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Artículo
Instituto de Tecnología de Separación y Procesos, Universidad Tecnológica de Clausthal, Leibnizstr. 15, 38678
Clausthal-Zellerfeld, Alemania; jensch@itv.tu-clausthal.de (CJ); schmidt@itv.tu-clausthal.de (AS)
* Correspondencia: strube@itv.tu-clausthal.de ; Teléfono: +49-5323-72-2872
Abstracto:En el contexto de los enfoques de investigación bioeconómica, un uso en cascada de materias primas
vegetales tiene sentido en muchos casos para la valorización de residuos. Esto no solo garantiza que la materia prima se
utilice de la manera más completa posible, sino que también ofrece la posibilidad de utilizar sus subproductos y flujos
residuales de manera rentable. Para que tales usos en cascada sean lo más eficientes posible, se necesitan procesos
eficientes y respetuosos con el medio ambiente. Para ejemplificar el método versátil, por ejemplo, cada año se
acumulan 675.000 toneladas métricas de cáscara de grano de cacao (CBS) como flujo de desecho en la industria de
procesamiento de alimentos en todo el mundo. Un novedoso proceso verde alcanza rendimientos muy altos de hasta el
---- 100 % en una sola etapa de extracción, asegura un bajo consumo de solventes orgánicos debido al doble uso de etanol
--- como único solvente orgánico, es lo suficientemente adaptable para capturar todo tipo de metabolitos secundarios de
Citación:Jensch, C.; Schmidt, A.; Strube, J. extractos de agua caliente y asegura el uso de carbohidratos estructurales de la precipitación. Se llevó a cabo un diseño
Procesamiento verde versátil para la de experimentos (DoE) para optimizar la influencia del valor de pH y la relación de fase en el rendimiento y la pureza del
recuperación de compuestos fenólicos de
sistema integrado de extracción bifásica de etanol/agua/sal acuosa (ATPS).
extractos de productos naturales hacia la
10.3390/su14053126
d-líquido
líquidointerfaz de usuario
PHWE Precipitación Destilación mi
xtracción
2. Materiales y métodos
2.1. Configuración de extracción
Para el cribado de temperatura, se extrajo 1 g de CBS molido en una columna de extracción de 10 mL con
un flujo de 1 mL/min. La planta de extracción consta de una bomba, un horno GC para calentamiento, una
columna para extracción y un baño de agua para enfriamiento. Para obtener el máximo rendimiento, se
recogieron fracciones de 120 ml de extracto.
Para el cribado del disolvente, se extraen 2 g de CBS molido con 40 ml del disolvente
respectivo: etanol al 20-100 %, metanol, isopropanol, MTBE, acetato de butilo, acetato de etilo,
tolueno y hexano. Los viales se colocaron en un dispositivo de agitación durante 24 h para alcanzar
el equilibrio de extracción. Todos los disolventes se adquirieron en VWR International GmbH,
30163 Hannover, Alemania.
La extracción se llevó a cabo como una extracción de agua caliente a presión/agua caliente líquida/agua
subcrítica (PHWE). La planta de extracción consta de una columna de extracción con un volumen de 0,1 L, un
recipiente de disolvente, una unidad de calefacción con un intercambiador de calor, una unidad de refrigeración
con un intercambiador de calor y un recipiente de extracción. Las condiciones de extracción fueron 140◦C a 1 L/
h. El CBS se obtuvo como residuo industrial seco de un socio del proyecto. No se especificó más el origen. Fue
molido y tamizado a 630–2000µm, que es lo suficientemente pequeño para garantizar una rápida transferencia
de masa pero lo suficientemente grande para evitar el bloqueo de la columna de extracción. La columna de
extracción se llenó con 20 g de material vegetal molido y se recolectaron 500 mL de extracto. El solvente de
extracción fue agua desionizada de una planta de desionización interna. La proporción de solventes se origina
en la selección de temperatura, en la que se alcanzó el rendimiento total después de una proporción de
solventes de 25.
2.3. Analítica
El análisis sin conexión consta de tres métodos analíticos diferentes. Para los componentes objetivo
teobromina, cafeína, catequina y epicatequina, se realizaron análisis de cromatografía líquida de alto
rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). El método se modifica en base a Rojo-Poveda et al. [28]. Para la
detección se utiliza un detector de matriz de diodos (DAD), que detecta teobromina y cafeína a 272 nm y
catequina y epicatequina a 280 nm. Para la separación se utilizó una columna Kinetex Phenyl-Hexyl C18
(150 mm de longitud×4,6 mm de diámetro interno y 5µm tamaño de partícula; Phenomenex,
Aschaffenburg, Alemania). El volumen de inyección fue de 10µL. El gradiente consta de ácido fórmico al
0,1 % como disolvente A y metanol como disolvente B con un caudal de 1 ml/min. El programa de elución
comienza con un 10 % de disolvente B hasta 12,5 min. El gradiente alcanza el 80 % de disolvente B a los
37,5 min y un escalón hasta el 90 % de disolvente B hasta los 42,5 min. Para el equilibrio, la partición del
solvente B es 10% de 42.5 a 45 min.
La columna se calienta a 35◦C. El metanol y el ácido fórmico en grado HPLC se compraron a
VWR International GmbH, 30163 Hannover, Alemania. Para la calibración se utilizaron estándares
de teobromina, cafeína, catequina y epicatequina de concentraciones entre 0,02 y 1 g/L de Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. Las calibraciones para el análisis de HPLC y la prueba de Folin-
Ciocalteu se muestran en la Figura2.
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100,000,000 1.4
Cafeína y = 92.709.986,407x
R² = 0,991
90,000,000
1.2
Teobromina y = 132.192.015,942x
80,000,000
R² = 0,999
70,000,000 1
epicatequina y = 26.039.875,580x
20,000,000
0.2
10,000,000
0 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Concentración (mg/mL)
Figura 2.Curvas de calibración para cafeína, teobromina, epicatequina, catequina y c equivalente de ácido
gallilentas (GAE).
2.5. Cálculos
Para la caracterización de la extracción sólido-líquido, el rendimiento se calcula de acuerdo a
la Ecuación (1), con mCTcomo la masa extraída del componente objetivo y mCBScomo la masa de
CBS molido utilizado en el proceso de extracción.
Rendimiento =
metroCT
(1)
metroCBS
C
k =TC,LP (2)
CTC.HP
El rendimiento en la extracción líquido-líquido se calcula de acuerdo con la Ecuación (3),
con la masa del componente objetivo en la fase ligera mTC,LPy en la fase pesada mTC HP.
Sostenibilidad2022,14, 3126 5 de 16
La pureza de la extracción líquido-líquido para cada componente se calcula de acuerdo con la Ecuación
(4), con la masa del residuo seco en la fase ligera mRepública Dominicana, LP.
metroTC,LP
Rendimiento = (3)
metroTC.HP+mTC.LP
metro
Pureza =TC,LP (4)
metroRepública Dominicana, LP
3. Resultados
Residuo seco
25 miligramos por gramo
teobromina
Cafeína
Rendimiento a materia prima
catequina
20 miligramos por gramo
epicatequina
Figura 3.Rendimientos para residuo seco, metilxantinas y polifenoles en cribado de disolventes con acuoso
etanol y disolventes orgánicos.
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Además de la materia seca extraída, son de interés los polifenoles de las cáscaras de cacao. Los
rendimientos alcanzados en miligramos de polifenoles por gramo de cáscara de cacao extraída se
muestran en la Figura4. Además de los componentes objetivo investigados descritos al principio, donde
se consideran los dos fenoles catequina y epicatequina, así como las dos metilxantinas teobromina y
cafeína, aquí aparece un contenido total de fenoles. Estas son nuevas mediciones de muestras antiguas
que todavía estaban disponibles. El análisis por medio de Folin-Ciocalteu se estableció adicionalmente
solo en el curso posterior del proyecto. Por lo tanto, este método analítico hasta ahora solo se ha llevado
a cabo en esta serie de mediciones. Se puede observar que en el rango de temperatura entre 120◦C y 160
◦C, los rendimientos obtenidos se mantienen relativamente constantes. En consecuencia, hasta una
temperatura de extracción de 160◦C, se puede suponer que no tienen lugar procesos de descomposición
térmica de los componentes investigados. Según la suma de las propiedades de extracción con respecto
a los glicanos y polifenoles, así como las consideraciones operativas y de seguridad, una temperatura de
extracción de 140◦C se selecciona para las extracciones posteriores. No se detectó quercetina en ninguno
de los extractos de las presentes cáscaras de cacao.
50mg/g
40mg/g
se forman huecos de mezcla, que es un requisito previo para LLE. Sin embargo, es posible realizar una
extracción bifásica acuosa en un sistema de etanol/agua/sal. En este caso, la adición de sal a una mezcla
de etanol y agua desplaza al etanol con menor contenido de agua de la fase rica en sal. En principio, una
amplia gama de diferentes sales son adecuadas para este propósito. En vista de la compatibilidad
ambiental y los procesos de extracción verde, se utiliza una sal de citrato. Comparativamente, pero
menos verde, se usa una sal de fosfato. Los coeficientes de partición para los componentes objetivo se
muestran en la Figura5. El coeficiente de partición se calcula con la concentración en la fase ligera
dividida por la concentración en la fase pesada. Aquí, los valores grandes representan una distribución
preferencial de los componentes objetivo en la fase ligera, que en todos los casos es la fase orgánica, o la
fase etanólica baja en sal. Aquí, solo se obtienen coeficientes de reparto muy bajos para los disolventes
orgánicos en cuestión. En contraste, se logran grandes coeficientes de partición para los sistemas de
etanol/agua/sal. Aquí, el sistema de citrato muestra los mejores resultados en comparación. El uso de
este sistema también tiene la ventaja de que no es necesario agregar extractante orgánico adicional al
proceso. Solo se usa el etanol, que de todos modos se requiere para la precipitación.
35
fechanreihen2
30 teobromina
Cafeína
catequina
25 epicatequina
Coeficiente de partición
20
15
10
0
MTBE acetato de butilo Acetato de etilo Citrato ATPS Fosfato odiar
atp S
Por lo tanto, los sistemas de etanol/agua/sal se caracterizarán e investigarán con más detalle
en ensayos posteriores.
En figura6, los resultados del cribado de fases con citrato ATPS a pH 6, 7 y 8, fosfato ATPS a pH 7 y
8, acetato de etilo y acetato de butilo en relaciones de fase 30/70, 40/60, 50/50, 60/40 y Se muestran
70/30 (m/m) expresados como alimentación/disolvente. Los componentes investigados son contenido
fenólico total, teobromina, cafeína, catequina y epicatequina. El rendimiento se calcula como la masa del
componente respectivo en la fase ligera dividida por la masa del componente respectivo que se
introduce en el sistema con el extracto de CBS usado. La pureza se calcula como la masa del componente
respectivo dividida por la masa del residuo seco dentro de la fase ligera. Los datos muestran que, para
todos los componentes, los sistemas acuosos de dos fases alcanzan rendimientos excepcionalmente
altos de hasta el 100 % en una sola etapa de extracción. mientras que los sistemas de extracción
convencionales con acetato de etilo y acetato de butilo alcanzan solo hasta un máximo del 50 % para la
cafeína y solo hasta el 30 % para los polifenoles objetivo. Los datos muestran rendimientos más altos
para el ATPS a una relación de fase más alta, lo que
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representa un menor consumo de solvente, mientras que los solventes orgánicos muestran un comportamiento
contrario. Entonces, para mejores rendimientos en el ATPS, se usa menos solvente, y para mejores rendimientos
con solventes orgánicos, se necesita una mayor cantidad de solvente. El valor del pH parece tener una influencia
insignificante en el rendimiento. En cuanto a la pureza, los disolventes orgánicos alcanzan valores
significativamente más altos. Esto se debe a los contenidos bastante altos de sal en el ATPS en la fase ligera rica
en fenol. Esto se puede optimizar con una adaptación del sistema de extracción, por ejemplo, un mayor
contenido de etanol en la alimentación. Esto se investigará en un estudio de seguimiento.
100% 100%
Citrato pH 6 Citrato pH 6
pH 7 pH 7
90% Fosfato 90% Fosfato
pH 8 pH 8
Acetato de etilo Acetato de etilo
80% Acetato de butilo
80% acetato de butilo
70% 70%
Fenoles de pureza
Fenoles de rendimiento
60% 60%
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30
Relación de fase alimentación/disolvente Relación de fase alimentación/disolvente
(a) (b)
100% 100%
Citrato pH 6
90% 90% pH 7
Fosfato
pH 8
Acetato de etilo
80% 80% acetato de butilo
70% 70%
presagio
Rendimiento Teobromina
Citrato
hermano
pH 6
60% Fosfato pH 7 60%
Acetato de etilo pH 8
50% 50%
Pureza Theo
acetato de butilo
40% 40%
30% 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30
Relación de fase alimentación/disolvente Relación de fase alimentación/disolvente
(C) (d)
100% 100%
Citrato pH 6
90% 90% Fosfato pH 7
pH 8
Citrato pH 6 Acetato de etilo
80% Fosfato pH 7 80% acetato de butilo
Acetato de etilo pH 8
70% 70%
acetato de butilo
rendimiento cafeína
Cafeína de pureza
60% 60%
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30
Relación de fase alimentación/disolvente Relación de fase alimentación/disolvente
(mi) (F)
Figura 6.continuación.
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100% 100%
Citrato pH 6
90% 90% pH 7
Fosfato
pH 8
Acetato de etilo
80% 80% acetato de butilo
catequina
Catequina de pureza
70% 70%
Rendimiento Catecnología
Catequina de pureza
60% 60%
50% 50%
Producir
Citrato pH 6
Fosfato pH 7
40% 40%
Acetato de etilo pH 8
30% acetato de butilo 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30
Relación de fase alimentación/disolvente Relación de fase alimentación/disolvente
(gramo) (h)
100% 100%
Citrato pH 6
90% 90% pH 7
Fosfato
pH 8
Acetato de etilo
80% 80% acetato de butilo
Pureza epicatequina
70% 70%
Rendimiento epicatequina
Pureza epicatequina
Rendimiento epicatequina
60% 60%
50% 50%
Citrato pH 6
40% Fosfato pH 7 40%
pH 8
Acetato de etilote
30% acetato de butilo 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30
Relación de fase alimentación/disolvente Relación de fase alimentación/disolvente
(i) (j)
Figura 6.Rendimientos y purezas para el contenido fenólico total (a,b), teobromina (C,d), cafeína (mi,F), catequina (
gramo,h) y epicatequina (i,j) en DoE con relación de fase y valor de pH incluyendo acetato de etilo y acetato de butilo
como referencia.
En figura7, se muestra la influencia estadística del valor de pH y la relación de fase en el rendimiento del
contenido de fenol, teobromina, cafeína, catequina y epicatequina. Los cuadrados negros en los gráficos
representan los valores objetivo de los datos experimentales. Estos resultados son para el ATPS con un tampón
de citrato al 40% en peso. Debido a la baja solubilidad de las sales de fosfato a pH 6, no se pudo realizar una
DoE factorial completa.
(a) (b)
Figura 7.continuación.
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(C) (d)
(mi) (F)
(gramo) (h)
Figura 7.continuación.
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(i) (j)
Figura 7.Influencia del pH y la relación de fases en el rendimiento del contenido fenólico total (a,b), teobromina (C,d),
cafeína (mi,F), catequina (gramo,h) y epicatequina (i,j).
Para el contenido fenólico total, el coeficiente de regresión del modelo estadístico es 0,98. El valor de pH
no tiene una influencia significativa en el rendimiento de extracción, donde la relación de fase tiene una
influencia positiva alta en el rendimiento de extracción. Este comportamiento coincide con las observaciones en
la Figura6. Para la teobromina, el coeficiente de regresión del modelo estadístico es 0,96. Tanto el valor de pH
como la relación de fase tienen una influencia positiva significativa en el rendimiento de extracción. El
coeficiente de regresión del modelo estadístico para el rendimiento de cafeína es 0,72. De acuerdo con los
valores P, el valor de pH tiene un efecto positivo significativo, mientras que la relación de fase no tiene un efecto
significativo. Sin embargo, debido a la baja R2y la alta dispersión de los valores medidos en la figura7e,f, esta
afirmación es cuestionable.
Para la catequina, el coeficiente de regresión del modelo estadístico 0,88. Tanto el valor de pH como la relación
de fase tienen una influencia positiva significativa en el rendimiento de catequina.
El coeficiente de regresión del modelo estadístico para la epicatequina es 0,91. El valor de pH tiene una
influencia positiva significativa media en el rendimiento, mientras que la relación de fase tiene una influencia
positiva significativa en el rendimiento de epicatequina.
En figura8, se muestra la influencia estadística del valor de pH y la relación de fase en la
pureza del contenido fenólico total, teobromina, cafeína, catequina y epicatequina.
(a) (b)
Figura 8.continuación.
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(C) (d)
(mi) (F)
(gramo) (h)
Figura 8.continuación.
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(i) (j)
Figura 8.Influencia del pH y la relación de fase en la pureza del contenido fenólico total (a,b), teobromina (C,d),
cafeína (mi,F), catequina (gramo,h) y epicatequina (i,j).
Para el contenido fenólico total, el coeficiente de regresión del modelo estadístico es 0,80. El valor
de pH tiene una influencia positiva significativa en el rendimiento de la extracción, mientras que la
relación de fase tiene una influencia baja o nula en la pureza. Este comportamiento coincide con las
observaciones en la Figura6. Para la teobromina, el coeficiente de regresión del modelo estadístico es
0,89. Tanto el valor de pH como la relación de fase tienen una influencia positiva significativa en la pureza
de la teobromina. El coeficiente de regresión del modelo estadístico para la pureza de la cafeína es 0,76.
De acuerdo con lapag-valores, valor de pH y relación de fase tienen un efecto positivo medio significativo
en la pureza de la cafeína.
Para la catequina, el coeficiente de regresión del modelo estadístico 0,58. Tanto el valor de pH como la
relación de fase no tienen una influencia positiva significativa en el rendimiento de catequina. Sin embargo,
debido a la baja R2y la alta dispersión de los valores medidos en la figura8g,h, esta afirmación tiene un nivel de
confianza bajo.
El coeficiente de regresión del modelo estadístico para la epicatequina es 0,28. Debido a la baja
calidad de la regresión, no es necesario hacer una declaración sofisticada.
Además, para el rendimiento y la pureza, no existe una influencia significativa de la interacción
entre el valor de pH y la relación de fase.
4. Discusión
En el presente estudio, se investigó el comportamiento de extracción de los diversos componentes
objetivo en el sistema de stock CBS. Se demostró que los solventes orgánicos comunes, con la excepción
de las mezclas de etanol y agua, solo dan resultados de extracción deficientes. Las propiedades de
extracción comparativamente buenas de las mezclas de etanol y agua ya proporcionaron una indicación,
en la selección de solventes del SLE, de que un ATPE con la fase etanólica parece un método prometedor.
La detección de temperatura mostró muy buenos resultados de extracción para una temperatura de
extracción de 140◦C, que es una temperatura de extracción común para la extracción de componentes
fenólicos.
En una primera selección de disolventes para LLE, se investigan los tres posibles puntos de
aplicación de LLE en las alternativas de proceso. Que LLE ocurra antes o después de la precipitación no
tuvo efecto en los resultados de los presentes experimentos. Por otra parte, los disolventes
especialmente fuertemente apolares, como el tolueno o el hexano, no son adecuados para los sistemas
de sustancias grasas como el CBS. Sin embargo, se confirma el potencial del ATPE con etanol, agua y sal,
por lo que se prefiere esta alternativa de proceso. El único solvente orgánico requerido, el etanol, puede
incluso usarse una segunda vez para este propósito desde el paso anterior del proceso, la precipitación.
Esto ahorra recursos y protege el clima; ambos puntos deben ser considerados para procesos en la
bioeconomía. En el siguiente paso, se investigó el ATPE con dos sales diferentes. Aquí, Se variaron el pH
del tampón salino y la relación de fase. De la estadística experimental
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En el diseño, hay una influencia positiva en el rendimiento para proporciones de fase más
altas, es decir, para una proporción baja de tampón salino. El valor de pH tiene una influencia
baja en el rendimiento y solo para algunos componentes. La pureza también aumenta para
relaciones de fase más altas. El aumento del pH también tiene un efecto positivo en la
pureza. Para los estudios alternativos con acetato de etilo y acetato de butilo del extracto
crudo, se demostró que un alto contenido de fase orgánica aumenta tanto el rendimiento
como la pureza. Para los sistemas ATPE se consiguen rendimientos entre el 80 y el 100% para
los diferentes componentes objetivo. Las pruebas comparativas orgánicas solo arrojan
rendimientos entre 20 y 40% en una etapa de extracción. Las purezas comparativamente
bajas de los sistemas ATPE se deben a una transición de la sal a la fase ligera. El contenido de
sal en la fase ligera se puede reducir optimizando el punto del sistema.
La precipitación con etanol al 60 % en peso, que se definió en el presente estudio en el marco
de un proyecto, se investigará con más detalle en estudios de seguimiento. Debido a la doble
utilización de etanol en el ATPE, la precipitación y el LLE están directamente relacionados. Sin
embargo, también es concebible ajustar el contenido de etanol al óptimo del LLE después de la
precipitación con un contenido de etanol óptimo para este paso del proceso.
5. Conclusiones
Tras este estudio, está disponible un proceso que integra el PHWE en un proceso general para la
utilización en cascada para la valorización de residuos de una manera económicamente eficiente, verde y
respetuosa con el medio ambiente. El proceso consiste en una extracción con agua caliente, una precipitación
con etanol como antidisolvente y una extracción líquido-líquido del sobrenadante de precipitación con
salificación del etanol. De esta forma, tanto los componentes de la matriz como los compuestos secundarios de
la planta se pueden utilizar por completo integrando las operaciones unitarias de manera apropiada. El versátil
proceso verde para la valorización de residuos se muestra en la Figura9.
• mi
El novedoso proceso alcanza rendimientos muy altos de hasta el 100% en una sola etapa de extracción.
• El nuevo proceso asegura low co consumo de disolventes orgánicos debido auso doble mi
de eth anol como único disolvente orgánico.
• El pr ocess es lo suficientemente adaptable para cubrirtura todo k encuentra metabolitos secundarios de
caliente extractos de agua y asegura el uso de estructura todos los carbohidratos fr om precipitación.
El etanol es bien conocido como precipitante de los componentes de la matriz de los extractos de agua
caliente. El contenido de etanol en la fase ligera es lo suficientemente adaptable para igualar las
propiedades de solubilidad del componente objetivo, generalmente entre 50 y 80 % de etanol.8,14].
• Los estudios de seguimiento se centrarán en la optimización de procesos, la investigación sobre tecnología
analítica de procesos y la caracterización completa de residuos secos por grupos de componentes [13].
Fondos:Esta investigación tiene su origen en el Proyecto GlyChem dentro de "BioBall Verbund" y fue
financiada por el PtJ encargado por el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), subvención
número 031B0905C. También agradecemos el apoyo del Open Access Publishing Fund de Clausthal
University of Technology.
Expresiones de gratitud:Los autores desean agradecer al equipo de laboratorio de ITVP, especialmente a Frank
Steinhäuser, Colin Herzberger, Volker Strohmeyer y Thomas Knebel por sus esfuerzos y apoyo. Los autores
también quisieran agradecer a Stefan Hanstein de Fraunhofer IWKS, Alzenau, Alemania por la fructífera
discusión.
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