ARTÍCULO2

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E

INDUSTRIAS
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE LOS ESTEROIDES

BOLDENONA Y TREMBOLONA EN MÚSCULO BOVINO DE LA
PROVINCIA DE MANABÍ
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

DE INGENIERA DE ALIMENTOS
VARGAS ORTEGA MARÍA BELÉN
DIRECTOR: Dr. LUIS RAMOS GUERRERO
Quito, enero 2018

© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2018
Reservados todos los derechos de reproducción

FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO
PROYECTO DE TITULACIÓN
DATOS DE CONTACTO
CÉDULA DE IDENTIDAD: 1720388899
APELLIDO Y NOMBRES: Vargas Ortega María Belén
DIRECCIÓN: Conocoto, Valdivia y Abdón Calderón
EMAIL: belenchis_04@hotmail.com
TELÉFONO FIJO: 02-3805778
TELÉFONO MOVIL: +593-978905758
DATOS DE LA OBRA
TITULO: “EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE
LOS ESTEROIDES BOLDENONA Y
TREMBOLONA EN MUSCULO BOVINO
DE LA PROVINCIA DE MANABI”
AUTOR O AUTORES:
Vargas Ortega María Belén
FECHA DE ENTREGA DEL PROYECTO
DE TITULACIÓN: Diciembre, 2017
DIRECTOR DEL PROYECTO DE

Dr. Luis Ramos
TITULACIÓN:
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO

x
TITULO POR EL QUE OPTA:
Ingeniera en Alimentos
x
RESUMEN:
En varios países, el sector ganadero ha
manifestado indicios sobre el incorrecto uso
de promotores del crecimiento en bovinos.
La normativa ecuatoriana establece un
tiempo de retiro para aquellos medicamentos
veterinarios suministrados previo al
faenamiento, pues la presencia de residuos
hormonales en el producto puede llegar a
afectar la salud del consumidor. La creciente
demanda cárnica hace difícil el cumplimiento
de las disposiciones por parte de los
productores. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo se basó en la evaluación de
trembolona y boldenona (compuestos
esteroides) mediante el método ELISA
competitivo en tejido muscular bovino
procedente de mataderos en la provincia de
Manabí. Los resultados obtenidos indicaron
que no existe presencia del compuesto
trembolona, cumpliendo el límite máximo de
residuos (LMR) de < 2 µg/kg vigente en el
Codex Alimentarius. Por otra parte para el
compuesto de boldenona, se tomó como
referencia la normativa establecida por la
Unión Europea de tolerancia cero, al no
existir un LMR definido por el Codex
Alimentarius, los resultados determinaron
muestras positivas a la presencia de esta
hormona en aquellas correspondientes a los
mataderos ubicados en la parroquia de
Honorato Vásquez, cantón Santa Ana (50 %
de presencia); seguido por los mataderos de
Portoviejo (40 % de presencia) y la parroquia
de San Juan de Manta (8.3 % de presencia),
constituyendo un total del 14.6 % en la
totalidad de las muestras analizadas bajo el
método ELISA competitivo. Así mismo, se
realizó la evaluación del desempeño del
método ELISA competitivo para ambas
hormonas, donde las pendientes de ambas
curvas de calibración logarítmica mostraron
una buena correspondencia entre los
estándares y sus respuestas con coeficientes
2
de determinación de R = 0.98. Se verificó la
exactitud del método comparando los
estándares del kit, tanto de trembolona como
de boldenona, con los estándares preparados
en laboratorio, donde se determinaron los
porcentajes de recuperación
correspondientes a cada kit, los que se
encontraron entre el 82 % y 98 %. Además,
se observó poca dispersión entre las réplicas.
Estos resultados indican que los análisis se
desarrollaron de una manera técnica y sólida.
PALABRAS CLAVES:
boldenona / trembolona / inocuidad / límite
máximo de residuos / seguridad alimentaria
ABSTRACT:
The livestock sector in several countries has
shown signs of improper use of growth
promoters in cattle. The ecuadorian
legislation establishes a withdrawal time for
those veterinary drugs supplied prior to
slaughter, since the presence of hormonal
residues in the product may affect the health
of the consumer. Given the growing demand
for meat, it is difficult to comply with the
provisions by producers. Therefore, the
objective of this study was identified the
presence of two steroid compounds
(trenbolone and boldenone) in bovine muscle
tissue, using competitive ELISA. Samples
were collected from slaughterhouses located
in Manabí.
The result showed no presence of the

trenbolone compound, complying with the
maximum residue limit (MRL) of < 2 μg / kg in
force in the Codex Alimentarius. Moreover for
boldenone compound the norm established
by the European Union of zero tolerance was
taken as a reference in the absence of an
MRL defined by the Codex Alimentarius, the
results determined positive samples for the
presence of this hormone for samples
corresponding to the slaughterhouses located
in parish Honorato Vásquez, Santa Ana (50
% presence); followed by the
slaughterhouses of Portoviejo (40 %
presence) and the parish of San Juan de
CI: 1712923760
Además, se observó poca dispersión entre
las réplicas. Estos resultados indican que los
análisis se desarrollaron de una manera
técnica y sólida.
PALABRAS CLAVES:
boldenona / trembolona / inocuidad / límite
máximo de residuos / seguridad alimentaria
ABSTRACT:
The livestock sector in several countries has
shown signs of improper use of growth
promoters in cattle. The ecuadorian
legislation establishes a withdrawal time for
those veterinary drugs supplied prior to
slaughter, since the presence of hormonal
residues in the product may affect the health
of the consumer. Given the growing demand
for meat, it is difficult to comply with the
provisions by producers. Therefore, the
objective of this study was identified the
presence of two steroid compounds
(trenbolone and boldenone) in bovine muscle
tissue, using competitive ELISA. Samples
were collected from slaughterhouses located
in Manabí.
The result showed no presence of the

trenbolone compound, complying with the
maximum residue limit (MRL) of < 2 μg / kg in
force in the Codex Alimentarius. Moreover for
boldenone compound the norm established
by the European Union of zero tolerance was
taken as a reference in the absence of an
MRL defined by the Codex Alimentarius, the
results determined positive samples for the
presence of this hormone for samples
corresponding to the slaughterhouses
located in parish Honorato Vásquez, Santa
Ana (50 % presence); followed by the
slaughterhouses of Portoviejo (40 %
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a mis padres Azucena y Wilson, y a mis hermanos

Juan Martín y Juan Pablo, por su apoyo, cariño y amor incondicional a lo largo
de esta etapa de mi vida y confiar siempre en mí.
A mis abuelitos por sus enseñanzas que con amor me han impartido desde
pequeña.
A mis primas Soledad y Justine por su gran cariño y apoyo cuando lo

necesitaba.
Gracias.
AGRADECIMIENTO
A Dios por permitirme cumplir cada una de mis metas planteadas, siendo mí
soporte emocional durante mi vida estudiantil.
A mis padres por su ejemplo de superación y lucha, brindarme su apoyo en

cada etapa y no dejarme caer.
A AGROCALIDAD, y todos los que forman parte de ella; por permitirme

realizar mi trabajo de titulación en sus instalaciones y bajo su tutela.
Y a mí tutor, el Dr. Luis Ramos, a mis revisores Dr. Cristian Alcívar y Dra.
Patricia Garrido, y a la Ing. Michelle Guijarro por su ayuda tutela y paciencia
como guías imprescindibles para la culminación de este trabajo
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN 1
2
ABSTRACT
3
1. INTRODUCCIÓN
9
2. METODOLOGÍA
9
2.1 MUESTRA
2.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE MÚSCULO 10

BOVINO
2.3 MÉTODO ELISA COMPETITIVO 12
2.4 DESEMPEÑO MÉTODO ELISA COMPETITIVO 12
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 14
3.1 TREMBOLONA 14
3.2 BOLDENONA 15
3.3 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO: 18

TREMBOLONA
3.4 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO: 19

BOLDENONA
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 22
4.1 CONCLUSIONES 22
4.2 RECOMENDACIONES 23
5. BIBLIOGRAFÍA
24
6. ANEXOS 33
i
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Número de muestras obtenidas de cada matadero 9
Tabla 2. Curva de Calibración Logarítmica del Kit Estándar del 12

Método ELISA Trembolona
13
Tabla 3. Curva de Calibración Logarítmica del Kit Estándar del
Método ELISA Boldenona
Tabla 4. Verificación de la exactitud del método ELISA 19

competitivo para trembolona
Tabla 5. Verificación de la exactitud del método ELISA 20

competitivo para Boldenona
ii
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Preparación de la muestra 11
Figura 2. Análisis de muestras trembolona versus LMR Codex 14

Alimentarius
Figura 3. Análisis de muestras para boldenona versus LMR 15

Unión Europea
Figura 4. Concentración de boldenona/muestra de tejido 16

muscular
Figura 5. Parroquias de Manabí con mayor incidencia a 17

resultados positivos de Boldenona por el método
ELISA.
Figura 6. Porcentaje de incumplimiento en Manta (A), 18

Portoviejo (B), Honorato Vásquez (C) al LMR de la
Unión Europea
Figura 7. Curva de calibración para trembolona por el método 18

ELISA
Figura 8. Curva estándar del método ELISA para boldenona 20
iii
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO 1. ESTRUCTURAS DE A) COLESTEROL, B) 33

TESTOSTERONA, C) TREMBOLONA, D)
BOLDENONA
ANEXO 2. NÚMERO DE MUESTRAS OBTENIDAS DE 34

MATADEROS MANABÍ
ANEXO 3. RESULTADOS TREMBOLONA 35
ANEXO 4. RESULTADOS BOLDENONA 37
ANEXO 5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: A) RECEPCIÓN 39

DE LA MUESTRA, B) HOMOGENIZACIÓN, C)
PESAJE, D) CODIFICACIÓN, E) VORTEADO, F)
CENTRIFUGACIÓN, G) SOBRENADANTE, H)
ADICIÓN DE REACTIVOS, I) EVAPORACIÓN
CON NITRÓGENO
ANEXO 6. MÉTODO ELISA COMPETITIVO 41
ANEXO 7. REGISTRO DE MUESTRAS – PROTOCOLO 42

ELISA TREMBOLONA
ANEXO 8. REGISTRO DE MUESTRAS – PROTOCOLO 43

ELISA BOLDENONA
iv
RESUMEN
En varios países, el sector ganadero ha manifestado indicios sobre el

incorrecto uso de promotores del crecimiento en bovinos. La normativa
ecuatoriana establece un tiempo de retiro para aquellos medicamentos
veterinarios suministrados previo al faenamiento, pues la presencia de
residuos hormonales en el producto puede llegar a afectar la salud del
consumidor. La creciente demanda cárnica hace difícil el cumplimiento de las
disposiciones por parte de los productores. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo se basó en la evaluación de trembolona y boldenona
(compuestos esteroides) mediante el método ELISA competitivo en tejido
muscular bovino procedente de mataderos en la provincia de Manabí. Los
resultados obtenidos indicaron que no existe presencia del compuesto
trembolona, cumpliendo el límite máximo de residuos (LMR) de < 2 µg/kg
vigente en el Codex Alimentarius. Por otra parte para el compuesto de
boldenona, se tomó como referencia la normativa establecida por la Unión
Europea de tolerancia cero, al no existir un LMR definido por el Codex
Alimentarius, los resultados determinaron muestras positivas a la presencia
de esta hormona en aquellas correspondientes a los mataderos ubicados en
la parroquia de Honorato Vásquez, cantón Santa Ana (50 % de presencia);
seguido por los mataderos de Portoviejo (40 % de presencia) y la parroquia
de San Juan de Manta (8.3 % de presencia), constituyendo un total del 14.6
% en la totalidad de las muestras analizadas bajo el método ELISA
competitivo. Así mismo, se realizó la evaluación del desempeño del método
ELISA competitivo para ambas hormonas, donde las pendientes de ambas
curvas de calibración logarítmica mostraron una buena correspondencia entre
los estándares y sus respuestas con coeficientes de determinación de R2 =
0.98. Se verificó la exactitud del método comparando los estándares del kit,
tanto de trembolona como de boldenona, con los estándares preparados en
laboratorio, donde se determinaron los porcentajes de recuperación
correspondientes a cada kit, los que se encontraron entre el 82 % y 98 %.
Además, se observó poca dispersión entre las réplicas. Estos resultados
indican que los análisis se desarrollaron de una manera técnica y sólida.
PALABRAS CLAVE: boldenona / trembolona / inocuidad / límite máximo de

residuos / seguridad alimentaria
1
ABSTRACT
The livestock sector in several countries has shown signs of improper use of
growth promoters in cattle. The ecuadorian legislation establishes a withdrawal
time for those veterinary drugs supplied prior to slaughter, since the presence
of hormonal residues in the product may affect the health of the consumer.
Given the growing demand for meat, it is difficult to comply with the provisions
by producers. Therefore, the objective of this study was identified the presence
of two steroid compounds (trenbolone and boldenone) in bovine muscle tissue,
using competitive ELISA. Samples were collected from slaughterhouses
located in Manabí.
The result showed no presence of the trenbolone compound, complying with

the maximum residue limit (MRL) of < 2 μg / kg in force in the Codex
Alimentarius. Moreover for boldenone compound the norm established by the
European Union of zero tolerance was taken as a reference in the absence of
an MRL defined by the Codex Alimentarius, the results determined positive
samples for the presence of this hormone for samples corresponding to the
slaughterhouses located in parish Honorato Vásquez, Santa Ana (50 %
presence); followed by the slaughterhouses of Portoviejo (40 % presence) and
the parish of San Juan de Manta, Manta (8.3 % of presence) constituting a
total of 14.6 % of non-compliance in the total of the samples analyzed with the
ELISA method. Likewise, the performance of the competitive ELISA method
was evaluated for the determination of boldenone and trenbolone. The
calibration curves showed the correlation between the standards and their
responses, the determination coefficients were R 2 = 0.98 in both cases, in the
same way the accuracy of the method was verified, using standards and
determining the percentages of recovery, which they were determined
between 82 % and 98 %. In addition, little dispersion was observed between
the replicates. What together allows us to indicate that the analyzes were
developed in a technical and solid way.
KEYWORDS: boldenone / trenbolone / harmlessness / maximum residue limit

/ food safety
2
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
Se pronostica que para el año 2050 la demanda mundial de productos

cárnicos se incrementará en 1.3 % (ESPAE; ESPOL, 2016). Siendo en las
regiones desarrolladas y en vías de desarrollo donde el consumo de carne
bovina llegará a los 7.4 kg/habitante al año (FAO, 2004). Por esta razón se
prevé un aumento de la población mundial de bovinos, que en 1998 se
encontraba cerca de 1.310 millones de cabezas de ganado y en el 2008
ascendió a 1.347 millones (SAGARPA, 2009). De las cuales,
aproximadamente 4.6 millones corresponde a Ecuador (INEC, 2014).
Relacionándose con el consumo anual de 17 kg de carne bovina per cápita a
nivel nacional (INEC, 2010). La producción cárnica de doble propósito
(producción lechera y cárnica), se concentra en la región Costa y Amazonía
(INEC, 2010), principalmente en las provincias de Manabí, Esmeraldas y
Guayas, donde se estima se sacrificaron aproximadamente 0.9 millones de
cabezas de ganado durante el 2015, cantidad equivalente a 182 mil TM de
peso (ESPAE; ESPOL, 2016).
La ganadería se puede clasificar acorde a técnicas empleadas, tipo de ganado

y el espacio ocupado (Zambrano, 2015); disponiéndose en diferentes tipos de
mataderos (municipales, tipo cooperativa de productores, empresas
comerciales privadas y órganos paraestatales) (Veall, 1993). En Ecuador la
carne generalmente proviene de mataderos municipales con bajo nivel de
tecnificación, como es el caso de los mataderos de la provincia de Manabí
(Calero, 2012). Delgado, et. al. (2015) evidenció que las carnes obtenidas en
estos mataderos presentan problemas debido a sus condiciones sanitarias.
Dada la creciente demanda de productos cárnicos, los productores se vieron

en la necesidad de acortar los tiempos de crecimiento mediante la crianza de
razas de fácil engorde, optimizando sistemas de pastoreo, mejorando las
razas, tecnificando la alimentación del ganado con gramíneas y leguminosas,
y utilizando sustancias promotoras de crecimiento o subproductos que
aceleran el metabolismo del animal, con la finalidad de optimizar la
transformación del alimento en proteína (Fajardo, Méndez & Molina, 2011);
enfocándose en el mejoramiento de la genética, sanidad, alimentación o
instalaciones (Zambrano, 2015). Particularmente, el uso de promotores del
crecimiento, no normada o controlada generaría condiciones que
comprometerían parte de la seguridad alimentaria, debido al incremento de la
posible presencia de remanentes de medicamentos veterinarios en los
alimentos que, a largo plazo, ocasionarían serios problemas de salud pública
(Roncato, Siqueira, & Ferreira, 2002).
Respecto a los controles, estos varían de acuerdo con la normativa vigente

en cada país (Collins, Belk, & Cross, 1989); pues se estima que alrededor del
3
15 – 20 % del medicamento veterinario suministrado puede permanecer sin
absorberse, razón por la que se establece un tiempo de retiro antes del
sacrificio (Fajardo, Méndez, & Molina, 2011). En determinados países
latinoamericanos con industrias cárnicas de menor proporción, el uso de
promotores de crecimiento ha ido en aumento (Menacho, 1995). Siendo un
ejemplo claro Colombia con la apertura del uso de benzoato de estradiol,
progesterona, acetato de trembolona y zeranol (Ledezma, 2014). Este
aumento se debe a que el costo por alimentación representa el 70 % del total
de los costos de producción, disminuyéndose gracias a que la conversión del
alimento en proteína es más eficiente (Gorostiaga, 1986) y la carne que se
obtiene de los bovinos tratados es magra (Arias, 2013).
Por el contrario, aquellos países con mayor producción cárnica son miembros
de la unión europea y no admiten el uso de cualquier tipo de promotor,
incrementando su producción con ganado de genética seleccionada (Gerde,
2003), Argentina prohíbe el uso de hormonas y su normativa controla los
remanentes por medio de metodologías basadas en técnicas cromatográficas
y de radioinmunoanálisis. En cuanto a Uruguay y Brasil no admiten el uso del
zeranol, pero sí permiten emplear otras sustancias anabólicas y Paraguay
prohíbe utilizar anabolizantes en animales destinados a consumo (Fajardo,
Méndez, & Molina, 2011).
En Ecuador, estudios respecto al uso de anabólicos, promotores de

crecimiento o el desarrollo de normativas que regulen su utilización, como en
el caso de la trembolona y boldenona, son escasos (Zambrano, 2015). Estos
compuestos, según Heitzman (1983), se alojan en los músculos y la grasa en
concentraciones del orden de partes por billón (ppb). Se conoce que la
cantidad no es factor relevante en cuanto a la acción que ejercen sobre el
organismo (Roncato, Siqueira, & Ferreira, 2002). El Comité Mixto del Codex
Alimentarius /FAO/WHO indica que la ingesta de alimentos contaminados con
anabolizantes puede llevar a la aparición de disturbios endocrinos (Cardoso,
Silva, & Santos, 1999).
Los compuestos que actúan como promotores de crecimiento se clasifican en

andrógenos, estrógenos, antibióticos y probióticos (Ruiz, 1997). Bavera, et. al.
(2002) las clasifica en aquellas que pueden tener actividad hormonal y no
hormonal y por su origen pueden variar entre endógenos (naturales) o
sintéticos. Dentro del grupo de naturales se engloban sustancias como el
estradiol (17 beta y 17 alfa), testosterona (y sus derivados), progesterona,
somatrotofina y agonistas beta adrenérgicos (epirefrina y nor-epirefrina). Los
compuestos sintéticos son estilbénicos (dietilestilbestrol y dienestrol), no
estilbénicos (menengestrol, zeranol y trembolona) y betadrenérgicos
(clembuterol, cimaterol y fenoterol). Desde el punto de vista bioquímico
Spotorno (1998), los clasifica en naturales (testosterona, estradiol y
progesterona), xenobióticos no estilbenos (zeranol y acetato de trembolona),
4
estilbenos (dietilestilbestrol,hexoestrol, dienestrol), hormonas del crecimiento
y compuestos afines y beta agonistas.
Algunas de las principales marcas de anabólicos empleados en bovinos son:

Zeranol (Ralgro®), 17β Estradiol en goma siliconada (Compudose®),
Benzoato de Estradiol en combinación con Progesterona (Synovex®M),
Benzoato de Estradiol con Testosterona (Synovex®H) (Cáñez, Gómez, Cajal,
& Zambrano, 1985), el Acetato de Trembolona (Finaplix) que puede usarse
solo o combinado con Estradiol (Revalor®) o Zeranol, Nandralona sola o en
combinación con estrógenos, Undecilato de Boldenona con o sin estrógenos,
la mixtura de progesterona y benzoato de estradiol (Ganavet Machos).
Para el uso de sustancias anabólicas se debe tomar en cuenta la regulación

de cada país, los grados de riesgo, factores de tolerancia y el metabolismo
animal (Isaza & González, 1985), además de la distribución de la droga en el
organismo y su excreción; esta información en conjunto con el límite máximo
de residuos (LMR), que es la cantidad residual de una sustancia que se
considera sin potencial efecto sobre el consumidor, permite establecer los
tiempos de retiro (intervalo entre administración y faenamiento) (Spotorno,
1998).
Los LMR debido al tipo de medicamento veterinario empleado, para los

compuestos naturales los LMR están dentro de los niveles fisiológicos
normales debido a que su dosis es insignificante en comparación a los niveles
producidos por el animal. En cuanto a los xenobióticos no estilbenos se
establece un LMR inferior al nivel de actividad hormonal, en vista que la
concentración suministrada es mayor a la que fisiológicamente produce el
organismo del bovino, lo que puede desencadenar la aparición de células
atípicas. Cabe mencionar que los estilbenos son genotóxicos y está prohibido
su uso (Spotorno, 1998).
Asimismo, los anabólicos en bovinos se disponen como implantes

subcutáneos, inyecciones de soluciones oleosas (Heitzman, 1983), tabletas
comprimidas o como caucho siliconado rodeado por una capa que contiene la
hormona (Cardona & Sanclemente, 1986), se coloca en la cara dorsal de la
oreja debido a la escasa irrigación sanguínea del lugar, y se realiza mediante
una pistola de implante, evitando los bordes laterales del cartílago (Fajardo,
Méndez, & Molina, 2011).
Los anabólicos mejoran el balance de nitrógeno en el organismo y, por

consiguiente, incrementan la producción de proteína (Bolaños & Inga, 2010).
Al combinar diferentes agentes anabólicos aumenta la ganancia de peso vivo
(GPV) y la eficiencia de la conversión alimenticia (ECA) (Heitzman, 1983). Los
anabólicos se derivan del núcleo del esterano
(ciclopentanoperhidrofenantreno), formados por 4 anillos fusionados
5
(Hoffmann, 1983) llamados gonano. Se dividen en tres grupos importantes:
esteroles, ácidos biliares y hormonas esteroides (Koolman & Röhm, 2004).
Las hormonas esteroides provienen bioquímicamente del colesterol que es

liberado por lipoproteínas circulantes (LDL-colesterol) (Ver Anexo 1. A)
(BIOPSICOLOGIA, 2012). Su función es de señalamiento, controlan el
metabolismo, crecimiento y reproducción (Koolman & Röhm, 2004). Tanto la
trembolona como la boldenona son esteroides anabólicos androgénicos
(EEA), derivados de la testosterona (Hoffmann, 1983) (Ver Anexo 1. B).
La trembolona tiene origen sintético y actúa directamente sobre el músculo

(Bartle, Preston, Brown, & Grant, 1992). Su fórmula molecular es C18H22O2
(LCSS, SF) (Ver Anexo 1. C). El producto para uso veterinario (Finajet) está
conformado por acetato de trembolona cuya acción tiene una duración entre
2 – 3 días (Gomez, 2016). Este rápidamente se hidroliza a 17-β-trembolona,
y luego a 17-α-trembolona, el cual es considerado como el metabolito más
abundante, no obstante, en músculo el que se encuentra en mayor grado es
la 17 β-trembolona (Pottier, Busigny, & Grandadam, 1975). Jouquey, et. al.
(1983), menciona que puede permanecer en el organismo del ganado de 60
a 90 días antes del sacrificio y, una vez dentro del sistema circulatorio es
rápidamente hidrolizado a su forma libre (TBOH). Este medicamento es
utilizado solo o combinado con estradiol y sus derivados para mejores
resultados (FAO, 1990).
En general la trembolona ha sido empleada con éxito en forma comercial en

la industria pecuaria (Hoffman & Evers, 1986). En 1995, el Codex Alimentarius
determinó un Límite Máximo de Residuos (LMR) para trembolona de 2 ppm
en músculo bovino (Palermo, 1998). Actualmente, los LMR son menores a 2
ppb (CODEX ALIMENTARIUS, 1995). El comité mixto de la FAO/OMS
establece un LMR de 1.4 ppm de β-trembolona en tejido muscular bovino y de
14 ppm de α-trembolona en riñón e hígado bovino (Collins, Belk, & Cross,
1989).
La boldenona es de lenta absorción, su fórmula molecular es C19H26O2 (LCSS,

SF) (Ver Anexo 1. D). Tiene un efecto prolongado pues alcanza su acción de
dos a cuatro semanas, por esta razón los tiempos de espera, en Estados
Unidos, antes del sacrificio son de 71 días (Bolaños & Inga, 2010), o 60 días
antes del sacrificio después de que se haya retirado el fármaco (Rojas, 2004).
La dosis administrada en animales es de 0.02 ppm de peso vivo, o 1 ml por
cada 90 kg de peso, cada 30 días o a criterio del veterinario (Bolaños & Inga,
2010). No tiene un límite máximo de residuos dado por el Codex Alimentarius,
por ello se toma en cuenta la normativa dada por la Unión Europea, la cual
prohíbe el uso de sustancias con efecto hormonal y tireostático, además de
sustancias beta-agonistas en la cría de ganado, por lo que no debe haber
6
presencia de residuos en el tejido muscular dispuesto para consumo (Directiva
96/22/CE, 1996).
En Ecuador durante el 2015 se registró la venta de 13 medicamentos

veterinarios con boldenona en su composición, para uso en bovinos, porcinos,
equinos, caninos y felinos en dosis de 0.2 – 0.5 ppm, con un tiempo de retiro
de 70 días (AGROCALIDAD, 2015).
A escala mundial se muestran diferentes técnicas empleadas para la

detección de residuos de medicamentos veterinarios como inmunoensayos,
este método engloba los radioinmunoensayos (RIA) e inmunoabsorbentes
ligados a enzimas (ELISA), utilizado para determinar presencia o ausencia
(Hoffman & Blietz, 1983) y métodos fisicoquímicos por cromatografía (CG-EM,
CCDAE) que se utilizan para determinaciones cuantitativas (Lone, 1997).
De acuerdo con Plaizer (1993), para que un método de determinación de

sustancias anabolizantes sea considerado satisfactorio, deberán permitir que
se realice regularmente por una persona cualificada y el manejo de un gran
número de muestras en un pequeño espacio de tiempo; Eeckhout, et. Al.
1998, agrega que el método debe ser selectivo para el compuesto y así evitar
falsos positivos, además debe cuantificar de forma inequívoca la
concentración del compuesto presente; permitiendo tanto la cuantificación del
compuesto libre como su conjugado; y no ser muy costoso (Eeckhout,
Peteghem, & Helbo, 1998).
La tendencia se inclina al análisis de esteroides y anabolizantes por métodos

cromatográficos, estos pueden ser cromatografía líquida de alta eficiencia
(CLAE), cromatografía gaseosa acoplada a la espectrometría de masas (CG
- EM) y cromatografía en capa delgada de alta eficiencia (CCDAF), (Roncato,
Siqueira, & Ferreira, 2002). La técnica del CG-EM revela concentraciones muy
bajas de ng/l o ng/kg (Saeed, Ismael, & Ahmad, 1999). Algunos esteroides
anabolizantes y sus metabolitos no tienen buen comportamiento
cromatográfico debido a grupos hidroxilos o cetónicos en su estructura,
requiriéndose que se analicen por medio de una cromatografía a gas
(Marchand, Bizec, & Gade, 2000).
La CLAE - EM es un método de detección e identificación, con bajo límite de

detección (Roncato, Siqueira, & Ferreira, 2002). Horie & Nakazawa (2000)
utilizaron este método para la determinación de metabolitos de trembolona y
zeranol, de acuerdo con los autores, la principal ventaja de este tipo de
método es que las muestras no necesitan pasar por una etapa de
derivatización, evitando pérdidas indeseables (Horie & Nakazawa, 2000).
En cuanto a los inmunoensayos, están basados en la reacción antígeno-

anticuerpo y posterior revelación de esta reacción, para cuantificar y calificar
7
el ensayo. La revelación puede ser por reacción enzimática (ELISA) o por
emisión de radioactividad de un isótopo marcado (RIA) (Harlow & Lane, 1988).
El método de screening de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), se

fundamenta en la inmovilización del reactivo en una fase sólida y un generador
de señales el cual es una enzima; este ha simplificado la cuantificación de
antígenos (AG) y la detección de anticuerpos (AC) (Butler, 2000). Se clasifica
de acuerdo con el Anticuerpo AC y el Antígeno AG marcado, en el primer
grupo se encuentran ELISA Directo, ELISA Indirecto y ELISA sándwich (Doble
(DAS) o Heterólogo (HADAS), y de acuerdo con el AG marcado está el ELISA
competitivo. La diferencia entre cada tipo de ELISA se halla en sus etapas
(CULTEK, 2006). Además, los anticuerpos monoclonales que se utilizan en
estos ensayos presentan resultados rápidos y confiables, detectando niveles
alrededor de 0,05 ppm en pollos, pavos, bovinos y caprinos (Watanabe,
Satake, & Matsumoto, 1998).
En el ELISA competitivo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el

conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Si la
muestra presenta ausencia de color es positiva, debido a que el sustrato no
encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra (Cruz, 2001). La medición se realiza
fotométricamente a 450 nm o a 600 nm; y la absorción es inversamente
proporcional a la concentración de los analitos en la muestra (United States
Department of Agriculture, 2004). Este método ha sido ampliamente utilizado
para la determinación de remanentes de medicamentos veterinarios en
estudios realizados por Morales (2016), Xia, et al. (2007) y Quing, et al. (2007).
Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la presencia de
trembolona y boldenona en productos pecuarios bovinos utilizando esta
técnica y persigue los siguientes objetivos específicos:
 Adquirir una muestra representativa de tejido muscular bovino en la

provincia de Manabí.
 Obtener resultados sobre detección de Trembolona y Boldenona en
tejido muscular bovino en dicha provincia.
 Conocer sobre el uso de Trembolona y Boldenona en el alcance del
proyecto utilizando el método de screenning de inmunoadsorción ligado
a enzimas (ELISA).
 Evaluar el desempeño del método ELISA competitivo para la
evaluación del Trembolona y Boldenona.
8
2. METODOLOGÍA
2. METODOLOGÍA
2.1 MUESTRA
La cantidad de muestras y de lugares de muestreo se basaron en criterios

técnicos establecidos en el método de muestreo recomendado por el CODEX
Alimentarius CAC/GL 33, 1999 (Anexo 2). Así como en la información
suministrada por AGROCALIDAD (Tabla 1), sobre el estado de los mataderos
en el país correspondientes al período 2017.
Las muestras fueron obtenidas en mataderos pertenecientes a la provincia de

Manabí que es la mayor productora de carne a nivel nacional, por tanto, el
área con mayor representatividad. Se identificaron 12 mataderos con mayor
ingreso de animales por mes (Tabla 1). De los cuales se tomó un total de 41
muestras de 500 g y se procedió a identificarlas en campo, posteriormente se
transportaron congeladas a los laboratorios de AGROCALIDAD, ubicados en
Tumbaco – Cantón Quito, Provincia de Pichincha; donde recibieron un código
de muestra en laboratorio (Anexo 3 y 4).
Tabla 1. Número de muestras obtenidas de cada matadero
INGRESO ANIMALES /
NOMBRE DEL MATADERO MUESTRAS
MES
Matadero Cogamantasa 1272 12

Matadero municipal Portoviejo 1011 10
Matadero parroquial San isidro 25 0
Matadero municipal Chone 178 1
Matadero municipal Leonidas plaza 94 2
Matadero parroquial Charapotó 89 3
Matadero municipal El Carmen 295 2
Matadero municipal Paján 378 4
Matadero municipal Pedernales 68 2
Matadero municipal Rocafuerte 179 3
Matadero parroquial Honorato Vásquez 210 1
Matadero municipal Tosagua 324 1
TOTAL 4123 41
9
2.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE MÚSCULO BOVINO
Una vez receptadas las muestras se separó el tejido graso y venas para
obtener un tejido magro. Se homogenizó por separado en un molino
procesador de tejidos, marca Omni Tissue Master, y de cada muestra se
pesó 2 g a las que se adicionó 6 ml de acetonitrilo y 2.5 ml de 1X Buffer de
Balance de Muestra. Se homogenizó mediante un vórtex a máxima velocidad
durante 20 minutos. A continuación, se centrifugó a 4000 revoluciones por 10
minutos a temperatura ambiente (20 – 25 °C/ 68 – 77 °C), se transfirió 3 ml el
sobrenadante a un nuevo tubo, se adicionó 300 mg de Tissue Clean Up Mix y
se vorteó a máxima velocidad por 5 minutos a temperatura ambiente (20 – 25
°C/ 68 – 77 °C). Luego se centrifugó la mezcla por 10 minutos a 4000
revoluciones a temperatura ambiente y se transfirió 2.4 ml de sobrenadante a
un nuevo tubo. Finalmente se secó la muestra en un evaporador a 50 – 60 °C
al mismo tiempo que se sopló gas nitrógeno en la muestra. Se adicionó 1X
PBS, y se vorteó vigorosamente por 30 segundos a máxima velocidad (Anexo
5). De la muestra preparada se tomó 50 µl. (Figura 1).
10
Figura 1. Preparación de la muestra (Método de extracción líquido – líquido)
11
2.3 MÉTODO ELISA COMPETITIVO
El método para la evaluación de la presencia o ausencia de los esteroides se

basó en los lineamientos descritos en los manuales correspondientes a cada
esteroide - MaxSignal Trenbolone ELISA Test Kit # 1089 – 02, 2013 y el
MaxSignal Boldenone ELISA Test Kit # 1085 – 01, 2014; manufacturados por
la corporación Bioo Scientific (Anexo 6) y siguiendo el protocolo establecido
por AGROCALIDAD “Instructivo INT/CPP/01’’ (Anexo 7 y 8).
La lectura se realizó mediante el lector ELISA, a una longitud de onda de 450
nm. Se utilizó The MaxSignal ELISA Analysis Program en Excel para evaluar
los resultados obtenidos.
2.4 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO
La evaluación del método ELISA competitivo se basó en el desempeño

analítico, donde se tomó en cuenta el límite de detección del kit (< 0,025 ppb),
lineabilidad (curva de calibración y coeficiente de determinación) y la exactitud
(precisión de los datos y veracidad), tanto para trembolona, así como también
boldenona.
Para la construcción de la curva de calibración logarítmica se utilizó los valores

de la absorbancia media relativa (B/B0) de cada estándar de referencia versus
la concentración correspondiente al analito evaluado en ppb; de este modo se
obtuvo el coeficiente de determinación (R2). Para evaluar la exactitud de los
datos se comparó la absorbancia del estándar del kit en determinada
concentración versus el resultado que se obtuvo de la absorbancia del
estándar preparado en laboratorio con la misma concentración
Las concentraciones para el Kit ELISA competitivo de Trembolona se

evaluaron en 0,25 ppb y 1 ppb (Tabla 2).
Tabla 2. Curva de Calibración Logarítmica del Kit Estándar del Método ELISA Trembolona
VALORES
ESTÁNDAR CONCENTRACIÓN
EXPERIMENTALES OD450-1 B/B0*
N°. Log
(ppb)
St 1 0,000 1.090 1.000
St 2 0.050 2.996 0.878 0.806
St 3 0.100 2.303 0.743 0.682
St 4 0.250 1.386 0.505 0.463
St 5 0.500 0.693 0.275 0.252
St 6 1.000 0.000 0.208 0.191
OD: Densidad Óptica
B: Absorbancia del estándar
B0: Absorbancia del estándar cero
B/B0: Absorbancia relativa
12
Las concentraciones que se utilizó para la evaluación de la exactitud del kit
ELISA competitivo de Boldenona fueron de 0.5 ppb y 4.5 ppb (Tabla 3).
Tabla 3. Curva de Calibración Logarítmica del Kit Estándar del Método ELISA Boldenona
VALORES
ESTÁNDAR CONCENTRACIÓN
EXPERIMENTALES OD450-1 B/B0*
N°. Log
(ppb)
St 1 0.000 1.905 1.000
St 2 0.050 2.996 1.720 0.903
St 3 0.150 1.897 1.345 0.706
St 4 0.500 0.693 0.912 0.479
St 5 1.500 0.405 0.771 0.405
St 6 4.500 1.504 0.384 0.202
B: Absorbancia del estándar
B0: Absorbancia del estándar cero
13
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. RESULTADOS Y DISCUCIÓN
3.1 TREMBOLONA
De acuerdo con el CODEX Alimentarius, la concentración de trembolona en

tejido muerto no debe superar los 2 ppb, los resultados obtenidos indicaron
estar por debajo del límite de detección < 0.025 ppb en las muestras
provenientes de Manabí (Anexo 3), estableciéndose el 100% de cumplimiento
de la norma establecida (Figura 2). Esto se puede atribuir a que, al ser un
medicamento veterinario escaso en el mercado ecuatoriano a comparación
con países como Brasil, donde no es ampliamente utilizado a pesar de
categorizarse como permitido.
Aunque en estudios realizados en ratas Sprague-Dawley alimentadas con

carne de terneros implantados con una mezcla de 20 mg de estradiol-17β +
140 mg de TBA (acetato de trembolona), revelaron que no existe influencia
sobre el crecimiento, el peso de los órganos, la reproducción, la
teratogenicidad y la cancerogenicidad, aún es incierto saber los efectos que
puedan tener sobre el organismo humano (Gropp, Buttenkotter & Kaemmerer,
1978). Si bien algunos autores mencionan que es ampliamente utilizado dado
su alto rendimiento en los índices de conversión y ganancia de peso (Fajardo,
Méndez, & Molina, 2011), los resultados obtenidos en el presente estudio
indican que la posible presencia del esteroide en el tejido muscular bovino es
baja.
Los datos obtenidos pueden no ser certeros cuantitativamente, dado que en

estudios realizados por medio de radioinmunoanálisis en animales a los que
se les suministró implantes vía intravenosa, se encontró que los residuos de
17β-trembolona y 17α-trembolona pueden encontrarse en concentraciones de
0.05 – 0.005, 0.10 – 1.0 y 0 – 191 ppb, en músculo, hígado y bilis
respectivamente; 60 días después de retirado el implante. Se llegó a la
conclusión de que, en este tipo de ensayos, el 95% de residuos de TBA
permanece sin extraerse del músculo, posiblemente unida de forma covalente
al músculo cuando se realiza el radioinmunoanálisis (Velle, 1982). Lo mismo
menciona Ryan et. al. (1975), los residuos solubles son alrededor del 10 %
del total de la muestra, mientras que el resto está ligado a los tejidos, es decir,
no son extraídos por disolventes orgánicos. Por lo que este tipo de ensayos
únicamente nos ayudarían a determinar cualitativamente la presencia o
ausencia del analito.
14
100% 41
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0
0%
AUSENCIA PRESENCIA
Frecuencia 41 0
Figura 2. Análisis de muestras trembolona versus LMR Codex Alimentarius
3.2 BOLDENONA
Tras el análisis de los datos, los valores que mostraron estar por debajo el
límite de detección (< LD) se reportaron como ausencia del esteroide, junto
con aquellos no detectados (ND) (Anexo 4). Se encontró que el 14.63 % de
las muestras resultaron positivos a la presencia del esteroide boldenona
(Figura 3). Cuando los resultados indican estar por debajo del límite de
detección, Roncato, et al, (2002) recomienda que se realice un análisis de
masas para determinar con mayor exactitud el contenido de esteroides cuya
presencia no es permitida. Dado que el kit evalúa la presencia de anticuerpos
de boldenona en el animal, las reacciones pueden dar lugar a falsos positivos,
como lo menciona Lin (2015), estos test están sujetos a un gran número de
variables que pueden afectar el resultado de la muestra, estas variables
pueden ser la selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y
tiempo; además, un animal que haya sido inyectado con la hormona
anteriormente continúa produciendo anticuerpos de Boldenona, por lo que se
requiere evaluar la presencia mediante métodos confirmatorios.
15
90% 85,37%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20% 14,63%
10%
0%
PRESENCIA AUSENCIA
Frecuencia 14,63% 85,37%
Figura 3. Análisis de muestras para boldenona versus LMR Unión Europea
El Codex Alimentarius no establece un límite para boldenona en tejido

muscular bovino, sin embargo, la Unión Europea señala que no debe existir
presencia de este esteroide. Resultados similares fueron hallados en el Camal
Metropolitano de Quito, donde se evidenció la presencia en el 100 % de las
muestras analizadas para el mismo esteroide (Morales, 2016). Además,
estudios realizados mediante métodos cromatográficos en China indican
presencia de los esteroides dentro del país asiático. Xia, et al. (2007),
determinó la presencia de residuos de progesterona, trembolona y boldenona
en pollo, carne bovina y porcina, mediante HPLC-MS/MS (cromatografía
líquida de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas), encontrando
concentraciones de residuos de 0.11, 0.17 y 0.02 ppb. Por otro lado, Quing,
et al. (2007), realizó la determinación de trembolona, boldenona y 3 –
metoxitiramina en productos cárnicos utilizando LC-MS-MS (cromatografía
líquida sumada a espectrometría de masas en tándem) y GC-MS
(cromatografía de gases sumado a espectrometría de masas), donde sus
límites de detección fueron 0.3 y 2 ppb respectivamente. En Guatemala,
Rodríguez, et al. (2010), realizaron un estudio de detección de residuos en
orina con la técnica cromatografía de gases en 15 porcinos (8 machos
castrados y 7 hembras) donde encontraron que el 47 % de las muestras dieron
positivo a la presencia de 6β – hidroxiboldenona, el 6 % a la presencia de
Methandrostenolona y 47 % de las muestras resultaron negativas a la
presencia de esteroides anabólicos. Demostrando que su uso como promotor
de crecimiento es frecuente tanto en países latinoamericanos como en los
asiáticos.
Las concentraciones con mayor acaecimiento se encuentran entre las

concentraciones de 0.03 ppb y 0.04 ppb (Figura 4), muy cerca del límite de
detección del método, pese a existir estudios que demuestran que el uso de
boldenona como tratamiento de engorde del ganado es el de más baja
rentabilidad (2.4 %) (Muñoz & Ocampo, 2008).
16
Figura 4. Concentración de boldenona/muestra de tejido muscular
El mayor porcentaje de incidencia de Boldenona se observa en los mataderos

de Honorato Vásquez (50 %), seguido por los mataderos en Portoviejo (40 %)
y Manta (8.33 %) (Figura 5).
Figura 5. Parroquias de Manabí con mayor incidencia a resultados positivos de Boldenona

por el método ELISA.
Una de las doce muestras de Manta analizadas evidenció presencia de

boldenona, así como cuatro de diez muestras de Portoviejo y dos muestras
pertenecientes a Honorato Vásquez (Figura 6).
17
Figura 6. Porcentaje de presencia en Manta (A), Portoviejo (B), Honorato Vásquez (C) al
LMR de la Unión Europea
3.3 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO:

TREMBOLONA
La pendiente de la curva de calibración logarítmica nos indica que existe una
buena correlación entre los estándares preparados y la respuesta
espectrofotométrica del método, ya que se obtuvo un coeficiente de
determinación R2 = 0.98 (Figura 7), muy cercano a 1.
Figura 7. Curva de calibración para trembolona por el método ELISA
18
Como resultado la exactitud del Kit ELISA competitivo para Trembolona indicó
ser del 82 %, lo cual es aceptable considerando que se trabaja con una matriz
compleja como lo es músculo bovino (Tabla 4).
Tabla 4. Verificación de la exactitud del método ELISA competitivo para trembolona
NOMBRE
VALOR %
DE OD-1 B/B0 RESULTADOS PROMEDIO
EXPERIMENTAL RECUPERACION
MUESTRA
QC 0.25
0.559 51.30% 0.196
ppb
0.204 0.25 81.60%
QC 0.25
0.540 49.50% 0.212
ppb
QC 1 ppb 0.217 19.90% 0.820 0.820 1 82.00%
B/B0: Porcentaje de Absorbancia relativa
Mediante otros métodos para la evaluación y cuantificación de esteroides, se

ha logrado cuantificar distintas concentraciones de residuos. Watanabe, et. al.
(1998), lograron detectar concentraciones de hasta 0.05 ppb. Mientras que,
Weiner, et. al (2000), realizó evaluaciones mediante radioinmunoensayos,
demostrando su alta sensibilidad y precisión en la determinación de hormonas
en el ganado vacuno. En Japón, Furusawa (2009), determinó que la
cromatografía líquida (HPLC) es un método fácil, barato, inofensivo y rápido
para el análisis de acetato de trembolona y 17 betatrembolona en músculo de
ganado.
Pérez, et. al. (2014), realizó el análisis de validación del método ELISA,
obteniendo una buena correlación, al obtenerse un coeficiente de
determinación superior a 0,99 (R2=0,9991). El autor también menciona que,
un aspecto importante para validar un ELISA, es necesario demostrar la
condición de exceso de anticuerpos como requisito para establecer la validez
del ensayo, pues de esta forma se garantiza la detección de altas
concentraciones de PCHs que pudieran estar presentes en una muestra.
3.4 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO:

BOLDENONA
El método ELISA Competitivo para boldenona presentó un coeficiente de

determinación R2 = 0.98 (Figura 8), lo que indica que los resultados obtenidos
se correlacionan bien y por lo tanto generarán resultados confiables durante
la interpolación de las muestras.
19
Absorbancia relativa
Concentración estándar (ppb)
Figura 8. Curva estándar del método ELISA para boldenona
La verificación de la exactitud del método arrojó porcentajes de recuperación

del 91.5 % y 98.9 %, para las concentraciones de 0.5 ppb y 4.5 ppb
respectivamente (Tabla 5). Lo que indica que los resultados de las muestras
se encuentran muy cercanos al valor considerado como verdadero o que el
error de la determinación es muy pequeño.
Tabla 5. Verificación de la exactitud del método ELISA competitivo para Boldenona

NOMBRE
VALOR %
DE OD-1 B/B0 RESULTADOS PROMEDIO
EXPERIMENTAL RECUPERACION
MUESTRA
QC 0.5
1.039 54.50% 0.459
ppb
0.4575 0.5 91.50%
QC 0.5
1,041 54.60% 0.456
ppb
QC 4.5
0.386 20.30% 4.449 4.449 4.5 98.87%
ppb
El porcentaje de recuperación para los controles realizados en el laboratorio

de AGROCALIDAD, muestran una exactitud o porcentaje de recuperación
alto, debido a la correcta preparación de la muestra y respuesta del kit. Como
lo explica Riera los límites de detección dependerán en gran medida de la
extracción y de la purificación que se le haga a la muestra (Riera, 2010). Por
lo que, estos porcentajes indican que los resultados obtenidos son altamente
exactos (80 – 90 %).
Otros autores han realizado análisis de la eficiencia de distintos métodos en
la evaluación de residuos de medicamentos veterinarios. Roda, et al. (2000),
demostró la alta eficiencia en la detección de clembuterol en orina de bovinos
mediante el método RIA, en un rango de 0.5 ppb a 1.2 ppb (Roda, Manetta, &
Piazza, 2000).
De acuerdo con De Brabander et al. (1989), es recomendable la cromatografía

en capa delgada de alta eficiencia (CCDAE), pues al autor le permitió realizar
20
una determinación rutinaria de varios residuos anabólicos en muestras de
orina bovina, con sensibilidad en el rango de 0.5 ppb a 10 ppb.
21
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1 CONCLUSIONES
Se obtuvo una muestra representativa, bajo la metodología sugerida por el

CODEX y adaptada por AGROCALIDAD, donde se tomaron muestras de
tejido muscular bovino de 12 mataderos en la provincia de Manabí.
Obteniéndose un total de 41 muestras en mataderos que continúan en
funcionamiento en dicha provincia.
El uso de métodos rápidos de tipo screening son particularmente útiles para

determinar la posible presencia de contaminantes a un costo manejable.
Considerando los resultados negativos a la presencia de trembolona, se

puede inferir que el peligro de consumir carne contaminada con residuos de
este esteroide es baja. Sin embargo, el estudio reveló resultados positivos a
la posible presencia del esteroide boldenona, podría indicar su potencial uso
dentro del país. Si se considera que su uso no es permitido se incrementa el
riesgo para la inocuidad de alimentos y salud de los consumidores, por lo que
es necesario realizar un análisis confirmatorio mediante otros métodos como
los cromatográficos.
El desempeño del método ELISA competitivo, tanto para trembolona como

para boldenona, indican que las muestras en laboratorio fueron analizadas
con una exactitud aceptable (mayor al 80 %).
22
4.2 RECOMENDACIONES
Las muestras evaluadas por el método ELISA competitivo requieren de un

análisis confirmatorio, este puede ser cromatografía líquida acoplada a
espectrofotometría de masas. Haciendo énfasis en aquellas muestras que
resultaron positivas a la posible presencia de los esteroides, con la finalidad
de verificar la fiabilidad del método.
Se debe tomar en cuenta las condiciones que afectan los resultados; estas
variables pueden ser la selección de reactivo, temperatura, medición de
volumen y tiempo, incluso si el animal fue inyectado con anterioridad el
esteroide se pueden presentar residuos de anticuerpos, arrojando falsos
positivos. Además, es importante mantener la cadena de frío cuando se
recepta las muestras para evitar reacciones propias del tejido muerto.
Por otra parte, se sugiere a los entes reguladores realizar capacitaciones a los
productores cárnicos, a fin de que se conozca la problemática que conlleva el
uso inadecuado de esteroides. Informando la relevancia de cumplir con la
normativa acerca de los límites máximos de residuos, que afectarían la
inocuidad y calidad de la carne. Asimismo, se pueden implementar soluciones
alternativas, ya sea en alimentación balanceada de los bovinos, como en el
mejoramiento de las razas. Además, el mejoramiento en el control de la venta
de medicamentos veterinarios no permitidos por la normativa nacional e
internacional; concientizar a la población de los riesgos que pueden existir con
el uso irracional de los mismos.
23
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31
6. ANEXOS
6. ANEXOS
ANEXO 1
ESTRUCTURAS DE A) COLESTEROL, B) TESTOSTERONA, C)

TREMBOLONA, D) BOLDENONA
A) B)
C) D)
FUENTE: (Báthori, Tóth, Hunyadi, Márki, & Zádor, 2008)
33
ANEXO 2
NÚMERO DE MUESTRAS OBTENIDAS DE MATADEROS

MANABÍ
Fuente: Codex Alimentarius CAC/GL 33, 1999
34
ANEXO 3
RESULTADOS TREMBOLONA
CÓDIGO DE IDENTIFICACIÓN DE RESIDUOS
N° ANALITO LMR**
LA CAMPO DE LA ENCONTRADOS
MUESTRA DETECTADO (ug/kg)
MUESTRA MUESTRA (ug/kg)
CPP - 17 -
1 M - 01 TREMBOLONA ND 2
137
CPP - 17 -
138
CPP - 17 -
139
CPP - 17 -
140
CPP - 17 -
141
CPP - 17 -
142
CPP - 17 -
143
CPP - 17 -
144
CPP - 17 -
145
CPP - 17 -
146
CPP - 17 -
147
CPP - 17 -
148
CPP - 17 -
13 P - 01 TREMBOLONA ND 2
149
CPP - 17 -
150
CPP - 17 -
151
CPP - 17 -
152
CPP - 17 -
153
CPP - 17 -
154
CPP - 17 -
155
CPP - 17 -
156
CPP - 17 -
157
CPP - 17 -
158
CPP - 17 -
23 EC - 01 TREMBOLONA ND 2
159
CPP - 17 -
160
CPP - 17 -
161
35
CÓDIGO DE IDENTIFICACIÓN DE RESIDUOS
N° ANALITO LMR**
LA CAMPO DE LA ENCONTRADOS
CPP - 17 -
26 R - 01 TREMBOLONA ND 2
162
CPP - 17 -
27 R - 02 TREMBOLONA ND 2
163
CPP - 17 -
28 PD - 01 TREMBOLONA ND 2
164
CPP - 17 -
29 PJ - 01 TREMBOLONA ND 2
165
CPP - 17 -
166
CPP - 17 -
167
CPP - 17 -
168
CPP - 17 -
33 H - 01 TREMBOLONA ND 2
169
CPP - 17 -
34 H - 02 TREMBOLONA ND 2
170
CPP - 17 -
35 Cha - 01 TREMBOLONA ND 2
171
CPP - 17 -
36 T - 01 TREMBOLONA ND 2
172
CPP - 17 -
173
CPP - 17 -
174
CPP - 17 -
39 CH - 01 TREMBOLONA ND 2
175
CPP - 17 -
40 CH - 02 TREMBOLONA ND 2
176
CPP - 17 -
41 B - 01 TREMBOLONA ND 2
177
ND: No Detectado LD: Límite de Detección NE: No Establecido
LMR: Límite Máximo de Residuos
36
ANEXO 4
RESULTADOS BOLDENONA
CÓDIGO DE IDENTIFICACIÓN RESIDUOS

N° ANALITO LMR**
LA DE CAMPO DE LA ENCONTRADOS
CPP - 17 -
1 M - 01 BOLDENONA ND NE
137
CPP - 17 -
2 M - 02 BOLDENONA 0,03 NE
138
CPP - 17 -
139
CPP - 17 -
140
CPP - 17 -
141
CPP - 17 -
142
CPP - 17 -
143
CPP - 17 -
144
CPP - 17 -
145
CPP - 17 -
146
CPP - 17 -
147
CPP - 17 -
148
CPP - 17 -
13 P - 01 BOLDENONA ND NE
149
CPP - 17 -
150
CPP - 17 -
15 P - 03 BOLDENONA 0,04 NE
151
CPP - 17 -
152
CPP - 17 -
153
CPP - 17 -
154
CPP - 17 -
155
CPP - 17 -
156
CPP - 17 -
157
CPP - 17 -
158
CPP - 17 -
23 EC - 01 BOLDENONA <LD NE
159
CPP - 17 -
160
37
CÓDIGO DE IDENTIFICACIÓN RESIDUOS
N° ANALITO LMR**
LA DE CAMPO DE LA ENCONTRADOS
CPP - 17 -
161
CPP - 17 -
26 R - 01 BOLDENONA <LD NE
162
CPP - 17 -
27 R - 02 BOLDENONA ND NE
163
CPP - 17 -
28 PD - 01 BOLDENONA ND NE
164
CPP - 17 -
29 PJ - 01 BOLDENONA ND NE
165
CPP - 17 -
166
CPP - 17 -
167
CPP - 17 -
168
CPP - 17 -
33 H - 01 BOLDENONA ND NE
169
CPP - 17 -
34 H - 02 BOLDENONA 0,03 NE
170
CPP - 17 -
35 Cha - 01 BOLDENONA ND NE
171
CPP - 17 -
36 T - 01 BOLDENONA ND NE
172
CPP - 17 -
173
CPP - 17 -
174
CPP - 17 -
39 CH - 01 BOLDENONA ND NE
175
CPP - 17 -
40 CH - 02 BOLDENONA ND NE
176
CPP - 17 -
41 B - 01 BOLDENONA ND NE
177
ND: No Detectado LD: Límite de Detección NE: No Establecido
LMR: Límite Máximo de Residuos
38
ANEXO 5
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: A) RECEPCIÓN DE LA

MUESTRA, B) HOMOGENIZACIÓN, C) PESAJE, D)
CODIFICACIÓN, E) VORTEADO, F) CENTRIFUGACIÓN, G)
SOBRENADANTE, H) ADICIÓN DE REACTIVOS, I)
EVAPORACIÓN CON NITRÓGENO
A) B)
C) D)
E) F)
39
G) H)
I)
40
ANEXO 6
MÉTODO ELISA COMPETITIVO
A) B)
C) D)
41
ANEXO 7
REGISTRO DE MUESTRAS – PROTOCOLO ELISA
TREMBOLONA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B St4 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0.5 137 141 145 149 153 157 161 165 169 173
B B St4 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0.5 137 141 145 149 153 157 161 165 169 173
C St1 Sts 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,05 1.0 138 142 146 150 154 158 162 166 170 174
D St1 Sts 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,05 1.0 138 142 146 150 154 158 162 166 170 174
E St2 QC 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,10 0.25 139 143 147 151 155 159 163 167 171 175
ppb
F St2 QC 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,10 0.25 139 143 147 151 155 159 163 167 171 175
ppb
G St3 F1 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,25 146’ 140 144 148 152 156 160 164 168 172 177
H St3 F1 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,25 146’ 140 144 148 152 156 160 164 168 172 177
Fuente: AGROCALIDAD, 2017
42
ANEXO 8
REGISTRO DE MUESTRAS – PROTOCOLO ELISA
BOLDENONA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B St4 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
1.5 137 141 145 149 153 157 161 165 169 173
B B St4 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
1.5 137 141 145 149 153 157 161 165 169 173
C St1 Sts 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,05 4.5 138 142 146 150 154 158 162 166 170 174
D St1 Sts 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,05 4.5 138 142 146 150 154 158 162 166 170 174
E St2 QC 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,15 0.5 139 143 147 151 155 159 163 167 171 175
ppb
F St2 QC 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,15 0.5 139 143 147 151 155 159 163 167 171 175
ppb
G St3 F1 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,5 171’ 140 144 148 152 156 160 164 168 172 177
H St3 F1 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17- 17-
0,5 171’ 140 144 148 152 156 160 164 168 172 177
Fuente: AGROCALIDAD, 2017
43

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E

EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE LOS ESTEROIDES

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

VARGAS ORTEGA MARÍA BELÉN

DIRECTOR: Dr. LUIS RAMOS GUERRERO

Quito, enero 2018

Reservados todos los derechos de reproducción

DIRECTOR DEL PROYECTO DE

PROGRAMA PREGRADO POSGRADO

The result showed no presence of the

The result showed no presence of the

Este trabajo va dedicado a mis padres Azucena y Wilson, y a mis hermanos

A mis primas Soledad y Justine por su gran cariño y apoyo cuando lo

A mis padres por su ejemplo de superación y lucha, brindarme su apoyo en

A AGROCALIDAD, y todos los que forman parte de ella; por permitirme

2.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE MÚSCULO 10

2.3 MÉTODO ELISA COMPETITIVO 12

2.4 DESEMPEÑO MÉTODO ELISA COMPETITIVO 12

3.3 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO: 18

3.4 DESEMPEÑO DEL MÉTODO ELISA COMPETITIVO: 19

Tabla 1. Número de muestras obtenidas de cada matadero 9

Tabla 2. Curva de Calibración Logarítmica del Kit Estándar del 12

Tabla 4. Verificación de la exactitud del método ELISA 19

Tabla 5. Verificación de la exactitud del método ELISA 20

Figura 1. Preparación de la muestra 11

Figura 2. Análisis de muestras trembolona versus LMR Codex 14

Figura 3. Análisis de muestras para boldenona versus LMR 15

Figura 4. Concentración de boldenona/muestra de tejido 16

Figura 5. Parroquias de Manabí con mayor incidencia a 17

Figura 6. Porcentaje de incumplimiento en Manta (A), 18

Figura 7. Curva de calibración para trembolona por el método 18

Figura 8. Curva estándar del método ELISA para boldenona 20

ANEXO 1. ESTRUCTURAS DE A) COLESTEROL, B) 33

ANEXO 2. NÚMERO DE MUESTRAS OBTENIDAS DE 34

ANEXO 3. RESULTADOS TREMBOLONA 35

ANEXO 4. RESULTADOS BOLDENONA 37

ANEXO 5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: A) RECEPCIÓN 39

ANEXO 6. MÉTODO ELISA COMPETITIVO 41

ANEXO 7. REGISTRO DE MUESTRAS – PROTOCOLO 42

ANEXO 8. REGISTRO DE MUESTRAS – PROTOCOLO 43

En varios países, el sector ganadero ha manifestado indicios sobre el

PALABRAS CLAVE: boldenona / trembolona / inocuidad / límite máximo de

The result showed no presence of the trenbolone compound, complying with

KEYWORDS: boldenone / trenbolone / harmlessness / maximum residue limit

Se pronostica que para el año 2050 la demanda mundial de productos

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