Primer reporte de un fitoplasma del grupo 16SrXV en Fragaria sp. proveniente de E.U.A.

First report of a 16SrXV phytoplasma group in Fragaria sp. from E.U.A.

Anahí Martínez Cárdenas, Laboratorio de Biología Molecular, Centro Nacional de Referencia

Fitosanitaria, División General de Sanidad Vegetal, SENASICA-SAGARPA, Km 37.5 Carretera
Federal México-Pachuca, Tecámac Edo. México, CP 55740, México.
dgsv.cnrfito34@senasica.gob.mx; José Luis Cruz Jaramillo, Área de Desarrollo y Validación
de Protocolos, Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, División General de Sanidad
Vegetal, SENASICA-SAGARPA, Km 37.5 Carretera Federal México-Pachuca, Tecámac Edo.
México, CP 55740, México. dgsv.cnrfito14@senasica.gob.mx; Sonia Monroy Martínez,
Laboratorio de Biología Molecular, Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, División
General de Sanidad Vegetal, SENASICA-SAGARPA, Km 37.5 Carretera Federal México-
Pachuca, Tecámac Edo. México, CP 55740, México. dgsv.cnrfito36@senasica.gob.mx; Israel
Morales Gonzales, Laboratorio de Biología Molecular, Centro Nacional de Referencia
Fitosanitaria, División General de Sanidad Vegetal, SENASICA-SAGARPA, Km 37.5 Carretera
Federal México-Pachuca, Tecámac Edo. México, CP 55740, México.
dgsv.cnrfito35@senasica.gob.mx; Ariane Regina Razo Rodríguez, Laboratorio de Biología
Molecular, Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, División General de Sanidad Vegetal,
SENASICA-SAGARPA, Km 37.5 Carretera Federal México-Pachuca, Tecámac Edo. México,
CP 55740, México. reginarazo06@gmail.com; Mario Espinosa Mendoza*, Laboratorio de
Biología Molecular, Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, División General de Sanidad
Vegetal, SENASICA-SAGARPA, Km 37.5 Carretera Federal México-Pachuca, Tecámac Edo.
México, CP 55740, México. mario.espinosa@senasica.gob.mx.

*Autor de correspondencia.

1
Resumen. México es uno de los principales países productores de fresa con una producción de
208 mil 932.25 ton en 2008 y un aumento de 17% durante el periodo 2008-2015. Los
Fitoplasmas pueden generar pérdidas en el rendimiento de los cultivos de fresa desde un 13% a
un 90%. Material propagativo de fresa proveniente de E.U.A. fue analizado para la detección de
fitoplasmas. Se realizó el diagnóstico mediante la técnica de PCR-anidada con los iniciadores
P1A/P7A, posteriormente se utilizaron los iniciadores R16F2n/R16R2. El producto de PCR del
R16F2n/R16R2 fue sometido a secuenciación y a cortes con enzimas de restricción. El análisis de
la secuencia obtenida mostró una similitud del 99 % con Candidatus phytoplasma brasiliense
perteneciente al grupo 16SrXV. En concordancia, el patrón generado por las enzimas de
restricción concordó con el patrón reportado para el grupo 16SrXV depositado en el USDA
RFPL virtual gel. Finalmente, se generó un árbol filogenético por el método de Neighbour-
Joining con la secuencia del R R16F2n/R16R2, el cual colocó al fitoplasma encontrado dentro del
grupo 16SrXV. No se tienen reportes de infección por fitoplasmas del grupo 16SrXV en plantas
de fresa en México, lo que hace necesario verificar la fitosanidad del material propagativo de
fresa que se introduce al país y evitar con ello que se ponga en riesgo la sanidad del campo
mexicano.

Palabras clave adicionales. Candidatus phytoplasma brasiliense, PCR anidada, RFLP.

2
Abstract. Mexico is one of the main strawberries countries producers with a production of 208
thousand 932.25 tons in 2008 and an increase of 17% during 2008-2015. Phytoplasmas can
generate losses in strawberry crops yield from 13% to 90%. Propagative strawberry material from
E.U.A. was analyzed for the detection of phytoplasmas. The nested PCR technique was used for
diagnostic with P1A/P7A primers, and then with the primers R16F2n/R16R2. The
R16F2n/R16R2 PCR product was subjected to sequencing and, another proportion was digested
with restriction enzymes. The analysis of the sequence obtained showed a 99% similarity with
Candidatus phytoplasma brasiliense belonging to the group 16SrXV. In concordance, the
restriction pattern generated agreed with 16SrXV group pattern reported in the USDA RFPL
virtual gel. Finally, a phylogenetic tree was generated by the Neighbor-Joining method with the
R16F2n/R16R2 sequence; this placed the phytoplasma found in the strawberry sample within the
16SrXV group. There are no reports of infection by 16SrXV phytoplasmas group in strawberry
plants in Mexico, which makes it necessary to verify the phytosanity of propagative strawberry
material that is introduced into the country and thus avoid putting the health of the Mexican
countryside at risk.

Additional keywords. Candidatus phytoplasma brasiliense, nested PCR, RFLP.

3
México es el quinto productor de berries del mundo, antecedido por China, Estados Unidos,
Rusia y Polonia. En 2003 el valor de producción de berries representó 0.9 por ciento del valor
total de la producción agrícola; para 2014 este porcentaje fue de 3.1%. La fresa funge como la
frutilla más importante entre las berries debido a su volumen de producción, en 2008 México
tuvo una superficie cultivada de fresa de 6 mil 214 hectáreas con una producción de 208 mil
932.25 ton. El valor de las exportaciones de berries de México ha aumentado a una tasa anual
promedio de 17 por ciento durante el periodo 2008-2015, lo que ha provocado que la balanza
comercial continúe aumentando su brecha positiva durante los últimos años. En 2015, las
exportaciones de berries tuvieron un valor de 1,501 millones de dólares, mientras que las
importaciones fueron por 42 millones de dólares (Panorama agroalimentario, Berries 2016).

El cultivo de fresa es afectado por una variedad de enfermedades asociadas a la infección por
fitoplasmas (organismos similares a micoplasmas, MLOs) (Podovan et al., 2000). Los
fitoplasmas son organismos que se multiplican en el floema de las plantas de fresa y son
diseminados de planta a planta por insectos vectores de la familia Cicadellidae. Los síntomas
observados incluyen el retraso en el crecimiento, el desarrollo de múltiples coronas, las hojas
pueden crecer de la fruta, amarillamiento de las hojas, entro otros. Estos patógenos son
fácilmente transmitidos a través del cultivo de tejidos y mediante material propagativo (Louws,
2014). Por lo tanto, es esencial que todo material propagativo de fresa de importación a México
sea evaluado para asegurar que está libre de fitoplasmas y con ello asegurar la inocuidad en el
campo mexicano.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Para la extracción de ácidos nucleicos y llevar a cabo el diagnóstico de fitoplasmas, se

pesaron 200 mg de la nervadura central de hojas. Las muestras de plantas de fresa variedad
Festival se encontraban en fase fenológica de pre y floración, fueron provenientes del condado de
Red Bluff, California E.U.A, con destino al municipio de Zamora, Michoacán, México.

4
Extracción de DNA

El DNA se extrajo con el método CTAB (Doyle y Doyle, 1987) modificado. Se pesaron
200 mg de la nervadura central de hojas de fresa y se maceraron con 1 mL de buffer PBS 1X en
una Matrix M de lisado utilizando el equipo FastPrep-24™ (MP Biomedicals, Santa Ana,
California), hasta obtener un lisado homogéneo. Posteriormente, al lisado se le agregó 500 µL de
buffer CTAB al 2%, 2 % de 2-mercaptoetanol y 1% de PVP, se mezcló e incubó a 65°C por 1
hora y se dejó enfriar. A la mezcla se le agregaron 500 µL de cloroformo, homogenizando por
inversión. Los tubos conteniendo la muestra lisada se centrifugaron a 3500 g durante 10 minutos,
el sobrenadante de cada tubo se colocó en un tubo nuevo estéril, posteriormente se agregaron 300
µL de 2-propanol grado biología molecular y se procedió a incubar por 2 horas a -20°C. Posterior
a la incubación, los tubos se centrifugaron a 3500 g durante 15 min. Una vez precipitado el DNA,
se lavó con 1 mL de etanol al 70% y se centrifugó a 5000 g por 2 min. La pastilla formada se
diluyó con 50 μL de agua libre de nucleasas. Calidad y concentración del DNA obtenido, se
verificó mediante absorbancia con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, Massachusetts). Los reactivos utilizados en esta sección fueron de la marca
Sigma (San Luis, Misuri), a menos que otra cosa se especifique.

PCR anidada.

Para la detección de fitoplasmas es necesario primero realizar un PCR que posteriormente

será tomado como molde para un PCR final, este procedimiento se conoce como PCR anidada.
Se realizó el primer PCR con los iniciadores P1A (5´-ACGCTGGCGGCGCGCCTAATAC-3´) y
P7A (5´-CCTTCATCGGCTCTTAGTGC-3´), los cuales generan un fragmento de 1.8 kb (Lee et
al., 2004). Una vez obtenido el producto de PCR, se realizó una dilución 1:30 y se prosiguió con
la segunda PCR, ésta se realizó los iniciadores R16F2n (5´-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3´)
y R16R2 (5´-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3´) que generan un fragmento de 1.2 kb
(Gundersen y Lee, 1996). Las mezclas de reacción para cada PCR se llevaron a cabo en un
volumen de 25 µl que contenía: Buffer PCR 1X, 0.2 mM de dNTPs, 10 pmoles/µL de cada
iniciador, 1.5 mM de MgCl2, 1.25 U de Taq DNA Polymerasa Recombinante, 2 µL de DNA (50
ng/µl) para el P1A/P7A y 5 µL de la dilución de producto de PCR. Las condiciones de
amplificación fueron un ciclo a 94 °C por 11 y 2* minutos; 38 y 35* ciclos, 1 min a 94 °C, 2 min
a 55 °C y 3 min a 72°C; un ciclo final de 7 y 10* minutos a 72°C (*corresponde a las condiciones

5
para R16F2n/ R16R2). El producto del segundo PCR se analizó por electroforesis en gel de
agarosa al 2% teñido con GelRed® (Biotium, Inc., Fremont, California) y visualizado en un
fotodocumentador Gel Doc EZ (Biorad, Hércules, California). El producto de PCR se llevó a
secuenciación en un secuenciador ABI 3130 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific).
Todos los reactivos utilizados en esta sección fueron de la marca Invitrogen (Thermo Fisher
Scientific), a menos que otra cosa se especifique.

Alineamiento BLAST y RFLP virtual

La secuencia de 1.2 kb del producto de PCR R16F2n/R16R2 se editó manualmente en el

programa SeaView 4.6.2 y fue utilizada para realizar una búsqueda en BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) de la base de datos de NCBI. Esa misma secuencia fue
utilizada para generar el patrón de RFLP virtual
(https://plantpathology.ba.ars.usda.gov/virtualgel.html).

Polimorfismos en longitud de fragmentos amplificados (RFLP-PCR)

Para determinar el grupo al cual pertenecía el fitoplasma detectado, el producto de PCR

proveniente de la reacción con los iniciadores R16F2n/R16R2, se sometió a un análisis de
RFLPS. Se realizó la digestión del producto de PCR utilizando las enzimas de restricción: AluI,
BamHI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI, HpaII, KpnI, Sau3AI, RsaI, AspI, y TaqI. Las
reacciones de digestión se realizaron en un volumen de 20 µl conteniendo; Buffer de enzima 1X,
10 U de enzima y 0.1-0.5 µg de ADN. Todas las reacciones se incubaron durante a 37 °C 1 h,
excepto la TaqI que se efectuó a 65 °C por 1 h. Los productos de las reacciones de digestión se
analizaron en un gel de agarosa al 2.5 % teñido con bromuro de etidio. Los patrones obtenidos se
compararon con los geles virtuales depositados en el USDA RFPL virtual gel.

Recuperación de secuencias de NCBI

Se consideró recuperar las secuencias utilizadas en un estudio del rendimiento de dos

marcadores moleculares para la clasificación de distintos grupos de fitoplasmas utilizando la
reconstrucción filogenética de las unidades taxonómicas de organizadas en los grupos VI, VII, V,
XI, IX, IV, III, XV, II, XX, X, XII y I, con un total de 67 secuencias del operón ribosomal 16S
parcial, tRNA-ile, 23S parcial (Makarova et al., 2012). Se recuperaron los números de acceso, se

6
descargaron las secuencias en formato Fasta, se agregaron en un solo archivo y conociendo la
asociación de los grupos con parámetros documentados en el cuerpo de la publicación, se rehízo
el análisis filogenético empleado en el artículo.

Reconstrucción filogenética

La metodología de Makarova et al. (2012), fue adaptada para el análisis. A partir del
archivo Fasta con todas las secuencias, se agregaron dos secuencias adicionales (Nos. HQ258882
y Y10096 de grupo XV y grupo II respectivamente) y la secuencia consenso obtenida del
R16F2n/R16R2. Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias con MEGA7, utilizando
ClustalW (algoritmo progresivo) con los parámetros de gap-open-cost en 10 y gap-extension-cost
en 1, para los alineamientos pairwise y multiple. La matriz de pesos de DNA que se utilizó fue
ClustalW 1.6 con un peso de transición de 0.5 y los demás parámetros por defecto.

A partir de este alineamiento múltiple, se realizó la reconstrucción filogenética con el

modelo de Neighbour-Joining, utilizando el método estadístico de bootstrap con 500 réplicas. El
modelo de sustitución de bases fue el K2P (Kimura 2-parameters) utilizando transversiones y
transiciones. La tasa de sustitución entre sitios se consideró uniforme y se utilizó una deleción
parcial del 95% de posiciones con gaps o información no disponible.

Estos parámetros fueron utilizados previamente sobre el set original de 67 secuencias para
comparar los resultados obtenidos con los de Makarova et al. (2012), para mantener las
asociaciones consistentes aun utilizando CLC-Bio y MEGA4 a comparación de usar MEGA7.
Posteriormente se graficó el árbol con las 70 secuencias finales para el resultado obtenido en
MEGA7.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación del fitoplasma en fresa por secuenciación y RFLP´s.

Con los iniciadores R16F2n/R16R2 se obtuvo un fragmento de 1.2 kb en una de las 12

muestras de fresa (datos no mostrados), con ello se obtuvo la secuencia correspondiente y la
alineación mediante BLAST en el NCBI mostro una identidad del 99% con un fitoplasma

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reportado en el grupo 16SrXV representado por Candidatus Phytoplasma brasilense (Montano et
al., 2001). El patrón virtual de RFLP de la secuencia de 1.2 kb de la muestra de fresa, concordó
con la reportada para el grupo 16SrXV del USDA RFPL virtual gel (Figura 1A).

El patrón del corte con las enzimas AluI, HpaII, HaeII, Sau3AI, KpnI que se muestra en el gel de
agarosa (Figura 1B) corresponde al mismo patrón de bandas que se reportan para el grupo
16SrXV (AF147708). Las enzimas HaeIII y HpaII hicieron la diferenciación de los subgrupos A
y B, resultando que la muestra de fresa proveniente de E.U.A presentó la presencia de un
fitoplasma del grupo 16SrXVA.

Árbol filogenético de NJ

Se observó que la secuencia consenso correspondiente al fitoplasma en tejidos de fresa

muestra una asociación filogenética (Figura 1C) a las unidades taxonómicas adjudicadas en el
grupo 16SrXV de Ca. Phytoplasma. El árbol filogenético de bootstrap también muestra una
asociación con las secuencias del grupo 16SrXV y un clado secundario compartido con
fitoplasmas del grupo 16SrII (datos no mostrados). En el árbol de Makarova et al. (2012) se
observa que dicha asociación también se encuentra presente en los marcadores del gen parcial tuf
y del 16StRNA-Ile-23S. Con lo anterior es posible hacer una confirmación de una detección nova
de Ca. Phytoplasma 16SrXV en el cultivo de fresa proveniente de E.U.A.

CONCLUSIONES

La secuenciación del fragmento de 1.2 kb obtenido por PCR del gen 16S así como el
análisis de RFLP y la construcción del árbol filogenético, permitieron determinar a nivel de
grupo, el fitoplasma presente en plantas de Fragaria sp. provenientes de E.U.A.

El fitoplasma presente en planas de Fragaria sp. provenientes de E.U.A se identificó como

un fitoplasma del grupo 16SrXV. Este grupo de fitoplasmas no ha sido reportado en cultivos en
México y constituye el primer reporte en muestras de fresa de importación.

8
Agradecimientos

Los autores agradecen al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF-DGSV) por la

infraestructura proporcionada durante el desarrollo de este trabajo.

LITERATURA CITADA
Doyle JJ and Doyle JL. 1978. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf
tissue. Phytochemical Bulletin 19:11–15.
http://220.227.138.213/phytofura/phytoweb/protocols/lDoyle%20and%20Doyle%20ctab
%20method%20of%20dna%20isolation.pdf.
Gundersen DE and Lee IM. 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested-PCR assay
using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea 35:144–151.
https://www.jstor.org/stable/42685262?seq=1#page_scan_tab_contents.
Lee IM, Gundersen-Rindal DE, Davis RE, Bottner KD, Marcone C and Seemuller E. 2004.
‘Candidatus Phytoplasma asteris’ a novel phytoplasma taxon associated with aster yellows
y related diseases. International Journal of Systematic y Evolutionary Microbiology
54:1037–1048. DOI. 10.1099/ijs.0.02843-0.
Louws F. 2014. Phytoplasma of Strawberry: Introduction, Symptoms and the Pathogen. North
Carolina State University. https://content.ces.ncsu.edu/phytoplasma-of-strawberry.
Makarova O, Contaldo N, Paltrinieri S, Kawube G, Bertaccini A, Nicolaisen M. 2012. DNA
Barcoding for Identification of ‘Candidatus Phytoplasmas’ Using a Fragment of the
Elongation Factor Tu Gene. Plos one 7:12. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052092
Montano HG, Davis RE, Dally EL, Hogenhout S, Pimentel JP and Brioso PST. 2001.
‘Candidatus Phytoplasma brasiliense’ a new phytoplasma taxon associated with hibiscus
witches’ broom disease. International Journal of Systematic y Evolutionary Microbiology
51:1109–1118. DOI. 10.1099/00207713-51-3-1109.
Padovan A, Gibb K, Persley D. 2000. Association of Candidatus Phytoplasma australiense with
green petal and lethal yellows diseases in strawberry. Plant Pathology 49:362–369.
DOI:10.1046/j.1365-3059.2000.00461.x.
Panorama Agroalimentario. Dirección de Investigación y Evaluación Económica y Sectorial.
Fideicomisos Instituidos en relación con la Agricultura. 2016.

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 https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/200633/Panorama_Agroalimentario_Berr
ies_2016.pdf.

Leyendas de figuras

Figura 1. Árbol filogenético y patrones de RFLP correspondientes al fitoplasma del grupo

16SrXV detectado en cultivos de fresa provenientes de E.U.A. (A), Árbol filogenético NJ a
escala de distancias evolutivas. A laidlawii fue usado como grupo externo. La secuencia de
interés está marcada con un punto rojo. (B), Gel virtual que muestra el patrón de RFLP
correspondiente a Ca. Phytoplasma brasiliense representante del grupo 16SrVX. (C), Gel de
agarosa al 2% que muestra el patrón de RFLP del producto de PCR R16F2n/R16R2 de una
muestra de Fragaria sp. proveniente de E.U.A.

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Figura 1.

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