ENZIMOLOGÍA DIAGNOSTICA

INTRODUCCIÓN

1. ¿Qué es una enzima?

Cuando un compuesto se transforma en otro, de diferente naturaleza, se ha producido una reacción

química. Las reacciones químicas ocurren a una determinada velocidad, que, entre otros, depende
de los siguientes factores:
 La concentración del sustrato/s: Así, cuanto mayor sea la concentración del compuesto
inicial más rápido será el proceso.
 La temperatura: Cuya elevación acelera las reacciones químicas.
 La presencia de un catalizador modifica la velocidad de una reacción química.
Los procesos biológicos en los seres vivos, son catalizados por ENZIMAS, como catalizadores que
son, presentan las mismas características generales:

- Se requieren pequeñas cantidades para que la reacción tenga lugar.

- No se consumen durante la reacción química que catalizan.
- No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables.
- No modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

La diferencia fundamental entre un enzimas y un catalizador orgánico o inorgánico es la

especificidad de reacción que determina la ausencia de subproductos en estas reacciones y que el
rendimiento del producto en las reacciones enzimáticas sea casi del 100%. Esta especificidad
supone un ahorro de energía y protege frente al desaprovechamiento de metabolitos en las células
vivas.

Así, los enzimas no pueden lograr el que se produzca una reacción imposible, pero sí que una casi
imperceptible suceda a una velocidad apreciable.
Los enzimas normalmente son proteínas que tienen una actividad catalítica, aunque también hay
RNAs con actividad catalítica, son los Ribozimas. (no los vamos a estudiar por que tienen menos
interés clínico que los enzimas proteicos).
Actúan de diferentes modos, pero siempre gracias a que un grupo de aminoácidos, que se
encuentran próximos en la estructura espacial de la proteína, facilitan la transformación de que se
trate. Estos aminoácidos constituyen lo que se denomina centro activo de la enzima.
1.1. Las enzimas disminuyen la energía de activación de la reacción.
Para que una determinada reacción química ocurra deben darse tres condiciones:
- Los reactivos (sustratos) deben colisionar.
- La colisión molecular debe ocurrir en una orientación adecuada.
- Los reactivos deben poseer suficiente energía.

Esta energía se denomina Energía de Activación. En las reacciones catalizadas enzimáticamente

disminuye la Energía de Activación y aumenta la probabilidad de una orientación adecuada de los
reactivos.
2. Clasificación y nomenclatura de los enzimas:

Tradicionalmente los enzimas se nombraban añadiendo el sufijo "asa" al nombre del sustrato. Por
ejemplo, la ureasa es la enzima que cataliza la hidrólisis de la urea formando amoníaco y dióxido
de carbono.

Sin embargo conforme se fueron descubriendo nuevas enzimas esta nomenclatura comenzó a
resultar poco efectiva y confusa. La International Enzime Comission emitió en 1972 unas
directrices para sistematizar la nomenclatura y clasificación de los diferentes enzimas conocidas y
aplicables también a futuros descubrimientos.

2.1. Clasificación de los enzimas: Este sistema divide a las enzimas en seis clases que a su vez
pueden tener diferentes subclases. La clasificación de los enzimas en estos seis grupos se basa en el
tipo de reacción catalizada: Oxidorreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas y
Ligasas.

Clase 1. Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de

hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

Ejemplos: Succinato deshidrogenasa o la Citocromo c oxidasa.

Clase 2. Transferasas: Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de

un sustrato a otro, según la reacción:

A-B + C A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reacción representada en la Figura

glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

Clase 3. Hidrolasas: Catalizan las reacciones de hidrólisis:

A-B + H2O AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción:

lactosa + agua glucosa + galactosa

Clase 4.Liasas: Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos:

A-B A+B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reacción:

ácido acetacético CO2 + acetona

Clase 5. Isomerasas: Catalizan la interconversión de isómeros:

A B
Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la fosfoglucosa isomerasa, que catalizan las reacciones
representadas en la tabla inferior:

fosfotriosa isomerasa fosfoglucosa isomerasa

glucosa- fructosa-6-
gliceraldehído-3-fosfato dihidroxiacetona-fosfato
6-fosfato fosfato

Clase 6. Ligasas: Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido
trifosfato (ATP, GTP, etc.):

A + B + XTP A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reacción:

piruvato + CO2 + ATP oxaloacetato + ADP + Pi

2.2. Nomenclatura: El nombre sistemático de un enzima consta actualmente de 3 partes:

 el sustrato preferente
 el tipo de reacción realizado
 terminación "asa"

Un ejemplo sería la glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerización de la glucosa-6-fosfato

en fructosa-6-fosfato.

Muchos enzimas catalizan reacciones reversibles. No hay una manera única para fijar cual de los
dos sentidos se utiliza para nombrar al enzima. Así, la glucosa fosfato isomerasa también podría
llamarse fructosa fosfato isomerasa.

Cuando la acción típica del enzima es la hidrólisis del sustrato, el segundo componente del nombre
se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente lactasa. Además de los nombres
sistemáticos, aún persisten otros consagrados por el uso. Así, la glucosa: ATP fosforiltransferasa se
llama habitualmente glucoquinasa.

Además el nombre de cada enzima puede ser identificado por un código numérico, encabezado por
las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro números separados por puntos. El
primer número indica a cual de las seis clases pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas
subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos
que intervienen en la reacción

Así, la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) se define como EC 2.7.1.2. El número 2 indica

que es una transferasa, el 7 que es una fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y
el último 2 indica que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.

2.2. Clasificación de los enzimas según su origen:

o Enzimas especificas de plasma: son las enzimas que tienen su lugar de acción en el
plasma. Estas enzimas son sintetizadas en determinados tejidos y vertidas a la sangre
activamente, que es su lugar de acción, donde se encuentran su sustrato y su coenzima. Por
ejemplo las enzimas del complejo protrombínico, lipoproteinlipasa, plasminógeno y
pseudocolinesterasa. Este grupo de enzimas son sintetizadas fundamentalmente por el
hepatocito y son muy activas en el plasma (a diferencia de otras que si están aumentadas
indican daño). Entonces de este grupo de enzimas nos interesa saber sus valores inferiores;
porque una disminución de su actividad indica una alteración en la síntesis, y como la
mayoría son producidas en el hígado esto nos estaría indicando una alteración de la
funcionalidad hepática.

o Enzimas de secreción: Son enzimas secretadas por glándulas ó tejidos muy especializados,
su lugar de acción está alejado, es el caso por ejemplo de las enzimas digestivas segregadas
por el páncreas y que van al duodeno a ejercer su acción, como por ejemplo la amilasa,
lipasa, tripsina, etc. Clínicamente, estas enzimas en sangre están en baja actividad.

o Enzimas celulares de tejidos u órganos : Son todos los enzimas actúan dentro de la misma
célula que las sintetiza, no tienen acción en plasma por falta de sustrato y de coenzima. Se
dividen en 2 grupos:
  Ubicuas: Son todas las que intervienen en el metabolismo general como por ejemplo
LDH, MDH, ALT o Alanina-aminotransferasa, AST o Aspartato-aminotransferasa.

 Organoespecíficas: Enzimas especificas de determinados órganos ó tejidos que

actúan en procesos metabólicos específicos de ciertos tejidos. Por ejemplo la GLDH, y
SDH.

El conocimiento de la procedencia celular del enzima, de su distribución y difusión a través de

sangre, linfa y tejido intersticial, así como de sus vías de eliminación, nos ofrecerá datos de gran
interés para estudiar un fenómeno patológico y su posterior evolución.

3. Cinética enzimática

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la
especificidad del enzima. Las aplicaciones prácticas del estudio de la cinética enzimática son muy
amplias. En este sentido, los ensayos enzimáticos in vitro se emplean rutinariamente en los
laboratorios clínicos, ya que una velocidad enzimática anormal puede dar una pista sobre una
patología determinada. Además la información proporcionada puede indicarnos alteraciones en una
ruta metabólica determinada. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse
con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La
medida se realiza siempre en condiciones óptimas para que la enzima pueda catalizar la reacción a
velocidad máxima (Vmax). Esto se consigue cuando:

- Las condiciones de pH son óptimas.

- Las condiciones de temperatura son óptimas.
- La reacción se da en presencia de cofactores.
- Se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.

En estas condiciones la velocidad puede determinarse midiendo la aparición de los productos o la

desaparición de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del
tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la
reacción.
Figura 1. Al seguir la velocidad de
aparición de producto (o de
desaparición del sustrato) en función
del tiempo se obtiene la llamada
curva de avance de la reacción.

A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo

porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (ver figura de arriba). Para evitar esta
complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la
reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0
se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la
concentración de sustrato ([S]) como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además,
en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto
formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican
enormemente las ecuaciones de velocidad.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la
velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos la
velocidad inicial de la reacción (v0 ) frente a la concentración inicial de sustrato ([S]0) obtenemos
una gráfica como la de la figura 2. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente
proporcional a la concentración de sustrato y por tanto, la reacción es de primer orden. Pero a altas
[S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0 . En este
punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es
máxima (Vmax).

Figura 2. Modelo de Michaelis-

Menten: Si representamos la
velocidad inicial frente a la
concentración inicial del sustrato
obtenemos una curva hiperbólica.

Al efectuar análisis de enzimas en el laboratorio es fundamental que la concentración de

sustrato sea lo suficientemente elevada como para favorecer la saturación enzimática y por ello que
la reacción se sitúe en una cinética de orden cero. Con el fin de asegurar que una reacción
enzimática tenga cinética de orden cero durante un análisis, es necesario proporcionar la
concentración óptima de sustrato. La CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN (Km) es útil para
ello. Dicha constante representa la concentración de sustrato (en mol/L) cuando la velocidad de
reacción es ½Vmáx. El valor de Km se obtiene de la gráfica de Michaelis-Menten.

Km es una constante cuyo valor permanece sin cambios para cada conjunto o par ES salvo
que se modifiquen las condiciones de reacción que afectan al enlace del enzima con el sustrato. Por
otra parte, Km nos da información sobre la afinidad del enzima por el sustrato, de tal forma que si
Km es alta, la afinidad entre ambos elementos es baja (y, por tanto, la velocidad de reacción es
lenta); en caso de que Km sea baja, la afinidad enzima/sustrato es alta y la velocidad de reacción
rápida.

6. Enzimas más significativos en diagnostico clínico.

Lactato-deshidrogenasa (LDH → EC 1.1.1.27):

Es una oxidorreductasa cuya actividad es necesaria en la interconversión del ácido pirúvico

(piruvato) en ácido láctico (lactato) y viceversa; como recordaremos, este paso metabólico aparecía
tras la glicolisis si las condiciones eran anaerobias, por ello este enzima desempeña un papel muy
importante en los tejidos que utilizan la glucosa como principal fuente energética (músculo
esquelético, tejido cardíaco, hígado, eritrocitos y plaquetas, riñón, pulmones y bazo).

La LDH es un tetrámero formado por cuatro cadenas polipeptídicas; cada cadena o

subunidad puede ser de dos tipos: cardíaca (H) o muscular (M). Las combinaciones de estas
subunidades producen cinco isoenzimas denominadas LDH-1 (4 cadenas H), LDH-2 (3 cadenas H y
una cadena M), LDH-3 (2H y 2M), LDH-4 (1H y 3M) y LDH-5 (4M); estos isoenzimas poseen
distinta carga eléctrica, por lo que pueden separarse por electroforesis, de tal modo que los dos
primeros (LDH-1 y LDH-2) poseen una alta movilidad electroforética, la LDH-3 tiene una
movilidad intermedia y la LDH-4 y LDH-5 se mueven con lentitud sobre el soporte de la
electroforesis. La localización de cada isoenzima también varía:

-LDH-1/LDH-2 → corazón y eritrocitos.

-LDH-3 → pulmón y bazo.
-LDH-4/LDH-5 → músculo e hígado.

En el suero de individuos sanos, la fracción isoenzimática predominante es la LDH-2

seguida, por este orden, de LDH-1, LDH-3, LDH-4 y LDH-5.

La actividad LDH se incrementa en varias afecciones: infarto de miocardio, anemia

megaloblástica, leucemia, lesión hepática (hepatitis, cirrosis, obstrucción biliar) y lesión muscular
(ejercicios intensos, aplastamiento, distrofias); es un buen indicador de hemólisis. En cualquier
caso, la elevación aislada de este enzima debe considerarse como un dato inespecífico.

Transaminasas:

Constituyen una clase de enzimas incluídas entre las transferasas que están ampliamente
extendidas en el organismo y que catalizan la transferencia de un grupo amino (-NH2) desde un
aminoácido a un cetoácido. Las dos transaminasas de mayor importancia son la AST (o GOT → EC
2.6.1.1) y la ALT (o GPT → EC 2.6.1.2):

-AST→aspártico-aminotransferasa ; GOT→glutámico-oxalacético-transaminasa
-ALT→alanina-aminotransferasa ; GPT→glutámico-pirúvico-transaminasa

Las reacciones catalizadas por la AST (o GOT) y la ALT (O GPT) se representan a

continuación:

AST
Aspártico + Glutárico ─────────── Oxalacético + Glutámico
ALT
Alanina + Glutárico ───────── Pirúvico + Glutámico

La AST se encuentra predominantemente en el citoplasma y las mitocondrias del hepatocito,

en músculo cardíaco y esquelético y en riñón; en menor grado se encuentra en eritrocitos, páncreas,
bazo y pulmón. La ALT se localiza principalmente en el citoplasma hepático y, en menor grado, en
músculo esquelético, corazón, riñón, páncreas, pulmón y eritrocitos. Las transaminasas nunca se
detectan en orina a menos que exista una lesión renal.

Las determinaciones de AST y ALT son de gran utilidad para diagnosticar enfermedades
hepáticas agudas y crónicas (hepatitis, cirrosis), así como afecciones cardíacas (infarto agudo de
miocardio) y musculares (distrofias, aplastamientos, gangrenas).

Creatin-quinasa (CK → EC 2.7.3.2):

Es un enzima citoplasmático y mitocondrial que se incluye en la clase de las transferasas y

cataliza, en ambos sentidos, la reacción siguiente:

CK
Creatina + ATP ════════ Fosfocreatina + ADP + energía
Mg++
 La actividad CK es de particular importancia en el tejido muscular, ya que toda contracción
de sus fibras exige hacer uso del ATP. Además de en el músculo esquelético, encontramos
abundante CK en cerebro, corazón, estómago, intestino y eritrocitos.

La CK se presenta como un dímero que consta de dos subunidades (B o cerebral y M o

muscular) que se combinan de distintas formas para dar lugar a tres isoenzimas:

-CK-BB (2 subunidades B): predomina en cerebro y S.N.C.

-CK-MB (1 B y 1 M): predomina en corazón.
-CK-MM (2 subunidades M): predomina en músculo y corazón.

En suero normal, las proporciones de los distintos isoenzimas de la CK son las siguientes:

·CK-MM → 94%
·CK-MB → ≈6%
·CK-BB → ≈0%

Existe una cuarta forma de CK denominada mitocondrial (CK-mito) que nunca se observa
en suero normal, pero que, cuando aparece, es indicativa de daños extensos en los tejidos, con
liberación del contenido mitocondrial.

La CK se eleva principalmente en enfermedades que afectan al tejido musculoesquelético

(distrofias, aplastamientos, hipotiroidismo), miocardio (infarto agudo) y cerebro. Como la CK total
se eleva en muy diversas afecciones, su determinación tiene menor significado clínico que la de sus
isoenzimas.

Fosfatasa alcalina (ALP → EC 3.1.3.1):

Es una hidrolasa que actúa a pH 9'0-10'5, catalizando la liberación de fósforo orgánico con
producción de un alcohol:

ALP
-
H2O + R-PO4H ────── R-OH + H2PO4

Sus isoenzimas se encuentran ampliamente distribuidas en los tejidos humanos,

localizándose preferentemente en hígado, hueso, placenta, intestino, bazo y riñón. La ALP presente
en suero procede de dos tejidos principales: hígado y hueso; los isoenzimas pueden ser
diferenciados por electroforesis.

El aumento de actividad ALP en suero se observa en diversas afecciones, sin embargo su

significado clínico se relaciona principalmente con la detección de enfermedades óseas (osteítis
deformante o enfermedad de Paget, raquitismo, osteomalacia, metástasis osteoblásticas) y hepáticas
(especialmente la obstrucción biliar).

Fosfatasa ácida (ACP → EC 3.1.3.2):

Como la anterior, es una hidrolasa que libera fósforo orgánico con producción de alcohol,
pero, a diferencia de ella, actúa a pH 4'5-7'0.

Se encuentra ampliamente distribuida en los tejidos y líquidos orgánicos, predominando en

próstata, hígado, riñón, eritrocitos, plaquetas y osteoclastos.
 Como la actividad ACP en la próstata es más de 1.000 veces superior a la de otros tejidos, se
solicitan determinaciones de esta sustancia principalmente para diagnosticar afecciones prostáticas
(cáncer de próstata) y, en menor grado, para enfermedades malignas de los huesos (metástasis,
mieloma, etc.).

Amilasa (AMS → EC 3.2.1.1):

La a-amilasa es un enzima que requiere Ca++ como activador y pertenece a la clase de las
hidrolasas. Cataliza la ruptura de los enlaces α1→4 internos del almidón, glucógeno y otros
polímeros de glucosa, dando lugar a oligosacáridos.

Las principales fuentes tisulares de este enzima son las glándulas salivares y el páncreas
exocrino. Puede encontrarse también en sudor, pulmón, huesos, ovarios y tiroides.

Puesto que la AMS se filtra en pequeñas cantidades en el glomérulo renal y no se reabsorbe

totalmente en los túbulos, la determinación analítica de esta sustancia puede realizarse tanto en
suero como en orina.

Se han identificado dos isoenzimas de la AMS: la pancreática o P (con tres subvariedades →

P1, P2 y P3) y la salivar o S (también con tres subvariedades → S1, S2 y S3). En el suero de un
adulto normal, el 40% de la actividad total de AMS se debe al tipo P y el 60% restante al tipo S.

La actividad de la AMS se eleva en varias enfermedades, no obstante su significado clínico

se relaciona principalmente con la pancreatitis aguda (especialmente si existe P3, habitualmente
indetectable en suero).

Lipasa (LPS → EC 3.1.1.3):

Es una hidrolasa que rompe dos uniones glicerol/ácido graso de los triglicéridos, dando
como resultado un monoglicérido y dos ácidos grasos:
LPS
Glicerol + 2 H2O ────── Monoglicérido + 2 ácidos grasos

Se localiza en páncreas, mucosa intestinal, estómago, leucocitos y tejido adiposo, pero sólo
la forma pancreática tiene significado clínico, utilizándose en el diagnóstico de pancreatitis aguda.
A diferencia de la amilasa, se reabsorbe totalmente en los túbulos renales, por lo que no se detecta
en orina.

Gamma-glutamil-transferasa (GGT/GT → EC 2.3.2.1):

Es una transferasa cuya función más importante es la transferencia del grupo -glutamil del
glutation y otros péptidos.

Los principales tejidos que contienen GGT incluyen el hígado, riñón, páncreas e intestino,
aunque la mayor parte de la actividad sérica de este enzima se deriva del hígado.

El uso clínico más frecuente de la GGT es la detección y diagnóstico diferencial de las

afecciones hepatobiliares, especialmente de la obstrucción biliar o colestasis. Puesto que el alcohol
y ciertos fármacos (antidepresivos y anticonvulsivantes) inducen su síntesis, este enzima es un
indicador bastante sensible de abuso de alcohol (de hecho se utiliza para vigilar la abstinencia, ya
que desciende tras 2-5 semanas del abandono del consumo de esta sustancia).
Colinesterasa (ChE → EC 3.1.1.7):

Es una hidrolasa que cataliza la ruptura de la acetil-colina en colina y ácido acético. Se

conocen dos formas diferentes de colinesterasa: la verdadera (o acetil-colinesterasa → AChE) y la
pseudocolinesterasa (ChE).

La AChE se localiza preferentemente en los eritrocitos y S.N.C., mientras que la de la ChE

lo hace en hígado y sustancia blanca del encéfalo.

Los análisis clínicos de colinesterasa se solicitan en casos de intoxicación por

organofosforados, en enfermedades hepáticas (hepatitis, cirrosis, cáncer) y en situaciones en las que
debe administrarse succinil-colina como miorrelajante previo a la anestesia general (ya que existen
determinadas formas de la colinesterasa que no degradan este miorrelajante; en estas situaciones
puede aparecer fallo respiratorio durante la anestesia).

Aldolasa (ALS → EC 3.4.1.1):

Es una liasa que rompe la fructosa-1,6-difosfato en dihidroxiacetona-fosfato y

gliceraldehido-3-fosfato.

Se detecta actividad aldolasa en todas las células vivas, pero predomina en músculo
esquelético, hígado y cerebro, lugares en donde existe en forma isoenzimática (ALS-A en músculo,
ALS-B en hígado y ALS-C en cerebro).

Su utilidad clínica se relaciona principalmente con afecciones musculares (distrofias, sobre

todo) y, en menor grado, con alteraciones hepáticas y cerebrales.

5-Nucleotidasa (5'NT → EC 3.1.3.5):

Cataliza la hidrólisis de los nucleótidos en nucleósidos, con liberación de fosfato.

Se localiza en muchos tejidos, especialmente el hepático; clínicamente, junto a ALP, se

relaciona con afecciones hepatobiliares (colestasis), de tal manera que si aumentan ambos enzimas,
el proceso se localiza en vias biliares, mientras que si sólo aumenta ALP, el proceso es de origen
óseo.

Leucinaminopeptidasa (LAP → EC 3.4.1.1):

Es una hidrolasa que rompe el enlace peptídico N-terminal de los péptidos, especialmente de
aquellos que tienen leucina como aa externo.

Se localiza preferentemente en hígado, riñón e intestino delgado y se relaciona con

afecciones hepatobiliares.
7. Metodología para la determinación de enzimas.

7.1. Toma de muestra y conservación para la determinación de enzimas:

La muestra destinada a las determinaciones de enzimas debe cumplir una serie de requisitos
que son básicos para garantizar la calidad del resultado:

1. Evitar la éstasis venosa prolongada durante la extracción (por mantenimiento excesivo del
compresor), pues se produce hipoxia y un aumento de la permeabilidad de las células
sanguíneas, con vertido de su contenido al medio.

2. No poner las muestras para las determinaciones enzimáticas en tubos lavados con detergentes,
ya que se pueden alterar la estructura proteica del enzima.

3. Transportar refrigerada la muestra destinada a determinación enzimática, pero sin congelar

(salvo que haya de conservarse largo tiempo sin procesar).

4. No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces, pues ello puede
ser causa de desnaturalización irreversible del enzima.

5. Separar lo antes posible el coágulo del suero/plasma, pues ciertos enzimas (LDH, ACP) son
componentes de las plaquetas y se liberan al medio si existe destrucción de las mismas.

6. No trabajar con muestras hemolizadas, ya que en ellas se encuentran aumentados los enzimas
intraeritrocitarios, que han sido liberados al medio, sobre todo LDH, ACP, CK y AST.

7. Evitar el envejecimiento de las muestras, sobre todo si vamos a determinar ACP o CK, ya que
son enzimas muy lábiles (especialmente el primero de ellos). Los enzimas más estables son la
ALP y la ChE.

7.2. Fundamento de las determinaciones enzimaticas.

Dada su baja concentración en sangre u orina, el estudio de los enzimas en el laboratorio de

diagnostico clínico se basa, de una forma general, en la demostración "in vitro" de la actividad
catalítica que un enzima cualquiera tiene "in vivo". No es, por tanto, a diferencia de otras técnicas
de laboratorio, la cantidad (en peso) del enzima presente en la muestra lo que se mide, sino su
funcionalidad. Esto no quiere decir que sea imposible la determinación de la cantidad de enzima
presente (que puede conseguirse por métodos de alta sensibilidad, ya sean inmunológicos -como el
RIA, ELISA, EQL, inmunoelectroforesis- o cromatográficos).

La actividad catalítica de un enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de

sustrato transformada en producto por unidad de tiempo (en condiciones definidas y controladas).

Las unidades de actividad catalítica son la U.I./L (en el sistema convencional) y el Katal/L
(en el sistema internacional):

U.I. = cantidad de enzima que produce 1 mmol/min de producto

Katal = cantidad de enzima que produce 1 mol/s de producto

1 U.I. = 1'67×10-8 Kat

 En la práctica, para determinar la actividad catalítica de un enzima cualquiera (y siempre
que mantengamos constante la temperatura y el pH de la reacción y trabajemos con concentraciones
de sustrato al menos 10 veces mayores que Km para así alcanzar una cinética de orden cero),
podemos:

Medir el aumento de producto que se forma a lo largo de la reacción.

Medir la disminución de sustrato que va ocurriendo a lo largo de la reacción.

Para que una determinación enzimática sea válida, hay que hacer hincapié en que la
concentración de enzima debe ser el único factor limitante de la reacción y en que la velocidad de
dicha reacción no debe estar influída por situaciones distorsionantes (temperatura, pH, sustrato
insuficiente) ni sustancias presentes en el medio (activadores, inhibidores).

Si representamos en unos ejes de coordenadas el aumento de producto (o la disminución de

sustrato) en función del tiempo de reacción, obtendremos los siguientes gráficos:
1. Fase de retraso: tras añadir muestra (con el enzima problema) a una mezcla de reacción, se

produce un periodo de latencia (cuya duración va de segundos a minutos) durante el cual

enzima y reactivos se unen entre sí. La actividad enzimática no debe determinarse durante
esta fase, ya que la reacción se encuentra dentro del periodo de cinética de primer orden
(existen pocos complejos Enzima-Sustrato y muchas moléculas libres de enzima).

2. Fase de velocidad inicial: durante ella, la velocidad de formación de producto (o de

disminución de sustrato) tiene lugar de una manera lineal con respecto al tiempo. La
reacción enzimática tiene ahora dinámica de orden cero y, por tanto, todas las moléculas de
enzima están en forma de complejos ES. Esta es la fase en la que debe determinarse la
actividad enzimática.

3. Fase de velocidad reducida: se caracteriza por una disminución progresiva de la formación

de producto (o de la disminución de sustrato). La reacción enzimática vuelve a tener cinética
de primer orden, por lo que aquí tampoco debe determinarse la actividad enzimática. La
disminución de la velocidad de reacción se debe fundamentalmente al agotamiento del
sustrato, con la consiguiente existencia de moléculas de enzima libres. Cuando se entra en la
fase de velocidad reducida, la reacción deja de ser lineal, por lo que se dice que se ha
alcanzado el LIMITE DE LINEALIDAD; en estas circunstancias, la muestra debe ser
diluída y vuelta a analizar (para que, al disminuir la concentración de enzima, el sustrato se
agote más lentamente y el periodo lineal se alargue). Antes de dar el resultado, debemos
multiplicarlo por el factor de dilución.
7.3. Metodología:

Una vez que la reacción enzimática se inicia (al añadir suero a una mezcla de reacción) y se
alcanza la cinética de orden cero, pueden utilizarse dos métodos para determinar la actividad
enzimática: el de punto final y el cinético (ya sea de puntos múltiples o de vigilancia continuada):

Método de punto final:

Es poco utilizado actualmente; supone incubar la mezcla un tiempo predeterminado y,

transcurrido dicho tiempo, detener la reacción y medir la variación de la absorbancia (por técnicas
colorimétricas o ultravioletas), calculando a partir de ella la actividad del enzima. Su principal
desventaja es que no sabemos con certeza si la reacción progresa en forma lineal y, por tanto, tiene
dinámica de orden cero.

Métodos cinéticos:

Suponen la realización de varias mediciones de absorbancia. Pueden ser de dos tipos: puntos
múltiples (los más usuales) y vigilancia continuada; ambos tipos pueden utilizar técnicas
colorimétricas o ultravioletas. Los métodos cinéticos permiten conocer si la reacción progresa o no
en forma lineal y, por tanto, tiene dinámica de orden cero.

-Método cinético de puntos múltiples colorimétrico:

El enzima de la muestra actúa sobre un sustrato presente en el reactivo para ejercer

su acción biológica; como consecuencia de ello se forma un producto que interacciona con
un indicador también presente en el reactivo. El resultado final es la formación de un
cromógeno (compuesto coloreado) que puede llevarse al espectrofotómetro y leerse a una
longitud de onda visible.

Tras la mezcla muestra-reactivo y el periodo de incubación pertinente, se hacen

varias lecturas a intervalos regulares de tiempo, se calcula la media de las diferencias de
absorbancia por intervalo de tiempo (E/T o A/T) y se multiplica por un factor
suministrado por el fabricante del reactivo y calculado según la siguiente fórmula:

ε=Coeficiente de extinción molar

1 V b=Ancho de cubeta
F = ─── · ───── · 1.000 V=Volumen de la mezcla reactiva
ε·b v v=Volumen de muestra

-Método cinético de puntos múltiples ultravioleta:

Se basa en que las formas reducidas de los coenzimas que participan en las
reacciones enzimáticas (NADH, NADPH) absorben luz UV a ≈340 nm, mientras que las
formas oxidadas de estos coenzimas (NAD+, NADP+) no lo hacen. El enzima de la muestra
actúa sobre el sustrato presente en el reactivo, produciéndose una reacción en la que
participa el coenzima (también presente en el reactivo); dependiendo de que se utilice la
forma reducida o la oxidada del coenzima, la absorbancia (que se mide a intervalos
regulares de tiempo tras la incubación) irá disminuyendo (NADH→NAD +;
 NADPH→NADP+) o aumentando (NAD+→NADH; NADP+→NADPH). Tras anotar las
absorbancias, se calcula la media de las diferencias por intervalo de tiempo (E/T o A/T) y
se multiplica por un factor suministrado por el fabricante del reactivo de acuerdo a la misma
fórmula del apartado anterior.

-Método de vigilancia continuada:

Exige utilizar un fotómetro dotado de un sistema de registro continuo que va

trazando el progreso de la reacción a lo largo de un periodo de tiempo; la pendiente de la
porción lineal de dicha reacción se utiliza para calcular la actividad enzimática. Cualquier
desviación de la linealidad se observa de inmediato en la gráfica de registro.

8. Los enzimas como reactivos:

Además de utilizar los enzimas como indicadores del estado de los tejidos y órganos que los
producen, estos catalizadores tienen otras funciones útiles en el laboratorio, empleándose como
reactivos en la determinación de otros analitos.

Como los enzimas sólo catalizan determinadas reacciones, su uso como reactivos da
especificidad a estos procedimientos analíticos, ya que así se eliminan las interferencias de otras
sustancias que comúnmente alteran los resultados de procedimientos no enzimáticos.

En estos casos, a diferencia de cuando los estamos determinando, los enzimas deben aportarse
en exceso para que la reacción se efectúe en su totalidad y no quede ninguna molécula del sustrato a
determinar sin reaccionar.