UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE.

INGENIERÍA EN AGROBIOTECNOLOGÍA EN AREA VEGETAL.

BIOLOGÍA MOLECULAR.

Tarea 1:

Estudio de PCR en especie vegetal seleccionada

1.- de su especie vegetal seleccionada, va a partir de los siguientes datos: posee sembradas 100
hectáreas con la planta, investigue una enfermedad ocasionada por virus, bacterias u hongos en
dicha planta. Seleccione sólo una enfermedad, la cual van a estudiar mediante PCR.

a).- Determine el porcentaje de plantas que va a muestrear para hacer el estudio.

b).- Investigue y seleccione el método de muestreo que va a utilizar de acuerdo a la especie

vegetal y problema fitosanitario seleccionado.

c).- Describa ampliamente la forma en qué va a muestrear, tipo de material vegetal a tomar (hoja,
raíz, tallo, fruto), hora de muestreo, número de muestras que va a tomar, justificando cada uno de
los apartados mencionados con base a la técnica de extracción de ADN y PCR.

Desarrollado por:

Jhoana Ornelas Flores 20171101

Revisa:

Dr. Emigdio De la Cruz De la Cruz

 Muestreo y PCR de Dypsis lutescens

La palma de frutos de oro, es una planta muy singular, que decora los jardines aportando un
toque exótico y tropical que tanto nos gusta. Hay unas 3 mil especies aceptadas, y un buen
porcentaje de ellas se utilizan como plantas ornamentales en todo tipo de zonas, sobre todo
en aquellas que disponen de un clima templado o cálido.

Ahora bien, como todos los ser vegetal, también ella tienen que superar varios desafíos
impuestos por plagas y enfermedades que las atacan.

Hay muchos insectos que se sienten atraídos por estas maravillosas plantas, y a veces
cuando nos damos cuenta. Lo que era tan sólo un insecto se ha convertido en una plaga que
la está perjudicando seriamente. Algunos ejemplos de plagas que atacan a Dypsis lutescens
son las Cochinillas (tanto algodonosas como la llamada Piojo de San José), pulgones, trips,
sin contar con los temidos picudo rojo y Paysandisia archon, pueden hacerles mucho daño
a las plantas, sobretodo estos dos últimos, ya que viven dentro del cogollo de la planta y se
alimentan de él.

La época donde estas plagas se sienten más cómodas es en verano, cuando las temperaturas
son altas y el ambiente seco. Así, será en esta estación cuando tengamos que
hacer tratamientos preventivos para proteger la palma areca. En el caso de las plagas más
conocidas podemos recurrir a insecticidas naturales como el Aceite de Neem o las
infusiones con ajo, pero cuando se trata de prevenir y/o combatir al picudo y/o a la
Paysandisia no nos queda más remedio que utilizar productos químicos que contengan
Clorpirifos.

Para llevar a cabo estudio de PCR en la especie vegetal seleccionada, en este caso Dypsis
lutescens, palma areca o palma de frutos de oro, se eligió Amarilleo letal (Lethal
Yellowing). Es una devastadora enfermedad en las palmeras, producida por un organismo
micoplasmático relacionado con los virus.

Es considerada una enfermedad severa y peligrosa, pues además de dispersarse

rápidamente, causa la muerte de las plantas en un periodo de entre cuatro a seis meses
después de los primeros síntomas.
Afecta a más de 30 especies de palma. Destaca en Cocoteros (Cocos nucifera). En Europa
aún no se ha detectado.

Síntomas
Ataca tanto a plantas jóvenes como adultas, y tras una incubación de seis a doce meses
empiezan a aparecer los primeros síntomas.

Causa un amarillamiento inicial en el follaje de la palmea afectada y posteriormente una

defoliación total, dejando a la palmera con un aspecto de "poste telefónico".

- Amarilleo y muerte de las hojas.

- Raíces necróticas.

- Ennegrecimiento de las inflorescencias.

- Desprendimiento prematuro de los frutos.

- Cambio de color de las frondas adultas las cuales se secan y cuelgan en forma de paraguas
plegado.
- Colapso de crecimiento.

- Finalmente, muerte de la planta.

Una playa o una plantación afectada por esta enfermedad presentan un panorama
devastador, semejante al ocasionado por un incendio.

Trasmisión
El agente causal de la enfermedad es un fitoplasma que es transmitido por un insecto vector
chupador conocido comúnmente como  saltamontes Haplaxius crudus (antiguo
nombre Myndus crudus), originario de Florida, partes del Caribe, partes de Australia y
América Central.  La única cura efectiva es la prevención, es decir, plantar variedades
resistentes de palma de coco y prevenir un ambiente similar a un parque o un campo de golf
que atraiga al saltamontes., el cual se distribuye ampliamente y se haya en todo lugar donde
hay cocoteros.
Este insecto mide aproximadamente 1mm de largo y se alimenta de la savia del follaje de
las palmeras. Al alimentarse de una palmera infectada, ingiere el fitoplasma, que luego es
posteriormente inyectado a una palmera sana al alimentarse.

Este vector puede dispersarse por el viento o con el movimiento de grama ornamental
infectada, utilizada en las cubiertas del suelo en plantaciones de palmera.

Control
No puede ser controlada con métodos químicos ni la enfermedad ni el insecto vector.
Siendo la única solución viable la plantación masiva de variedades de Cocoteros tolerantes.
Entre estas destacan Malayo, Enano Malasino y los tipos híbridos.

Una palmera atacada en un 25% de su corona debe ser eliminada por la imposibilidad de
poder sanarla.

La lucha curativa está de momento centrada en la aplicación de diversos antibióticos,

fungicidas, sales minerales e insecticidas.

Se han demostrado algunos efectos beneficiosos aplicando Tetraciclina a dosis de 1 a 3

gramos por palmera cada cuatro meses, no soportando las palmeras aplicaciones totales de
más de 20 gramos por planta.

Para llevar a cabo el estudio de PCR de la especie Dypsis lutescens, en el cultivo referente
a las 100 hectáreas es necesario, realizar un muestreo aleatorio que en este caso se aplicaría
a un 50% de la población de plantas de palma areca.

El muestreo aleatorio constituye una de las clases más populares de muestreo

aleatorio o probabilístico.

En esta técnica, cada miembro de la población tiene la misma probabilidad de ser

seleccionado como sujeto. Todo el proceso de toma de muestras se realiza en un paso, en
donde cada sujeto es seleccionado independientemente de los otros miembros de
la población.
Una de las mejores cosas del muestreo aleatorio simple es la facilidad para armar la
muestra. También se considera una forma justa de seleccionar una muestra a partir de una
población, ya que cada miembro tiene igualdad de oportunidades de ser seleccionado.
Otra característica clave del muestreo aleatorio simple es la representatividad de la
población. En teoría, lo único que puede poner en peligro su representatividad es la suerte.
Si la muestra no es representativa de la población, la variación aleatoria es
denominada error de muestreo.
Para sacar conclusiones de los resultados de un estudio son importantes una selección
aleatoria imparcial y una muestra representativa. Recuerda que uno de los objetivos de la
investigación es sacar conclusiones con relación a la población a partir de los resultados de
una muestra. Debido a la representatividad de una muestra obtenida mediante un muestreo
aleatorio simple, es razonable hacer generalizaciones a partir de los resultados de la muestra
con respecto a la población.
Aunque una de las limitaciones más evidentes del muestreo aleatorio simple es la necesidad
de una lista completa de todos los miembros de la población. Debes tener en cuenta que la
lista de la población debe estar completa y actualizada. Esta lista generalmente no está
disponible en poblaciones grandes. En estos casos, es más prudente utilizar otras técnicas
de muestreo.

Al realizar el muestreo aleatorio, se extraerá tejido vegetal de los tallos de los especímenes
seleccionados y esto se llevará a cabo una vez establecido el cultivo. Con un total de 50
plantas de las cuales, 25 serán la muestra, de donde se efectuará la extracción de ADN y
posterior análisis de PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica

millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los
que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad
de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en
las células. En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente
hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del
ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-
PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante una reacción conocida
como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de
convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este método fue copiado de los retro virus
que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en
millones de partículas virales.2 El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión del
ARNm de algún gen de interés.

Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la

enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs:
adenina, timina, citosina y guanina), el ion magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o
buffer y H2O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se
compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en donde se
realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para establecer
un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se
modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se
amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR o también llamados
ampliaciones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa.
A continuación se explicarán cada uno de los puntos mencionados.