UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN” FACI – ESBM. Blgo. Mblgo.

Daniel Machaca Mena

PRÁCTICA Nº 04
Colorantes y Coloraciones

I. INTRODUCCIÓN:

Muchas células u organismos como las bacterias resultan difíciles verlas al microscopio por ser incoloras o
transparentes, por lo que es necesario realizar preparados microscópicos, fijarlas y teñirlas aplicando
alguna técnica de coloración para distinguir los detalles de sus estructuras externas e internas que sirven
de base para su identificación y clasificación.

II. OBJETIVOS:

• Es propósito de esta práctica hacer una introducción preliminar al conocimiento de los colorantes y las
técnicas básicas de coloración, así como la de algunas coloraciones especiales.
• Adiestrase en el procedimiento de la coloración Gram para diferenciar bacterias Gram positivas y
Gram negativas

III. MARCO TEORICO

1. COLORANTE. son sustancias o compuestos químicos que tiene color y que los transmite a otros
objetos o tejidos coloreándose de acuerdo a la naturaleza física química tanto del objeto como del
colorante. estos compuestos orgánicos contienen radicales cromoforos y auxocromos.

• Los cromóforos imparten la propiedad cromógena (producen color) al colorante. Los grupos nitro (-
NH2) y azo (-N=N) son cromoforos.
• Los auxocromos permite que el colorante se una con la muestra, formando sales. Los radicales
hidroxido (-OH) y amino (-NH2), son grupos auxocromos.

2. CLASES DE COLORANTE

a. POR SU NATURALEZA U ORIGEN

i. NATURALES: Son aquellos que se obtienen directamente de animales y vegetales como:

- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
• Hematoxilina: La hematoxilina es una sustancia capaz de colorear, extraída de la madera
de un árbol conocido como árbol de Campeche, originario de Centroamérica.
• Orceína: Es un principio colorante extraído de ciertos líquenes. Es un ácido débil.
Utilizando una mezcla en que el ácido acético actúa como mordiente se utiliza para
colorear cromosomas. También colorea las fibras elásticas.

ii. ARTIFICIALES: llamados también sintéticos, se obtienen como productos derivados de la

destilación fraccionada de la hulla, generalmente se le conoce como colorantes de anilina.

b. POR SU AFINIDAD TINTOREA LOS COLORANTES ARTIFICIALES

a) Colorantes Ácidos: Son aquellos que tienen por afinidad especial colorear el citoplasma, por lo
que se les llama también colorantes citoplasmáticos. Los más usados son:
• Eosina, Fucsina ácida, ácido pícrico
• Naranja G, Azul de anilina, Safranina.

b) Colorantes Básicos: Son aquellos que tienen afinidad especial por colorear la cromatina nuclear,
llamándoseles por eso colorantes nucleares. Entre los más usados están:
• Hematoxilina, Azul de metileno, Fucsina básica, Azur “A”, Azur “B”
• Violeta de Genciana, Thionina, Azul de toluidina, Hemateína.

c) Colorantes Neutros: Aquellos que en su constitución lleva una parte ácida y otra básica que
colorean. Ejemplos:
• Eosinato azul de metileno
• Wright, Leishman, May Grunwald
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3. COLORACIÓN. Es el proceso físico químico mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia
colorante, la penetración del colorante se debe a un fenómeno osmótica (teoría física) y a la unión
entre moléculas del colorante con los elementos constituyentes de la muestra (teoría química).

4. FACTORTES QUE INTERVIENEN EN LA COLORACION:

Pureza de los colorantes, Concentración de los colorantes, pH de la solución del colorante,

Temperatura del ambiente, Sustancias adicionales y Tiempo de coloración.

5. TIPOS DE COLORACIÓN
a) Coloración Simple
b) Coloración Doble
c) Coloración Neutra
d) Coloración Diferencial o Especial

IV. EXPERIENCIAS

A. COLORACIONES

1. COLORACIÓN SIMPLE.

a. Material y reactivos: mucosa labial, alcohol, eosina, safranina, azul de metileno, hematoxilina,
agua destilada, microscopio.

b. Procedimiento:

• Extensión o frotis ( muestra: mucosa labial )

• Fijación ( alcohol, calor moderado del mechero, medio ambiente )
• Colorear de 1 a 5 minutos ( con un colorante acido o básico )
• Lavar a chorro tenue y secar al medio ambiente o calor moderado.
• Observar empleando el objetivo de inmersión.

2. COLORACIÓN DOBLE

a. Material y reactivos: los mismos de la coloración anterior especificando que se utiliza como
colorante acido la eosina y como colorante básico la hematoxilina

b. Procedimiento:

• Extensión o frotis ( muestra: mucosa labial )

• Fijación ( alcohol, calor moderado del mechero, medio ambiente )
• Colorear con hematoxilina de 3 a 5 minutos
• Colocar el preparado en agua destilada de 1 a 2 minutos
• Colorear con eosina de 5 a 10 minutos
• Lavar con agua corriente
• Secar y observar en el microscopio con el objetivo de inmersión

3. COLORACIÓN DIFERENCIAL: GRAM

a. Material y reactivos: sarro dentario, pus o esputo, frascos de vidrio, asa de Koll, mechero,
laminas portaobjetos, agua destilada, cristal violeta, lugol, alcohol acetona, safranina, mechero,
microscopio.

b. Procedimiento:
• Recolectar la muestra (sarro dentario, pus o esputo ) en un frasco de vidrio esterilizado
• Con una de asa de Koll previamente esterilizada al calor, tomar una pequeña porción de la
muestra y realizar una extensión o frotis en una lamina portaobjeto.
• Fijar al calor moderado y colorear con cristal violeta hasta cubrir el preparado y dejarlo en
reposo por espacio de 1 a 2 min.
• Eliminar el exceso de colorante sin lavar la lámina y agregar lugol hasta cubrir el preparado
y dejarlo en reposos por 1 a 2 min.
• Decoloración con alcohol acetona hasta que el preparado este incoloro
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• Lavar el preparado con agua destilada

• Añadir colorante de contraste safranina y dejarlo en reposo por espacio de 1 a 2 min.
• Lavar el preparado en agua destilada.
• Secar el preparado al medio ambiente o al calor moderado.
• Observar al microscopio con objetivo de inmersión e identifique Bacterias Gram positivas
y Gram negativas
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4. COLORACIÓN DIFERENCIAL DE ZIEHL NEELSEN (Para gérmenes ácido alcohol resistente,

BAAR)

Técnica:
• Preparar el frotis de la muestra de esputo.
• Cubrir íntegramente con el colorante fucsina fenicada de Ziehl.
• Calentar a la llama de un mechero de alcohol, hasta desprendimiento de vapores por 3 a 5 veces
consecutivas, sin llegar a ebullición.
• Decolorar con alcohol ácido.
• Lavar con agua de caño.
• Aplicar el azul de metileno, como colorante de contraste, por 1 a 2 minutos.
• Lavar, secar y observar.
• Se observará bacilos rojos con pequeñas granulaciones (se observará BAAR)

Cuestionario
1. Describa el fundamente de la coloración Gram
2. Describa el fundamente de la coloración Ziehl Neelsen