Lagunas aireadas. Son procesos similares al de lodos activos, con la salvedad de utilizar estanques de poca profundidad por lo que se precisan extensiones importantes, Biodiscos. Son procesos intermedios entre los filtros bacterianos y los lodos activos, pues presentan una superficie amplia para la fijacién de los microorganismos parcialmente sumergida dentro de un tanque con licor mezcla. La aireacién se realiza mediante el giro continuo de la superficie de fijacion. 5. Degradacién anaerobia. Los procesos anaerobios se presentan en igual forma que los anteriores con Ia diferencia de la ausencia de oxigeno para poder realizar la degradaciénVentajas @ inconvanientas de los distintos tratamientos biolSgicos [tans ioe] Verte Inconvorenon limi boas canmadores Ensiba mina contaminants dsvetos | $6 Vaities-Bucepe a vcs Fitosbeceance Suscoptae a cargasconlanine Desiruye contamnantes. Sumcoptiks © sortie 0a breaths Produce pocts logos Poatiesaascamsrtea ls bas coven Ene Ise mina contaminantes davetss eases eect Destruye contaminantes: ‘Susceptiole a cambios de temperatura. Dispose J ldos ina corkarnanles Gavaloa | Ebina bias coneotaconan Erin nas creates | Deshye containaron coveliies. Susceptle a toncos (ee vaca pec ake ‘Suscoptile a cargas contami. Suscoptle a canbe do terporakia Ty Elmina Ease soeontosores lira contamonis dsuatos | ne Ek leiosiscoe Destaye contaminates Binge» ics, Suacepale 9 crgas ening Suscrpn a cambos de temperatura imine cotarinariesdovelos | Elmina tas coneantacron. Deere eratmeartes Susceptae 200005. |Dearadacion anaerobia | ice pocos lads ‘Susceptible a corgas contamina. Pedobear. Scape cabs de leper, 1 Siguiente2/2 ESQUEMA TRATAMIENTO AGUA POTABLE 0 DE APORTE 4 5 a | | 3] l2 | Le | a i : a gs | lel le | | 83) PRECLORAGION —-REGULACIGN pIciGN POSTCLORAGION ” | cure ih ' AGUA | pespaste |_| GoacuLacion| | DECANTAGION |__| FiLTRACION| _[DEPOSiTO| si ee LU) “AGUA ADIGION r eee COAGULANTE it DESHIDRATAGION Hi 1 at \ a Hi FANGO Seco iF 8 3 COAGULANTES Y FLOCULANTES APLICADOS EN EL TRATAMIENTO DE AGUASSAL DEALUNOUHERO Sac oueigcreoo ec Tae Ren cl FaNeOS ae 1 : z io L re Lf L sous Lf scnseo. | ceseasre He E ou f] SoneutoeN nuocuaoen L] cecaran + Oe cc ane ‘ emcee | [onan | [eon] [rer aoa Tea L || som tesnrecoen [| = en aro ration Anterior 2/24. Defini nes relativas al tratamiento del agua Tratamiento quimico del agua de potabilizacién Con caracter complementario se citan algunos de los productos quimicos empleados en las diversas operaciones del tratamiento, habida cuenta de la posible interaccién de los mismos sobre la eficacia de la operacién de coagulacién y floculacién, puede despejar el panorama de la problematica general que se presenta en el tratamiento de aguas para potabilizacién1/2 Se realizan sobre las diversas substancias contenidas en el agua, pero no todas tienen el mismo interés para el analista. Las mas fundamentales se incluyen en todos los controles rutinarios. Los demés solo figuran en el marco del “analisis somero del agua’ que es més elaborado que el control de rutina, En fin los otros andlisis hacen un estudio profundo (andlisis completo) de las propiedades del agua. Andlisis que forman parte del control de rutina. 1.El pH mide la acidez del agua. Hemos visto que el agua tiene como férmula H20 - en solucién, practicamente todos los cuerpos se disuelven en iones, y el agua no es ninguna excepcién-. Se descompone en iones, H+ y OH- segiin el equilibrio que muestra la siguiente férmula H20 =H++#0H- Esta disociacién es extremadamente débil, de modo que, si se aplica a esta ecuacién la ley de la accién de masa, se puede desestimar el término H20 que se mantiene précticamente constante, y el equilibrio se traduce por la constante de disociacién que vemos: [H+] [OH] = 10-14 Los ntimeros obtenidos siendo bastante pequefios. Se ha acordado llamar el pH como el logaritmo de la concentracién de ion H+. Por consiguiente, el agua neutra tiende al equilibrio, [H+] [OH] y de la ecuacién anterior se obtiene: pH = 7 Se puede decir entonces que: © Un agua dcida tiene un pH inferior a 7. © Un agua basica (en términos de quimica) o alcalina (en términos de tratamiento de aguas) tiene un pH superior a 7. Las aguas tienen un pH entre 6 y 91. La alealinidad mide la mineralizacién del agua. La alcalinidad medida en el laboratorio es la alcalinidad total debida a los carbonatos, los bicarbonatos y las bases libres de calcio, magnesio y sodio, es decir, la alcalinidad originada por las sales de Acidos débiles de metales alcalinos y alcalinotérreos. En la practica, la alcalinidad corresponde al T.A.C. 0 Titulo Alcalimétrico Completo. En la determinacién de pH de las aguas naturales, todas las sales son bicarbonatos, medidos por la alcalinidad. Este se debe los valores de pH de disociacién: Esto quiere decir que: 1. si pH > 10,3 presencia de carbonatos. 2. si 6,34 < pH < 10,3 presencia de bicarbonatos. 3. si pH < 6,34, presencia de gas carbénico CO2. La alcalinidad se expresa en miligramos de cal (CaO) por litro y se determina con una solucién de dcido sulftrico *N/28, de la cual 1 cm3 corresponde a 1 mg de CaO. Efectivamente, si se escribe la ecuacién de neutralizacién de la cal por el dcido sulfirico También se puede expresar la alcalinidad en grados franceses (T.A:C): 1° F corresponde a 5,6 mg/L de CaO 0 a 10 mg/L de CaCO3 NOTA.- Repaso de la nocién de normalidad: de una solucién dcida: 1 litro de solucién normal, N libera 1 iongramo H+ por litro. * En la solucién de problemas por métodos quimicos, es bastante comin la conversién de una masa dada de soluto o disolvente a numero de moles. La molaridad de una solucién se define como la cantidad de soluto disuelto en moles por litro de solucion, donde la molaridad seria igual al numero de moles entre los litros de soluci6n. 1. Las materias organicas son impurezas importantes del agua. En realidad, el método de determinacién indica las materias oxidables por el permanganato potasico, tanto las propias orgénicas como las minerales. Se miden por cantidad de KMnO4 que son capaces de reducir en condiciones experimentales bien definidas (medio Acido o alcalino). Se expresan en peso de oxigeno consumido del permanganato. Esta cantidad de oxigeno se calcula segin el volumen de solucién de KMn04 N/80 queha intervenido en la reaccién y de la cual 1 cm* corresponde a 0,1 mg de oxigen, o sea, 1 mg/L para una muestra de 100 mL. En la practica: estos tres analisis (pH, alcalinidad, materia organica) son los més realizados en el control rutinario de las aguas tratadas. Dos de estos elementos no son independientes: el pH y la alcalinidad. En el grafico carbénico que veremos més tarde, estos dos valores determinan un punto caracteristico del agua analizada. La posicién de este punto en el grafico permite calcular el gas carbénico 0 CO2 libre, el CO2 agresivo que ataca la cal y los metales, el CO2 de los bicarbonatos y el CO2 total Ani is somero del agua. En el andlisis somero, ademés de las tres medidas expuestas anteriormente, se puede afiadir un buen numero de determinaciones que permiten precisar las propiedades del agua; 1. La turbidez. Que da idea de las materias en suspensién y los coloidales sean minerales u organicos. 2. El color. Debido en muchos casos a la materia organica, pero también a algunos iones coloreados como el hierro. 3. Los cloruros. Que se expresan en miligramos por litro de cloro (Cl). No hay que sobrepasar la cantidad de 250 mg/L. Un valor aislado de cloruros no significara mucho pero si se comprueba, en una serie de determinaciones, un aumento brusco de la cantidad de cloruros puede ser el indice de una contaminacién reciente. El titulo hidrotimétrico (T.H.) Es la dureza debida a las sales calcicas y magnésicas. Puede proceder de sales con un Acido débil, como los carbonatos y los bicarbonatos, pero también con dcidos fuertes como los sulfatos y los cloruros. Es por la dureza del agua por lo que es mas dificil cocer verduras y hacer espuma con jabén. Siguiente2/2 Antiguamente se media la dureza por la formacién de espuma de jabén, pero hoy en dia se determina con la ayuda de un reactivo complejante que da reaccién coloreada con un indicador. 1. Los nitrites y el amoniaco. Los nitritos y el amoniaco proceden en general de la oxidacién de las materias orgénicas nitrogenadas y contribuyen a los productos intermediarios de su putrefaccién. Su presencia es, por consiguiente, un indice de contaminacién de las aguas y para determinar esta contaminacién, su determinacién es necesatia. Los nitritos se oxidan con el cloro 0 con sus derivados oxigenados, pero no se han encontrado métodos econémicos para eliminar el amoniaco. La eliminacién por aireacién necesita un pH en torno a un 10; la eliminacién con cloro necesita una dosis de cloro cerca de 10 veces superior a la del amoniaco. 2. Los nitratos. Los nitratos representan la forma més oxidada del nitrégeno. Estos pueden proceder de la oxidacién biolégica del nitrégeno organico, del amoniaco y de los nitritos, 0 de la disolucién en aguas de infiltracién del fertilizante utilizado por los agricultores. A la larga esto puede convertirse en un problema si la concentracién sobrepasa las normas, ya que todos son solubles y entonces, habria que acudir a tratamientos biolégicos para eliminarlos. 3. Los fosfatos. Los fosfatos son, junto a los nitratos, uno de los elementos nutritivos que favorecen el desarrollo de algas y que contribuyen a la eutrofizacién del medio receptor. Estos pueden proceder de la descomposicién de las materias orgénicas o del uso de detergentes sintéticos, ya que los fosfatos utilizados como fertilizantes son, en general, poco solubles. Durante el tratamiento de! agua se eliminan mediante la precipitacién con sales de hierro o de aluminio. 4, El hierro y el manganeso. Es raro que en el agua se encuentre hierro sin manganeso, 0 al revés, manganeso sin hierro. Se ha comprobado que estos dos elementos, en muchas ocasiones, estaban ligados. Los dos existen probablemente en varias formas. © En forma soluble, bajo la forma de iones ferrosos y manganosos, que hay que oxidar en ion férrico o manganésico mediante un tratamientoespecifico para eliminarlos © En forma de suspensién (hidréxidos insolubles o complejos érgano- metélicos) que se eliminan parcialmente con el tratamiento de coagulacién, decantacién o filtracién. © En forma coloidal. Sin ser peligrosos para el consumidor, estos elementos conllevan una perturbacién de la distribucién (coloracién del agua, formacién de depésitos, etc.). Su concentracién maxima en el agua estd, no obstante, reglamentada. El control de la concentracién de hierro y manganeso en el agua es, pues, una necesidad. Andlisis completo. En el andlisis completo, se dosifican ademés, los principales iones que no se han determinado anteriormente con métodos especiales y, en muchos casos, laboriosos. Las otras determinaciones afectan: © Los cationes, cargados positivamente: calcio, magnesio, sodio, potasio. © Los aniones, cargados negativamente: sulfatos, nitratos, silicatos, fosfatos, bicarbonatos, y carbonates. Los principales son el bicarbonato, presente en todos los casos, y el carbonato, presente cuando el pH del agua es superior ad. © La salinidad de! agua, o residuo seco obtenido por evaporacién a 105-110" C de un litro de solucién. Una vez pesado este residuo seco es calcinado a 525° C; se pesa entonces la fraccién mineral, y la diferencia entre el residuo seco y la fraccién mineral se obtiene la fraccién orgénica (0 materia organica real en lugar de la oxidabilidad al permanganato de potasio) © La resistividad, propiedad eléctrica del agua que es inversamente proporcional a la mineralizacién o la salinidad: cuanto mas mineralizada esté un agua, menos resistividad y, al revés, cuanto menos minerales tiene una agua, més resistividad tiene. La resistividad de aguas brutas es de aproximadamente 1.500 para las muy mineralizadas y de 20.000 para las poco mineralizadas. Se puede seguir también la Conductividad igual a la inversa de la Resistividad. Anterior 1 2/24.2. Analisis bacteriolégico La potabilidad del agua no sélo se mide por andlisis quimicos sino también por analisis bacteriolégicos. Las materias orgénicas contenidas en el agua, se presentan, en parte, bajo la forma de seres vivos con distintos nombres segtin su tamafio y su papel bacteriolégico: estan en particular virus, bacterias, patégenas 0 no, y algas. El andlisis bacteriolégico de las aguas potables consiste en la busqueda de un cierto numero de gérmenes-test, llamados de contaminacién fecal, ya que es muy dificil identificar todos los gérmenes peligrosos. La busqueda y la numeracién se refieren a: © Escherichia coli o E.Coli o coliformes fecales. Para ser potable, el agua debe contener menos de uno por cada 100 ml. © Bacterias coniformes. « Estreptococos fecales o enterococos. © Clostridium perfingens o sulfito reductores. Un andlisis bacteriolégico completo comprende ademas de la busqueda y la numeracién: e De los gérmenes totales después de 24 horas a 37° C de 72 horas a 20° C; © De los bacteriofagos fecales. El reglamento Técnico Sanitario, as{ como las directivas de la Comunidad Europea sobre la potabilidad del agua para consumo humano, facilitan todos los datos sobre los valores limites y la interpretacién de los andlisis tanto fisico, como quimico y bacteriolégico.4.3. Técnicas analiticas en microbiologia de aguas En este apartado se describen las técnicas analiticas para realizar los estudios microbiolégicos sobre muestras de aguas para determinar su calidad sanitaria. Estas técnicas van encaminadas a establecer el grado de contaminacién con residuos. Se utilizan més pruebas para la deteccién y recuento de microorganismos indicadores que para los patégenos. El grupo de bacterias coliformes es el principal indicador de la adecuacién del agua para usos domésticos, industriales 0 de otro tipo. Los dos procesos que més se emplean para el aislamiento y la enumeracién de microorganismos en microbiologia de aguas es la Técnica del Numero mas probable y el método de Filtracién por Membrana. Los medios empleados, las temperaturas y tiempos de incubacién son diferentes dependiendo del tipo de microorganismos que se estudie. En la practica la técnica més empleada es la filtracién por membrana que resulta un método més simple y que puede ser aplicado a un gran numero de microorganismos y resulta tan eficaz como la fermentacién en tubos multiples.4.4. Técnica del numero mas probable (NMP). En esta técnica del NMP volimenes de muestra o diluciones de ella son afiadidos a una serie de tubos que contienen el medio liquido diferencial. Posteriormente se meten a incubacién y en aquellos tubos en los que exista crecimiento de microorganismos se producirén cambios en las caracteristicas del medio. Dependiendo del numero de tubos en los que exista crecimiento se estima el ntimero de microorganismos presentes en la muestra empleando para ello tablas de probabilidad Los resultados se expresan como NMP de microorganismos por 100 mi de muestra. Los tubos en los que exista crecimiento se pueden confirmar empleando medios de cultivo especificos para la confirmacién del microorganismo estudiado. El método de tubos miitiples es muy empleado para el andlisis de aguas muy contaminadas.4.5. Técnica de filtracién por membrana. 18 En esta técnica un volumen de muestra de la suspensién madre o de la muestra diluida se filtra a través de una membrana de celulosa o fibras similares. El tamafio de poro es el adecuado para permitir la retencién de microorganismos, una vez filtrada la muestra la membrana se retira y se coloca sobre la superficie de un medio selectivo. Posteriormente se incuban a la T* adecuada para el crecimiento de los diferentes microorganismos y en la superficie del filtro crecen colonias con colores y morfologia caracteristicas. Los resultados se expresan como numero de unidades formadoras de colonia/volumen de agua filtrada. Las colonias presuntivas se confirman subcultivandolas todas o un numero representativo (al menos 10). Es el procedimiento elegido en el LSPPA para el anélisis de aquellos parametros en los que los resultados se expresan en volimenes superiores al ml (por ejemplo, UFC/20mL, UFC/100 mL, UFC/50mL 0 UFC/250mL). La técnica es adecuada para aquellas aguas que contienen una pequefia cantidad de materia en suspensién como las aguas de bebida, aguas envasadas y la mayor parte de aguas de bafio. El volumen de muestra filtrado sera el requerido en la legislacién especifica. Se consideran contables un numero de entorno a 100 unidades formadoras de colonias en una membrana de 50 mm de diametro. Esterilizacin de la rampa de filtracién y filtracién de la muestra Tanto la base como el cono del embudo estaran estériles antes de comenzar cada grupo de anilisis. Los embudos de filtracién pueden ser desinfectados entre muestras mediante inmersién en agua destilada hirviendo durante al menos 1 minuto. Después de su desinfeccién se colocan y se espera a que enfrien antes de ser utilizados La rampa de filtracién estard conectada a una fuente de vacio. Una vez que el equipo esté a temperatura ambiente se coloca la membrana estéril con la superficie cuadriculada hacia arriba sobre el disco poroso del embudo de filtracién. La membrana debe manipularse Gnicamente por el borde exterior conunas pinzas estériles de extremos romos. Colocar la parte superior del embudo sobre la base y asegurar el conjunto con el dispositivo previsto para el caso. Con la llave de vacio cerrada verter o pipetear en el embudo un volumen conocido de la muestra (al menos 20 mi) (0 de una dilucién de la misma). Abrir la llave de vacio de forma que se aplique una presién de aproximadamente 70kPa y el agua pase lentamente a través de la membrana. La llave de vacio se cerrard tan pronto como las muestras hayan sido filtradas. En ese momento se retira el embudo y con la ayuda de las pinzas estériles se coloca la membrana sobre una placa estéril de! medio de cultivo apropiado para la determinacién Para diferentes volimenes de una misma muestra, se puede reutilizar el mismo embudo sin necesidad de desinfeccién teniendo la precaucin de filtrar en primer lugar los volimenes més pequefios. Para filtrar otra muestra el embudo debe ser nuevamente desinfectado o debe utilizarse otro estéril. Si esta previsto filtrar en un mismo dia aguas tratadas y no tratadas, en primer lugar deberan sembrarse todas las aguas cloradas y aquellas en las que se presume con fundamento ausencia de microorganismos y por tiltimo las aguas no tratadas o presumiblemente contaminadas. PROCEDIMIENTO DE TRABAJO Seguridad e higiene en el laboratori Independientemente del nivel de seguridad asignado formalmente al laboratorio, las medidas de higiene personal son esenciales en el laboratorio de microbiologia, pues hay que contemplar la posibilidad del aislamiento de microorganismos patégenos: © Mantener las ufias cortas y el pelo largo recogido. © Lavar las manos con agua caliente y jabén antes y después de cada manipulacién. © La préctica de pipetear directamente con la boca esta prohibida en el laboratorio realizandose esta operacién siempre con propipetas. Nunca debe mantenerse, almacenarse 0 consumirse alimentos 0 bebidas dentro del laboratorio. Tampoco deben Ilevarse a la boca ningun tipo de utensilios u objetos como ldpices, etiquetas, pipetas... ni fumar en el laboratorio. © En todo momento la bata debe mantenerse perfectamente cerrada, conviene utilizar calzado especifico para el laboratorio y utilizar guantes en cualquier manipulacién con microorganismos.No se debe acceder a otras zonas, como cafeteria o dreas de descanso con la indumentaria de laboratorio. © Las superficies de trabajo deben ser desinfectadas regularmente, al final del dia y siempre que se produzcan accidentes o derramamientos. @ Los contenedores de alcohol al 70% deben estar siempre facilmente accesibles préximos a los contenedores de materia desechable para autoclavar. © Cuando se produce un derramamiento debe cubrirse con papel empapado en alcohol y ser mantenido asi durante 30 minutos, a continuacién, el papel ira a los contenedores del autoclave. © Todos los microorganismos clasificados dentro del nivel de seguridad 3 (por ejemplo, Salmonella typhi) deben ser manipulados en interior de una cabina de flujo laminar vertical (de seguridad para el operador), © Esterilizar todos los cultivos y el material en contacto con ellos en autoclave antes de ser desechados o reutilizados (por ejemplo, e! material de vidrio). Siguiente4.5. Técnica de filtracién por membrana. 2/8 Toma de muestras. No es funcién del LSPPA la toma de muestra de aguas para andlisis microbiolégico, no obstante, y teniendo en cuenta que el Laboratorio suministra los frascos de toma de muestra y la estrecha relacién entre la misma y los resultados de los andlisis se describen a continuacién unas consideraciones generales sobre este punto. El primer objetivo es obtener una muestra que sea representativa, tanto como sea posible, del agua que va a ser examinada. Para ello son necesarias ciertas precauciones que son comunes a cualquier procedimiento de muestreo en el examen bacteriolégico: 1. Los envases y botellas reutilizables de toma de muestras deben ser de material capaz de resistir los sucesivos procesos de esterilizacién sin dar lugar a sustancias que puedan inhibir o estimular el crecimiento bacteriano Los recipientes de muestreo deben contener un agente capaz de neutralizar los posibles desinfectantes contenidos en el agua y por supuesto deben estar estériles. El agente neutralizante no debe afectar a la viabilidad y crecimiento de los microorganismos. 1. Para neutralizar el cloro se afiadiré 0,1 ml de una solucién estéril al 1,8% (m/m) de tiosulfato sédico por cada 100 ml de capacidad. La solucién deberd ser afiadida antes de la esterilizacién de los frascos. En el caso de piscinas 0 aguas hipercloradas la concentracién de tiosulfato sédico sera del 10%, 2. Debe prestarse especial cuidado en no contaminar la muestra durante su recogida y posterior manipulacién 3. Las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible después de su recogida (preferiblemente dentro de las 24 horas), 4, Cada frasco de muestra debe estar claramente identificado y debe ser acompajiado por informacién suficiente respecto al origen de a muestra yel tipo de andlisis requerido. Conservacién y manejo de las muestras. Se recomienda mantener las muestras a una temperatura inferior de la existente durante el llenado. Los recipientes no deben llenarse del todo. Conviene sefialar que el enfriamiento de las muestras sélo es verdaderamente efectivo si se aplica inmediatamente después de la recogida de muestras. En general, las muestras deben ser transportadas al laboratorio para su analisis tan pronto como sea posible. Las muestras se_transportardn reftigeradas y en condiciones de oscuridad La refrigeracién simple (en hielo fundido o en un refrigerador entre 2° C y 10° C) y el almacenamiento en la oscuridad son, en la mayoria de los casos, suficientes para conservar la muestra durante su transporte al laboratorio y durante un periodo de tiempo relativamente corto antes de su anélisis. El enfriamiento no puede considerarse como un medio de conservacién a largo plazo. Preparacién de la muestra para el analisis. Antes de comenzar el anélisis, la muestra debe ser homogeneizada concienzudamente mediante agitacién vigorosa para asegurar una distribucién homogénea de los microorganismos (y dependiendo de la naturaleza de la muestra y de la carga de contaminacién supuesta cualquier dilucién necesaria se realizaria en este momento). En caso de ser necesaria la preparacién de diluciones el diluyente empleado serd Peptona Salina segtin la formulacién de la ISO 8199:1988 - Water quality - General guide to the enumeration of microorganisms by culture. En el LSPPA Ia naturaleza de las muestras de aguas analizadas hacen muy infrecuente la necesidad de realizar diluciones en los andlisis microbiolégicos de las mismas. Clasificacién de los medios de cultivo. Medio de cultivo: Formulacién de sustancias en forma sélida, liquida o semisdlida la cual tiene constituyentes naturales y/6 sintéticos los cuales permiten la multiplicacién o preservar la viabilidad de los microorganismos. 1. Seguin su composicién quimica.© Medios de cultivo de composicién quimica definida. Son aquellos medios constituidos por compuestos quimicos definidos (por ejemplo, estructura molecular y grado de pureza) © Medios de cultivo de composicién quimica incompleta. Son aquellos medios constituidos entera o parcialmente por sustancias naturales, cuya composicién quimica no est4 completamente definida, 1. Segiin su consistencia. © Medios de cultivo liquido. Son aquellos medios que estan constituidos por una solucién acuosa con uno o mas constituyentes (por ejemplo, agua de peptona, Nutrien Broth). © Medios de cultivo sélidos y semisdlidos. Son aquellos medios de cultivo liquido que contienen materiales solidificantes (por ejemplo, agar-agar, gelatina etc.) en diferentes concentraciones. 1. Segtin su uso. © Medios de transporte. Son aquellos medios que mantienen la viabilidad de los microorganismos durante el periodo que transcurre desde la recoleccién hasta el procesado de la muestra. © Medios de conservacién. Son aquellos medios que mantienen la viabilidad de los microorganismos durante un largo periodo de tiempo y los protegen frente a condiciones adversas, como puede ser el mantenimiento durante largos periodos de tiempo a bajas temperaturas y posteriormente conseguir su recuperacién. © Medios de revivificacién. Son aquellos medios (reconstituyentes liquidos) que recuperan el crecimiento normal de los microorganismos dafiados y estresados sin estimular su multiplicacién. © Medios de enriquecimiento. Son aquellos medios generalmente liquidos cuya composicién favorece la multiplicacién de los microorganismos. © Medios de enriquecimiento selectivo. Son aquellos medios que favorecen la muttiplicacién de microorganismos especificos e inhiben total o parcialmente el crecimiento de otros, (por ejemplo, Rappaport-Vassiliadis Medium) © Medios de enriquecimiento no selectivo. Son aquellos medios que favorecen el crecimiento de la mayor parte de microorganismos (por ejemplo, el Nutrient Broth). @ Medios de aislamiento. Son aquellos medios de cultivo sélidos 6 semisélidos que favorecen el crecimiento de microorganismos. @ Medios de aislamiento selective. Son aquellos que favorecen el crecimiento de microorganismos especificos, e inhiben el crecimiento deotros microorganismos (por ejemplo, agar Palcam, agar McConkey), Medios de aislamiento no selectivo. Son aquellos que no sirven para inhibir selectivamente microorganismos (por ejemplo, el Nutrient Agar). Medios diferenciales. Son aquellos que permiten determinar una 6 mas caracteristicas fisiolégicas y/o bioquimicas de los microorganismos para su identificacién Medios de identificacién. Son aquellos medios que producen una reaccién especifica que permite la identificacién de los microorganismos sin necesitar test de confirmacién Medios de multiples usos. Son aquellos medios de cultivo que pueden ser asignados a muchas categorias, por ejemplo, el agar sangre puede ser un medio de revivificacién, un medio de aislamiento o un medio diferencia usado para la deteccién de hemdlisis. Seguin el método de preparacién. Medios listos para su uso. Son aquellos medios que ya se preparan en contenedores listos para su uso de (Placas Petri o tubos). Medios de cultivo. Preparados a partir de formulaciones comerciales deshidratadas (por ejemplo, polvos, granulado, productos liofilizados). La rehidratacién puede ser de dos maneras: Medio completo listo para su uso. . Medio incompleto al cual hay que afiadirle ciertos componentes habiles en el momento del uso. Medios de cultivo preparados en el laboratorio a partir de componentes individuales. Anterior 1 Siguiente 2/83/8 Lote de un medio de cultivo. Se define como aquella unidad de producto totalmente trazable referido a un volumen de producto terminado o semiterminado, que tiene un tipo de consistencia y una calidad el cual ha sufrido una serie de controles a lo largo de su linea de produccién (contro! del proceso) y test de aseguramiento de la calidad, el cual ha sido producido en un periodo de tiempo determinado asignandole un mismo numero de lote. Preparacién de los medios de cultivo. La preparacién de los medios de cultivo conlleva cinco etapas: disolucién del medio deshidratado, medicién del pH, reparto, esterilizacién y registro. Los botes que contienen el medio deshidratado se mantendrén completamente protegidos de la luz, en un lugar seco y a la temperatura aconsejada por el fabricante No se utilizarén después de su fecha de caducidad. Es esencial que los botes se mantengan perfectamente cerrados, un medio con muestras de humedad o apelmazamiento no debe de ser utilizado. Para consultar el protocolo de elaboracién de cada medio de cultivo se dispone del "Cuadero de elaboracién de medios de cultivo' de! Laboratorio 6 en los protocolos correspondientes a las técnicas en los que se utilizan 1. Disolucién del medio de cultivo. Para la disolucién del medio de cultivo el agua utilizada debe ser agua destilada, desionizada, o de calidad equivalente; libre de sustancias que puedan ser inhibidoras del crecimiento de los microorganismos bajo las condiciones previstas en el ensayo. En el LSPPA para la preparacién de los medios de cultivo se utiliza agua Tipo Il seguin la clasificacién |SO/UNE77- 081-93, obtenida con el equipo ELIX 5. Millipore o ELIX 10 Millipore Para asegurar la calidad del agua empleada en la realizacién de medios de cultivo deberdn realizarse los siguientes controles periédicos una vez al mes:© Contenido en gérmenes totales comprobando que los valores obtenidos se mantienen por debajo de 1.000 UFC/mL. © El pH del agua que sale del ELIX-S y ELIX-10 debe tener un valor comprendido entre 5,5 y 7,5. © La resistividad para poder ser considerada como agua de buena calidad deberd ser de al menos 300.000 cm. Preparar los medios de cultivo en recipientes (por lo general si es posible, matraces de vidrio) de al menos el doble de volumen que el medio que se va a preparar. Los matraces antes de su utilizacién deben ser lavados cuidadosamente y aclarados bien, de manera que no queden restos eventuales de cualquier substancia extrafia capaz de contaminar el medio. Se seguirdn estrictamente las especificaciones detalladas en el protocolo general de limpieza. © Con espatula limpia, pesar la cantidad de medio deshidratado requerida. Esta operacién debe hacerse con rapidez y precaucién y en lugar alejado de fuentes de humedad (autoclaves, bajios, etc.). Evitar la inhalacién de polvo. © Medir en una probeta graduada la cantidad de agua requerida, recién destilada y de calidad controlada. © Afiadir al medio de cultivo deshidratado y pesado una pequefia cantidad del agua necesaria (aproximadamente una tercera parte) y agitar vivamente. Incorporar la cantidad de agua restante, balanceando el matraz para recuperar el polvo que hubiera podido quedar adherido en las paredes internas. Anterior 1203 Siguiente 3/84.5. Técnica de filtracién por membrana. 4/8 © Disolver con un agitador magnético provisto de calefaccién. La agitacién, en caso de realizarse manualmente y sobre todo si se trata de medios que contienen agar, debe ser constante para evitar que los componentes se peguen a las paredes del recipiente. © Los medios de cultivo que no contienen agar se suelen disolver bien con un ligero calentamiento. Los medios de cultivo que contienen agar deben llevarse a ebullicién durante 1 0 2 minutos. 1.Medida del pH. Si el medio es liquido, separar una alicuota una vez preparado, esterilizar en el mismo ciclo y dejar enfriar a temperatura ambiente, medir con el electrode para liquidos. Si el medio es sélido, separar aproximadamente 15 ml en una placa Petri y dejar enfriar a temperatura ambiente, medir el pH con el electrodo para sélidos En los medios comerciales deshidratados se medird el pH después de la esterilizacion. En los medios de elaboracién propia, deberd medirse también el pH antes de la esterilizacién, ajustando si es necesario con soluciones preparadas de dcido clothidrico (1 mol/L) y de hidréxido sédico (1 mol/L). 1. Reparto. ® Antes de autoclavar cada recipiente debe de ser etiquetado con cinta indicadora para comprobar que se ha alcanzado la temperatura de esterilizacién © Si es preciso, repartir el medio de cultivo en recipientes adecuados como, por ejemplo, frascos o tubos (nunca placas de Petri), de manera que, en cada uno de ellos, el medio que se afiada no alcance nunca las dos terceras partes del volumen (preferiblemente la mitad del volumen). © Rotular en los recipientes el nombre del medio de cultivo y la fecha de caducidad, asi como el numero de orden (lote) del formato de preparacién de medios de cultivo.1. Esterilizaci6én. La esterilizacién de los medios de cultivo puede llevarse a cabo utilizando varias técnicas entre las que se incluyen © esterilizacién por calor himedo en autoclave normaimente a 121° C durante 15 min, Mantener los medios con agar en bafio a 47£2° C hasta su empleo o distribucién en placas o tubos, o si es necesario hasta la adicin de otros componentes. Enroscar los tapones de los frascos. © esterilizacién por filtracién utilizando membranas y filtros de tamafio de poro de 0.22 um en condiciones de presién o de vacio. Por otro lado, ciertos medios y componentes pueden ser utilizados sin ningtin tipo especial de esterilizacién (seguin normas internacionales o especificaciones del proveedor). Preparacién de los suplementos. Muchos de los suplementos que se utilizan contienen agentes téxicos, en particular los antibisticos deben ser manejados con cuidado pues se puede producir la dispersién de polvos que pueden provocar reacciones alérgicas en el personal. Hay que tomar precauciones y seguir las instrucciones del fabricante cuando se preparen las soluciones. Deben de ser preparadas y adicionadas el dia de su utilizacién sobre todo las soluciones de antibisticos, en ciertas ocasiones estas pueden mantenerse congeladas en alicuotas, pero no se pueden volver a congelar después de su uso. Las pérdidas de actividad debido a la congelacién deberian consultarse con el fabricante o ser comprobada por el usuario. Los suplementos termolabiles deben ser afiadidos a los medios de cultivo una vez que estos han sido enfriados a la T* de trabajo 47°C#2° C. El suplemento debe estar a T* ambiente antes de su adicién al medio de agar. Los Iiquidos frios pueden provocar la gelificacién del agar. Los suplementos se mezcian con agitacién, y deben ser dispensados en los contenedores finales tan rapido como sea posible. Fundido de los medios sélidos. La mayoria de los medios de cultivo sélidos pueden almacenarse preparados y estériles en frascos para fundirlos y verterlos en placa cuando se requiera El procedimiento a seguir es el siguiente: © Fundir el medio que contiene agar en autoclave durante 4 minutos aproximadamente 0 en bafio hirviendo. También puede usarse un microondas.© Dejar enfriar el medio en bafio termostatico a 4742" C para que se mantenga, en todo momento, liquido (anotar la temperatura en el formato 73503), © Repartir asépticamente en placas. Dejar solidificar el medio en las placas y secarlas, se puede hacer con las tapas quitadas y la superficie del agar hacia abajo en una estufa entre 25° C y 50° C 0 en una cabina de flujo laminar hasta que desaparezcan todas las gotas de la superficie del medio. Para los medios de placas preparadas comercializadas deben seguirse las instrucciones del fabricante para su uso. Nunca debe volver a fundirse un medio ya fundido una vez. Anterior 1 34 Siguiente4.5. Técnica de filtracién por membrana. 5/8 El grosor de la capa de medio de cultivo dispensado en placas Petri debe ser al menos de 2 mm de espesor (por ejemplo para una placa de 90 mm de diémetro son necesarios unos 15 ml de medio). Posteriormente el agar solidifica al enfriar en las placas Petri tapadas en un lugar frio y sobre una superficie horizontal Los medios de cultivo asi preparados pueden ser usados inmediatamente a su preparacién 6 mantenidos en una habitacién oscura a T? de refrigeracién 2-8° C durante el periodo que se establezca segtin indique las condiciones dadas por el fabricante. En cada lote de medio almacenado deberd figurar el nombre del medio almacenado, el n® de lote y la fecha de caducidad. Las placas pueden ver incrementado su periodo de vida util si se guardan en bolsas de plastico. Para evitar la condensacién las placas deben ser enfriadas antes de introducirlas en las bolsas. No secar la superficie del agar antes de guardarlas. En general para la inoculacién en superficie de los medios sélidos, secar las placas. Incubacién. No se deben apilar mas de seis placas en una misma fila para asi conseguir una buena circulacién del aire y permitir que el medio se equilibre a la T® de incubacién lo mas rapido posible. Para medios de cultivo liquidos el tiempo para alcanzar la T* deseada de incubacién depende de diversos factores, por ejemplo, volumen, tipo de envase y tipo de incubador. Registro. Anotar en el formato T3501 de preparacién de medios de cultivo del laboratorio los datos siguientes: N° y fecha de caducidad del lote objeto de preparacién dado por nuestro laboratorio, nombre y lote comercial de los medios y suplementos utilizados, relacién peso/volumen empleado, forma de distribucién y unidades, tipo de esterilizacién, pH y controles realizados, asi como la persona que ha llevado a cabo la elaboracién del medio y la fecha de preparacién.Controles de los medios de cultivo. Con la finalidad de obtener resultados fidedignos en andlisis microbiolégicos de alimentos, se hace necesario efectuar un control de calidad de los medios de cultivo preparados en el laboratorio y/o comercializados. Se considera como lote, el medio de cultive preparado a partir de una misma pesada, en un mismo recipiente, repartido y esterilizado al mismo tiempo y en el mismo autoclave. Todo lote de medios de cultivo se debe controlar después de su esterilizacién y en su presentacién final. Si un medio se prepara en una cantidad superior a la capacidad del autoclave y se esteriliza en 2 6 ms veces, habré un lote por cada ciclo de autoclave. A los medios comercializados se realizaré un control a cada lote diferenciado por el fabricante Para cada lote, se llevaran a cabo los siguientes controles: © control macroseépico © control de pH © control de esterilidad © control de eficacia Los controles del medio se deben realizar el mismo dia o el siguiente al de su preparacién. Los resultados de los controles se anotarén en el formato T3501 en el caso de medios preparados en el Laboratorio y en el T3504 en el caso de medios comercializados. 1. Control macroscépico. Se realizar una observacién del aspecto general del medio de cultivo, prestando especial atencién a: © color del medio de cultivo © transparencia/opalescencia del medio de cultivo © humedad de las placas ‘© posible aparicién de precipitados © posible presencia de gas en las campanas Durham Una vez realizado el control, si existe alguna apreciacién negativa, se anotaran los resultados de la apreciacién en el registro de control y empleo de medios de cultivo. Se compararan los resultados, principalmente en lo referente al color y transparencia, con los indicados en el protocolo de preparacién y control del medio en cuestién (Cuaderno de preparacién de medios).1. Control de pH. Se realizaré la medida de pH a cada lote de medios, comercializados o de elaboracién en el laboratorio. Una vez realizados los controles de pH, se anotaran los resultados en el registro de control y empleo de medios en los formatos asociados. Se comparard el resultado con el indicado en el protocolo de preparacién y control del medio en cuestién: 1, Control de esterilidad. Coger un 1% del lote (esterilizado y dispuesto en su presentacién final) e incubar en estufa de cultivo a 371° C durante 2444 horas. Después de la incubacién, se comprobara la ausencia de crecimiento de microorganismos en el medio. Los resultados se anotarén en el formato asociado. 1. Control de eficacia, En el anexo | estén especificadas las cepas que se deben utilizar para el control de la eficacia y los caracteres a estudiar. Unas tendrén un crecimiento preferencial en el medio de cultivo a ensayar y otras no creceran o lo haran débilmente. Se emplearén cepas de referencia, éstas son cepas procedentes de una coleccién nacional o internacional, mantenidas estables en el Centro e identificadas en origen o en el laboratorio. Presentan unos caracteres bien definidos, imprescindibles para reproducir 0 comparar ensayos con otros laboratorios. En el LSPPA se emplean cepas de la Coleccién Espajiola de Cultivos Tipo (CECT). Anterior 2 Siguiente 5/84.5. Técnica de filtracién por membrana. 6/8 Seguin se trate de un medio de cultivo Ifquido o sélido, se procedera de la siguiente manera’ © Medio de cultivo Ifquido. © Apartir de una emulsién de cultivo 0,5 de la Escala de MacFarland en agua destilada estéril, sembrar 10 ll en un tubo con el medio a controlar. © Se siembran tantos tubos con el medio a controlar como cepas se requieran para el control de la eficacia. e Rotular todos los tubos e incubar en estufa de cultivo a la temperatura y tiempo correspondientes al andlisis microbiolégico, © Evaluar, de acuerdo con el protocolo de preparacién y control del medio que se controla, el crecimiento (turbidez, gas en la campana Durham, pase a medio sélido, etc.) Anotar en los registros correspondientes. © Medio de cultivo sdlido, Método ecométrico (Método de Mossel): 1. Control Positive. Se toca con un asa de inoculacién una colonia del cultivo tipo y se inocula en peptona salina hasta conseguir una emulsién de cultivo de 0,5 de la escala de MacFarland, con un asa de siembra de 0,1 pl y se siembra en una placa del medio a comprobar (previamente seco y a temperatura ambiente): © Dividir la placa de Petri en cuatro cuartos y con el asa de 0,1 il, hacer 5 estrias en el primer cuarto. Sin recargar, hacer § estrias en el segundo cuarto y asi sucesivamente los cuatro cuartos, hacer una estria final en el centro de la placa. © Se siembran tantas placas/tubos con el medio a controlar como cepas se requieren para el control de la eficacia. Rotular e incubar las placas/tubos en estufa de cultivo a la temperatura y tiempo éptimos que corresponde a cada microorganismo. Para medios en placas, evaluar el crecimiento en todos los sectores inoculados.@ Se considera que un medio cumple las condiciones de calidad necesarias, si se obtiene crecimiento en todos los sectores de la placa. 1. Control negativo. Se realiza el mismo procedimiento que para el control positivo, en este caso eligiendo un microorganismo que no debe de crecer © pobremente en dicho medio. El medio se consideraré apto cuando no se encuentre crecimiento en los sectores 0 éste no sobrepase el segundo sector. Asimismo evaluar, de acuerdo con el protocol de preparacién y control del medio a ensayar, los caracteres referentes a la morfologia y color de las colonias (para medio en placas) y a las reacciones de diferenciacién y selectividad. Anotar en los registros correspondientes los resultados obtenidos. Técnicas de estriado a) estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado Cercas del mechero espera que se enfrie el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula Ja muestra en un extremo de la placa y con el asa en posicién ligeramente horizontal realiza las estrias (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcién pequefia del agar; mediante un balanceo sucesivo y rapido de la mufieca b) estriado en cuadrantes: la mayor parte del inéculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un area pequefia de la superficie de la placa con medio, en forma de estrias muy juntas, pero sin hacer presién para no dafiar el medio, Se flamea el asa, se enfria y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrias. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estria. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicién invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nuimero de bacterias. izacién y neutralizacién de frascos para toma de muestras.